HU217776B - Élő vakcina, és a hatóanyagot képező gyengített baktérium, valamint eljárás ezek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány szerinti, immunológiai megelőzési célokra alkalmasgyengített baktériumokban a gyengítést egy nemrevertáló mutációjelenléte okozza a htrA génben, és kívánt esetben egy második génbenis tartalmaznak nemrevertáló mutációt. A baktérium adott esetbenheterológ antigént kódoló DNS expressziójára is képes. ŕ

Description

A találmány gyengített mikroorganizmusokra és az ezeket tartalmazó vakcinákra vonatkozik, amelyek állatok vagy ember immunológiai profilaktikus védelmére alkalmazhatók.

A vakcinálás vagy immunprofilaxis elve az, hogy egy állatban egy patogén organizmussal szemben immunválaszt indukálnak egy, az organizmus valamely gyengített törzsével való inokulálással, ezáltal az ezt követő provokálás ellen védelmet biztosítanak. Bacon és munkatársai [Br. J. Exp. Path. 31., 714-724. (1950)] kimutatták, hogy a S. typhi bizonyos auxotróf mutánsai egérben gyengültek a szülőtörzshöz viszonyítva. A fenti auxotróf mutánsok némelyikéről feltételezték, hogy alkalmas lehet teljes sejtvakcinák előállítására [lásd például Hosieth és Stocker, Natúré, 241., 238-239. (1981); és 322 237 számon publikált európai szabadalmi leírás]. Az alapvető auxotróf mutációkon kívül más helyeket is azonosítottak, ahol a mutációk a mikroorganizmus gyengülését eredményezték. A fenti helyekre példaként említjük a regulonokat, amelyek pleiotróf hatásokat fejtenek ki, például a cya/crp rendszert [Roy Curtiss III és munkatársai: Vakcine 6., 155-160. (1988)] és az ompR/envZ rendszert [Dorman és munkatársai: Infect. Immun. 57., 2136-2140. (1989)], valamint a phoP rendszert [Fields és munkatársai: Science 243., 1059-1062. (1989)].

Sok mikroorganizmusban 1-2 tucat protein képződik különféle környezeti stresszek, például magas hőmérséklet, tápanyagmegvonás, toxikus oxigéngyökök és metabolikus károsodások hatására adott válaszként. Ezek több eltérő gén koordinált szabályozásának részét képezik, amelyek egy mikroorganizmusra kifejtett adott stressz hatásaként indukálódnak. A legfontosabb stresszproteinek családja (amelyeket hősokkproteinek néven is ismernek) egyike a leginkább konzervált jellegűeknek. Lényeges homológia van az E. coliból, Drosophilia spp.ből és emberből izolált fenti családba tartozó egyes tagok között [legújabb áttekintését lásd Neidhardt G. C. és Van Bogelen, R. A.: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology; szerk. F. C. Neidhardt és munkatársai: eds. 1334-1345. oldal, American Society fór Microbiology, Washington D.C (1987)]. Például a Hsp90, Hsp70 és Hsp60 hősokkproteinek minden prokariótában és eukariótában megtalálhatók. Az E. coliból és az emberből származó Hsp90 aminosavszekvenciájának összehasonlítása azt mutatja, hogy az aminosavmaradékoknak mintegy fele azonos. A stresszproteincsalád további tagjai a GrpE, GroEL, DnaK, GroES, Lón és DnaJ.

Hősokkproteinek családjába tartozó proteineket kódoló géneket az RNS-polimeráz írja át az rpoH gén termékével, a σ³² faktorral együttműködve [áttekintését lásd Neidhardt, F. C. és van Bogelen, R. A.: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, szerk. Neidhardt, F. C. és munkatársai, 1334-1345. oldal, American Society fór Microbiology, Washington, D.C. (1987)]. Napjainkban Lipinska és munkatársai [Nucleic, Acids. Rés. 21., 10 053-10 067. (1988)] leírtak egy hősokkproteint E. coliban, amelyet HtrA-nak neveztek, és amely úgy tűnik, hogy a³²-től független. A htrA gén promoterrégiójának vizsgálatával kimutatható a DNS-szekvencia homológa az rpoH gén P.3 promoterével; ezt a promotert ismert módon a σ^Ε(σ²⁴) faktor ismeri fel. Ebből a hasonlóságból arra lehet következtetni, hogy a htrA promotert az RNS-polimeráz-a^E(a²⁴) holoenzim is felismerheti.

E. coliban a htrA lókuszon végbement mutáció fenotipikusan megszünteti a baktérium azon képességét, hogy 42 °C fölötti hőmérsékleten életben maradjon [Lipinska és munkatársai: J. Bacteriol; 171., 1574-1584. (1989)]. A gén az E. coli kromoszóma géntérképén 4 percnél helyezkedik el, és egy 51163 kD relatív móltömegű proteint kódol. Ez a protein prekurzor N-terminális módosításokon megy keresztül, amelyek magukban foglalják egy szignálpeptid-szekvencia eltávolítását [Lipinska és munkatársai: Nucleic. Acids. Rés. 21., 10 053-10 067. (1988)], amelynek eredményeként a polipeptid érett formája keletkezik a baktérium belső membránján keresztüli kiválasztódás során. Ettől függetlenül a htrA gént degP-ként is azonosította Strauch, K. L. és Beckwith J. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85., 1576-1580. (1988)], akik csökkent proteázaktivitású E. coli mutánsokat vizsgáltak, a degP mutánsokat TnphoA mutagenézissel izolálták [Manoil C. és Beckwith J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82., 8129-8133. (1985)] és egy hibrid Tsr-phoA (Tsr-AP2) rekombináns protein megnövekedett stabilitása révén ismerték fel degP háttérben [Strauch K. L. és Beckwith J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85., 1576-1680. (1988)]. Az E. coliban degP-ként azonosított gén és a htrA gén azonosnak tűnnek, és egy proteint kódolnak, amely a „stresszválasz” család egyik tagja.

A találmány vakcinára vonatkozik, amely gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és hatóanyagként a htrA génben nemrevertáló mutációt és adott esetben egy második génben nemrevertáló mutációt tartalmazó gyengített baktériumot tartalmaz. A találmány további tárgyát képezi a htrA génben nemrevertáló mutációval és adott esetben egy második génben nemrevertáló mutációval gyengített baktérium is, amely egy gazdaszervezet mikroorganizmusok által okozott fertőzésével szembeni profilaktikus kezelésére alkalmazható.

A találmány értelmében alkalmazható baktériumok előnyösen olyan baktériumok, különösen Gram-negatív baktériumok, amelyek eukarióta sejteket támadnak meg és abban szaporodnak, és a telepeiket a nyálkafelületen képezik. Idetartoznak a Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus és Escherichia nemzetség tagjai. Közelebbről az alábbi fajokat említhetjük: S. typhi - a humán tífusz okozója -; S. typhimurium - számos állatfajban a salmonellosis okozója -, S. enteritidis ételmérgezés okozója emberben -; S. choleraesuis - a salmonellosis okozója sertésben -; Bordetella pertussis - a szamárköhögés kórokozója -; Haemophilus influenzáé - a meningitis kórokozója -; és Neisseria gonorrhoeae - a gonorrhoea kórokozója.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan Salmonella baktérium, amely a htrA génben nemrevertáló mutációval és adott esetben egy második génben nemrevertáló mutációval gyengített.

HU 217 776 Β

A nemrevertáló mutáció egy olyan mutáció, amely nem javítható ki egyetlen lépésben. Az ilyen típusú genetikus mutációk közé tartozik a deléciós, inszerciós vagy szubsztitúciós mutáció. A deléciós mutációkat transzpozonokkal lehet előidézni. Ezek olyan DNSszekvenciák, amelyek 750-több ezer bázispárból állnak, amely szekvenciák képesek a gazda kromoszomális DNS-ébe integrálódni. így a kérdéses DNS-szekvencia folyamatossága megszakad, és egyidejűleg a gén funkciója elveszik. A transzpozonok a gazda kromoszomális DNS-éből delécióval törölhetők, leggyakrabban a kivágás nem pontos, ami egy nemrevertáló mutációhoz vezet. Szubsztitúciós vagy inszerciós mutációk keletkezhetnek egy inaktivált DNS-szekvencia alkalmazásával, amelyet egy vektor hordoz, amely rekombinálódik, vagy kereszteződik a kérdéses szekvenciával a gazda kromoszomális DNS-ében, és ennek következtében a gén funkciója elvész.

A degP-ként is ismert htrA génszekvencia az 1. ábrán látható (1. azonosítási számú szekvencia).

Elő vakcina formájában való alkalmazás esetén nyilvánvalóan fontos, hogy a találmány szerinti gyengített baktérium nem revertál vissza virulens állapotba. Ennek az eseménynek a valószínűsége egyetlen DNSszekvencia nemrevertáló mutációja esetén is igen kicsinek tekinthető. Azonban a reverzió kockázata olyan baktériumban, amely két különálló DNS-szekvenciában végbement mutáció jelenléte miatt gyengített, elhanyagolhatónak tekinthető. Ezért a találmány értelmében előnyösen egy második génben lévő nemrevertáló mutációval is gyengített baktériumot alkalmazunk a vakcina hatóanyagaként. A második gén előnyösen egy olyan enzimet kódol, amely egy esszenciális auxotróf útvonalban játszik szerepet, vagy egy olyan gén, amelynek terméke az ozmotikusán befolyásolható gének, például ompR [Infect and Immun. 2136-2140. (1989)] szabályozását kontrollálja. Legelőnyösebben a mutáció egy olyan génben van, amely az aromás aminosavak bioszintézisének útvonalában játszik szerepet, közelebbről az aroA-t, aroC-t vagy aroD-t kódoló génben (EP-A-322 237).

A találmány értelmében alkalmazott gyengített baktériumokat úgy állítjuk elő, hogy a DNS-szekvenciába szakemberek számára ismert módon bevezetjük a mutációkat (Maniatis: Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Nemrevertáló mutációkat egy hibrid transzpozon, a TnphoA bevezetésével állíthatunk elő, például S. typhimurium törzsekben. A TnphoA enzimatikusan aktív proteinek képződését válthatja ki, a lúgos foszfatáz periplazmatikus vagy membránproteinekkel való fúziójával. A TnphoA transzpozon egy kanamicinrezisztenciát kódoló gént hordoz. A transzdukciós terméket a kanamicinrezisztencia jelenléte alapján szelektálhatjuk megfelelő szelekciós tápközegen való tenyésztéssel.

Úgy is eljárhatunk, hogy a DNS-szekvenciát egy vektorba, például egy plazmidba vagy kozmidba klónozzuk, a klónozott DNS-szekvenciába egy szelektálható marker gént inszertálunk, amely annak inaktiválását eredményezi. Az inaktivált DNS-szekvenciát hordozó plazmidot és egy másik szelekciós markert ismert módszerekkel vezethetjük be a baktériumba (Maniatis: Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Ezután megfelelő szelekcióval olyan mutánsokat lehet azonosítani, amelyekben az inaktivált DNS-szekvencia a baktérium kromoszómájával rekombinálódott, és a vad típusú DNS-szekvencia az alléi kicserélődés néven ismert folyamatban működésképtelenné vált. Közelebbről, az alkalmazott vektor a baktériumban előnyösen nem stabil, és spontán elveszik. A plazmidban lévő mutált DNS-szekvencia és a vad típusú DNS-szekvencia egy genetikus keresztezési eseményben kicserélődhet. További módszerekkel kiküszöbölhető idegen DNS bevezetése a vakcinatörzsekbe a mutációk helyén.

Gyengített baktériumot, például egy Salmonella baktériumot úgy állíthatunk elő, hogy

i) a baktérium htrA génjébe, és kívánt esetben egy második génjébe is bevezetünk egy nemrevertáló mutációt

a) transzpozon-mutagenezissel vagy

b) a baktériumnak egy nemrevertáló mutációt tartalmazó htrA gént beépítő vektorral, és kívánt esetben egy nemrevertáló mutációt tartalmazó második gént beépítő vektorral történő transzformálásával; és ii) a kívánt baktériumot szűrővizsgálattal szelektáljuk.

A találmány szerinti gyengített baktérium adott esetben heterológ antigént expresszál. Ez az expresszió valószínűleg kedvező a htrA mutánsokban, a degP fenotípussal kapcsolatos rekombináns antigének fokozott stabilitása miatt. A fenti antigének virálisak, bakteriálisak, protozoálisak vagy magasabb rendű parazitásak lehetnek. Az ilyen baktériumok azután két- vagy többértékű vakcinák alapját képezhetik. A hasznos antigénekre példaként említhetjük az E. coli hőlabilis toxin B alegységet (LT-B), az E. coli K88 antigéneket, az FMDV (száj- és körömfájás vírusa) peptideket, az Influenza vírusból származó proteineket, és a B. pertussisból származó P.69 proteint. A hasznosan expresszálódó egyéb antigének közé tartoznak például a Chlamydiából, mételyekből, mikoplazmából, bélférgekből, szalagférgekből, veszettségvírusból és rotavírusból származó antigének.

A heterológ antigént kódoló DNS-t expresszáló baktériumot úgy állíthatjuk elő, hogy a baktériumot egy expressziós kazettával transzformáljuk. Az expressziós kazetta a heterológ antigént kódoló DNS-szekvencia mellett tartalmaz transzkripciós és transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciákat is. Az expresziós kazetta tartalmazhat regulátor szekvenciákat is. Az ilyen expressziós kazetták szakemberek számára jól ismertek, és így szakemberek kötelező tudásához tartozik ezek konstruálása. Az expressziós kazetta egy szerkesztett vektor vagy egy természetes plazmid részét képezheti. Az EP-A-127 153 számú szabadalmi leírásban ismertetnek egy olyan genetikailag módosított gyengített Salmonellát, amely képes heterológ antigént expresszálni. Az expressziós kazettát úgy is módosíthatjuk, hogy lehetővé tegye a heterológ gén beépülését a baktérium kromoszómájába.

HU 217 776 Β

Egy másik bivalens vakcinát - amely egy E. coli hőlabilis enterotoxin B alegységet expresszáló gyengített Salmonella typhit tartalmaz - Clements és munkatársai ismertetnek [Infection and Immunity 46., (2), 564-569. (1984)]. A Ty21a gyengített S. typhi törzset egyéb antigének, például a Shigella sonnei I formájú antigén expresszálására alkalmaztak [Formai és munkatársai: Infection and Immunity 34., 746-750.(1981)].

A találmány szerinti vakcina előnyösen liofilizált formában van, például kapszula formában, amelyet a betegnek orálisan adagolhatunk. A fenti kapszulákat enterális bevonattal is elláthatjuk, amely például Eudragate „S”-t, Eudragate „L”-t, cellulóz-acetátot, cellulózftalátot vagy hidroxi-propil-metil-cellulózt tartalmazhat. Ezeket a kapszulákat mint olyanokat is alkalmazhatjuk, vagy a liofilizált anyagot az alkalmazás előtt - például szuszpenzió formájában - rekonstruálhatjuk. A rekonstitúciót előnyösen megfelelő pH-jú pufferrel végezzük az organizmus életképességének biztosítására. A gyengített baktériumok vagy a vakcina gyomorsavaktól való védelmére előnyösen egy nátrium-hidrogén-karbonát-preparátumot adagolunk a vakcina beadása előtt. Úgy is eljárhatunk, hogy a vakcinát parenterális, intranazális vagy intramammáris adagolásra alkalmas formában állítjuk elő.

A gazdát (főleg humán gazdát) profilaktikusan kezelhetjük valamely mikroorganizmus által okozott fertőzés ellen oly módon, hogy a gazdának egy találmány szerinti vakcina hatásos dózisát adagoljuk. A fenti kezelési eljárásban alkalmazott dózisok különféle klinikai faktoroktól, például a gazda korától és testtömegétől, és a vakcina formálási típusától függ. Gyengített S. typhi esetében mintegy ΙΟ⁹-10¹¹ S. typhi baktérium adagolása dózisonként általában elegendő egy 70 kg-os felnőtt humán gazda kezelésére.

A találmányt - korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

Az ábrák magyarázata az alábbi:

1. ábra: htrA gén DNS-szekvenciája és az általa kódolt protein aminosavszekvenciája;

2. ábra: S. typhimurium htrA 046 mutáns érzékenysége 42 °C feletti hőmérsékletre és oxigéngyökökre;

3. ábra: htrA mutációt (BRD726) és htrA aro mutációkat (BRD807) tartalmazó S. typhimurium törzsek in vivő kinetikája.

I. példa htrA gén azonosítása Salmonella typhimuriumban és egy htrA mutáns előállítása

Az egérre virulens Salmonella typhimurium C5 törzsben alkalmaztuk a TnphoA mutagenezist [Miller és munkatársai: Infect. Immunoi, 57, 2758-2763. (1989)]. Azokat a mutánsokat szelektáltuk, amelyek valószínűleg a szignálpeptid-szekvenciát tartalmazó génekben tartalmaznak sérüléseket, vagyis azokban a proteinekben, amelyek a bakteriális sejtmembránon keresztüli transzportban részt vesznek. A TnphoA inszerciót határoló DNS izolálásával azonosítható az a gén, amelyet az inszerció aktivált. Ezt a gént izoláltuk, és DNS-szekvenciáját standard módszerekkel meghatároztuk (lásd 1. ábra,

1. azonosítási számú szekvencia) [Maniatis és munkatársai: In Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982); Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74., 5463-5467. (1977)]. A transzlatált protein szekvenciájának összehasonlítása az EMBL-adatbankban tárolt szekvenciával meglepő módon azt mutatta, hogy 8 8%-os homológia van az E. coliból származó htrA termék szekvenciájával (1. ábra, 1. azonosítási számú szekvencia).

2. példa htrA, mint stresszválaszban szerepet játszó gén azonosítása S. typhimuriumban A htrA génben sérült E. coli mutánsok nem képesek °C feletti hőmérsékleten szaporodni. A S. typhimurium htrA 046 mutáns szaporodását magasabb hőmérsékleteken megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy ugyanolyan jól szaporodik, mint a szülői C5 törzs. Azonban, ha az oxigéngyökökre való érzékenységet vizsgáljuk, a 046 mutáns rezisztenciája kisebb, mint a szülő C5 törzs rezisztenciája, világosan jelezvén, hogy ez a gén felelős - legalábbis részben - az ilyen típusú stresszválaszért (2. ábra).

3. példa

Gyengített Salmonella typhimurium 046 törzs összehasonlítása a virulens szülő Salmonella typhimurium C5 törzzsel

A gyengített törzseket a TnphoA transzpozon mutagenézis alkalmazásával állítottuk elő Miller és munkatársai módszere szerint [Infect. Immun. 57, 2758-2763. (1989)].

A mutáns 046 törzs lgLD₅₀-értéke orális adagolás esetén nagyobb, mint 9 sejt, ezzel szemben a szülői C5 törzs lgLD₅₀-értéke 6,38 sejt. (Az összes LD₅₀-értéket 28 nap elteltével számítottuk ki.) Ezek szerint a 046 törzs erősen gyengített. Iv. adagolás esetén a 046 törzs lgLDjQ-értéke 5,13 sejt, míg a szülői C5 törzsé 10-nél kisebb, és ebből ismét arra következtetünk, hogy a 046 törzs erősen gyengített a C5 törzshöz viszonyítva.

4. példa

Orális provokálás utáni védelem egérben

Az egereket 046 törzzsel immunizáltuk, és 28 nap elteltével a virulens szülői C5 törzzsel provokáltuk. A 10¹⁰ 046 sejttel vakcináit egerekben kiváló védelmet tapasztaltunk C5-tel való provokálás ellen a vakcinálás után 11 héttel. Az immunizált állatok lgLD₅₀-értéke 9,64 sejt, összehasonlítva a nem immunizált kontrollállatok 6,6 sejt értékével. Tehát az orálisan egyetlen 046 dózissal vakcináit egerek kiválóan védettek virulens C5 törzs általi fertőzéssel szemben.

5. példa

S. typhimurium SL1344 htrA mutáns előállítása

A szekvenciaadatok megkönnyítették azon megfelelő restrikciós endonukleáz helyek felismerését, amelyek egy deléció bevezetésére alkalmazhatók a htrA

HU 217 776 Β génbe. A pSHTl plazmid htrA génjébe egy 1,2 kb hosszúságú deléciót úgy vezettünk be, hogy EcoRV-tel emésztettünk, és újraligáltuk. A pSHTl egy pUC18alapú replikon, amely a S. typhimurium C5 htrA génjének 3,0 kbp fragmentumát kódolja [Johnson és munkatársai, Mól. Microbiol. 5., 401-407. (1991)]. A törölt szekvencia helyére egy gyógyszer-rezisztencia markert (kanamicinkazetta, Pharmacia) is bevezettünk a plazmidba szokásos módon, hogy a géndeléció jelenlétére való szelektálás lehetővé váljon. A htrA géndeléciót tartalmazó plazmidot egy polA S. typhimurium törzsbe (BRD207) vittük be [Strugnell és munkatársai, Gene 88., 57-61. (1990)], amelyben a plazmid nem tud replikálódni. A kanamicinrezisztencia csak abban az esetben maradhat meg a gazdában, ha egy rekombináció megy végbe a vektorban lévő S. typhimurium szekvenciák és a kromoszómán lévő homológ régiók között. Az ampicillinrezisztencia elvesztése a kanamicinrezisztencia megtartása mellett egy második homológ rekombinációs esemény végbementét jelzi, amelynek következtében az intakt htrA gén a törölttel helyettesítődik. A kanamicinnel szemben rezisztens telepeket izoláltuk, és ampicillinrezisztencia szempontjából vizsgáltuk. További vizsgálatok céljára kiválasztottunk egy olyan telepet, amely kanamicinrezisztenciát és ampicillinérzékenységet mutatott, ezt BRD698-nak neveztük (letétbe helyezve a PHLS-nél, NCTC, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, letéti száma: NCTC 12457, letétbe helyezés dátuma: 1991.03.22.).

Szokásos módon egy P22 lizátumot állítottunk elő ebből a törzsből [Dougan és munkatársai: J. Infect. Dis. 158., 1329-1335. (1988)] és ezt alkalmaztuk a S. typhimurium SL1344 (B. A. D. Stocker, Stanford University, USA) fertőzésére [Hoiseth és munkatársai, Natúré 291., 238-239. (1981)]. Izoláltuk a kanamicinrezisztens telepeket, és a deléció jelenléte szempontjából Southern biot hibridizációval analizáltuk. További tanulmányozás céljából egy törzset választottunk ki, amelyet BRD726-nak neveztünk (PHLS-nél letétbe helyezve, letéti száma: NCTC 12458, letétbe helyezés dátuma: 1991.03.22.).

6. példa

S. typhimurium SL1344 aroA htrA kettős mutáns előállítása

Az 5. példa szerint előállított BRD698 törzsből az 5. példa szerint preparált P22 lizátumot alkalmaztuk a htrA deléció bevitelére egy, az aroA deléciót már tartalmazó S. typhimurium SL1344 törzsbe [Dougan és munkatársai, J. Infect. Dis. 158., 1329-1335. (1988)]. Egy olyan törzset találtunk, amely mind az aroA, mind a htrA deléciót tartalmazza, ezt választottuk ki további vizsgálat céljára, és BRD807-nek neveztük (PHLS-nél letétbe helyezve, letéti száma: NCTC 12459, letétbe helyezés dátuma: 1991. 03. 22.).

7. példa

SL1344 htrA (BRD726) és SL1344 htrA és aroA (BRD807) gyengítésének összehasonlítása a virulens szülői SL1344 törzzsel

Orális adagolás esetén a BRD726 és

BRD807 lgLD₅₀-értéke > 10,0 sejt, szemben a virulens szülői törzs lgLD₅₀-értékével, amely 6,8 sejt (minden LDjQ-értéket 28 nap elteltével számoltunk ki). Ezért mind a két törzs erősen gyengített a virulens szülői SL1344 törzshöz viszonyítva.

8. példa

BRD726 és BRD807 tartalmú orális vakcina hatékonyságának meghatározása BALB/c egereket orálisan immunizálunk mintegy

10¹⁰ sejt BRD726-tal, illetve BRD807-tel a korábban leírtak szerint [Dougan és munkatársai: J. Infect. Dis. 158., 1329-1335. (1988)], és 4, illetve 10 hét elteltével a szülői virulens SL1344 törzzsel fertőzzük az állatokat. Az LD₅₀-értékeket Reed és Muench módszere szerint számoljuk ki [Am. J. Hyg. 27., 493-497. (1934)]. Az összes meghatározást legalább kétszer elvégezzük. A BRD726-tal és BRD807-tel vakcináit egerek kiváló védelmet mutattak SL1344-gyel való fertőzés ellen 4 hét múlva, a lgLD_S0-értékek >10,0, illetve 9,7 sejt. Ezekkel az értékekkel szemben a nem immunizált kontrollok lgLD_S0-értéke 6,1 sejt. 10 hét elteltével a BRD726 és BRD807 lgLD₅₀-értéke 9,11, illetve 8,11 sejt, összehasonlítva az SL1344 6,5 értékével. Ebből megállapítható, hogy a BRD726-tal immunizált egerek kiváló, hosszan tartó immunitást mutatnak a virulens SL1344-gyel szembeni fertőzésre. Ez kedvezően hasonlítható össze a kettős aro mutáns SL1344 által biztosított védelemmel [Dougan és munkatársai: J. Infect. Dis. 158., 1329-1355. (1988)]. A BRD807-tel való vakcinálás által biztosított hosszan tartó védelem 46-szor jobb, mint az immunizálatlan kontrolioké. Ebből megállapítható, hogy mind a BRD726, mind a BRD807 jó vakcinatörzseket jelentenek a BALB/c egerek számára.

9. példa

BRD726 és BRD807 in vivő kinetikája BALB/c egérben

A BRD726 és BRD807 in vivő szaporodását intravénás adagolás után vizsgáltuk. Az egereket mintegy 105 mikroorganizmussal fertőztük. A baktériumok számát különböző időpontokban meghatároztuk a májban és a lépben a fertőzés utáni 21. napig. Az eredményeket a 3. ábrán ábrázoljuk. Sem a BRD726, sem a BRD807 nem megy át replikációs iniciációs perióduson egérszövetekben. A baktériumok lassan tisztulnak ki a szervekből, és a 21. napra a BRD807 majdnem teljesen kiürült az egérszövetekből, míg a BRD726 alacsony koncentrációban, de még mindig jelen volt.

10. példa

Gyógyászati készítmények formálása

A találmány szerinti gyengített mikroorganizmust előnyösen orális tabletta formában állítjuk elő. Összetevők mg/tabletta

Tablettamag

1. Fagyasztva szárított hordozó segédanyag, amely ΙΟ⁹-10¹⁰ gyengített baktériumot tartalmaz 70,0

HU 217 776 Β

Összetevők mg/tabletta

2. Szilícium-dioxid (Aerosil 200) 0,5

3. Dipak (97% szacharóz) 235,0

4. Térhálós povidon (Kollidon CL) 7,0

5. Mikrokristályos cellulóz (Avicel pH 102) 35,0

6. Magnézium-sztearát 2,0

7. Opadry Enteric, OY-P-7156 [poli( vinil-acetát-ftalát)+dí éti 1-italát] 35,0

385,0

Előállítjuk az 5% szacharózt, 1% nátrium-glutamátot és 1 % baktokazitont tartalmazó hordozót vizes oldószerrel. A mikroorganizmust ebben a hordozóban szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk.

A fagyasztva szárított anyagot Aerosil 200-zal összekeveqük, és az így kapott elegyet átszitáljuk. Az átszitált port elegyítjük a Dipakkal, Kollidon CL-lel, Avicel pH 102-vel és magnézium-sztearáttal egy keverőben. Az így kapott keveréket tablettává préseljük, majd enterális bevonattal látjuk el.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fenti készítményben számos komponens helyettesíthető fünkcionálisan egyenértékű gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal.

Claims (29)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Vakcina, azzal jellemezve, hogy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és hatóanyagként a htrA gén nemrevertáló mutációja és kívánt esetben egy második gén nemrevertáló mutációja által gyengített baktériumot tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a htrA gén mutációja egy deléciós vagy inszerciós mutáció.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a baktérium a Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus vagy Escherichia nemzetségbe tartozik.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a Salmonella baktérium Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis vagy Salmonella cholerasuis.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a második gén mutációja egy, az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó génben van.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó gén az aroC, aroA vagy aroD gén.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a baktérium egy heterológ antigént kódoló DNS-t expresszál.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy orális adagolásra alkalmas formában van.
9. 9. Gyengített baktérium valamely mikroorganizmus által okozott fertőzés elleni profilaktikus alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy a baktérium a htrA gén nemrevertáló mutációja és kívánt esetben egy második gén nemrevertáló mutációja által gyengített.
10. 10. A 9. igénypont szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hagy a baktérium a Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus vagy Escherichia nemzetségbe tartozik.
11. 11. Gyengített Salmonella baktérium, azzal jellemezve, hogy a baktérium a htrA génben jelen lévő, nemrevertáló mutáció és kívánt esetben egy második génben jelen lévő nemrevertáló mutáció által gyengített.
12. 12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hogy a htrA gén mutációja egy deléciós vagy inszerciós mutáció.
13. 13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hogy azt Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis és Salmonella cholerasuis közül választjuk.
14. 14. A 9-13. igénypontok bármelyike szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hogy a második gén mutációja egy, az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó génben van.
15. 15. A 14. igénypont szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hogy az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó gén az aroC, aroA vagy aroD gén.
16. 16. A 9-15. igénypontok bármelyike szerinti gyengített baktérium, azzal jellemezve, hogy egy heterológ antigént kódoló DNS-t expresszál.
17. 17. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot egy, a htrA gén nemrevertáló mutációja és kívánt esetben egy második gén nemrevertáló mutációja által gyengített baktérium hatásos mennyiségével elegyítjük.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a htrA gén mutációjaként egy deléciós vagy inszerciós mutációt tartalmazó baktériumot alkalmazunk.
19. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként a Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus vagy Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot alkalmazunk.
20. 20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Salmonella baktériumként Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis vagy Salmonella cholerasuis baktériumot alkalmazunk.
21. 21. A 17-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második gén mutációjaként egy, az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó génben lévő mutációt tartalmazó baktériumot alkalmazunk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó gén mutációjaként az aroC, aroA vagy aroD génben lévő mutációt tartalmazó baktériumot alkalmazunk.
23. 23. A 17-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként egy heterológ antigént kódoló DNS-t expresszáló baktériumot alkalmazunk.
24. 24. Eljárás gyengített Salmonella baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy

    HU 217 776 Β

    i) a baktérium htrA génjébe és kívánt esetben egy második génjébe is bevezetünk egy nemrevertáló mutációt

    a) transzpozon-mutagenezissel vagy

    b) a baktériumnak egy nemrevertáló mutációt tartalmazó htrA gént beépítő vektorral, és kívánt esetben egy nemrevertáló mutációt tartalmazó második gént beépítő vektorral történő transzformálásával; és ii) a kívánt baktériumot szűrővizsgálattal szelektáljuk.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a htrA gén mutációjaként egy deléciós vagy inszerciós mutációt vezetünk be.
26. 26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis vagy Sál monella cholerasuis baktériumot alkalmazunk.
27. 27. A 24-26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második génként egy, az

    5 aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó génbe vezetünk be mutációt.
28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aromás aminosavak bioszintézisútjában szerepet játszó génként az aroC, aroA vagy aroD génbe ve10 zetünk be mutációt.
29. 29. A 24-28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként egy heterológ antigént kódoló DNS-t expresszáló baktériumot alkalmazunk.