JPH0630766A - 弱毒化された安全性の高い赤痢生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 赤痢菌において、ｖｉｒＫ遺伝子を変異また
は欠失させた赤痢ワクチン株、ｔｈｙＡ遺伝子を変異ま
たは欠失させた赤痢ワクチン株、ｖｉｒＫおよびｔｈｙ
Ａの量遺伝子を変異または欠失させた赤痢ワクチン株を
得るものである。 【構成】 ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ遺伝子を変異、欠失させ
た赤痢ワクチン株および赤痢ワクチン。 【効果】 安全性が高い弱毒赤痢ワクチンが得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は安全性の高い弱毒化され
た赤痢菌生ワクチンを製造するための赤痢ワクチン株に
関する。さらに詳しくは本発明は赤痢菌のＯ抗原は野生
型のままに保持されているが、病原性を弱毒化させるた
めにその発現に必要な遺伝子VirKを変異させたもの、ま
たはさらに安全性を高めるために栄養要求性遺伝子thyA
をも変異させた赤痢生ワクチン株に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】赤痢などの細菌性下痢症は、公衆衛生状
態の悪い開発途上国などにおいては特に深刻な感染症で
あり、我が国において伝染病予防法による法定伝染病に
指定されているように伝染性と致命率の極めて高い感染
症である。公衆衛生の向上に伴って先進国における赤痢
の罹患率は減少しているものの最近では輸入感染症とし
て再び重要性が増している。今後は人および物の世界レ
ベルでの交流が一層盛んになることが予想されており、
安全で有効な赤痢ワクチンの開発が強く望まれている。

【０００３】細菌性赤痢の感染防御抗原として赤痢菌
（Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S.
sonneiＥＩＥＣを含む) の種に特的な菌体抗原（リポ多
糖体、Ｏ抗原）が知られている。死菌赤痢菌を用いたワ
クチンが多く開発されてきたが、このような死菌ワクチ
ンで誘導される抗Ｏ抗体の力価は低いために満足な感染
防御効果は得られていない。このことは、赤痢の感染防
御には生体の細胞性免疫の関与が必要であることを示唆
するものであった。そこで、赤痢菌のＯ抗原遺伝子で形
質転換した大腸菌や病原性が弱毒化されたチフス菌によ
る生菌ワクチンが開発されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、依然と
して感染防御効果や安全性（下痢）の観点から、その効
果は満足されるものではなかった。赤痢菌はヒトならび
にサルにおいて細菌性赤痢をおこす。赤痢発症に至る必
須の初期段階は結腸上皮細胞への侵入性（LaBrecet a
l.,1964)で、次いで細胞内における菌の増殖と侵入した
菌が隣接細胞に拡散する。即ち、赤痢菌は結腸上皮細胞
に侵入して増殖し（１次侵入）、増殖した赤痢菌は細胞
間伝播により隣接する上皮細胞に再侵入（２次侵入）し
て、そこで再び増殖する。このような増殖と侵入とが繰
り返されるために大腸上皮細胞は破壊され、赤痢病変を
おこすことが知られている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者はこのような赤
痢菌の赤痢惹起因子が巨大プラスミド（２３０キロベー
ス）並びに染色体上に多数存在することを明らかにし
た。詳細な遺伝子の解析の結果、図１に示したように赤
痢菌の病原性またはその発現と調節に関与する多数の遺
伝子または領域を同定した。この内で、ｖｉｒＧと命名
した遺伝子は赤痢菌の２次侵入をつかさどることを明ら
かにした。即ち、ｖｉｒＧ遺伝子が変異すると結腸上皮
細胞のモデルとして用いた培養細胞（ＭＫ２細胞）への
１次侵入は起こるものの２次侵入は不可能であった。

【０００６】また、赤痢の動物モデルであるモルモット
の眼ヘの感染（Sereny試験）が起こらなかった。すなわ
ち、ｖｉｒＧ変異菌は赤痢を起こさないものと考えられ
る。ｖｉｒＧ遺伝子は１１６ｋＤの免疫原性のある、外
膜表面に露出した外膜蛋白をコードしており、細胞内に
ある菌が細胞質内および隣接する細胞に拡散する能力に
必須である。ｖｉｒＧ蛋白を発現している菌は感染した
上皮細胞の細胞質内にある菌体の周りにＦ−アクチン
（filamentous actin ）の極性沈着をひきおこす性質を
もっている。

【０００７】従って、ｖｉｒＧ蛋白質の発現に関与し菌
の２次侵入が減弱したようなｖｉｒＧ遺伝子に変異がお
こり、ｖｉｒＧ蛋白が産生されなくなると赤痢菌は１次
細胞侵入性は示すが、２次細胞侵入性は起こさなくなる
ので、赤痢菌の拡散は限定され、免疫状態を惹起するこ
とはできるが、下痢を惹起することはできないと考えら
れる。即ち、ｖｉｒＧ変異菌は赤痢弱毒ワクチンになる
と考えた。そこで、トランスポソンＴｎ１０挿入変異法
（以下、Ｔｎ１０という）によってこのような変異菌を
検索したところ、ｖｉｒＫと命名した遺伝子がｖｉｒＧ
蛋白質の発現を調節する遺伝子であることが明らかとな
った。

【０００８】即ち、Ｔｎ１０を用いてＹＳＨ６０００Ｔ
株（この菌株については後記する実験方法を参照）の挿
入変異株の採取を試みた結果、同定された領域の一つは
巨大プラスミド上にその存在が位置づけられた。この新
しいビルレンス関連領域は本発明者によりｖｉｒＫと命
名されたが、その分子生物学的ならびに機能的性質決定
を行った結果、ｖｉｒＧ蛋白の発現を転写後のレベルで
正調節し、完全に発現させることに関与することによ
り、結果として菌が隣接上皮細胞に拡散するのに関与し
ていることが解明された。

【０００９】従って、赤痢菌の２次侵入をつかさどるｖ
ｉｒＧ遺伝子を調節しているｖｉｒＫ遺伝子を変異また
は欠失させることにより、ｖｉｒＧ遺伝子の発現に基づ
く赤痢病変は抑制または消失した。そのような赤痢菌株
を用いて作製された赤痢ワクチンは極めて安全であると
推定した。そして、ｖｉｒＫ遺伝子の塩基配列を決定
し、それが３６．７ｋＤの蛋白をコードしていることを
見出し、そのｖｉｒＫ遺伝子を変異または欠失させるこ
とにより本発明を完成した。

【００１０】更に又、本発明者は赤痢菌の染色体上にも
多数の病原性因子を同定した。図１にその詳細を示し
た。この内でｔｈｙＡ遺伝子の変異（巨大プラスミドは
正常）はＭＫ２細胞への侵入は正常に起こるが、隣接細
胞への拡散はおきにくい。ｔｈｙＡはチミンの生合成に
係わる遺伝子であることからこの変異は菌の生体内での
増殖が減弱した結果の現象であろう。このｔｈｙＡ変異
菌はスムース型のコロニー形状を示しリポ多糖（ＬＰ
Ｓ）の長さも親株と同程度であった。すなわち、感染防
御に必須であるＯ抗原は維持されている。

