JP2002507414A - ワクチンに使用する弱毒化細菌 - Google Patents
ワクチンに使用する弱毒化細菌Info
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Abstract
(57)【要約】
（ワクチンに使用できる弱毒化細菌）本発明は、aroC遺伝子、ompF遺伝子及びompC遺伝子の各遺伝子中で非可逆突然変異により弱毒化した細菌を提供するものである。当該細菌は、ワクチンとして使用することができる。当該細菌は、例えば下痢症状に対するワクチンとして使用し得る大腸菌の弱毒化菌株である。
Description
【０００１】 本発明は、ワクチンに使用できる弱毒化細菌に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） ワクチン接種の背後にある原理は、宿主の中に免疫反応を誘発し、病原体の攻
撃から保護する方法を提供することにある。当該保護は、当該病原体の生きた弱
毒化菌株、即ち、菌力の強い病原体が病気を引き起こすことのないように、菌力
を低下させた菌株を接種することにより、これを達成することができる。
撃から保護する方法を提供することにある。当該保護は、当該病原体の生きた弱
毒化菌株、即ち、菌力の強い病原体が病気を引き起こすことのないように、菌力
を低下させた菌株を接種することにより、これを達成することができる。
【０００３】 元来、２種類の方法の中いずれかの方法を使用して、細菌及びウィルスの生き
た弱毒化菌株が選ばれてきた。突然変異誘発性の化学物質を使用してこれらの微
生物を処理するか、或いはこれらの微生物を生体外で繰り返し継代させることに
より、突然変異種を創ることも行われてきた。しかし、これらいずれかの方法に
よる場合は、弱毒化機構がはっきりしない弱毒化菌株が得られることになる。弱
毒化により単一の（容易に逆戻りできる）突然変異が起こる場合もあれば多重突
然変異が起こる場合もあるので、これらの菌株が野性種の菌株に戻ってしまう可
能性もあり、そのキャラクタリゼーションは特に困難である。さらに、多重突然
変異を起こさせると最適な免疫原性を有する菌株を得ることは困難になるので、
多重菌株を病原体に対して保護する何らかの措置が必要と考えられる。
た弱毒化菌株が選ばれてきた。突然変異誘発性の化学物質を使用してこれらの微
生物を処理するか、或いはこれらの微生物を生体外で繰り返し継代させることに
より、突然変異種を創ることも行われてきた。しかし、これらいずれかの方法に
よる場合は、弱毒化機構がはっきりしない弱毒化菌株が得られることになる。弱
毒化により単一の（容易に逆戻りできる）突然変異が起こる場合もあれば多重突
然変異が起こる場合もあるので、これらの菌株が野性種の菌株に戻ってしまう可
能性もあり、そのキャラクタリゼーションは特に困難である。さらに、多重突然
変異を起こさせると最適な免疫原性を有する菌株を得ることは困難になるので、
多重菌株を病原体に対して保護する何らかの措置が必要と考えられる。
【０００４】 近代的な遺伝技術を使用することにより、安定な弱毒化欠失を創りだせる遺伝
的に明確に定義された弱毒化細菌株の構築が今や可能となった。この種の技術を
使用して、サルモネラ菌のサイト指向型突然変異体が多数創りだされた（２，４
，５，９，12，16，17，18）。aro（例えばaroA、aroC、aroD及びaroE）遺伝子 、pur遺伝子、htrA遺伝子、ompR遺伝子、ompF遺伝子、ompC遺伝子、galE遺伝子 、cya遺伝子、crp遺伝子及びphoP遺伝子を含む多数の遺伝子において、突然変異
が弱毒化に使用できることが報告されている。
的に明確に定義された弱毒化細菌株の構築が今や可能となった。この種の技術を
使用して、サルモネラ菌のサイト指向型突然変異体が多数創りだされた（２，４
，５，９，12，16，17，18）。aro（例えばaroA、aroC、aroD及びaroE）遺伝子 、pur遺伝子、htrA遺伝子、ompR遺伝子、ompF遺伝子、ompC遺伝子、galE遺伝子 、cya遺伝子、crp遺伝子及びphoP遺伝子を含む多数の遺伝子において、突然変異
が弱毒化に使用できることが報告されている。
【０００５】 今ではサルモネラaroAの突然変異体はそのキャラクタリゼーションが充分に行
われ、いくつかの動物種において、サルモネラ症の優れた生ワクチンとして効果
を発揮することが示されている。さらに、菌力が再結合により逆転する可能性を
低下させるために、aroA/purA 及びaroA/aroCのよな２種類の独立した遺伝子に 対して突然変異が導入された。チフス菌（ヒト）及びサルモネラ デュブリン菌 （ウシ）などのサルモネラ菌株を宿主に順応させ、同一の突然変異を起こさせる
ことによっても、１回投与ワクチンの候補が数多く創りだされ、臨床（８, 11）
及び実地試験（10）において成功を収めてきた。
われ、いくつかの動物種において、サルモネラ症の優れた生ワクチンとして効果
を発揮することが示されている。さらに、菌力が再結合により逆転する可能性を
低下させるために、aroA/purA 及びaroA/aroCのよな２種類の独立した遺伝子に 対して突然変異が導入された。チフス菌（ヒト）及びサルモネラ デュブリン菌 （ウシ）などのサルモネラ菌株を宿主に順応させ、同一の突然変異を起こさせる
ことによっても、１回投与ワクチンの候補が数多く創りだされ、臨床（８, 11）
及び実地試験（10）において成功を収めてきた。
【０００６】 Chatfieldら（1991, 参考文献21）は、ompC遺伝子及びompF遺伝子の両方に安 定な突然変異を宿したネズミチフス菌株について述べている。BALB/cマウスに経
口投与した場合、50%致死投与量（LD50）が約1,000倍になるまで当該菌株は弱毒
化された。しかし、静脈投与によるLD50値は約10倍になったに過ぎない。このこ
とは、細菌が経口ルートで感染する能力において、ポリンが重要な働きをしてい
ることを示している。
口投与した場合、50%致死投与量（LD50）が約1,000倍になるまで当該菌株は弱毒
化された。しかし、静脈投与によるLD50値は約10倍になったに過ぎない。このこ
とは、細菌が経口ルートで感染する能力において、ポリンが重要な働きをしてい
ることを示している。
【０００７】 ompC遺伝子及びompF遺伝子の発現はompRにより調節されている。Pickardら（1
994, 参考文献13）は、チフス菌 Ty2コスミド バンクから採取したompBオペロン
（ompR遺伝子及びenvZ遺伝子で構成されている）をクローン化し、DNA配列分析 によりキャラクタリゼーションを行った結果について述べている。当該DNA配列 のデータを使用して、ompR遺伝子の開放読取枠内に明確な517 bp欠失を発生する
に適した抑制サイトが確認された。 この欠失は、すでにaroC及びaroD両遺伝子の中に明確な欠失を宿している２種類
のチフス菌株の染色体中へ同族再結合させて導入されたものである。外部膜試料
を調べた結果、チフス菌のompR突然変異体は、ompC及びompFポリン発現量の著し
い減少を示した。ompR-envZの２成分調節システムが、チフス菌中のVi多糖合成 の調節において重要な役割を演じていることも分かった。
994, 参考文献13）は、チフス菌 Ty2コスミド バンクから採取したompBオペロン
（ompR遺伝子及びenvZ遺伝子で構成されている）をクローン化し、DNA配列分析 によりキャラクタリゼーションを行った結果について述べている。当該DNA配列 のデータを使用して、ompR遺伝子の開放読取枠内に明確な517 bp欠失を発生する
に適した抑制サイトが確認された。 この欠失は、すでにaroC及びaroD両遺伝子の中に明確な欠失を宿している２種類
のチフス菌株の染色体中へ同族再結合させて導入されたものである。外部膜試料
を調べた結果、チフス菌のompR突然変異体は、ompC及びompFポリン発現量の著し
い減少を示した。ompR-envZの２成分調節システムが、チフス菌中のVi多糖合成 の調節において重要な役割を演じていることも分かった。
【０００８】 動物実験において、弱毒化したネズミチフス菌をベヒクルとして使用し、免疫
システムに異種抗原を導入した（３，６，15）。これによりヒトに使用し得る多
価ワクチンを開発できる可能性が高まった（７）。
システムに異種抗原を導入した（３，６，15）。これによりヒトに使用し得る多
価ワクチンを開発できる可能性が高まった（７）。
【０００９】 （発明の要約） 本発明は、aroC遺伝子、ompF遺伝子及びompC遺伝子において非可逆的突然変異
を起こさせることにより、弱毒化した細菌を提供するものである。本発明は、当
該細菌を含むワクチンを提供するものでもある。
を起こさせることにより、弱毒化した細菌を提供するものである。本発明は、当
該細菌を含むワクチンを提供するものでもある。
【００１０】 aroC/ompF/ompCの遺伝子組合せを突然変異させることにより、優れた性質を有
するワクチンが得られるものと信じられている。例えば、aroC/ompF/ompCの組合
せ遺伝子は、aroC/ompRの遺伝子組合せと比べて、下記の理由で優れているもの と信じられている。
するワクチンが得られるものと信じられている。例えば、aroC/ompF/ompCの組合
せ遺伝子は、aroC/ompRの遺伝子組合せと比べて、下記の理由で優れているもの と信じられている。
【００１１】 １．ompR遺伝子を突然変異させると、ompRがompF及びompC以外の多数の遺伝子
を調節することができるので、ompF/ompCの組合せを突然変異させた場合より高 レベルの弱毒化を起こすことができる。このことは、生体内で細菌が生存するた
めに重要である。従って、ompF/ompCの組合せにより、細菌がワクチンを接種し た宿主の中で、より長い時間、より高濃度で生存することができ、その結果その
効力を長時間持続することができる。
を調節することができるので、ompF/ompCの組合せを突然変異させた場合より高 レベルの弱毒化を起こすことができる。このことは、生体内で細菌が生存するた
めに重要である。従って、ompF/ompCの組合せにより、細菌がワクチンを接種し た宿主の中で、より長い時間、より高濃度で生存することができ、その結果その
効力を長時間持続することができる。
【００１２】 ompRの突然変異にはompRに免疫原性に重要な抗原発現性を調節する能力がある
ので、ompF/ompC の組合せ突然変異と比較して免疫原性を低下させることができ
る。
ので、ompF/ompC の組合せ突然変異と比較して免疫原性を低下させることができ
る。
【００１３】 （発明の詳細な説明） （本発明に有用な細菌） 本発明のワクチンを製造するために使用する細菌は、一般に経口ルートで感染
する細菌類である。当該細菌として、真核性細胞又はコロニー或いはその両者の
粘膜表面から侵入して成長する細菌類を使用することができる。当該細菌は、通
常グラム陰性菌である。
する細菌類である。当該細菌として、真核性細胞又はコロニー或いはその両者の
粘膜表面から侵入して成長する細菌類を使用することができる。当該細菌は、通
常グラム陰性菌である。
【００１４】 当該細菌はジェネラ エシェリキア菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌、ヘモフィ リス菌、ナイセリア菌、エルジニア菌、ボルデテラ菌又はブルセラ菌からこれを
選択することができる。これら細菌類の例として、大腸菌（ヒトに下痢を引き起
こす）；ネズミチフス菌（いくつかの動物種にサルモネラ症を引き起こす）；チ
フス菌（ヒトに腸チフスを引き起こす）；ゲルトネル菌（ヒトに食中毒を引き起
こす）；ブタコレラ菌（ブタにサルモネラ症を引き起こす）；サルモネラ ドゥ ブリン菌（Salmonella dublin：ウシ、特に新生ウシに全身病及び下痢症を引き 起こす）；インフルエンザ菌（髄膜炎を引き起こす）；淋菌（淋病を引き起こす
）；エンテロコリチカ菌（ヒトに胃腸炎から致命的な敗血症に至る一連の病気を
引き起こす）；百日咳菌（百日咳を引き起こす）；及びブルセラ流産菌（ウシに
流産及び不妊を引き起こし、ヒトに波状熱として知られる状態を引き起こす）な
どがある。
選択することができる。これら細菌類の例として、大腸菌（ヒトに下痢を引き起
こす）；ネズミチフス菌（いくつかの動物種にサルモネラ症を引き起こす）；チ
フス菌（ヒトに腸チフスを引き起こす）；ゲルトネル菌（ヒトに食中毒を引き起
こす）；ブタコレラ菌（ブタにサルモネラ症を引き起こす）；サルモネラ ドゥ ブリン菌（Salmonella dublin：ウシ、特に新生ウシに全身病及び下痢症を引き 起こす）；インフルエンザ菌（髄膜炎を引き起こす）；淋菌（淋病を引き起こす
）；エンテロコリチカ菌（ヒトに胃腸炎から致命的な敗血症に至る一連の病気を
引き起こす）；百日咳菌（百日咳を引き起こす）；及びブルセラ流産菌（ウシに
流産及び不妊を引き起こし、ヒトに波状熱として知られる状態を引き起こす）な
どがある。
【００１５】 本発明において、大腸菌及びサルモネラ菌の菌株は特に有用である。それら自
体がサルモネラ菌の感染を予防するワクチンであると同時に、弱毒化サルモネラ
菌は、他の微生物からを経口ルートを経由して免疫系へ導入される異種起源抗原
の担体としても使用することができる。サルモネラ菌は強力な免疫原であり、全
身及び局部細胞反応及び抗体反応を刺激することができる。生体内でサルモネラ
菌の中に異種起源抗原の発現の動因となるシステムが存在することが良く知られ
ており、例えばnirB及びhtrAプロモータが生体内における抗原発現の有効な動因
であることが知られている。
体がサルモネラ菌の感染を予防するワクチンであると同時に、弱毒化サルモネラ
菌は、他の微生物からを経口ルートを経由して免疫系へ導入される異種起源抗原
の担体としても使用することができる。サルモネラ菌は強力な免疫原であり、全
身及び局部細胞反応及び抗体反応を刺激することができる。生体内でサルモネラ
菌の中に異種起源抗原の発現の動因となるシステムが存在することが良く知られ
ており、例えばnirB及びhtrAプロモータが生体内における抗原発現の有効な動因
であることが知られている。
【００１６】 本発明は、これをエンテロトキシン性大腸菌（ETEC) に適用することができる
。ETECは下痢を引き起こす大腸菌の一種である。ETECは近位小腸に転移増殖する
。標準的なETEC菌株はATCC H10407である。
。ETECは下痢を引き起こす大腸菌の一種である。ETECは近位小腸に転移増殖する
。標準的なETEC菌株はATCC H10407である。
【００１７】 旅行者が起こす下痢の中で、最も頻繁な単一原因がETECの感染であり、開発途
上国を訪れる旅行者の中で300-900万人の人達がETECに感染している。この病気 が流行している地域において、ETECの感染は幼児及び小さな子供の脱水性下痢症
の重要な原因となっており、１年間に世界中で５歳未満の子供が800,000人も死 んでいる。開発途上国において、臨床病に結びつくETECの感染例は、年齢ととも
に減少し、次第にETECの感染に対して免疫ができることを示している。これと対
照的に、これら地方病の地域を訪れる免疫の無い工業化諸国の大人達は、ETECに
より非常に感染され易い。しかし、これら地方病の地域に長期間滞在し、或いは
これらの地域を繰り返し訪問すると、ETECへの感染し易さは低下する。このこと
は、弱毒化した生きたETECのワクチンを接種することにより、感染が抑えられる
ことを示しているものと考えられる。
上国を訪れる旅行者の中で300-900万人の人達がETECに感染している。この病気 が流行している地域において、ETECの感染は幼児及び小さな子供の脱水性下痢症
の重要な原因となっており、１年間に世界中で５歳未満の子供が800,000人も死 んでいる。開発途上国において、臨床病に結びつくETECの感染例は、年齢ととも
に減少し、次第にETECの感染に対して免疫ができることを示している。これと対
照的に、これら地方病の地域を訪れる免疫の無い工業化諸国の大人達は、ETECに
より非常に感染され易い。しかし、これら地方病の地域に長期間滞在し、或いは
これらの地域を繰り返し訪問すると、ETECへの感染し易さは低下する。このこと
は、弱毒化した生きたETECのワクチンを接種することにより、感染が抑えられる
ことを示しているものと考えられる。
【００１８】 本発明者らは、非毒素発生菌株であるE1392/75/2A と呼ばれるETECについて試
験を行うこととした。E1392/75/2Aは毒性の突然変異体から毒素遺伝子の欠失に より自然発生した菌株である。ヒトの研究において、E1392/75/2Aの生ワクチン を経口摂取することにより、異血清型の毒素発現ETECの攻撃に対して75%の保護 率が得られた。しかし、約15%のワクチン摂取者は当該ワクチンの副作用として 下痢を経験した。当該菌株は、本発明によりさらに弱毒化を達成し、当該副作用
を減少させない限り、有力なワクチンとししてこれを使用することはできない。
験を行うこととした。E1392/75/2Aは毒性の突然変異体から毒素遺伝子の欠失に より自然発生した菌株である。ヒトの研究において、E1392/75/2Aの生ワクチン を経口摂取することにより、異血清型の毒素発現ETECの攻撃に対して75%の保護 率が得られた。しかし、約15%のワクチン摂取者は当該ワクチンの副作用として 下痢を経験した。当該菌株は、本発明によりさらに弱毒化を達成し、当該副作用
を減少させない限り、有力なワクチンとししてこれを使用することはできない。
【００１９】 Seq Id No.1は大腸菌aroC遺伝子の配列を示し、Seq Id No.3は大腸菌ompC遺伝
子の配列を示し、Seq Id. No.5は大腸菌ompF遺伝子の配列を示している。
子の配列を示し、Seq Id. No.5は大腸菌ompF遺伝子の配列を示している。
【００２０】 （その他の突然変異） その他にも一種類以上の突然変異を本発明の細菌中に導入して、aroC、0mpC及
びompF中における突然変異以外の突然変異を含む菌株を発生させることができる
。かかる突然変異としては（ｉ）遺伝子中におけるaroC、ompC及びompF以外の弱
毒化突然変異、（ii）プラスミド（例えば、異種起源の抗原を発現しているプラ
スミド）を維持する細胞のために生体内選択を提供する突然変異、又は(iii) 毒
素遺伝子の発現を防ぐ突然変異などがある。
びompF中における突然変異以外の突然変異を含む菌株を発生させることができる
。かかる突然変異としては（ｉ）遺伝子中におけるaroC、ompC及びompF以外の弱
毒化突然変異、（ii）プラスミド（例えば、異種起源の抗原を発現しているプラ
スミド）を維持する細胞のために生体内選択を提供する突然変異、又は(iii) 毒
素遺伝子の発現を防ぐ突然変異などがある。
【００２１】 さらにその他の弱毒化突然変異として、すでに弱毒化していることが知られて
いる突然変異がある。かかる突然変異には、aro遺伝子（例えばaroA、aroD及びa
roE）、pur、htrA、ompR、galE、cya、crp、phoP及びsurA中で起こる突然変異な
どがある（例えば２，４，５，９，12，13，16，17及び18参照）。
いる突然変異がある。かかる突然変異には、aro遺伝子（例えばaroA、aroD及びa
roE）、pur、htrA、ompR、galE、cya、crp、phoP及びsurA中で起こる突然変異な
どがある（例えば２，４，５，９，12，13，16，17及び18参照）。
【００２２】 プラスミド維持のための選択を提供する突然変異は、細菌の生存にとって必須
の遺伝子を突然変異させることにより行われる。必須遺伝子を乗せたプラスミド
を次に当該細菌に導入し、細胞だけが生存できるようにする。当該プラスミドが
例えば細菌により発現される異種起源の抗原を含んでいる場合に、この方法は有
用であろう。
の遺伝子を突然変異させることにより行われる。必須遺伝子を乗せたプラスミド
を次に当該細菌に導入し、細胞だけが生存できるようにする。当該プラスミドが
例えば細菌により発現される異種起源の抗原を含んでいる場合に、この方法は有
用であろう。
【００２３】 細菌を使用して調製したワクチンを摂取したために副作用が起こる場合があり
、これを減らす目的で、毒素遺伝子の発現を防ぐような突然変異を起こさせるこ
とができる。例えば、ETECなどの大腸菌株によるワクチンを摂取した場合には、
熱に不安定な毒素（LT）遺伝子又は熱に安定な毒素（ST）遺伝子を、これらが発
現されないように突然変異させることが好ましいであろう。
、これを減らす目的で、毒素遺伝子の発現を防ぐような突然変異を起こさせるこ
とができる。例えば、ETECなどの大腸菌株によるワクチンを摂取した場合には、
熱に不安定な毒素（LT）遺伝子又は熱に安定な毒素（ST）遺伝子を、これらが発
現されないように突然変異させることが好ましいであろう。
【００２４】 （突然変異の性格） 細菌性ワクチンの中へ導入された突然変異により、通常、遺伝子機能は完全に
ノックアウトされる。遺伝子からのポリペプチド合成機能を完全に無効化するか
、又は非機能ポリペプチド合成機能を与えるような突然変異を起こさせることに
より、これを達成することができる。ポリペプチド合成の機能を無効化するには
、遺伝子全体か又はその5'端を欠失させることができる。遺伝子のコード化配列
内の欠失又は挿入により、非機能ポリペプチド（例えば野性型タンパク質のN-末
端配列のみを含むポリペプチド）のみを合成する遺伝子を創ることができる。
ノックアウトされる。遺伝子からのポリペプチド合成機能を完全に無効化するか
、又は非機能ポリペプチド合成機能を与えるような突然変異を起こさせることに
より、これを達成することができる。ポリペプチド合成の機能を無効化するには
、遺伝子全体か又はその5'端を欠失させることができる。遺伝子のコード化配列
内の欠失又は挿入により、非機能ポリペプチド（例えば野性型タンパク質のN-末
端配列のみを含むポリペプチド）のみを合成する遺伝子を創ることができる。
【００２５】 当該突然変異は非可逆性突然変異である。これらの突然変異は、当該細菌をワ
クチンに使用した場合に、本質的に野性型へ逆戻りしない突然変異である。かか
る突然変異には、挿入及び欠失などが含まれる。挿入及び欠失部分のサイズはで
きるだけ大きい方が好ましく、通常は少なくとも10個のヌクレオチド（例えば10
−600個のヌクレオチド）が挿入又は欠失される。できれば、全コード化配列が 欠失されることが好ましい。
クチンに使用した場合に、本質的に野性型へ逆戻りしない突然変異である。かか
る突然変異には、挿入及び欠失などが含まれる。挿入及び欠失部分のサイズはで
きるだけ大きい方が好ましく、通常は少なくとも10個のヌクレオチド（例えば10
−600個のヌクレオチド）が挿入又は欠失される。できれば、全コード化配列が 欠失されることが好ましい。
【００２６】 ワクチンに使用する細菌は、はっきりした（即ち明確にキャラクタリゼーショ
ンされた）突然変異のみを含むことが好ましい。キャラクタリゼーションされて
いない突然変異は細菌に好ましくない副作用の原因となるような性質を与える危
険性があるので、ゲノム中にキャラクタリゼーションされていない突然変異を含
むような細菌をワクチンに使用することが好ましくないことは明らかである。
ンされた）突然変異のみを含むことが好ましい。キャラクタリゼーションされて
いない突然変異は細菌に好ましくない副作用の原因となるような性質を与える危
険性があるので、ゲノム中にキャラクタリゼーションされていない突然変異を含
むような細菌をワクチンに使用することが好ましくないことは明らかである。
【００２７】 弱毒化突然変異は、本技術に精通した人達に良く知られた方法（参考文献14参
照）により、これを導入することができる。適切な方法として、野性型の遺伝子
のDNA配列をベクター、例えばプラスミドの中へクローン化し、当該クローン化D
NA配列の中へ選択可能なマーカーを挿入し、又はDNA配列の一部を欠失させて、 これを不活性化する方法などがある。欠失は、例えば制限酵素を使用してコード
化配列の中又はそのすぐ外側でDNA配列を切断し、残った配列の２端を互いに結 紮することにより、これを導入することができる。不活性化DNAを乗せたプラス ミドは、電気穿孔及び接合など既知の方法により、これを細菌に形質移入するこ
とができる。次に、適切な選択を行うことにより、不活性化DNA配列を細菌の染 色体に再結合し、これにより野性型のDNA配列が同族再結合により非機能化され た突然変異体を突き止めることができる。
照）により、これを導入することができる。適切な方法として、野性型の遺伝子
のDNA配列をベクター、例えばプラスミドの中へクローン化し、当該クローン化D
NA配列の中へ選択可能なマーカーを挿入し、又はDNA配列の一部を欠失させて、 これを不活性化する方法などがある。欠失は、例えば制限酵素を使用してコード
化配列の中又はそのすぐ外側でDNA配列を切断し、残った配列の２端を互いに結 紮することにより、これを導入することができる。不活性化DNAを乗せたプラス ミドは、電気穿孔及び接合など既知の方法により、これを細菌に形質移入するこ
とができる。次に、適切な選択を行うことにより、不活性化DNA配列を細菌の染 色体に再結合し、これにより野性型のDNA配列が同族再結合により非機能化され た突然変異体を突き止めることができる。
【００２８】 （異種起源抗原の発現） 本発明の弱毒化細菌の遺伝子を操作し、当該弱毒化細菌が異種起源抗原の担体
として作用するように、野性型細菌によっては発現されない抗原（「異種起源抗
原」）を当該弱毒化細菌の中に発現させることができる。当該抗原として他の微
生物の抗原を使用すれば、当該ワクチンが他の微生物に対しても保護効果を発揮
できる。このようにして、有毒な弱毒化細菌の親細菌に対して免疫を与えるだけ
でなく、その他微生物に対しても免疫を与える多価ワクチンを造ることができる
。さらに、当該弱毒化細菌を遺伝子操作して、２つ以上の異種起源抗原を発現さ
せることもできる。この場合は、当該異種起源抗原は同じ微生物のものであって
も、又は異なる微生物のものであっても良い。
として作用するように、野性型細菌によっては発現されない抗原（「異種起源抗
原」）を当該弱毒化細菌の中に発現させることができる。当該抗原として他の微
生物の抗原を使用すれば、当該ワクチンが他の微生物に対しても保護効果を発揮
できる。このようにして、有毒な弱毒化細菌の親細菌に対して免疫を与えるだけ
でなく、その他微生物に対しても免疫を与える多価ワクチンを造ることができる
。さらに、当該弱毒化細菌を遺伝子操作して、２つ以上の異種起源抗原を発現さ
せることもできる。この場合は、当該異種起源抗原は同じ微生物のものであって
も、又は異なる微生物のものであっても良い。
【００２９】 当該異種起源抗原は、決定基を含むタンパク質の全体であっても又はその一部
であっても良い。当該抗原は他の細菌、ウィルス、酵母菌又は真菌のものであっ
ても良い。特に、当該抗原配列は大腸菌（例えばETEC）；破傷風菌；Ａ型、Ｂ型
、Ｃ型肝炎ウィルス；２型又は14型ヒト ライノウィルス；単純疱疹ウィルス； ２型又は３型ポリオウィルス；口蹄疫ウィルス；インフルエンザウィルス；コク
サーキーウィルス又はクラミジア トラコーマ菌由来のものであることが望まし い。有用な抗原としては、大腸菌熱変化性毒素の無毒成分、大腸菌K88抗原、ETE
C転移増殖因子抗原、百日咳菌由来のP.69タンパク質及び破傷風毒素フラグメン トＣなどが存在する。
であっても良い。当該抗原は他の細菌、ウィルス、酵母菌又は真菌のものであっ
ても良い。特に、当該抗原配列は大腸菌（例えばETEC）；破傷風菌；Ａ型、Ｂ型
、Ｃ型肝炎ウィルス；２型又は14型ヒト ライノウィルス；単純疱疹ウィルス； ２型又は３型ポリオウィルス；口蹄疫ウィルス；インフルエンザウィルス；コク
サーキーウィルス又はクラミジア トラコーマ菌由来のものであることが望まし い。有用な抗原としては、大腸菌熱変化性毒素の無毒成分、大腸菌K88抗原、ETE
C転移増殖因子抗原、百日咳菌由来のP.69タンパク質及び破傷風毒素フラグメン トＣなどが存在する。
【００３０】 ETEC転移増殖因子及びその成分は、発現異種起源抗原の主要候補である。下痢
性の病気を煽動するために、ETECの病原性菌株は腸に転移増殖し、エンテロトキ
シン（腸毒素）を造りだすことができなければならない。腸粘膜に付着するため
に必要な多くのETEC転移増殖因子（CF）菌株が確認されている。ほぼ全ての場合
において、CFが細菌の外面上に房状に発現する。数多くのCFが見いだされている
が、その中で最も一般的なものがCFAＩ、CFAII（CS１、CS２、CS３を含む）及び
CFAIV（CS４、CS５、CS６を含む）である。
性の病気を煽動するために、ETECの病原性菌株は腸に転移増殖し、エンテロトキ
シン（腸毒素）を造りだすことができなければならない。腸粘膜に付着するため
に必要な多くのETEC転移増殖因子（CF）菌株が確認されている。ほぼ全ての場合
において、CFが細菌の外面上に房状に発現する。数多くのCFが見いだされている
が、その中で最も一般的なものがCFAＩ、CFAII（CS１、CS２、CS３を含む）及び
CFAIV（CS４、CS５、CS６を含む）である。
【００３１】 ETEC用のワクチンは、一連の転移増殖因子抗原に対して保護を与え、これによ
り種々の異なる菌株から保護されることを保証できるのが理想である。１種類の
菌株に複数の転移増殖因子を発現させることにより、この目的を達成することが
できるものと考えられる。これに代わる方法として、それぞれ異なる転移増殖因
子を有する一連の異なるETEC菌株に対して、同じ弱毒化を行うこともできよう。
この方法には、かかる菌株の毒素を欠失する操作が含まれる。
り種々の異なる菌株から保護されることを保証できるのが理想である。１種類の
菌株に複数の転移増殖因子を発現させることにより、この目的を達成することが
できるものと考えられる。これに代わる方法として、それぞれ異なる転移増殖因
子を有する一連の異なるETEC菌株に対して、同じ弱毒化を行うこともできよう。
この方法には、かかる菌株の毒素を欠失する操作が含まれる。
【００３２】 異種起源抗原をコード化するDNAは、生体内で活性を有するプロモータから発 現する。サルモネラ菌の中で充分に作用することが示されている２種類のプロモ
ータは、nirBプロモータ（19，20）及びhtrAプロモータ（20）である。ETEC転移
増殖因子抗原を発現させるために、野性型のプロモータを使用することも可能で
あろう。
ータは、nirBプロモータ（19，20）及びhtrAプロモータ（20）である。ETEC転移
増殖因子抗原を発現させるために、野性型のプロモータを使用することも可能で
あろう。
【００３３】 異種起源抗原をコード化するDNAに操作可能な状態で結合したプロモータで構 成されるDNAを構築し、従来の技術を使用して、これを弱毒化細菌に形質変換す ることができる。当該DNA構造を含む形質変換剤を、例えば当該構造上でマーカ ーをスクリーニングすることにより選択することができる。当該構造を含む細菌
を生体外で増殖させ、これをワクチンに処方して宿主に接種することができる。
を生体外で増殖させ、これをワクチンに処方して宿主に接種することができる。
【００３４】 （ワクチンの処方） ワクチンは、既知の弱毒化細菌のワクチン処方技術を使用して、これを処方す
ることができる。当該ワクチンは、例えば凍結乾燥法により調製したカプセル化
を経口投与して接種することが望ましい。かかるカプセルは、例えばEudragate
"S"（商品名）、Eudragate "L"（商品名）、酢酸セルロース、フタル酸セルロー
ス又はヒドロキシメチル セルロースで構成される溶腸性被覆物でこれを調製す ることができる。これらのカプセルは、上記の方法で使用することもできるが、
凍結乾燥した薬剤を懸濁液に調製し直してこれを投与することもできる。当該再
調製は、当該細菌の生存に適したpHの緩衝液中でこれを行うことが望ましい。弱
毒化細菌及びワクチンを胃腸管の酸性から保護するために、ワクチン投与前に重
炭酸ナトリウム製剤を投与することが望ましい。或いは、当該ワクチンを非経口
投与、鼻孔内投与又は筋肉内投与用として調製することもできる。
ることができる。当該ワクチンは、例えば凍結乾燥法により調製したカプセル化
を経口投与して接種することが望ましい。かかるカプセルは、例えばEudragate
"S"（商品名）、Eudragate "L"（商品名）、酢酸セルロース、フタル酸セルロー
ス又はヒドロキシメチル セルロースで構成される溶腸性被覆物でこれを調製す ることができる。これらのカプセルは、上記の方法で使用することもできるが、
凍結乾燥した薬剤を懸濁液に調製し直してこれを投与することもできる。当該再
調製は、当該細菌の生存に適したpHの緩衝液中でこれを行うことが望ましい。弱
毒化細菌及びワクチンを胃腸管の酸性から保護するために、ワクチン投与前に重
炭酸ナトリウム製剤を投与することが望ましい。或いは、当該ワクチンを非経口
投与、鼻孔内投与又は筋肉内投与用として調製することもできる。
【００３５】 当該ワクチンは、哺乳類宿主特にヒト宿主のワクチン接種に使用することがで
きるが、動物宿主に接種することもできる。従って、本発明に基づいて調製した
有効量のワクチンを投与することにより、微生物特に病原体による感染を防止す
ることができる。使用する投与量は、最終的には担当医の判断によるものとする
が、宿主のサイズ及び体重並びに処方するワクチンの種類など、種々の要因によ
り変化する。しかし、経口投与を行う場合の投与量は、体重70 kgの大人（ヒト ）の場合、１回の投与量として細菌107-1011個分が適当であると考えられる。
きるが、動物宿主に接種することもできる。従って、本発明に基づいて調製した
有効量のワクチンを投与することにより、微生物特に病原体による感染を防止す
ることができる。使用する投与量は、最終的には担当医の判断によるものとする
が、宿主のサイズ及び体重並びに処方するワクチンの種類など、種々の要因によ
り変化する。しかし、経口投与を行う場合の投与量は、体重70 kgの大人（ヒト ）の場合、１回の投与量として細菌107-1011個分が適当であると考えられる。
【００３６】 （例） 本発明を説明するために、本節ではその例について説明する。
【００３７】 （例１：本発明に基づく菌株の構築及びキャラクタリゼーション） 欠失の設計及びプラスミドpCVDΔAroC, pCVDΔOmpC及びpCVDΔOmpFの構築 標
的遺伝子の開放読取枠全体を除去する欠失を設計した。テンプレートとして大腸
菌のゲノム配列を使用し、標的の開放読取枠を縁取っている500 - 600個の塩基 対フラグメントを増幅するようにPCRプライマを設計した（プライマ配列に関し ては表１を参照のこと）。PCRによるオーバーラップ拡張接合法を使用し、２個 の縁取り配列を融合させ、遺伝子全体を欠失させたPCR産物を創った（図１）。 欠失サイト周辺の野性型配列及び欠失後に予想される配列を図２に示す。
的遺伝子の開放読取枠全体を除去する欠失を設計した。テンプレートとして大腸
菌のゲノム配列を使用し、標的の開放読取枠を縁取っている500 - 600個の塩基 対フラグメントを増幅するようにPCRプライマを設計した（プライマ配列に関し ては表１を参照のこと）。PCRによるオーバーラップ拡張接合法を使用し、２個 の縁取り配列を融合させ、遺伝子全体を欠失させたPCR産物を創った（図１）。 欠失サイト周辺の野性型配列及び欠失後に予想される配列を図２に示す。
【００３８】 各遺伝子に対して、接合域の中へ２個の異なる制限サイトを導入した（下表２
参照）。これらの制限サイトを、欠失クローンの同定に使用した。PCRフラグメ ントのいずれかの端にあるPCRプライマによりユニークな制限サイトを導入し、 これをフラグメントのpCVD442多重クローン化サイト中へのクローン化に使用し た（図３）。
参照）。これらの制限サイトを、欠失クローンの同定に使用した。PCRフラグメ ントのいずれかの端にあるPCRプライマによりユニークな制限サイトを導入し、 これをフラグメントのpCVD442多重クローン化サイト中へのクローン化に使用し た（図３）。
【００３９】 PCR産物はQiagen（商品名）ゲル抽出キットを使用してこれをゲル精製し、適 切な制限酵素で消化してから、同じ酵素で消化し且つアルカリ性ホスファターゼ
で処理してベクターの自己結紮を防いだ自殺プラスミドpCVD442（22）に結紮し た（図３）。当該結紮混合物をSY327λpir中で形質変換し、L-アンピシリン（10
0 μg/ml）プレート上に接種した。アンピシリン抵抗形質変換体のプラスミドを
制限消化法によりスクリーニングし、欠失カセットの存在を調べた。その結果、
下記プラスミドの発生が明らかになった。 pCVDΔAroC pCVDΔOmpC pCVDΔOmpF
で処理してベクターの自己結紮を防いだ自殺プラスミドpCVD442（22）に結紮し た（図３）。当該結紮混合物をSY327λpir中で形質変換し、L-アンピシリン（10
0 μg/ml）プレート上に接種した。アンピシリン抵抗形質変換体のプラスミドを
制限消化法によりスクリーニングし、欠失カセットの存在を調べた。その結果、
下記プラスミドの発生が明らかになった。 pCVDΔAroC pCVDΔOmpC pCVDΔOmpF
【００４０】 自殺（suicide）プラスミドpCVD442は、pir遺伝子を宿した細胞中でのみ複製 することができる。これを非pir菌株の中へ導入すると、pCVD442の複製は不可能
となり、当該プラスミドにより与えられたアンピシリン抵抗は、当該プラスミド
が単一の同族再結合により染色体に統合された場合にのみこれを維持することが
できる。当該プラスミドもsacB遺伝子を有し、これがレバン スクラーゼをコー ド化する。当該レバン スクラーゼは蔗糖の存在下にグラム陰性菌に対して毒性 を示す。この性質により、第二の再結合を行うクローンを選別することができ、
第二の当該再結合で当該自殺プラスミドが切除される。当該細胞は蔗糖に対して
抵抗力を示すが、アンピシリンに対しては敏感である。
となり、当該プラスミドにより与えられたアンピシリン抵抗は、当該プラスミド
が単一の同族再結合により染色体に統合された場合にのみこれを維持することが
できる。当該プラスミドもsacB遺伝子を有し、これがレバン スクラーゼをコー ド化する。当該レバン スクラーゼは蔗糖の存在下にグラム陰性菌に対して毒性 を示す。この性質により、第二の再結合を行うクローンを選別することができ、
第二の当該再結合で当該自殺プラスミドが切除される。当該細胞は蔗糖に対して
抵抗力を示すが、アンピシリンに対しては敏感である。
【００４１】 （ΔAroCΔOmpCΔOmpF菌株の構築及びキャラクタリゼーション） 本節においては、菌株の構築及びΔAroCΔOmpCΔOmpF菌株の歴史について順を
追って説明する。本節において、「ETEC」とは、特に菌株E1392/75/2A及びその 誘導体を指すものとする。
追って説明する。本節において、「ETEC」とは、特に菌株E1392/75/2A及びその 誘導体を指すものとする。
【００４２】 先ず下記の順序で、ΔAroCΔOmpCΔOmpF欠失をE1392/75/2Aに導入した。 ΔA
roC→ΔAroCΔOmpC→ΔAroCΔOmpCΔOmpF
roC→ΔAroCΔOmpC→ΔAroCΔOmpCΔOmpF
【００４３】 （ETECΔAorCの構築） １）元のミクロバンク保存菌から採取したE1392/75/2AをL-寒天上に植え付け た。 ２）これらの細胞から、電気泳動易動度（electroporation）が可能な細胞を 調製した。その中100 μlを凍結した。 ３）Qiagen Qiafilter（商品名）ミディプレップを使用して、SY327pir細胞か
らpCVDΔAroCを精製した。エタノール沈殿により、当該プラスミドを約10倍に濃
縮した。pCVDΔAroCの構築方法はすでに説明した通りである。
らpCVDΔAroCを精製した。エタノール沈殿により、当該プラスミドを約10倍に濃
縮した。pCVDΔAroCの構築方法はすでに説明した通りである。
【００４４】 ４）濃縮プラスミド５μlを除氷細胞100 μlと混ぜ合わせて電気泳動易動度に
かけた。形質変換物全体をL-アンピシリン プレート上に植付け（50 μg/ml）、
37℃で一晩インキュベートした。
かけた。形質変換物全体をL-アンピシリン プレート上に植付け（50 μg/ml）、
37℃で一晩インキュベートした。
【００４５】 ５）アンピシリンに抵抗力を持つコロニーが一つだけ成長した。
【００４６】 ６）当該コロニーをL-アンピシリン プレート上に筋状に塗り（100 μg/ml） 、37 ℃で一晩成長させた（「メロディプロイド プレート）。
【００４７】 ７）TT19及びTT20（aroC遺伝子に固有のプライマ）を使用したPCR及びメロデ ィプロイド プレートから拾い上げたコロニーは、２本のバンドを増幅した。当 該バンドのサイズは野性型及びΔaroC遺伝子のサイズに対応していた。当該プラ
イマの配列を下表１に示す。
イマの配列を下表１に示す。
【００４８】 ８）メロディプロイド プレートから採取したコロニーを、ａ）L-アンピシリ ン ブロス（100 μg/ml）及びL-ブロス中で７時間かけ、完全に成長させた。L- アンピシリン上で成長したコロニーをミクロバンクに保存した。
【００４９】 ９）L-ブロスの培養組織を順次希釈し、下記の媒体上に接種した。 ａ）無塩L-寒天 ｂ）無塩L-寒天＋５%蔗糖 これらのプレートを30 ℃で一晩インキュベートした。
【００５０】 10）コロニー計数値から、L-寒天＋５%蔗糖よりL-寒天の方が、104個も多いコ
ロニーを成長させたことが分かった。この事実から、蔗糖の選択が結果に影響し
たことが分かる。
ロニーを成長させたことが分かった。この事実から、蔗糖の選択が結果に影響し
たことが分かる。
【００５１】 11）PCRにより蔗糖抵抗コロニーのスクリーニングを行い、ΔaroC遺伝子の有 無を調べた。スクリーニング用に選択したコロニーを拾い上げてL-寒天プレート
に接種し、37 ℃で一晩成長させた。当該プレートを４ ℃で保存して、その後の
試験に供した。
に接種し、37 ℃で一晩成長させた。当該プレートを４ ℃で保存して、その後の
試験に供した。
【００５２】 12）試験を行ったコロニーの50%に、ΔaroCだけが含まれていた。
【００５３】 13）コロニーを下記プレート上に接種して試験を行った。 ａ）M-9最少媒体プレート ｂ）M-9最少媒体＋アロミックス プレート ｃ）L-アンピシリン プレート（100 μg/ml） ΔaroCコロニーは、アロミックスを含まないM-9最少媒体上、又はL-アン ピシリン上では成長しないものと思われる。 アロミックスは、下記芳香族化合物の混合物である。 これらの化合物は野性型の細菌中で造られるが、aroC突然変異によりその合成
が阻止される。
が阻止される。
【００５４】 14）M-9最少媒体において13/14個の推定ΔAroCコロニーが成長するためには、
アロミックスの存在が必要であった。また、これら13/14個の推定ΔAroCコロニ ーはアンピシリンに対して敏感であった。
アロミックスの存在が必要であった。また、これら13/14個の推定ΔAroCコロニ ーはアンピシリンに対して敏感であった。
【００５５】 15）３つのコロニー（１, ２, ３）について、プライマMGR169及びMGR170を使
用するPCR法により、CS１主要ピリン タンパク質遺伝子の有無を試験した。３つ
のコロニー全てについて、期待通りのサイズ（700 bp）を有するPCR産物が得ら れた。当該プライマの配列を表１に示す。
用するPCR法により、CS１主要ピリン タンパク質遺伝子の有無を試験した。３つ
のコロニー全てについて、期待通りのサイズ（700 bp）を有するPCR産物が得ら れた。当該プライマの配列を表１に示す。
【００５６】 16）マスター プレートのスクリーニングにより得られたコロニー１，２及び ３をL-寒天上に筋状に接種し、37 ℃で一晩成長させた。これらのプレートから 採取した細胞をミクロバンク チューブに接種した。
【００５７】 17）ミクロバンクに保存したコロニー１を使用して、さらに試験を進めた。
【００５８】 18）永久保存を目的として、ミクロバンク トレーから採取したビーズ１個をL
-ブロス１ ml中に接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させて寒天スロー プを調製し、これを凍結乾燥して保存した。E1392/75/2AΔAroCの凍結乾燥保存 物をPTL004と命名した。残りの培養組織１ mlにL-ブロス20 mlを添加し、当該培
養組織を30 ℃で一晩インキュベートした。３つの各冷凍容器に当該一晩培養組 織１ mlずつを移し、液体チッ素中に保存した。
-ブロス１ ml中に接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させて寒天スロー プを調製し、これを凍結乾燥して保存した。E1392/75/2AΔAroCの凍結乾燥保存 物をPTL004と命名した。残りの培養組織１ mlにL-ブロス20 mlを添加し、当該培
養組織を30 ℃で一晩インキュベートした。３つの各冷凍容器に当該一晩培養組 織１ mlずつを移し、液体チッ素中に保存した。
【００５９】 （ETECΔAroCΔOmprの構築） １）電気泳動易動度に使用するpCVDΔOmpCプラスミドDNAの調製 pCVPΔOmpCを宿したSY327λpirのコロニーを37 ℃で一晩、L-アンピシリ ン ブロス100 ml中で成長させた（100 μg/ml）。Qiagen Qiafilter（商品名） ミディプレップ２個を使用して、プラスミドDNAを精製した。DNAをさらにエタノ
ール沈殿により濃縮した。pCVDΔOmpCの構築についてはすでに説明した。
ール沈殿により濃縮した。pCVDΔOmpCの構築についてはすでに説明した。
【００６０】 ２）電気泳動易動度抵抗細胞の調製 前節ステップ17で調製したミクロバンク トレーから採取したETECΔAroC 細胞を、L-寒天上に筋状塗布し、37 ℃で一晩成長させ、４ ℃で１週間以下の期
間保存してから、電気泳動易動度抵抗細胞の調製を目的として培養組織に接種し
た。
間保存してから、電気泳動易動度抵抗細胞の調製を目的として培養組織に接種し
た。
【００６１】 ３）ETECΔAroC細胞を、濃縮pCVDΔOmpC DNA５μl及び単一L-アンピシリン プ
レート上だけで培養した各形質変換体（50 μg/ml）でエレクトロポレートし、3
7 ℃で一晩成長させた。
レート上だけで培養した各形質変換体（50 μg/ml）でエレクトロポレートし、3
7 ℃で一晩成長させた。
【００６２】 ４）17個の アンピシリン抵抗コロニー（推定ETECΔAroC/pCVDΔOmoCメロディ
プロイド）が得られた。
プロイド）が得られた。
【００６３】 ５）これらのコロニーをマスター L-アンピシリン（100 μg/ml）プレート上 にスポット塗布し、これをプライマTT７/TT８を含むPCR用のテンプレートとして
使用した。当該マスター プレートは、室温で週末一杯かけて成長させた。当該 プライマの配列を下表１に示す。
使用した。当該マスター プレートは、室温で週末一杯かけて成長させた。当該 プライマの配列を下表１に示す。
【００６４】 ６）１個のコロニー（＃７）にΔompC遺伝子の存在が認められた。
【００６５】 ７）当該コロニーをL-ブロス中で５時間成長させた。
【００６６】 ８）当該L-ブロス培養組織を順次希釈して、下記媒体上に接種した。 ａ）無塩L-寒天 ｂ）無塩L-寒天＋５%蔗糖 これらのプレートを、30 ℃で一晩インキュベートした。
【００６７】 ９）コロニー計数値は、L-寒天＋５%蔗糖に比べて104個も多いコロニーが、L-
寒天上で成長したことを示している。この結果から、蔗糖の選択が有効であった
ことが分かる。
寒天上で成長したことを示している。この結果から、蔗糖の選択が有効であった
ことが分かる。
【００６８】 10）45個の蔗糖抵抗コロニーについて、プライマTT７及びTT８を使用し、PCR によりΔompCの有無をスクリーニングした。９個のコロニーにΔompC遺伝子の存
在が認められたが、その大部分は、ompC遺伝子をほんの微量含むだけであった。
プライマの配列を下表１に示す。
在が認められたが、その大部分は、ompC遺伝子をほんの微量含むだけであった。
プライマの配列を下表１に示す。
【００６９】 11）さらに推定ETECΔAroCΔOmpCコロニーについてキャラクタリゼーションを
行うため、これらコロニーをL-ブロス１ ml中で５時間成長させ、下記プレート 上に接種した。 ａ）L-寒天＋100 μg/mlアンピシリン ｂ）L-寒天 ｃ）L-寒天＋５%蔗糖 ΔOmpCコロニーは、蔗糖抵抗性を有し、アンピシリンには敏感であるもの
と考えられた。
行うため、これらコロニーをL-ブロス１ ml中で５時間成長させ、下記プレート 上に接種した。 ａ）L-寒天＋100 μg/mlアンピシリン ｂ）L-寒天 ｃ）L-寒天＋５%蔗糖 ΔOmpCコロニーは、蔗糖抵抗性を有し、アンピシリンには敏感であるもの
と考えられた。
【００７０】 12）ただ１つのコロニー（＃１）だけが、アンピシリンに対して敏感で、蔗糖
に対して抵抗性を有していた。
に対して抵抗性を有していた。
【００７１】 13）コロニー１について、プライマTT19/TT20, TT７/TT８並びにMGR169及び17
0を含むPCR により、ΔaroC、ΔompC及びCS１遺伝子の有無をチェックした。当 該プライマの配列を、下表１に示す。
0を含むPCR により、ΔaroC、ΔompC及びCS１遺伝子の有無をチェックした。当 該プライマの配列を、下表１に示す。
【００７２】 14）コロニー１からは、ΔaroC, ΔompC及びCS１遺伝子に関して、その期待サ
イズの産物はただ一つしか得られなかった。
イズの産物はただ一つしか得られなかった。
【００７３】 15）当該コロニーをミクロバンクに保存した。
【００７４】 16）永久保存を目的として、当該ミクロバンクからビーズ１個を取り出し、こ
れをL-ブロス１ ml中に接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させ、これを
使用して寒天スロープを調製し、これを凍結乾燥した。凍結乾燥保存したE1392/
75/2AΔAroCΔOmpCを、PTL008と命名した。培養組織１ mlの残りにL-ブロス 20
mlを添加し、当該培養液を30℃で一晩インキュベートした。当該一晩培養組織各
１ mlを３個の冷凍容器に移し、液体チッ素中で保存した。
れをL-ブロス１ ml中に接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させ、これを
使用して寒天スロープを調製し、これを凍結乾燥した。凍結乾燥保存したE1392/
75/2AΔAroCΔOmpCを、PTL008と命名した。培養組織１ mlの残りにL-ブロス 20
mlを添加し、当該培養液を30℃で一晩インキュベートした。当該一晩培養組織各
１ mlを３個の冷凍容器に移し、液体チッ素中で保存した。
【００７５】 （ETECΔAroCΔOmpCΔOmpFの構築） 接合法により、pCVDΔOmpFをE1392/75/2AΔAroCΔOmpCに導入した。
【００７６】 １）接合授与体細胞SM10λpirをpCVDