JP3054440B2 - 生ワクチン - Google Patents
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- JP3054440B2 JP3054440B2 JP3506347A JP50634791A JP3054440B2 JP 3054440 B2 JP3054440 B2 JP 3054440B2 JP 3506347 A JP3506347 A JP 3506347A JP 50634791 A JP50634791 A JP 50634791A JP 3054440 B2 JP3054440 B2 JP 3054440B2
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- vaccine
- bacterium
- salmonella
- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、弱毒化した微生物、その生産方法、動物や
人間での免疫予防的使用法、及びワクチンに関する。
人間での免疫予防的使用法、及びワクチンに関する。
ワクチン接種や免疫予防の背景となる原理は病原生物
の弱毒株を接種することに依り動物に免疫応答を引き起
こし、その後の感染に対して防御することである。
の弱毒株を接種することに依り動物に免疫応答を引き起
こし、その後の感染に対して防御することである。
1950年にベーコンらは（Br.J.Exp.Path.第31巻、714
−724頁）或る種のチフス菌（S.styfi）株の栄養要求変
異体が親株と比べマウスの内で弱毒化していることを示
している。これらの栄養要求変異体の或るものは全細胞
ワクチンの元になる候補として適しているものと提案さ
れてきた。（例えばホシィースとストッカーのNature,1
981年，第241巻,238−239頁及び欧州特許公開公報第32
2,237号を参照のこと）。本質的な栄養要求性経路にお
ける変異の外に、他の遺伝子坐にも微生物が弱毒化する
変異が起こることが示されている。その様な遺伝子坐の
例として多形質発現効果を示すレギュロン（regulons）
例えばcya/crpシステム（ロイ・クルティスIIIらのVacc
ine第６巻、155〜160頁、1988年）及びOmpRenvZシステ
ム（ドーマンらのInfect.Immun.第57巻、2136−2140
頁、1989年）及びpho Rシステム（フィールズらScience
第243巻、1059−1062頁、1989年）がある。
−724頁）或る種のチフス菌（S.styfi）株の栄養要求変
異体が親株と比べマウスの内で弱毒化していることを示
している。これらの栄養要求変異体の或るものは全細胞
ワクチンの元になる候補として適しているものと提案さ
れてきた。（例えばホシィースとストッカーのNature,1
981年，第241巻,238−239頁及び欧州特許公開公報第32
2,237号を参照のこと）。本質的な栄養要求性経路にお
ける変異の外に、他の遺伝子坐にも微生物が弱毒化する
変異が起こることが示されている。その様な遺伝子坐の
例として多形質発現効果を示すレギュロン（regulons）
例えばcya/crpシステム（ロイ・クルティスIIIらのVacc
ine第６巻、155〜160頁、1988年）及びOmpRenvZシステ
ム（ドーマンらのInfect.Immun.第57巻、2136−2140
頁、1989年）及びpho Rシステム（フィールズらScience
第243巻、1059−1062頁、1989年）がある。
多くの微生物では、高温や養分喪失や有毒な酸素ラジ
カルや代謝阻害の様ないろいろな環境ストレスに応答し
て、１〜２ダースのタンパク質が産生される。これらの
ものは、微生物が受ける特定のストレスに応じて誘導さ
れた様々な遺伝子の調節の一部分を表わしている。主要
ストレスタンパク質（ヒートショックタンパク質として
も知られている）のファミリーは自然界で最も高度に保
存されているものである。大腸菌、ショウジョウバエ
（Drosophilia spp.）及び人間から分離されたヒートシ
ョックタンパク質において、かなりの相同性がある（最
近の総説にナィドハルトG.Cとヴァン・ボーゲレンR.Aの
1987年版“大腸菌とネズミチフス菌":「細胞と分子生物
学」F.C.ナイドハルトら編集、1334〜1345頁、米国微生
物学会出版、ワシントンD.C）。例えば:Hsp 90,Hsp 70
及びHsp 60がすべての原核生物及び真核生物に見られる
ヒートショックタンパク質である。大腸菌及び人間のHs
p 90のアミノ酸配列の比較で、アミノ酸残基の約半数が
同じである。他のストレスタンパク質のファミリーのも
のはGrp E,Gro EL,Dna K,Gro Es,Lon及びDna Jである。
カルや代謝阻害の様ないろいろな環境ストレスに応答し
て、１〜２ダースのタンパク質が産生される。これらの
ものは、微生物が受ける特定のストレスに応じて誘導さ
れた様々な遺伝子の調節の一部分を表わしている。主要
ストレスタンパク質（ヒートショックタンパク質として
も知られている）のファミリーは自然界で最も高度に保
存されているものである。大腸菌、ショウジョウバエ
（Drosophilia spp.）及び人間から分離されたヒートシ
ョックタンパク質において、かなりの相同性がある（最
近の総説にナィドハルトG.Cとヴァン・ボーゲレンR.Aの
1987年版“大腸菌とネズミチフス菌":「細胞と分子生物
学」F.C.ナイドハルトら編集、1334〜1345頁、米国微生
物学会出版、ワシントンD.C）。例えば:Hsp 90,Hsp 70
及びHsp 60がすべての原核生物及び真核生物に見られる
ヒートショックタンパク質である。大腸菌及び人間のHs
p 90のアミノ酸配列の比較で、アミノ酸残基の約半数が
同じである。他のストレスタンパク質のファミリーのも
のはGrp E,Gro EL,Dna K,Gro Es,Lon及びDna Jである。
ヒートショックタンパク質のファミリーをコードする
遺伝子は、rpo H遺伝子の産物であるσ32因子と共作用
するRNAポリメラーゼによって転写される（ナイドハル
トF.C.及びヴァン・ボーゲルンR.Aによる1987年度総
説、“大腸菌とネズミチフス菌":「細胞と分子生物学」
ナイドハルトF.C.ら編集、1334〜1345頁、米国微生物学
会出版、ワシントンD.C）。最近リピンスカら（Nuclei
c.Acids.Res.1988年、第21巻、10053〜10067頁）がσ32
−非依存と思われるHtr Aとして大腸菌の或るヒートシ
ョックタンパク質を述べている。htr A遺伝子のプロモ
ーター領域を調べてrpo H遺伝子のP.3プロモーターとDN
A塩基配列の相同性があることを示しており、このプロ
モーターはσＥ（σ24）因子に認識されることが知られ
ている。この類似性はhtr AプロモーターもRNAポリメラ
ーゼのσＥ（σ24）ホロ酵素に認識されるのかも知れな
いことを示唆している。
遺伝子は、rpo H遺伝子の産物であるσ32因子と共作用
するRNAポリメラーゼによって転写される（ナイドハル
トF.C.及びヴァン・ボーゲルンR.Aによる1987年度総
説、“大腸菌とネズミチフス菌":「細胞と分子生物学」
ナイドハルトF.C.ら編集、1334〜1345頁、米国微生物学
会出版、ワシントンD.C）。最近リピンスカら（Nuclei
c.Acids.Res.1988年、第21巻、10053〜10067頁）がσ32
−非依存と思われるHtr Aとして大腸菌の或るヒートシ
ョックタンパク質を述べている。htr A遺伝子のプロモ
ーター領域を調べてrpo H遺伝子のP.3プロモーターとDN
A塩基配列の相同性があることを示しており、このプロ
モーターはσＥ（σ24）因子に認識されることが知られ
ている。この類似性はhtr AプロモーターもRNAポリメラ
ーゼのσＥ（σ24）ホロ酵素に認識されるのかも知れな
いことを示唆している。
大腸菌での表現型として、htr A遺伝子坐の変異は、
細菌が42℃以上の温度で生き延びる能力を失うことにな
る（リピンスカら、1989年J.Bacterial第171巻、1574−
1584頁）。この遺伝子は大腸菌染色体の上で4minの所に
位置し、相対分子量（Mr）51,163のタンパク質をコード
している。このタンパク質の前駆体は、シグナルペプチ
ドを取り除き、細菌の内膜を通した分泌で成熟したポリ
ペプチドを作るＮ−末端プロセシングを受ける（リピン
スカら、1988年、Nucleic.Acids.Res.第21巻、10053〜1
0067頁）。別個に、プロテアーゼ活性の低下した大腸菌
変異体を調べていたストラウチュK.LとベックウイズＪ
によって（1988年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻、15
76〜1580頁）htr A遺伝子は、deg Pと同定されており、
deg P変異体はTn pho A変異導入により単離され（マノ
イルＣとベックウイズＪ、1985年 Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第82巻、8129−8133頁）、deg Pを背景にハイブ
リッドTsrphoA（Tsr−AP2）組換えタンパク質の安定性
が向上していることによって認められた（ストラウチュ
K.L.とベックウィズＪ、1988年 Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、第85巻、1576〜1680頁）。大腸菌で、deg Pとhtr A
として同定された遺伝子は同じものと思われ、“ストレ
ス−応答”ファミリーの一つのタンパク質をコードして
いる。
細菌が42℃以上の温度で生き延びる能力を失うことにな
る（リピンスカら、1989年J.Bacterial第171巻、1574−
1584頁）。この遺伝子は大腸菌染色体の上で4minの所に
位置し、相対分子量（Mr）51,163のタンパク質をコード
している。このタンパク質の前駆体は、シグナルペプチ
ドを取り除き、細菌の内膜を通した分泌で成熟したポリ
ペプチドを作るＮ−末端プロセシングを受ける（リピン
スカら、1988年、Nucleic.Acids.Res.第21巻、10053〜1
0067頁）。別個に、プロテアーゼ活性の低下した大腸菌
変異体を調べていたストラウチュK.LとベックウイズＪ
によって（1988年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻、15
76〜1580頁）htr A遺伝子は、deg Pと同定されており、
deg P変異体はTn pho A変異導入により単離され（マノ
イルＣとベックウイズＪ、1985年 Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第82巻、8129−8133頁）、deg Pを背景にハイブ
リッドTsrphoA（Tsr−AP2）組換えタンパク質の安定性
が向上していることによって認められた（ストラウチュ
K.L.とベックウィズＪ、1988年 Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、第85巻、1576〜1680頁）。大腸菌で、deg Pとhtr A
として同定された遺伝子は同じものと思われ、“ストレ
ス−応答”ファミリーの一つのタンパク質をコードして
いる。
本発明は、その弱毒性が、環境的ストレスに応じて産
生される蛋白質をコードする或いはコードDNAの発現を
調節する微生物のDNAにおける変異によってもたらされ
ている、免疫予防に用いる弱毒化微生物、異種抗原をコ
ードしているDNAを随意に発現出来る微生物を提供する
ものである。
生される蛋白質をコードする或いはコードDNAの発現を
調節する微生物のDNAにおける変異によってもたらされ
ている、免疫予防に用いる弱毒化微生物、異種抗原をコ
ードしているDNAを随意に発現出来る微生物を提供する
ものである。
本発明で用いる微生物は、好ましくは細菌であり、特
に真核細胞の中に侵入し成育しムスコサル（muscosal）
表面を住み場とするグラム陰性細菌である。これらの具
体例としてサルモネラ属、ボルデェテラ属、ヴィブリオ
属、ハエモフィラス属及びエッシャリヒィア属のメンバ
ーが含まれる。特に、次の種、即ちチフス菌（S.typh
i）−人の腸チフスを起こす；ネズミチフス菌（S.typhi
murium）−幾つかの動物種にサルモネラ症を起こす；サ
ルモネラ・エンテリティディス−人に食中毒を起こす；
サルモネラ・コレラエスイス−ブタにサルモネラ症を起
こす；百日咳菌（ボルデェテラ・ペルタスシス）−百日
ぜきを起こす；インフルエンザ菌（ハエモフィラス・イ
ンフルエンザエ）−髄膜炎を起こす：及びナイセリア・
ゴノールローアエー淋疾を起こす：などが挙げられる。
に真核細胞の中に侵入し成育しムスコサル（muscosal）
表面を住み場とするグラム陰性細菌である。これらの具
体例としてサルモネラ属、ボルデェテラ属、ヴィブリオ
属、ハエモフィラス属及びエッシャリヒィア属のメンバ
ーが含まれる。特に、次の種、即ちチフス菌（S.typh
i）−人の腸チフスを起こす；ネズミチフス菌（S.typhi
murium）−幾つかの動物種にサルモネラ症を起こす；サ
ルモネラ・エンテリティディス−人に食中毒を起こす；
サルモネラ・コレラエスイス−ブタにサルモネラ症を起
こす；百日咳菌（ボルデェテラ・ペルタスシス）−百日
ぜきを起こす；インフルエンザ菌（ハエモフィラス・イ
ンフルエンザエ）−髄膜炎を起こす：及びナイセリア・
ゴノールローアエー淋疾を起こす：などが挙げられる。
DNAの変異は非復帰性の変異、即ち単一ステップでは
修復出来ないような変異である。この種の遺伝学的変異
は、欠失（deletion）、逆位（inversion）、挿入（ins
ertion）或いは置換（substitution）による変異が含ま
れる。欠失変異（deletion mutation）はトランスポゾ
ンを用いて生ずることが出来る。これは宿主の染色体DN
Aに取り込まれる750〜数千塩基対からなるDNA配列であ
る。関心ある一連のDNA配列はこの様にして遺伝子機能
を失くすことによって破壊される。トランスポゾンは宿
主の染色体DNAから削除し得る；即ち最も屡々起こる切
除は、非復帰性の変異に不正確ながらつながっている。
置換又は挿入による変異は、組み換えを起こすベクター
の上の不活性化PNA配列を用いる或いは宿主染色体DNA内
の関心あるDNA配列と交叉し結果として遺伝子機能を喪
失することにより生じ得る。
修復出来ないような変異である。この種の遺伝学的変異
は、欠失（deletion）、逆位（inversion）、挿入（ins
ertion）或いは置換（substitution）による変異が含ま
れる。欠失変異（deletion mutation）はトランスポゾ
ンを用いて生ずることが出来る。これは宿主の染色体DN
Aに取り込まれる750〜数千塩基対からなるDNA配列であ
る。関心ある一連のDNA配列はこの様にして遺伝子機能
を失くすことによって破壊される。トランスポゾンは宿
主の染色体DNAから削除し得る；即ち最も屡々起こる切
除は、非復帰性の変異に不正確ながらつながっている。
置換又は挿入による変異は、組み換えを起こすベクター
の上の不活性化PNA配列を用いる或いは宿主染色体DNA内
の関心あるDNA配列と交叉し結果として遺伝子機能を喪
失することにより生じ得る。
環境的ストレスに応じて産生されるタンパク質の例と
してヒートショックタンパク質（42℃以上の温度上昇に
応じて産生される）；栄養分欠損タンパク質（リン酸塩
や窒素化合物の如き必須栄養分が微生物の生存に必要な
量以下であるレベルに応じて産生される）；毒物ストレ
スタンパク質（染料、酸、或いは）ことによると植物の
滲出物の如き毒性化合物に応じて産生される）：或いは
代謝危機タンパク質（例えば微生物の浸透圧調節〔osmo
regulate〕能力に影響するイオンのレベル、ビタミン或
いは代謝機構を妨げるような共因子のレベルの上下変動
に応じて産生される）が挙げられる。
してヒートショックタンパク質（42℃以上の温度上昇に
応じて産生される）；栄養分欠損タンパク質（リン酸塩
や窒素化合物の如き必須栄養分が微生物の生存に必要な
量以下であるレベルに応じて産生される）；毒物ストレ
スタンパク質（染料、酸、或いは）ことによると植物の
滲出物の如き毒性化合物に応じて産生される）：或いは
代謝危機タンパク質（例えば微生物の浸透圧調節〔osmo
regulate〕能力に影響するイオンのレベル、ビタミン或
いは代謝機構を妨げるような共因子のレベルの上下変動
に応じて産生される）が挙げられる。
好ましくはヒートショックタンパク質は図１（SEQID
No:1）（deg Pとも記述される）に示した様なhtr A遺
伝子にコードされるタンパク質である。他のタンパク質
はgrp E、gro EL、（moPA）、dna K、gro ES、lon及びd
na Jの如きストレス応答に関与しているのが知られてい
る遺伝子にコードされている。環境的ストレスに応じて
誘導されることの知られている遺伝子にコードされてい
るタンパク質が他にも多くある（ロンソンらCell 第49
巻、579−581頁）。これらの中で、次のものが挙げられ
る；即ち窒素喪失に応じて誘導され積極的にgln A及びn
if LAを調節する大腸菌のntr B/ntr Cシステム（バック
らNature 第320巻、374−378頁、1986年；ヒルシュマ
ンらProc.Natl.Acad.Sci.USA、82巻、7525頁、1985年；
ニクソンらProc.Natl.Acad.Sci.USA、第83巻、7850−78
54頁、1986年；ライツァーとマガンサニクCell、第45
巻、785頁、1986年）；リン酸塩喪失に応じて誘導され
る大腸菌のpho R/pho Bシステム（マキノらJ.Mol.Bio
l、第192巻549−556頁、1986b）；染料や他の有毒化合
物に応答して誘導される大腸菌のcpx A/sfr Aシステム
（アルビンらJ.Biol.Chem.第261巻、4698頁、1986年；
ドゥルーリィーらJ.Biol.Chem.第260巻、4236−4272
頁、1985年）である。根粒菌での類似のシステムはdct
B/dct Dで、これは4C−デイスカルボン酸〔4C−discarb
oxylic acids〕に応答している（ロンソンらJ.Bacterio
l.第169巻、2424頁及びCell第49巻、579−581頁）。こ
の型の毒性のシステムが癌腫菌（Agrobacterium）で述
べられてきた。これは植物滲出物に応答して誘導される
vir A/vir Gシステムである（レ・ロークスらEMBO Ｊ
第６巻、849−856頁、1987年；スタセルとザンブリスキ
ィーAm.J.Vet.Res.第45巻、59−66頁、1986年；ウィナ
ンスらProc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、8278頁、1986
年）。同じ様に百日咳菌でのbvg C−bvg Aシステム（先
にvirとして知られている）がMg2+やニコチン酸のレベ
ルの上下変動に応答して毒性決定因子の産生を調節して
いる。
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伝子にコードされるタンパク質である。他のタンパク質
はgrp E、gro EL、（moPA）、dna K、gro ES、lon及びd
na Jの如きストレス応答に関与しているのが知られてい
る遺伝子にコードされている。環境的ストレスに応じて
誘導されることの知られている遺伝子にコードされてい
るタンパク質が他にも多くある（ロンソンらCell 第49
巻、579−581頁）。これらの中で、次のものが挙げられ
る；即ち窒素喪失に応じて誘導され積極的にgln A及びn
if LAを調節する大腸菌のntr B/ntr Cシステム（バック
らNature 第320巻、374−378頁、1986年；ヒルシュマ
ンらProc.Natl.Acad.Sci.USA、82巻、7525頁、1985年；
ニクソンらProc.Natl.Acad.Sci.USA、第83巻、7850−78
54頁、1986年；ライツァーとマガンサニクCell、第45
巻、785頁、1986年）；リン酸塩喪失に応じて誘導され
る大腸菌のpho R/pho Bシステム（マキノらJ.Mol.Bio
l、第192巻549−556頁、1986b）；染料や他の有毒化合
物に応答して誘導される大腸菌のcpx A/sfr Aシステム
（アルビンらJ.Biol.Chem.第261巻、4698頁、1986年；
ドゥルーリィーらJ.Biol.Chem.第260巻、4236−4272
頁、1985年）である。根粒菌での類似のシステムはdct
B/dct Dで、これは4C−デイスカルボン酸〔4C−discarb
oxylic acids〕に応答している（ロンソンらJ.Bacterio
l.第169巻、2424頁及びCell第49巻、579−581頁）。こ
の型の毒性のシステムが癌腫菌（Agrobacterium）で述
べられてきた。これは植物滲出物に応答して誘導される
vir A/vir Gシステムである（レ・ロークスらEMBO Ｊ
第６巻、849−856頁、1987年；スタセルとザンブリスキ
ィーAm.J.Vet.Res.第45巻、59−66頁、1986年；ウィナ
ンスらProc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、8278頁、1986
年）。同じ様に百日咳菌でのbvg C−bvg Aシステム（先
にvirとして知られている）がMg2+やニコチン酸のレベ
ルの上下変動に応答して毒性決定因子の産生を調節して
いる。
生ワクチンの形で使用するには、本発明の弱毒化微生
物が有毒状態に復帰しないことが明らかに重要である。
このことが単一DNA配列内での変異の起こる可能性は小
さいと考えられる。しかしながら二つの別々のDNA配列
の各々における変異によって弱毒化された微生物に復帰
の起こる危険性は、僅かであると考えられる。それ故に
本発明の微生物の弱毒化は、環境的ストレスに応じて産
生されるタンパク質をコードしている或いはコードDNA
の発現を調節しているDNA配列に変異を入れること及び
第２のDNA配列に変異を入れることによって、もたらさ
れることが好ましい。細菌にとって、第２のDNA配列
は、好ましくは必須の栄養要求性経路に関与する酵素を
コードしている或いは浸透圧的応答の遺伝子の調節を行
う産物の塩基配列即ちomp Rである（Infect and Immun.
1989年 2136−2140頁）。最も好ましくは、変異は芳香
族アミノ酸生合成経路に関与するDNA配列内にあり、一
層特別に好ましくはaro A、aro C又はaro Dをコードす
るDNA配列である。（EP公開公報番号322237）。
物が有毒状態に復帰しないことが明らかに重要である。
このことが単一DNA配列内での変異の起こる可能性は小
さいと考えられる。しかしながら二つの別々のDNA配列
の各々における変異によって弱毒化された微生物に復帰
の起こる危険性は、僅かであると考えられる。それ故に
本発明の微生物の弱毒化は、環境的ストレスに応じて産
生されるタンパク質をコードしている或いはコードDNA
の発現を調節しているDNA配列に変異を入れること及び
第２のDNA配列に変異を入れることによって、もたらさ
れることが好ましい。細菌にとって、第２のDNA配列
は、好ましくは必須の栄養要求性経路に関与する酵素を
コードしている或いは浸透圧的応答の遺伝子の調節を行
う産物の塩基配列即ちomp Rである（Infect and Immun.
1989年 2136−2140頁）。最も好ましくは、変異は芳香
族アミノ酸生合成経路に関与するDNA配列内にあり、一
層特別に好ましくはaro A、aro C又はaro Dをコードす
るDNA配列である。（EP公開公報番号322237）。
本発明の弱毒化微生物は、当業界での技術を持った者
なら誰でも知っている方法（マニアティス、モリキュラ
ー・クローニング・アンド・ラボラトリー・マニュア
ル、1982年）を用いてDNAに変異を導入することによっ
て構築される。非復帰性変異は、例えばネズミチフス菌
株へハイブリッド トランスポゾン Tn pho Aを導入
することにより生じさせ得る。Tn pho Aは細胞周辺質
の或いは膜のタンパク質にアルカリホスファターゼの酵
素的に活性なタンパク質の融合したものを作ることが出
来る。Tn pho Aトランスポゾンはカナマイシン耐性を
コードした遺伝子を持っている。適当な選抜培地の上で
コロニーを成育させることによりカナマイシン耐性の形
質導入体（transductant）を選抜する。
なら誰でも知っている方法（マニアティス、モリキュラ
ー・クローニング・アンド・ラボラトリー・マニュア
ル、1982年）を用いてDNAに変異を導入することによっ
て構築される。非復帰性変異は、例えばネズミチフス菌
株へハイブリッド トランスポゾン Tn pho Aを導入
することにより生じさせ得る。Tn pho Aは細胞周辺質
の或いは膜のタンパク質にアルカリホスファターゼの酵
素的に活性なタンパク質の融合したものを作ることが出
来る。Tn pho Aトランスポゾンはカナマイシン耐性を
コードした遺伝子を持っている。適当な選抜培地の上で
コロニーを成育させることによりカナマイシン耐性の形
質導入体（transductant）を選抜する。
択一的な方法は、ベクター例えばプラスミド或いはコ
スミドにDNA配列をクローニングすること、クローン化
したDNA配列に選抜マーカー遺伝子を挿入すること、そ
の結果遺伝子の不活性化されること、を含んでいる。不
活性化したDNA配列及び別の選抜マーカーを持つプラス
ミドは、公知の技術（マニアティス、モリキュラー・ク
ローニング・アンド・ラボラトリー・マニュアル、1982
年）を用いて生物に導入することが出来る。それから、
不活性DNA配列が微生物の染色体の中へ組み換えを起こ
し入って行き、野性型DNA配列が対立遺伝子交換で知ら
れる工程を経て非機能性になっていることを同定するこ
とが適当な選抜にて可能である。特に、使用するベクタ
ーは、好ましくは微生物の内で不安定であり、自然に失
くなってしまうであろう。プラスミド上の変異DNA配列
及び野性型DNA配列は遺伝学的交叉によって変換される
かも知れない。補足的な方法はワクチン株の変異部位に
外来性DNAを導入することを除いている。
スミドにDNA配列をクローニングすること、クローン化
したDNA配列に選抜マーカー遺伝子を挿入すること、そ
の結果遺伝子の不活性化されること、を含んでいる。不
活性化したDNA配列及び別の選抜マーカーを持つプラス
ミドは、公知の技術（マニアティス、モリキュラー・ク
ローニング・アンド・ラボラトリー・マニュアル、1982
年）を用いて生物に導入することが出来る。それから、
不活性DNA配列が微生物の染色体の中へ組み換えを起こ
し入って行き、野性型DNA配列が対立遺伝子交換で知ら
れる工程を経て非機能性になっていることを同定するこ
とが適当な選抜にて可能である。特に、使用するベクタ
ーは、好ましくは微生物の内で不安定であり、自然に失
くなってしまうであろう。プラスミド上の変異DNA配列
及び野性型DNA配列は遺伝学的交叉によって変換される
かも知れない。補足的な方法はワクチン株の変異部位に
外来性DNAを導入することを除いている。
それ故に、本発明は、環境的ストレスに応答して産生
するタンパク質をコードしている、或いはコードしてい
るDNA配列の発現を調節する微生物のDNA配列に次のいず
れかの方法即ち ａ）トラスポゾン変異又は ｂ）環境的ストレスに応答して産生するタンパク質をコ
ードしている或いはコードするDNA配列の発現を調節す
るDNA配列で非復帰性の変異を持っているDNA配列を用い
て微生物の形質転換を行なうことによって、微生物のDN
A配列へ変異を導入すること、 及び好ましい微生物を選抜スクリーニングすることから
構成される本発明の方法に従って弱族化微生物を生産す
る為の工程を提供するものである。
するタンパク質をコードしている、或いはコードしてい
るDNA配列の発現を調節する微生物のDNA配列に次のいず
れかの方法即ち ａ）トラスポゾン変異又は ｂ）環境的ストレスに応答して産生するタンパク質をコ
ードしている或いはコードするDNA配列の発現を調節す
るDNA配列で非復帰性の変異を持っているDNA配列を用い
て微生物の形質転換を行なうことによって、微生物のDN
A配列へ変異を導入すること、 及び好ましい微生物を選抜スクリーニングすることから
構成される本発明の方法に従って弱族化微生物を生産す
る為の工程を提供するものである。
本発明の弱毒化微生物は随意に異種抗原を発現する。
この発現はdeg Pの表現型と関連する組み換え抗原の安
定性を増した故に、htr A変体株でもっと好ましいもの
となっているようだ。かかる抗原として、ウイルス性、
細菌性、原生動物或いは高等な寄生性微生物であろう。
その様な微生物は、それから、二価又は多価のワクチン
の元を作り出す。有用な抗原の例として、大腸菌の熱不
安定性毒素Ｂユニット（LT−Ｂ）、大腸菌K88抗原、FMD
V（口・啼）のペプチド及びインフルエンザウィルスタ
ンパク質、百日咳菌からのP69タンパク質などが挙げら
れる。通常発現出来る他の抗原は、クラミドモナス属、
吸虫類、マイコプラズマ、線虫属、さなだ虫、ラビーウ
ィルス及びロタウィルスからのものであろう。
この発現はdeg Pの表現型と関連する組み換え抗原の安
定性を増した故に、htr A変体株でもっと好ましいもの
となっているようだ。かかる抗原として、ウイルス性、
細菌性、原生動物或いは高等な寄生性微生物であろう。
その様な微生物は、それから、二価又は多価のワクチン
の元を作り出す。有用な抗原の例として、大腸菌の熱不
安定性毒素Ｂユニット（LT−Ｂ）、大腸菌K88抗原、FMD
V（口・啼）のペプチド及びインフルエンザウィルスタ
ンパク質、百日咳菌からのP69タンパク質などが挙げら
れる。通常発現出来る他の抗原は、クラミドモナス属、
吸虫類、マイコプラズマ、線虫属、さなだ虫、ラビーウ
ィルス及びロタウィルスからのものであろう。
異種抗原をコードしているDNAを発現し得る微生物は
発現カセットを持って微生物の形質転換を行うことによ
って作り出せる。発現カセットは、異種抗原をコードし
たDNA配列の他に、転写及び翻訳の開始及び終止配列も
コードするDNA配列を含んでいる。発現カセットは調節
配列も含んでいてもよい。かかる発現カセットは当技術
分野でよく知られていて、それらの構築は当分野の技術
ある者の能力内で充分出来るものである。発現カセット
はベクター構造物或いは自然に生じるプラスミドの一部
分を形成するかも知れない。異種抗原を発現し得る遺伝
学的操作の弱毒化サルモネラ菌の例がEP公開公報127,15
3に開示されている。発現カセットは微生物の染色体に
異種遺伝子を取り込ませるのに使うことも出来るであろ
う。
発現カセットを持って微生物の形質転換を行うことによ
って作り出せる。発現カセットは、異種抗原をコードし
たDNA配列の他に、転写及び翻訳の開始及び終止配列も
コードするDNA配列を含んでいる。発現カセットは調節
配列も含んでいてもよい。かかる発現カセットは当技術
分野でよく知られていて、それらの構築は当分野の技術
ある者の能力内で充分出来るものである。発現カセット
はベクター構造物或いは自然に生じるプラスミドの一部
分を形成するかも知れない。異種抗原を発現し得る遺伝
学的操作の弱毒化サルモネラ菌の例がEP公開公報127,15
3に開示されている。発現カセットは微生物の染色体に
異種遺伝子を取り込ませるのに使うことも出来るであろ
う。
大腸菌の熱不安性胃腸障害毒素（エンテロトキシン）
サブユニットＢを発現出来る弱毒化チフス菌から成る二
価ワクチンがクレメンツらによって開示されている（In
fection ad Immunity,第46巻、No.2、1984年、564−569
頁）。
サブユニットＢを発現出来る弱毒化チフス菌から成る二
価ワクチンがクレメンツらによって開示されている（In
fection ad Immunity,第46巻、No.2、1984年、564−569
頁）。
弱毒化チフス菌株、Ty21aはシゲラ・ソネイ菌のＩ型
抗原の如き他の抗原を発現するのに使用されている（フ
ォーマルら、Infection and Immunity、第34巻、746−7
50頁、1981年）。
抗原の如き他の抗原を発現するのに使用されている（フ
ォーマルら、Infection and Immunity、第34巻、746−7
50頁、1981年）。
本発明の更なる態様に従えば、ここで述べる如く弱毒
化微生物、好ましくは細菌の有効な量と薬学的に受容し
得るキャリアーとから構成されるワクチンを提供するも
のである。
化微生物、好ましくは細菌の有効な量と薬学的に受容し
得るキャリアーとから構成されるワクチンを提供するも
のである。
ワクチンは患者に経口投与する為に好ましくは凍結乾
燥した形で、例えばカプセルに入れた形で提供される。
かかるカプセルは、例えばユードラゲイト“S" ユード
ラゲイト“L"セルロースアセテート、セルロース・フタ
レート、又はヒドロキシ・プロピルメチル・セルロース
からなる腸溶性コーティングとともに提供される。これ
らのカプセルはその様なものとして使えよう。或いは他
のやり方で、凍結乾燥したものを投与に先立ち、例えば
懸濁液として、水で元に戻し再構成されるであろう。再
構成は、好ましくは、微生物の生存を確保するのにふさ
わしいpHの緩衝液にてなし遂げられる。胃酸から弱毒化
細菌及びワクチンを守る為に、好ましくはワクチンの各
投与の前に炭酸水素ナトリウム調製物を投与しておく。
或いは、ワクチンは非経口投与、鼻経（intranasal）投
与或いは乳房内投与（intrammary）向きに調製されよ
う。
燥した形で、例えばカプセルに入れた形で提供される。
かかるカプセルは、例えばユードラゲイト“S" ユード
ラゲイト“L"セルロースアセテート、セルロース・フタ
レート、又はヒドロキシ・プロピルメチル・セルロース
からなる腸溶性コーティングとともに提供される。これ
らのカプセルはその様なものとして使えよう。或いは他
のやり方で、凍結乾燥したものを投与に先立ち、例えば
懸濁液として、水で元に戻し再構成されるであろう。再
構成は、好ましくは、微生物の生存を確保するのにふさ
わしいpHの緩衝液にてなし遂げられる。胃酸から弱毒化
細菌及びワクチンを守る為に、好ましくはワクチンの各
投与の前に炭酸水素ナトリウム調製物を投与しておく。
或いは、ワクチンは非経口投与、鼻経（intranasal）投
与或いは乳房内投与（intrammary）向きに調製されよ
う。
本発明は、また、微生物にて起こる感染で宿主（特に
人間宿主）を、本発明に従って有効な投与量のワクチン
を先述の宿主に投与することから構成される、予防的処
置を行う方法を提供するものである。その様な予防処置
方法に用いる投与量は、様々な臨床的因子、宿主の大き
さや体重、処法されたワクチンの型に依存するであろ
う。しかしながら、弱毒化されたチフス菌では１回投与
当り、109〜1010ケのチフス菌の投与量が、70kgの成人
宿主にとって一般に好都合である。
人間宿主）を、本発明に従って有効な投与量のワクチン
を先述の宿主に投与することから構成される、予防的処
置を行う方法を提供するものである。その様な予防処置
方法に用いる投与量は、様々な臨床的因子、宿主の大き
さや体重、処法されたワクチンの型に依存するであろ
う。しかしながら、弱毒化されたチフス菌では１回投与
当り、109〜1010ケのチフス菌の投与量が、70kgの成人
宿主にとって一般に好都合である。
以下に述べる実施例は、本発明に従って実験的な詳細
を提供するものである。これらの実施例は本発明を何ら
制限するものではないことは理解されるべきであろう。
を提供するものである。これらの実施例は本発明を何ら
制限するものではないことは理解されるべきであろう。
図の説明 図1.htr A遺伝子のDNA塩基配列とそこにコードされてい
るタンパク質のアミノ酸配列。
るタンパク質のアミノ酸配列。
図2.ネズミチフス菌のhtr A変異株046の42℃以上の温度
と酸素ラジカルに対する感受性。
と酸素ラジカルに対する感受性。
図3.htr Aに変異を持った株（BRD726）とhtr A aroの変
異を持った株（BRD807）のin vivoでのカイネティク
ス。
異を持った株（BRD807）のin vivoでのカイネティク
ス。
実施例１ ネズミチフス菌におけるhtr A遺伝子の同定とhtr A変異
株の作成 Tn pho Aの変異生成をマウスに有毒性のネズミチフ
ス菌株C5に行った（ミラーら、1989年 Infect.Immuno
l.第57巻、2758−2763頁）。
株の作成 Tn pho Aの変異生成をマウスに有毒性のネズミチフ
ス菌株C5に行った（ミラーら、1989年 Infect.Immuno
l.第57巻、2758−2763頁）。
変異体は、単一ペプチド配列、例えば細菌の膜を通し
て標的にされそうなタンパク質の遺伝子に損傷を持って
いそうなものを選んだ。Tn pho A挿入に隣接したDNAの
分離によって挿入されて活性化している遺伝子を同定で
きる。このような遺伝子が分離されて、そのDNA塩基配
列は標準的な方法で決定した（図１、SEQ ID No:
1）。（マニアティスら、1982年「モリキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリーマニュアル」コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク；サンガーら、1977
年 Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第74巻、5463−5467
頁）。翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列をEMBLデー
タベースに収録されているアミノ酸配列と比較して、驚
くべきことに大腸菌からのhtr A産物のアミノ酸配列
（図１、SEQ ID No:1）と88％の相同性があることが
わかった。
て標的にされそうなタンパク質の遺伝子に損傷を持って
いそうなものを選んだ。Tn pho A挿入に隣接したDNAの
分離によって挿入されて活性化している遺伝子を同定で
きる。このような遺伝子が分離されて、そのDNA塩基配
列は標準的な方法で決定した（図１、SEQ ID No:
1）。（マニアティスら、1982年「モリキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリーマニュアル」コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・ス
プリング・ハーバー、ニューヨーク；サンガーら、1977
年 Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第74巻、5463−5467
頁）。翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列をEMBLデー
タベースに収録されているアミノ酸配列と比較して、驚
くべきことに大腸菌からのhtr A産物のアミノ酸配列
（図１、SEQ ID No:1）と88％の相同性があることが
わかった。
実施例２ ネズミチフス菌のhtr Aがストレス−応答に含まれる遺
伝子であることの同定 htr A遺伝子に損傷を持つ大腸菌変異株は42℃以上の
温度で成育出来ない。ネズミチフス菌のhtr A変異株046
を高い温度で成育するかテストし、元の株C5と同様に成
育することがわかった。しかし、酸素ラジカルに対する
感受性テストで、変異株046は親株C5と比べて抵抗性が
低下していることがわかり、このことはその遺伝子が酸
素ラジカルのストレス−応答の様相に（少くとも部分的
に）関係している事を明らかに示している（図２を参照
せよ）。
伝子であることの同定 htr A遺伝子に損傷を持つ大腸菌変異株は42℃以上の
温度で成育出来ない。ネズミチフス菌のhtr A変異株046
を高い温度で成育するかテストし、元の株C5と同様に成
育することがわかった。しかし、酸素ラジカルに対する
感受性テストで、変異株046は親株C5と比べて抵抗性が
低下していることがわかり、このことはその遺伝子が酸
素ラジカルのストレス−応答の様相に（少くとも部分的
に）関係している事を明らかに示している（図２を参照
せよ）。
実施例３ 弱毒化したネズミチフス菌株046と有毒親株ネズミチフ
ス菌C5との比較 弱毒株はTn pho Aトランスポゾン変異化を以前に記
述したと同じ様に用いて構築した（ミラーら、1989年、
Infect.Immun.第57巻、2758−2763頁）。
ス菌C5との比較 弱毒株はTn pho Aトランスポゾン変異化を以前に記
述したと同じ様に用いて構築した（ミラーら、1989年、
Infect.Immun.第57巻、2758−2763頁）。
経口投与後、変異株046は、親株C5がLog10 LD50＝6.3
8細胞数なのに比べてLog10 LD50＞９細胞数であった
（すべてのLD50は28日後に計算した）。この様にして04
6株は高度に弱毒化されている。静脈投与後、046株は静
脈投与Log10 LD50＝5.13細胞数でC5株での10細胞数より
少なく、この事より再び046株はC5株と日べて高度に弱
毒化されていると結論した。
8細胞数なのに比べてLog10 LD50＞９細胞数であった
（すべてのLD50は28日後に計算した）。この様にして04
6株は高度に弱毒化されている。静脈投与後、046株は静
脈投与Log10 LD50＝5.13細胞数でC5株での10細胞数より
少なく、この事より再び046株はC5株と日べて高度に弱
毒化されていると結論した。
実施例４ 経口投与後のマウスの防御 マウスを046株で免疫し28日後有毒親株C5でチャレン
ジした。046株の1010ケの細胞でワクチン接種したマウ
スは接種後11週目のC5株のチャレンジテストに対し優秀
な抵抗性を示した。免疫された動物でのLog10 LD50は、
非免疫の対照群での6.6細胞数に比べて9.64細胞数であ
った。この様にして、046株の単一投与で経口的にワク
チン接種したマウスは、有毒株C5のチャレンジに対して
うまく防御されていた。
ジした。046株の1010ケの細胞でワクチン接種したマウ
スは接種後11週目のC5株のチャレンジテストに対し優秀
な抵抗性を示した。免疫された動物でのLog10 LD50は、
非免疫の対照群での6.6細胞数に比べて9.64細胞数であ
った。この様にして、046株の単一投与で経口的にワク
チン接種したマウスは、有毒株C5のチャレンジに対して
うまく防御されていた。
実施例５ 規定したネズミチフス菌SL1344 htr A変異株の構築 塩基配列のデータに基づいてhtr A遺伝子に削除（del
etion）を入れるのち使える適当な制限酵素切断部位を
決めた。Eco RVで分解し、再結合することによって1.2K
bの削除を入れた。薬剤耐性マーカー（カナマイシンカ
セット、ファルマシア製）も、削除を受けた遺伝子を選
抜し得る様に標準的方法で遺伝子の中に導入した。削除
を受けたhtr A遺伝子を持ったプラスミドをpol A株ネズ
ミチフス菌（BRD207）−この菌の内でプラスミドは複製
出来ない−に導入した。カナマイシン耐性が宿主の内で
維持され得る唯一の道は、ベクター上のネズミチフス菌
塩基配列と染色体上の相同領域との間に組換えが起った
場合である。カナマイシン耐性を維持する一方アンピシ
リン耐性を失くした場合、２回目の相同組換えが起こり
無傷htr A遺伝子が削除を受けた遺伝子に置き換わった
ことを示している。カナマイシン耐性のコロニーを分離
しアンピシリン耐性を調べた。カナマイシン耐性かつア
ンピシリン感受性のコロニーを更に調べるのに選抜し、
BRD698と名付けた61コリンデイル・アベニュー、ロンド
ンNW9、5HTのNCTCのPHLSにブダペスト条約の約款に従っ
て受託番号・・・・on・・・・で寄託してある）。
etion）を入れるのち使える適当な制限酵素切断部位を
決めた。Eco RVで分解し、再結合することによって1.2K
bの削除を入れた。薬剤耐性マーカー（カナマイシンカ
セット、ファルマシア製）も、削除を受けた遺伝子を選
抜し得る様に標準的方法で遺伝子の中に導入した。削除
を受けたhtr A遺伝子を持ったプラスミドをpol A株ネズ
ミチフス菌（BRD207）−この菌の内でプラスミドは複製
出来ない−に導入した。カナマイシン耐性が宿主の内で
維持され得る唯一の道は、ベクター上のネズミチフス菌
塩基配列と染色体上の相同領域との間に組換えが起った
場合である。カナマイシン耐性を維持する一方アンピシ
リン耐性を失くした場合、２回目の相同組換えが起こり
無傷htr A遺伝子が削除を受けた遺伝子に置き換わった
ことを示している。カナマイシン耐性のコロニーを分離
しアンピシリン耐性を調べた。カナマイシン耐性かつア
ンピシリン感受性のコロニーを更に調べるのに選抜し、
BRD698と名付けた61コリンデイル・アベニュー、ロンド
ンNW9、5HTのNCTCのPHLSにブダペスト条約の約款に従っ
て受託番号・・・・on・・・・で寄託してある）。
P22ライゼートを標準的方法を用いてこの株で調製し
（ドーガンらJ.Infect.Dis 第158巻、1329−1335頁、1
988年）、SL1344の感染に用いた。カナマイシン耐性コ
ロニーを分離しサザーンハイブリダイゼーションにて削
除があるか調べた。BRD726（ブドペスト条約の約款に従
って受託番号・・・・on・・・・でPHLSに寄託してａ
る）と名付けた、一つの株を更に調べるのに選抜した。
（ドーガンらJ.Infect.Dis 第158巻、1329−1335頁、1
988年）、SL1344の感染に用いた。カナマイシン耐性コ
ロニーを分離しサザーンハイブリダイゼーションにて削
除があるか調べた。BRD726（ブドペスト条約の約款に従
って受託番号・・・・on・・・・でPHLSに寄託してａ
る）と名付けた、一つの株を更に調べるのに選抜した。
実施例６ ネズミチフス菌SL1344のaro A htr A二重変異体の構築 BRD698で調製したP22ライゼートを、既にaro Aに削除
を受けたネズミチフス菌SL1344株にhtr A削除を導入し
た。aro A削除の導入方法は既にドーガンらによってJ.I
nfect.Dis.の第158巻、1329−1355頁（1988年）に述べ
られている。aro A及びhtr Aの両方に削除のあるのが判
った一つの株を更に調べる為に選び、BRD807と命名し
（ブダペスト条約の約款に従って受託番号・・・・on・
・・・でPHLSに寄託してある）。
を受けたネズミチフス菌SL1344株にhtr A削除を導入し
た。aro A削除の導入方法は既にドーガンらによってJ.I
nfect.Dis.の第158巻、1329−1355頁（1988年）に述べ
られている。aro A及びhtr Aの両方に削除のあるのが判
った一つの株を更に調べる為に選び、BRD807と命名し
（ブダペスト条約の約款に従って受託番号・・・・on・
・・・でPHLSに寄託してある）。
実施例７ SL1344htr A（BRD726）株及びSL1344htr A aro A（BRD
807）株の弱毒性の、有毒親株SL1344との比較 経口投与後、BRD726及びBRD807は、有毒親株がLog10
LD50＝6.8細胞数＊に対し、Log10 LD50＞10.0細胞数＊
であった。両株は、それ故に、有毒親株SL1344に比べ高
度に弱毒化していた。
807）株の弱毒性の、有毒親株SL1344との比較 経口投与後、BRD726及びBRD807は、有毒親株がLog10
LD50＝6.8細胞数＊に対し、Log10 LD50＞10.0細胞数＊
であった。両株は、それ故に、有毒親株SL1344に比べ高
度に弱毒化していた。
＊すべてのLD50は28日後計算。
実施例８ BRD726及びBRD807の経口ワクチンの可能性の評価 BALB/cマウスを先に述べた様に（ドーガンらJ.Infec
t.Dis.の第158巻、1329−1335頁、1988年）、BRD726及
びBRD807の約1010ケ細胞で経口的に免疫し、４週後、10
週後に有毒親株SL1344でチャレンジを行った。LD50はリ
ードとミュエンチの方法（Am.J.Hyg.第27巻 493−497
頁、1934年）で計算した。全ての決定は少くとも２回実
行した。BRD726及びBRD807でワクチン接種したマウスは
４週でのSL1344のチャレンジに対し優れた防御性を示
し、log10 LD50は各々＞10.0及び9.7細胞数であった。
このことは免疫していない対照群での対数値が6.1細胞
数と比較される。10週でのlog10 LD50はSL1344で6.5細
胞数に比べてBRD726及びBRD807で各々9.11及び8.11細胞
数であった。この様に、BRD726で免疫したマウスは有毒
性SL1344のチャレンジに対し優れた長期間免疫性を持っ
ていた。このことは、好ましくはSL1344の二重のaro変
異株にて導き出される防御性と比較される（ドーガン
ら、J.Infect.Dis.第158巻、1329−1335頁、1988年）。
BRD807のワクチン接種で得られる長期間防御性は非免疫
対照群より46倍良い。この様にBRD726及びBRD807の両方
はBALB/cマウスにとって良いワクチン株である。
t.Dis.の第158巻、1329−1335頁、1988年）、BRD726及
びBRD807の約1010ケ細胞で経口的に免疫し、４週後、10
週後に有毒親株SL1344でチャレンジを行った。LD50はリ
ードとミュエンチの方法（Am.J.Hyg.第27巻 493−497
頁、1934年）で計算した。全ての決定は少くとも２回実
行した。BRD726及びBRD807でワクチン接種したマウスは
４週でのSL1344のチャレンジに対し優れた防御性を示
し、log10 LD50は各々＞10.0及び9.7細胞数であった。
このことは免疫していない対照群での対数値が6.1細胞
数と比較される。10週でのlog10 LD50はSL1344で6.5細
胞数に比べてBRD726及びBRD807で各々9.11及び8.11細胞
数であった。この様に、BRD726で免疫したマウスは有毒
性SL1344のチャレンジに対し優れた長期間免疫性を持っ
ていた。このことは、好ましくはSL1344の二重のaro変
異株にて導き出される防御性と比較される（ドーガン
ら、J.Infect.Dis.第158巻、1329−1335頁、1988年）。
BRD807のワクチン接種で得られる長期間防御性は非免疫
対照群より46倍良い。この様にBRD726及びBRD807の両方
はBALB/cマウスにとって良いワクチン株である。
実施例９ BRD726及びBRD807のBALB/cマウスでのin vivoカイネテ
ィクス BRD726及びBRD807の静脈投与後のin vivoでの生育能
力を評価した。マウスに約105ケの生物を感染させた。
肝臓及び脾臓における細菌数を感染後21日迄いろいろな
日時に数えた。得られた結果を図３に示した。BRD726株
もBRD807株も、ネズミの組織の内で複製の開始を受けて
いない。両株は、ゆっくりと肝臓及び脾臓から消えてい
き、21日迄にBRD807はネズミの組織からほとんどきれい
になくなっていて一方BRD726は低レベルにまだ残ってい
る。
ィクス BRD726及びBRD807の静脈投与後のin vivoでの生育能
力を評価した。マウスに約105ケの生物を感染させた。
肝臓及び脾臓における細菌数を感染後21日迄いろいろな
日時に数えた。得られた結果を図３に示した。BRD726株
もBRD807株も、ネズミの組織の内で複製の開始を受けて
いない。両株は、ゆっくりと肝臓及び脾臓から消えてい
き、21日迄にBRD807はネズミの組織からほとんどきれい
になくなっていて一方BRD726は低レベルにまだ残ってい
る。
実施例10 製剤 本発明の弱毒化微生物は好ましくは経口錠剤型で与え
るのがよい。成 分 mg/錠剤 コア錠剤 1. 109 1010の弱毒化細菌を含有する凍結賦形剤 70.0 2. 二酸化ケイ素（エアロシル200） 0.5 3. ダイパック（97％蔗糖） 235.0 4. 架橋ポヴィドン（コリドンCL） 7.0 5. 微結晶性セルロース 35.0 （アヴィセルpH102） 6. ステアリン酸マグネシウム 2.5 コーティング 7. オパドライ・ エンテリック、OY−Ｐ−7156 35.0 （ポリビニルアセテートフタレート＋ジエチルフタ
レート） 385.0 水性溶媒に５％蔗糖、１％グルタミン酸ナトリウム及
び１％バクト・カシトンを含有するキャリアーを調製し
た。このキャリアーに細菌を懸濁し、それから凍結乾燥
を行った。
るのがよい。成 分 mg/錠剤 コア錠剤 1. 109 1010の弱毒化細菌を含有する凍結賦形剤 70.0 2. 二酸化ケイ素（エアロシル200） 0.5 3. ダイパック（97％蔗糖） 235.0 4. 架橋ポヴィドン（コリドンCL） 7.0 5. 微結晶性セルロース 35.0 （アヴィセルpH102） 6. ステアリン酸マグネシウム 2.5 コーティング 7. オパドライ・ エンテリック、OY−Ｐ−7156 35.0 （ポリビニルアセテートフタレート＋ジエチルフタ
レート） 385.0 水性溶媒に５％蔗糖、１％グルタミン酸ナトリウム及
び１％バクト・カシトンを含有するキャリアーを調製し
た。このキャリアーに細菌を懸濁し、それから凍結乾燥
を行った。
凍結乾燥したものをエアロシル200と混ぜ合わせ、こ
の混合物をふるいにかける。ふるいにかけた粉末をブレ
ンダーの中で、ダイパック、コディランCL、アリセルpH
102及びステアリン酸マグネシウムと混合する。この混
合物を次の腸溶性コーティングのために圧縮成形し錠剤
化する。
の混合物をふるいにかける。ふるいにかけた粉末をブレ
ンダーの中で、ダイパック、コディランCL、アリセルpH
102及びステアリン酸マグネシウムと混合する。この混
合物を次の腸溶性コーティングのために圧縮成形し錠剤
化する。
当業界の技術を持つ者ならば、本製剤の多くの成分が
機能的に等しい薬学的に受容される賦形剤を置き換え得
ることを充分理解するであろう。
機能的に等しい薬学的に受容される賦形剤を置き換え得
ることを充分理解するであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:42） (72)発明者 チャールズ，イアン，ジョージ イギリス国ビーアール３ ３ビーエス ケント，ベッケンハム，ラングリィ コ ート （番地なし) (72)発明者 ホルマエシェ，カルロス，エステニオ イギリス国 シービー２ ２キューキュ ー ケンブリッジ，ヒルズ ロード，ア デンブルックス ホスピタル，ラボラト リーズ ブロック，ユニバーシティ オ ブ ケンブリッジ，デパートメント オ ブ パソロジィ気付 (72)発明者 ジョンソン，ケビン スチュアート イギリス国 シービー２ ２キューキュ ー ケンブリッジ，ヒルズ ロード，ア デンブルックス ホスピタル，ラボラト リーズ ブロック，ユニバーシティ オ ブ ケンブリッジ，デパートメント オ ブ パソロジィ気付 (72)発明者 チャットフィールド，スチーブン，ネビ ル イギリス国ビーアール３ ３ビーエス ケント，ベッケンハム，ラングリィ コ ート （番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61P 31/04 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】htr A遺伝子における非復帰の変異によっ
て弱毒化されたグラム陰性細菌の有効量と、薬学的に許
容し得る担体とを含むワクチン。 - 【請求項２】変異が欠失または挿入変異である請求項１
のワクチン。 - 【請求項３】細菌がサルモネラ属、ボルデェテラ属、ヴ
ィブリオ属、ハエモフィラス属及びエシャリヒィア属か
ら選ばれる請求項１のワクチン。 - 【請求項４】サルモネラ細菌が、サルモネラチフス菌、
サルモネラネズミチフス菌、サルモネラエンテリティデ
ィス菌及びサルモネラコレラスイス菌から選ばれる請求
項３のワクチン。 - 【請求項５】弱毒化が第２のDNA塩基配列における変異
によってももたらされる請求項１のワクチン。 - 【請求項６】第２のDNA塩基配列における変異が、芳香
族アミノ酸の生合成経路に関与するDNA塩基配列内にあ
る請求項５のワクチン。 - 【請求項７】芳香族アミノ酸の生合成経路に関与するDN
A塩基配列が、aro C、aro A及びaro D遺伝子から選ばれ
る請求項６のワクチン。 - 【請求項８】細菌が、異種抗原をコードするDNAを発現
する請求項１〜７のいずれかのワクチン。 - 【請求項９】経口投与用に適合する様にした請求項１〜
８のいずれかのワクチン。 - 【請求項１０】微生物による感染に対して宿主の予防的
治療に用いるための、htr A遺伝子における非復帰の変
異によって弱毒化されたグラム陰性細菌。 - 【請求項１１】細菌がサルモネラ属、ボルデェテラ属、
ヴィブリオ属、ハエモフィラス属及びエシャリヒィア属
から選ばれる請求項10の細菌。 - 【請求項１２】htr A遺伝子における非復帰の変異によ
って弱毒化されたサルモネラ細菌。 - 【請求項１３】変異が、欠失または挿入変異である請求
項10、11または12の細菌。 - 【請求項１４】細菌が、サルモネラチフス菌、サルモネ
ラネズミチフス菌、サルモネラエンテリティディス菌及
びサルモネラコレラスイス菌から選ばれる請求項10〜13
のいずれかの細菌。 - 【請求項１５】弱毒化が、第２のDNA塩基配列における
変異によってもたらされる請求項10〜14のいずれかの細
菌。 - 【請求項１６】第２のDNA塩基配列における変異が、芳
香族アミノ酸の生合成経路に関与するDNA塩基配列内に
ある請求項15の細菌。 - 【請求項１７】芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する
DNA塩基配列が、aro C、aro A及びaro D遺伝子から選ば
れる請求項16の細菌。 - 【請求項１８】異種抗原をコードするDNAを発現する請
求項10〜17のいずれかの細菌。
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|---|---|---|---|
| GB9007194.5 | 1990-03-30 | ||
| GB909007194A GB9007194D0 (en) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Live vaccines |
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| WO1993018165A1 (en) * | 1992-03-02 | 1993-09-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microorganisms having attenuated invasiveness |
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