【００１１】従って、ｔｈｙＡ遺伝子を変異または欠失
させた赤痢菌、ｔｈｙＡ変異菌は赤痢菌の結腸上皮細胞
への侵入とそこでの増殖が減弱することになり、また感
染防御に必須である菌体Ｏ抗原は維持されているため、
弱毒化された赤痢菌である。したがって、このような性
質を有する赤痢菌からなる赤痢ワクチン株は安全性の高
い赤痢ワクチンを製造するために極めて有用である。こ
のように、赤痢菌の染色体中に存在するｔｈｙＡ遺伝子
を同定し、その作用を見出し、それを変異または欠失さ
せた赤痢菌を得ることにより本発明を更に完成させた。

【００１２】本発明者は、また更に、前記したｖｉｒＫ
とｔｈｙＡ遺伝子に関する知見に基づいて、より安全で
有効な赤痢ワクチンを調製するための赤痢ワクチン株を
得るために赤痢菌のｖｉｒＫとｔｈｙＡとの２重変異株
を作出することに成功し、本発明を完成した。この場合
ワクチン株の野生型への復帰（すなわち、強毒菌への復
帰）をなくするためにｖｉｒＫとｔｈｙＡとの両遺伝子
が欠失した変異株を作出した。サルにこのワクチン株を
投与した後に赤痢強毒菌で攻撃した結果、このワクチン
株を投与した群は非投与群に比して赤痢の臨床症状が軽
減されたことが見出され、本２重変異株の有用性が確認
された。

【００１３】以上述べたとおり、本発明は赤痢菌におい
て、ｖｉｒＫ遺伝子を変異または欠失させた赤痢ワクチ
ン株、ｔｈｙＡ遺伝子を変更または欠失させた赤痢ワク
チン株、ｖｉｒＫおよびｔｈｙＡの両遺伝子を変更また
は欠失させた赤痢ワクチン株を包含し、これらを提供す
ることを目的とする。また、本発明はこれらの遺伝子が
変異または欠失した赤痢菌からなる赤痢ワクチン株より
製造された赤痢ワクチンを包含し、それを提供すること
を目的とする。更にまた本発明は、上記した赤痢ワクチ
ン株を用いて赤痢ワクチンを製造する方法を包含し、提
供することを目的とする。更に、本発明は請求項４に記
載したｖｉｒＫ遺伝子を包含し、提供することを目的と
する。

【００１４】本発明においては、赤痢菌（野生型赤痢
菌）のｖｉｒＫおよび／またはｔｈｙＡ遺伝子を変異ま
たは欠失させた菌株が調製される。遺伝子の変異または
欠失は、通常の方法、遺伝子工学的手法により行うこと
が効率的であるが、その他の古典的な変異方法も応用可
能である。変異または欠失方法（以下、遺伝子の一部変
化および欠失を含めて変異ということがある）は、挿入
変異による方法が一般的である。特に抗生物質耐性トラ
ンスポゾン、例えば本発明者によるテトラサイクリン耐
性トランスポゾン（Ｔｎ）挿入変異法が、特にＴｎ１０
挿入変異法が本発明においては好ましい結果を与える。

【００１５】ｖｉｒＫおよびｔｈｙＡ遺伝子の特性を考
慮したとき、両方の遺伝子が変異している赤痢菌株いわ
ゆるｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ２重変異菌株、特に強毒菌株へ
の復帰をなくするために、ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ両遺伝子
欠損株が本発明において特に好ましい。このようにして
得られたｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ遺伝子欠損株から、通常の
赤痢ワクチンを製造する方法により、本発明の安全性の
高い弱毒化された赤痢生ワクチンが製造される。使用さ
れる赤痢菌はワクチン製造の目的に応じて選択され、そ
れは通常の赤痢菌、例えばShigella boydii 、Shigella
dysenteriae、Shigella flexneri またはShigella son
nei 等である。

【００１６】以下に、本発明の赤痢菌病原性喪失変異株
の作成、病原性発現に関連する遺伝子ｖｉｒＫの配列決
定等について説明する。赤痢菌体巨大プラスミドへのＴ
ｎ１０挿入法によるS. flexneri 2a YSH6000T株の病原
性喪失変異株の分離複製が温度感受性になったプラスミ
ドＲ３８８株の変異体、ｐＣＨＲ７１（このプラスミド
については実験方法を参照のこと）の上にＴｎ１０が挿
入したものを使用してＹＳＨ６０００Ｔ株のＴｎ１０挿
入変異株を遺伝的に独立に２０００株分離し、単層組織
培養においてｆｏｃｕｓ／プラーク形態能（Ｆｐ−ｔｅ
ｓｔ）（この方法については実施例を参照）を使ってス
クリーニングする。

【００１７】このようにして２２株のビルレンス喪失変
異株を得、それら変異株においてＴｎ１０がどこに挿入
しているかを決定した。１１株は巨大プラスミド、ｐＭ
ＹＳＨ６０００、上にＴｎ１０をもち、残り１１株は染
色体上に持っていた。プラスミドｐＭＹＳＨ６０００上
にＴｎ１０をもつ１１株につきＡからＴまで名前をつけ
た２３個のＳａl Ｉ断片のどの上にあるかを決定した。
その結果、１１株中３株において７．８ｋｂのＳａl Ｉ
断片Ｋに挿入されていることが判明した。本発明者は断
片ＫにＴｎ１０が挿入されている３株の変異株、Ｖ８３
６、Ｖ９５６およびＶ１０６０の性質を更に調べた。

【００１８】ｐＭＹＳＨ６０００のＳａl Ｉ断片Ｋにあ
る病原性関連ＤＮＡ領域の性質決定Ｖ８３６、Ｖ９５６
およびＶ１０６０の３株に病原性が喪失したという表現
型がＴｎ１０の挿入に関連しているかを確認するためＰ
１フアージによってＹＳＨ６０００Ｔ株に形質導入を行
い、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ−ｒ）選択により導入
体を得た。これら３株の変異株から得られたＴｃ−ｒの
形質導入体はＦｐ−ｔｅｓｔにおいて元の３株のＴｎ１
０挿入変異株と同じ表現型を示した。即ち、いずれもｆ
ｏｃｕｓを形成し、プラークは作らなかった。このこと
から、これら変異株は細胞侵入性は示す（Ｉｎｖ＋）が
細胞間伝播は起こせないことが示された。

【００１９】次いで、この病原性表現型に関与するＤＮ
Ａ配列が７．８ｋｂのＳａl Ｉ断片Ｋ上にコードされて
いることを確認するために、それぞれＳａl Ｉ断片Ｋ、
Ｏ−ＫまたはＫ−Ｑをもつ３株のｐＢＲ３２２誘導体
（図２）を各Ｔｎ１０挿入変異体に導入し、Ｆｐ−ｔｅ
ｓｔによりこれらの導入体の病原性表現型が回復するか
どうかを調べた。その結果、これら３種のｐＢＲ３２２
誘導体はすべて３株のＴｎ１０挿入変異体にプラークを
形成する能力を付与すること、すなわち、この病原性表
現型に関連するＤＮＡ配列はＳａl Ｉ−Ｋ断片上にある
ことが分かった。

【００２０】Ｖ８３６、Ｖ９５６およびＶ１０６０にお
けるＴｎ１０挿入位置を正確に決定した（下記実施例参
照）。図２に示すように、３株のＴｎ１０挿入はＳａl
Ｉ−ＫのＳａl Ｉ−０側の末端近くにある１．０ｋｂＳ
ａl Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片内に位置づけられた。次いで、
病原性関連ＤＮＡ配列を位置づけるためＳａl Ｉ−Ｋの
種々の制限酵素によってできるＤＮＡ断片をｐＢＲ３２
２にクローン化し、３株のＴｎ１０挿入変異体に病原性
を回復させる能力があるかどうかを調べた結果、Ｓａl
Ｉ−Ｋ断片の左端から１．４ｋｂＤＮＡ断片（図２）が
これら変異体に病原性を回復させるには必要であること
が示された。この病原性関連領域をｖｉｒＫと命名し
た。

【００２１】ｖｉｒＫ変異体の細胞内表現型について 上述のように、３株のＴｎ１０挿入変異体、Ｖ８３６、
Ｖ９５６およびＶ１０６０の病原性関連表現型は、とも
にＩｎｖ＋で、Ｆｐ−ｔｅｓｔでプラーク形成能が陰
性、フオーカス形成能は陽性である点で、いずれもｖｉ
ｒＧ変異体Ｍ９４（ｖｉｒＧ：Ｔｎ５）と同じクラスに
属する。ｖｉｒＫ変異体の細胞内の挙動を明らかにする
ため細胞内伝播および細胞間伝播をする能力の有無を調
べた。菌を感染させてから１時間までは細胞侵入したＶ
９５６とＭ９４の両株は病原性を有するＹＳＨ６０００
Ｔ原株と本質的に変わりが見られない。３時間後、ＹＳ
Ｈ６０００Ｔ原株は細胞質内で自由にかつ活発に運動
し、隣接する上皮細胞に再感染した（図３Ａ参照）。

【００２２】それに対し、細胞侵入したＶ９５６とＭ９
４の両株においては当初は正常の増殖を示したが、細胞
質内で局在化した。３時間後、みたところＶ９５６株は
Ｍ９４株よりも有意に強く細胞内伝播をおこした。ＭＫ
２細胞の細胞質部分はＶ９５６株では大部分菌で一杯に
なったが、Ｍ９４株ではならなかった（図３Ｂおよび図
３Ｃ参照）。それでもなお、大部分のＶ９５６菌は細胞
から細胞に拡散することはできなかった（図３Ｂ参
照）。菌の感染８時間後になると細胞内にいるＶ９５６
株の菌体はＭ９４株と同様に球形に変化した。Ｆｐ−ｔ
ｅｓｔにおいてもＶ９５６とＭ９４の差異は明白である
（図４Ａ参照）。Ｖ９５６株の感染７２時間後（図４Ｂ
参照）ではフオーカスの大きさは常にＭ９４株より大き
かった（図４Ｃ参照）。

【００２３】さらに細胞内の挙動を解明するためにＶ９
５６、Ｍ９４およびＹＳＨ６０００Ｔ株が細胞内に侵入
したときのＦ−アクチンの極性沈着を形成する能力、す
なわちｖｉｒＧ蛋白によって媒介されることが知られて
いる特徴的な性質で、菌が細胞内および細胞間伝播をす
るのに必須の性質について調べた（図５Ａ及びＢ、図６
Ｃ及びＤ、図７Ｅ及びＦ参照）。その結果、ｖｉｒＧ陰
性変異体はフアロイジンにより染色されなかった（図７
Ｆ参照）。Ｖ９５６株の場合は菌を取り囲んで少しはＦ
アクチンの沈着が見られたが（図６Ｄ参照）、その程度
は原株ＹＳＨ６０００Ｔで見られた沈着に比較して明ら
かに軽度であった（図５Ｂ参照）。

【００２４】Ｔｎ１０挿入変異体における１１６ｋＤの
ｖｉｒＧ蛋白の発現 上述の結果よりＶ９５６変異株においてｖｉｒＧ産物が
十分に発現しているかどうか疑問である。それ故、Ｖ８
３６、Ｖ９５６およびＶ１０６０変異体において発現し
ているｖｉｒＧ蛋白量を原株ＹＳＨ６０００Ｔおよびｖ
ｉｒＧ陰性変異体（Ｍ９４）におけるｖｉｒＧ蛋白量と
比較した。Ｔｎ１０挿入変異体および原株の全菌体溶解
液についてｖｉｒＧ特異抗血清、ＶＲＧ−Ｃを用いた免
疫ブロツト法で検出されるｖｉｒＧ蛋白量を測定した。
図８に示すように３株のＴｎ１０変異体が発現している
ｖｉｒＧ蛋白量は原株ＹＳＨ６０００Ｔに比較して明ら
かに減量はしていたが、完全に発現できなくなっている
訳けではない。

【００２５】これらのＴｎ１０挿入変異体におけるｖｉ
ｒＧ蛋白量の低下がｖｉｒＧ遺伝子の転写の低下のため
であるか否かを検討するため、ｖｉｒＧ遺伝子配列内の
１．４ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII を３２Ｐラベルし
たものをプローブとして用いたノザンドットブロット法
を行った。その結果、３株のＴｎ１０変異体、Ｖ８３
６、Ｖ９５６およびＶ１０６０は原株ＹＳＨ６０００Ｔ
と本質的には変わりのないｖｉｒＧｍＲＮＡ量を発現し
ていた（図９参照）。従って、ｖｉｒＫ領域はｖｉｒＧ
遺伝子の転写に何も影響を与えていなことが確認され
た。

【００２６】ｖｉｒＫ領域の産物の解析と塩基配列 ３株のＴｎ１０挿入変異体において病原性が喪失した表
現型の原因となる遺伝子領域を解明するため、Ｓａl Ｉ
−Ｋ断片内の１６４２ｂｐからなるＳａl Ｉ−ＳｐｈＩ
断片の塩基配列を決定した（配列番号：１参照）。塩基
３から塩基３６６まで（ＯＲＦ−１）と塩基３７３から
塩基１３２１まで（ＯＲＦ−２）の２個のＯＲＦ（翻訳
枠）が見つかった。各ＯＲＦの５’端はＳｐｈＩ断端
（図２参照）の方を向いていた。ＯＲＦ−２がコードす
る３１８個の推定アミノ酸配列から３６．７ｋＤの蛋白
ができるはずであるが、この数字は後述のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド ゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（図１０参照）に示される３６ｋＤという見掛け上の分
子量に近い。

【００２７】他方、病原性変化を伴わないＴｎ５挿入変
異体のうち一番左のＳ６２がＯＲＦ−１の５’端から塩
基２９７のところでＯＲＦ−１を分断していることから
判断して、ＯＲＦ−２のすぐ上流に位置するＯＲＦ−１
は病原性に関係ない。さらにＯＲＦ−２内で、塩基４４
３、塩基６３４および塩基９４９の位置にある３箇所の
ＳｍａＩサイトにリンカーを挿入して作製した３株の変
異体は３株のＴｎ１０変異体、Ｖ８３６、Ｖ９５６およ
びＶ１０６０の何れにおいてもＦｐ−ｔｅｓｔで病原性
表現型を回復させることができた。ＧｅｎＢａｎｋとＥ
ＭＢＬの塩基配列データベースで検索の結果有意の相同
性を示すものはなかった。

【００２８】ＯＲＦ−２から翻訳される蛋白産物を同定
するため、ｖｉｒＫ遺伝子を含む１．６ｋｂのＳａl Ｉ
−ＳｐｈＩ断片内にある１３７９ｂｐからなるＢａl Ｉ
断片の（配列番号：１参照）をＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ依存プロモータｐｈｉ１０の下流に両方向に位置づけ
たものを作成し、発現されたポリペプチドをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより解析した（図１０参照）。１３７９ｂｐか
らなるＢａl Ｉ断片の、図２で転写が右から左に起こっ
ている方向（方向Ｉとよぶ）から３６、１９、１１およ
び９ｋＤの少なくとも４ポリペプチドが発現していた
が、逆の方向IIではペプチドが発現していなかった。こ
れらの結果とｖｉｒＫ遺伝子の塩基配列やｖｉｒＫ領域
の相補性試験の結果とを総合して判断すると３６ｋＤ蛋
白がｖｉｒＫ機能に関与することになる。

【００２９】ｖｉｒＫ遺伝子の塩基配列は全ての赤痢菌
および腸管組織侵入性大腸菌の巨大プラスミド上に保存
されている。ＹＳＨ６０００Ｔ株のＳａl Ｉ−Ｋ断片内
にある１．６ｋｂのＳａl Ｉ−ＳｐｈＩ断片を３２Ｐで
ラベルしたプローブとして用い、S. dysenteriae１０
株、S.flexneri１４株、S. bodyii ９株、S. sonnei ４
株および腸管組織侵入性大腸菌９株から分離したプラス
ミドＤＮＡについてＤＮＡドット ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。

【００３０】その結果、すべてのプラスミドがＤＮＡプ
ローブに対して陽性反応を示した。赤痢菌の各血清群お
よび腸管組織侵入性大腸菌から２株づつ代表株を選び、
それらについてプラスミドＤＮＡをＳａl Ｉで消化し、
０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ｖｉｒＫ遺伝子
内の０．３ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII 断片を３２
Ｐでラベルしたものを用いてハイブリダイゼーションを
行った。Ｓａl Ｉ断片の大きさは赤痢菌の各血清群およ
び腸管組織侵入性大腸菌で異なっていたが、ｖｉｒＫの
ホモログが検査した全てのプラスミドに保存れていた。

【００３１】本発明者は上記した本発明において、Ｔｎ
１０挿入法を用いてS. flexneri ２ａ ＹＳＨ６０００
株の巨大プラスミド、ｐＭＹＳＨ６０００上のＳａl Ｉ
断片Ｋに新しい病原性関連領域（ｖｉｒＫ）を同定し
た。ｖｉｒＫの位置はｖｉｒＧ遺伝子の５’末端からお
よそ５０ｋｂと決定した（図２）。Ｔｎ１０の挿入によ
って得られた３株の病原性喪失変異体、Ｖ８３６、Ｖ９
５６およびＶ１０６０においてはＴｎ１０の挿入はＳａ
l Ｉ−Ｋ断片に起こっていた。Ｔｎ１０の挿入部位の位
置づけ（図２）およびｖｉｒＫ領域の塩基配列の決定
（配列番号：１）によって、問題の遺伝因子はＳａl Ｉ
−Ｏ断片に隣接するＳａl Ｉ−Ｋ断片の１．０ｋｂ配列
内にあることが判明した。

【００３２】病原性喪失変異体Ｖ９５６株を感染したＭ
Ｋ２細胞をギームザ染色すると菌は細胞質の全体を占め
ていた（図３Ｂ）が、ｖｉｒＧ変異体Ｍ９４株は細胞質
のごく一部を占めるだけであった（図３Ｃ）。Ｖ９５６
株はみたところ細胞内運動はできるが、細胞間の伝播は
原株に比較して非常に減弱している（図３Ａ）。Ｍ９４
株、Ｍ９５６株および病原性ＹＳＨ６０００Ｔ原株の間
の侵入した細菌の挙動の違いを分子レベルで明らかにす
るためフアロイジンと抗ＬＰＳ抗体による染色を行っ
た。その結果、得られたデータは侵入した細菌の挙動の
違いが侵入菌の周りと一極に沈着するＦ−アクチンの沈
着程度（図５ＡとＢ）および菌が発現しているｖｉｒＧ
蛋白の量（図８）に一致していた。したがって、Ｖ９５
６株の細胞内挙動はｖｉｒＧの発現レベルが低いことに
あり、その結果として侵入した菌は細胞内で運動できる
が細胞間ではできないことになる。

【００３３】ｖｉｒＧ遺伝子の完全な発現のための分子
機構はまだ明確ではないが、ｖｉｒＫ蛋白は１１６ｋＤ
ｖｉｒＧ蛋白の発現に関与することにより細胞に侵入し
た菌が隣接上皮細胞に伝播するのに必要となる。事実、
３株のＴｎ１０挿入変異体ではｖｉｒＧ特異抗体ＶＲＧ
−Ｃによる免疫ブロツトにより測定したｖｉｒＧの量
は、原株に比較して低レベルである（図８参照）。しか
しこれら３変異体においてｖｉｒＧｍＲＮＡの量はＹＳ
Ｈ６０００Ｔ原株と同じレベルである（図７）。従っ
て、ｖｉｒＫ蛋白はｖｉｒＧ遺伝子の形質発現に転写後
のレベルで作用すると結論される。

【００３４】ｖｉｒＫ領域の塩基配列からみて単一のＯ
ＲＦ（翻訳枠）の存在が示された（配列番号：１）。こ
れはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ依存性の遺伝子
発現系で見られた３６ｋＤの蛋白（図１０）をコードす
るのには十分の大きさである。塩基配列から推定したｖ
ｉｒＫ蛋白のアミノ酸配列の親水性プロフイルによれば
ｖｉｒＫ蛋白はわずかに親水性であつて、Ｎ末端に典型
的なシグナルペプチドはもつていない。このようにｖｉ
ｒＫ蛋白はｖｉｒＧ蛋白量を増加させるのに関与する細
胞質性のポリペウチドである。従って、ｖｉｒＫ遺伝子
を変異させることにより病原性発現に関与するｖｉｒＧ
遺伝子の発現を抑制または無くすることができ、そのよ
うな性質を有する赤痢菌は、菌の細胞侵入後の増殖と２
次細胞侵入性に関連するｔｈｙＡ遺伝子をも変異させる
ことにより、安全性に優れた弱毒性赤痢生ワクチンを製
造するために有効である。

【００３５】本発明における理解を更に助けるために以
下に図面についての説明を加える。図１はプラスミドお
よび染色体上の病原性因子関連遺伝子領域を示す。図２
はｖｉｒＫのマッピングであり、白ぬき横棒線の上にあ
る黒ぬり部分は巨大プラスミド、ｐＭＹＳＨ６０００上
のビルレンス関連遺伝領域を示し、白ぬき横棒線はｐＭ
ＹＳＨ６０００のＳａl Ｉ制限酵素地図である。白ぬき
丸印と黒ぬり丸印はそれぞれＴｎ１０とＴｎ５の挿入位
置を示す。中段の太い横棒線は、ｐＭＹＳＨ６０００の
Ｓａl Ｉ−Ｋ断片の物理的地図である。

【００３６】また、下半分にある９本の横棒線は、Ｓａ
l Ｉ−Ｋ断片に由来し、クローン化したＤＮＡ断片を示
す。左側に示した「＋」と「−」はＦｐ−ｔｅｓｔによ
って３株のＴｎ１０挿入変異体とクローン化された各断
片との間で相補性があるかどうかを調べた結果を示す。
省略印の説明は以下のとおりである。 Ｂ；ＢａｍＨＩ Ｂｇ；Ｂｇl II Ｅ；ＥｃｏＲＩ Ｅｖ；ＥｃＲＶ Ｈ；ＨｉｎｄIII Ｎ；ＮｃｏＩ Ｓ；Ｓａl Ｉ Ｓｐ；ＳｐｈＩ

【００３７】図３はＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ＹＳＨ６０
００由来の３菌株を接種後３時間におけるＭＫ２細胞の
光学顕微鏡写真であり、試料はメタノールで固定しギー
ザム液で染色した。図３におけるＡは原株ＹＳＨ６００
０Ｔ、ＢはＶ９５６（ｖｉｒ：：Ｔｎ１０）、ＣはＭ９
４（ｖｉｒＧ：：Ｔｎ５）である。図４は菌接種後７２
時間におけるＭＫ２細胞のフオーカス−プラーク形成
（Ｆｐ−ｔｅｓｔ）の位相差顕微鏡写真であり、ＡはＹ
ＳＨ６０００Ｔ、ＢはＶ９５６、ＣはＭ９４で倍率はそ
れぞれ×４０である。

【００３８】図５、図６および図７はＭＫ２細胞におけ
るＦ−アクチンと菌とのかかわりであり、図５のＡ、図
６のＢおよび図７のＥは、抗Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２
ａＬＰＳウサギ血清と蛍光ラベルした抗ウサギＩｇＧヤ
ギ血清を用いて免疫蛍光体法を行うことにより菌を可視
化した。また、図５のＢ、図６のＤおよび図７のＥはＦ
−アクチンをフアロイジンによりラベルした。図５にお
けるＡ、ＢはＹＳＨ６０００Ｔ、図６におけるＣおよび
（Ｄ）はＶ９５６、図７におけるＥ、ＦはＭ９４であ
る。

【００３９】図８はｖｉｒＧ蛋白の免疫ブロツト法によ
る解析であり、ｖｉｒＧ特異抗血清で免疫ブロツト法を
行うため全菌体溶液を用いた（実験方法を参照）。レー
ン１；Ｖ８３６、２；Ｖ９５６、３；Ｖ１０６０、４；
Ｍ９４、５；ＹＳＨ６０００Ｔ、１１６ｋＤ ｖｉｒＧ
蛋白は矢印で示した。図９はｖｉｒＧｍＲＮＡの産生量
であり、全ＲＮＡを抽出し、種々の量をブロツトし、３
２ＰでラベルしたｖｉｒＧ遺伝子の１．４ｋｂＥｃｏＲ
Ｖ−ＨｉｎｄIII 断片によりハイブリダイゼーションを
行った。レーン１；Ｖ８３６、レーン２；Ｖ９５６、レ
ーン３；Ｖ１０６０、レーン４；Ｍ９４、レーン５；Ｙ
ＳＨ６０００Ｔである。

【００４０】図１０はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ依存性プ
ロモータ系によりｖｉｒＫ領域から発現した蛋白産物で
あり、レーン１；Ｂａl Ｉ断片を方向Ｉに連結した、レ
ーン２；Ｂａl 断片を方向IIに連結した、レーン３；ベ
クターに何も挿入しなかった。矢印は３６ｋＤのｖｉｒ
Ｋ蛋白を示す。

【００４１】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて本発明を説
明するが、本発明はこれらに限定するものはない。 実施例１ 菌株とプラスミド Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ＹＳＨ６０００株（以下
に記す薬剤すべてに耐性）はサル糞便由来株で、ＹＳＨ
６０００Ｔ株はＹＳＨ６０００株に由来する（特別の変
異処理をすることなく）自然に発生したテトラサイクリ
ン（Ｔｃ）、クロラムフェニコール、アンピシリンおよ
びストレプトマイシン感受性誘導体である。Ｖ８３６、
Ｖ９５６およびＶ１０６０株はｖｉｒＫ遺伝子にＴｎ１
０を挿入させて作製したＹＳＨ６０００Ｔ株の病原性喪
失変異体である。Ｍ９４株はｖｉｒＧ遺伝子にＴｎ５を
挿入させて作製したＹＳＨ６０００株の病原性喪失変異
体である。プラスミドｐＢＲ３２２は２３０ｋｂプラス
ミド、ｐＭＹＳＨ６０００のＤＮＡ断片をクローニング
するのに常にベクターとして用いた。

【００４２】挿入変異法 ｐＣＨＲ７１：：Ｔｎ１０は３０℃でトリメトプリム
（Ｔｐ）耐性によって選択することによりＹＳＨ６００
０Ｔ株に接合により導入した。１０ｍｃｇ／ｍｌのチミ
ンを加えたＬＮ寒天平板にＴｃ耐性で、かつＴｐ耐性に
なった接合体のコロニーが３０℃で平板あたり約２００
０個生ずるように塗布した。これらのコロニー１個１個
を別々にＴｃを１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、チミンを１０ｍ
ｃｇ／ｍｌ含有したＬＮブロスに３０℃で培養し、Ｔｃ
含有寒天に塗布し、次いで４２℃で培養した。その後、
一平板あたり１個のＴｃ耐性で、かつＴｐ耐性のコロニ
ーを分離し、同じ選択平板で再度純化した後５０％グリ
セロール加ＬＮブロスに浮遊して−７０℃で保存した。

【００４３】病原性表現型の検査 アカゲザル上皮細胞（ＭＫ２）への細胞侵入性は既に報
告した方法によった（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５
４：３２−３６（１９８６））。フオーカス−プラーク
形成試験（Ｆｐ−ｔｅｓｔ）はもともと組織培養細胞プ
ラーク形成法を改良したものである。ＭＫ２細胞は９６
穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に３７℃にお
いて、５％ＣＯ₂ を含む加湿環境下に融合状（ｃｏｎｆ
ｌｕｅｎｔ）になるまで培養した。各穴の培養液をＭＫ
２細胞単層から取り除き、５ｍＭのグルタミンミンと５
％のウシ胎児血清を加えた新鮮な、抗生物質を含まない
イーグルＭＥＭ（日水製薬）培養液２５０ｍｃl に入れ
替えた。３７℃で増殖させた菌は生理食塩水でおよそ５
×１０⁸ ／mlの濃度になるまで希釈した。

【００４４】この菌液を各穴に５０ｍｃl ずつ加えた
後、このマイクロタイタープレートを５％ＣＯ₂ 存在下
に３７℃において２時間保温した。各穴をＨａｎｋｓバ
ランス塩溶液で２度洗い、１００ｍｃｇ／mlのゲンタミ
シンを含むイーグル培養液３００ｍｃｌを加え、５％Ｃ
Ｏ₂ 存在下に３７℃にオイテさらに１時間保温した。培
養液を変えた後、マイクロタイタープレートを５％ＣＯ
₂ 存在下に３７℃において７２時間保温した。各菌株に
ついてプラーク形成能とフオーカス形成能は低倍率下に
２４時間毎に観察した。

【００４５】細胞内増殖および感染上皮細胞の割合は
〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５３−３５９
（１９８９）〕による記載の通りに行った。菌の細胞内
伝播の検出とＦアクチンの沈着はＣｌｅｒｃとＳａｎｓ
ｏｎｅｔｔｉ（１９８７）〔Ｉｎｆｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
５５：２６８１−２６８８）によって記載された方法〕
を少し修正して行った。Ｆアクチンはローダミンフアロ
イジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎ
ｃ．）の５Ｕ／ml溶液でラベルし、細胞内の菌は抗フレ
キシナー２ａ赤痢菌ウサギ抗血清（デンカ生研）と、抗
ウサギ免疫グロブリンヤギ血清を用いて間接免疫蛍光抗
体法により染色した。

【００４６】ｐＭＹＳＨ６０００株のＳａl Ｉ−Ｋ断片
内のＴｎ５およびＴｎ１０の挿入位置の決定 ｐＭＹＳＨ６０００上のＴｎ１０の挿入位置はプラスミ
ドＤＮＡをＳａl Ｉ／ＢａｍＨＩで消化したものについ
て以下の３種のＤＮＡプローブのいずれかを用いてサザ
ンブロツト法を行い直接決定した。すなわち、Ｔｎ１０
の２．７ｋｂのＢｇlII 断片、ＳａlI断片Ｋ内の左のＳ
ａlI断片と一番左のＥｃｏＲＩの間の１．０ｋｂの断片
およびＳａl Ｉと一番左のＥｃｏＲＩの間の１．０ｋｂ
の断片およびＳａl Ｉ断片Ｋ内の左のＢａｍＨＩの間の
０．８ｋｂの断片の３種である。

【００４７】抗体作成と免疫ブロツト法 ｖｉｒＧ蛋白のＣ末端２３アミノ酸残基に相当する１０
８０残基１１０２残基までのペプチド（ＶＳＱＱＬＧＮ
ＮＳＹＲＤＴＱＧＧＩＬＧＶＫＹＴＦ）を合成し、それ
をベンチジンを用いてｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔへ
モシアニンの結合したものによつてウサギを免疫し、こ
のオリゴペプチドに特異的な抗血清（ＶＲＧ−Ｃ）を作
った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから溶出した抗原に対する免疫
ブロツト法はＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３：６２
７−６３５（１９８９）により行った。一本のレーンに
のせた全菌体溶解液試料は３７°培養新鮮菌体３×１０
⁹をＳＤＳ−サンプル緩衝液で溶解したものである。

【００４８】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：８８
７−８９３（１９９１）によりＲＮＡを分離しドツトブ
ロツト法を行った。ＲＮＡドツトハイブリダイゼーショ
ンに際しては３２ＰラベルしたＤＮＡドツトをＡＭＢＩ
Ｓ放射能解析イメージングシステム（ＡＭＢＩＳ）によ
り計測した。

【００４９】Ｔ７プロモーターポリメラーゼ発現系 ｖｉｒＫ遺伝子をもつＤＮＡ断片をｐＰＤ１のような少
数コピー数Ｔ７発現ベクターを用いて、ｐＰＤ１のＳｍ
ａＩサイトにｖｉｒＫ遺伝子をコードしている１３７９
ｂｐからなるＢａl Ｉ断片を両方向にクローン化した。
出来上がったｐＰＤ１誘導体はラムダブロアージ上にあ
る１ａｃＰＯにより制御されるようにしたＴ７ポリメラ
ーゼ構造遺伝子をもったＢＬ２１株に導入した。菌はグ
ルコースを０．５％、チミンを１０ｍｃｇ／mlおよびメ
チオニンとシステインを除く１８種のアミノ酸を各々
０．０１％（重量／容量）を含有したＭ９培地で３７°
で培養した。

【００５０】菌培養がＡ６００値で約０．３になったと
きイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最
終濃度が１ｍＭになるように加えてＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の形質発現を誘導した。３７℃にて３０分後
リフアンピシンを最終濃度が４００ｍｃｇ／mlになるよ
うに加え、さらに３７℃にて３０分保温した。つぎに、
０．３ml分の菌液に１０ｍｃＣｉの（Ｌ−メチオニン
〔３５Ｓ〕：Ｌ−システイン〔３５Ｓ〕）（ＩＣＮ Ｒ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えて１０分保温し
た。菌を集菌し、ＳＤＳ２％（重量／容積）、β−メル
カプトエタノール１％（容積／容積）、Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ６０ｍＭおよびグリセロール１０％（重量／容積）を
含有した電気泳動サンプル緩衝液に溶解した。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる蛋白の解析はＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２：５８９−５９７（１９８８）の方法により行
った。

【００５１】実施例２ ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ変異株の作
出 前記で得られたｖｉｒＫ：：Ｔｎ１０ ３株（Ｖ８３
６、Ｖ９５６、Ｖ１０６０）の１つ、例えばＶ９５６よ
りＭａｌｏｙ＆Ｎｕｎｎが開発した培地を多少改変した
ものを用いてテトラサイクリン感受性株を分離した。こ
れにより得られた菌株はＴｎ１０の脱落に伴ってｖｉｒ
Ｋ遺伝子の欠失がおこったものであった。このようにし
て赤痢菌〔Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ＹＳＨ６００
０Ｔ株（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６巻、ｉｎ ｐ
ｒｅｓｓ（１９２２）、Ｎａｋａｔａ ｅｔ ａ
ｌ．）〕のｖｉｒＫ欠失変異株を作出した。

【００５２】Ｔｎ１０が野生型赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎ
ｅｒｉ ２ａ ２４５７Ｔ株）のｔｈｙＡ遺伝子に挿入
された（ｔｈｙＡ：：Ｔｎ１０）ＣＳ２１９１−１株を
作出した。このＣＳ２１９１−１株を供与菌、前記で作
出したＹＳＨ６０００ＴｖｉｒＫ欠失変異株を受容菌と
してＰ１フアージによる形質導入を行った。得られたテ
トラサイクリン耐性導入株は供与菌のｔｈｙＡ：：Ｔｎ
１０と受容菌のｔｈｙＡ遺伝子との間で相同的な組替え
を起こし、受容菌がｔｈｙＡ^- となったものである。本
ｔｈｙＡ：：Ｔｎ１０、ｖｉｒＫ欠失変異株より、Ｍａ
ｌｏｙ＆Ｎｕｎｎの方法に準じて再びテトラサイクリン
感受性株を分離した。これによって、ｔｈｙＡ、ｖｉｒ
Ｋの二重欠失変異株が作出された。

【００５３】実施例３ ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ変異株の赤
痢感染防御効果 ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ２重欠失赤痢ワクチン株による安全
性ならびに有効性の予備的検査はカニクイザルをワクチ
ン投与群と対照群各５頭を用いて行った。ワクチン投与
菌数は一回あたり約４×１０¹⁰で、１週間隔で合計３回
投与し、３回目投与４週後、強毒菌約４×１０¹⁰を投与
した。ワクチン投与前２４時間は絶食させ、麻酔して経
鼻カテーテルにより胃内に投与した。直腸採便によるワ
クチン株の検出はほぼ４日までみられた。

【００５４】ワクチン投与群では麻酔を伴う投与操作を
合計４回行い、投与中１頭ずつ拘束飼育し、便中のワク
チン株排菌検査のため直腸採便するなどの不安状態にさ
せたため、ストレスが激しく、剖検時胃内出血や潰瘍が
みられた。それに対し、対照群は解放飼育し、麻酔を伴
う投与操作は１回のみで、直腸採便も行っていないため
ストレス性障害は発生しなかった。以上のようにワクチ
ン投与群の方が対照群よりも明らかに一般状態が不良に
なる条件下における実験結果であるが、ワクチン投与群
５頭中、強毒菌投与後２日における便性は３頭は臨床的
に正常（その内１頭はその後事故死し、剖検により胃潰
瘍を認め、腸には全く病的所見を認めなかった）、２頭
は臨床的に発症、うち１頭は４日目までに死亡した（剖
検によれば胃出血を認めた）。

【００５５】対照群では５頭中、強毒投与後２日には全
例臨床的に発症し、うち２頭は４日目までに死亡した。
同じ発症例でも肉眼的観察によれば一般に便性は対照群
の方が悪かった。その結果は表１に示す。以上、前述の
実施例２で得た赤痢菌ｖｉｒＫ、ｔｈｙＡ２重変異株を
ワクチン株としてサルに投与した後に強毒菌で攻撃した
結果、ワクチン株投与群は非投与群に比して赤痢の臨床
症状が軽減された。

【００５６】

【表１】

【配列表】

【００５７】配列番号：１ 配列の長さ：１６４２ 起源：サル糞便に由来 生物名：Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ 株名：ＹＳＨ６０００ 配列 GCATGCATGA TGATGTTTTT ATTGCTGACA ATGTTTTTCC TGCCGCCCCC GTATATCGGG 60 TTGCCAGTCT GGTGGTTCTG CCTTCAGAAA ACGAATCGTT TGGTATGGTA CTGGCAGAAG 120 CATCGGCATT TTCTGTGCCT GTACTGGCCA GTCAGATTGG TGGAATCCCT GATGTTATTC 180 AGAATAACCA GACCGGGACA TTGTTACCAG CAGGTAATAA GCACGCATGG ATGTGCGCCC 240 TGAATGATTT TTTTAATGAC CCTGGGCGTT TTTATCAGAT GGCTCGCCAG GCAAAACAGG 300 ATATAGAAGA GCGGTTTGAT ATTAATAAAA CTGCGTTAAA AATACTCACA TTAGCGAAGC 360 ACAAGTAACA ATATGTTTTC TGTAAGTAAC TTATCATTT ATCGGTTTCC TTAAAAGGAT 419 M F S V S N L S F I G F L K R I 5 10 15 TGTTTTTTCC TCAGATTCAC TCCCGGGGAA GTGGGAACAC AGAAAATTCC GGTTCATG 477 V F S S D S L P G K W E H R K F R F M 20 25 30 35 TACATTTTGC GATGTGCTAT AAATCCGGTT GCCAGTATTC GATATTATTA CGAACTGCGT 537 Y I L R C A I N P V A S I R Y Y Y E L R 40 45 50 60 TCCTTGCAGT GCATTGAG GATATTCTGG CAATACAACC CACGTTGCCA GCAAGAATTC 595 S L Q C I E D I L A I Q P T L P A R L 65 70 75 ATCGACCTTA TTTGCATAAA GGGGGGCGAG CCTGGTCC CGGGGGCAAT ATATTCTTGA 653 H R P Y L H K G G R A W S R G Q Y I L E 80 85 90 95 GCATTATCGC TTTGTGCAAA ATTTGCCAGA AAAATATTCT GAATTTTTGT TTCCACAA 711 H Y R F V Q N L P E K Y S E F L F P Q 100 105 110 AAATCGGTAT CATTAGTCCA ATTCATCGGG AAAGATGGAG AGGATTTTGA TATCCAGTGT 771 K S V S L V Q F I G K D G E D F D I Q C 115 120 125 130 TCTCCCAGTG GTTTTGAC CGGGAAGGAG AGTTGATGTT GTCATTGTTT TTCAATAAAA 829 S P S G F D R E G E L M L S L F F N K 135 140 145 150 TAGTGATTGC CCGGTTAACA TTTTCAGTCA TTCTGACT CAAAATGGAC ACACCGCTTT 887 I V I A R L T F S V I L T Q N G H T A F 155 160 165 170 TATTGGCGGA TTACAGGGAG CCCCCAAAAA TACCGGACCT GATATTATTC GGTGCGCA 945 I G G L Q G A P K N T G P D I I R C A 175 180 185 190 ACCCGGGCCT GTTATGGGCT TTTCCCAAAA CGGATTATTT TTGAAGCATT TTGTGCGTTG 1005 T R A C Y G L F P K R I I F E A F C A L 195 200 205 210 ATGAAAGCTT GTAATGTC TCTGAGTGTC TGGCAGTCAG TGAGCACAGT CATGTTTTCC 1063 M K A C N V S E C L A V S E H S H V F 215 220 225 230 GGCAATTGAG ATACTGGTAT CAGAAACGCA AAACCTTT GTTGCTGTCT ACAGTGATTT 1121 R Q L R Y W Y Q K R K T F V A V Y S D F 235 240 245 250 CTGGGAGTCT GTAGCAGGGA AAACCTGTGG TGACTGGTAC AAATTACCAA CACAGGTG 1179 W E S V A G K T C G D W Y K L P T Q V 255 260 265 270 GTTCGAAAGC CGCTAAGCAA TATAGCTAGT AAAAAACGCT CTGAGTATCG AAAACGATAC 1239 V R K P L S N I A S K K R S E Y R K R Y 275 280 285 290 GCTTTGCTGG ATTATATC CATGAAACTG CTATCCGCTC TTTGGATGCA TATCCTGTAA 1297 A L L D Y I H E T A I R S L D A Y P V 295 300 305 ACTCAGAACA TCAGGACTTA AATTAAGGTT TGATGTATTC TCTGAATAAA ATATTAATGA 1357 N S E H Q D L N 310 315 TGATTTTGGT AGGGGCATTC GCACTAAATA ATGAAAAAAT ACAAATCCGA GTTTATTCCT 1417 GAATTTAAGA AAAATTATCT TTCCCCTGTT TACTGGTTTA CATGGTTCGT TTTGGGAATG 1477 ATTGCAGGTA TTTCAATGTT TCCCCCTTCA TTCAGAGATC CTGTCTTGGC CAAAATAGGG 1537 CGTTGGGTGG GCAGATTGAG CAGAAAAGCT CGTCGCAGGG CGACGATTAA TTTATCGCTT 1597 TGTTTCCCGG AAAAGAGTGA TACAGAACGG GAAATAATTG TCGAC 1642

【図面の簡単な説明】

【図１】ｖｉｒＫおよびｔｈｙＡのプラスミド及び染色
体上の位置を示すものである。

【図２】ｖｉｒＫのマッピングである。

【図３】Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉＹＳＨ６０００由来の３
菌株を接種後３時間におけるＭＫ２の光学顕微鏡写真で
ある。

【図４】菌接種後７２時間におけるＭＫ２細胞のＦｐ−
ｔｅｓｔの位相差顕微鏡写真である。

【図５】ＭＫ２細胞におけるＦ−アクチンと菌とのかか
わりである。

【図６】ＭＫ２細胞におけるＦ−アクチンと菌とのかか
わりである。

【図７】ＭＫ２細胞におけるＦ−アクチンと菌とのかか
わりである。

【図８】ｖｉｒＧ蛋白の免疫ブロツト法による解析結果
である。

【図９】ｖｉｒＧｍＲＮＡの産生量である。

【図１０】ｖｉｒＫ領域から発現した蛋白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/112 ＡＤＺ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/31 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｖｉｒＫおよび／またはｔｈｙＡ遺伝子
   を変異または欠失させた赤痢菌。
2. 【請求項２】 ｖｉｒＫおよび／またはｔｈｙＡ遺伝子
   を変異または欠失させた赤痢ワクチン株。
3. 【請求項３】 請求項１または２の赤痢菌または赤痢ワ
   クチン株より製造された赤痢ワクチン。
4. 【請求項４】 下記の配列を有するｖｉｒＫ遺伝子。 GCATGCATGA TGATGTTTTT ATTGCTGACA ATGTTTTTCC TGCCGCCCCC GTATATCGGG 60 TTGCCAGTCT GGTGGTTCTG CCTTCAGAAA ACGAATCGTT TGGTATGGTA CTGGCAGAAG 120 CATCGGCATT TTCTGTGCCT GTACTGGCCA GTCAGATTGG TGGAATCCCT GATGTTATTC 180 AGAATAACCA GACCGGGACA TTGTTACCAG CAGGTAATAA GCACGCATGG ATGTGCGCCC 240 TGAATGATTT TTTTAATGAC CCTGGGCGTT TTTATCAGAT GGCTCGCCAG GCAAAACAGG 300 ATATAGAAGA GCGGTTTGAT ATTAATAAAA CTGCGTTAAA AATACTCACA TTAGCGAAGC 360 ACAAGTAACA ATATGTTTTC TGTAAGTAAC TTATCATTT ATCGGTTTCC TTAAAAGGAT 419 M F S V S N L S F I G F L K R I 5 10 15 TGTTTTTTCC TCAGATTCAC TCCCGGGGAA GTGGGAACAC AGAAAATTCC GGTTCATG 477 V F S S D S L P G K W E H R K F R F M 20 25 30 35 TACATTTTGC GATGTGCTAT AAATCCGGTT GCCAGTATTC GATATTATTA CGAACTGCGT 537 Y I L R C A I N P V A S I R Y Y Y E L R 40 45 50 60 TCCTTGCAGT GCATTGAG GATATTCTGG CAATACAACC CACGTTGCCA GCAAGAATTC 595 S L Q C I E D I L A I Q P T L P A R L 65 70 75 ATCGACCTTA TTTGCATAAA GGGGGGCGAG CCTGGTCC CGGGGGCAAT ATATTCTTGA 653 H R P Y L H K G G R A W S R G Q Y I L E 80 85 90 95 GCATTATCGC TTTGTGCAAA ATTTGCCAGA AAAATATTCT GAATTTTTGT TTCCACAA 711 H Y R F V Q N L P E K Y S E F L F P Q 100 105 110 AAATCGGTAT CATTAGTCCA ATTCATCGGG AAAGATGGAG AGGATTTTGA TATCCAGTGT 771 K S V S L V Q F I G K D G E D F D I Q C 115 120 125 130 TCTCCCAGTG GTTTTGAC CGCGAAGGAG AGTTGATGTT GTCATTGTTT TTCAATAAAA 829 S P S G F D R E G E L M L S L F F N K 135 140 145 150 TAGTGATTGC CCGGTTAACA TTTTCAGTCA TTCTGACT CAAAATGGAC ACACCGCTTT 887 I V I A R L T F S V I L T Q N G H T A F 155 160 165 170 TATTGGCGGA TTACAGGGAG CCCCCAAAAA TACCGGACCT GATATTATTC GGTGCGCA 945 I G G L Q G A P K N T G P D I I R C A 175 180 185 190 ACCCGGGCCT GTTATGGGCT TTTCCCAAAA CGGATTATTT TTGAAGCATT TTGTGCGTTG 1005 T R A C Y G L F P K R I I F E A F C A L 195 200 205 210 ATGAAAGCTT GTAATGTC TCTGAGTGTC TGGCAGTCAG TGAGCACAGT CATGTTTTCC 1063 M K A C N V S E C L A V S E H S H V F 215 220 225 230 GGCAATTGAG ATACTGGTAT CAGAAACGCA AAACCTTT GTTGCTGTCT ACAGTGATTT 1121 R Q L R Y W Y Q K R K T F V A V Y S D F 235 240 245 250 CTGGGAGTCT GTAGCAGGGA AAACCTGTGG TGACTGGTAC AAATTACCAA CACAGGTG 1179 W E S V A G K T C G D W Y K L P T Q V 255 260 265 270 GTTCGAAAGC CGCTAAGCAA TATAGCTAGT AAAAAACGCT CTGAGTATCG AAAACGATAC 1239 V R K P L S N I A S K K R S E Y R K R Y 275 280 285 290 GCTTTGCTGG ATTATATC CATGAAACTG CTATCCGCTC TTTGGATGCA TATCCTGTAA 1297 A L L D Y I H E T A I R S L D A Y P V 295 300 305 ACTCAGAACA TCAGGACTTA AATTAAGGTT TGATGTATTC TCTGAATAAA ATATTAATGA 1357 N S E H Q D L N 310 315 TGATTTTGGT AGGGGCATTC GCACTAAATA ATGAAAAAAT ACAAATCCGA GTTTATTCCT 1417 GAATTTAAGA AAAATTATCT TTCCCCTGTT TACTGGTTTA CATGGTTCGT TTTGGGAATG 1477 ATTGCAGGTA TTTCAATGTT TCCCCCTTCA TTCAGAGATC CTGTCTTGGC CAAAATAGGG 1537 CGTTGGGTGG GCAGATTGAG CAGAAAAGCT CGTCGCAGGG CGACGATTAA TTTATCGCTT 1597 TGTTTCCCGG AAAAGAGTGA TACAGAACGG GAAATAATTG TCGAC 1642
5. 【請求項５】 ｖｉｒＫが請求項４の配列である請求項
   １、２または３の赤痢菌または赤痢ワクチン株。
6. 【請求項６】 赤痢菌がShigella boydii 、Shigella d
   esenteriae、Shigella flexneri またはShigella sonne
   i である請求項１、または３の赤痢菌。
7. 【請求項７】 ｖｉｒＫおよび／またはｔｈｙＡ遺伝子
   を変異または欠失させることを特徴とする赤痢ワクチン
   株の製造法。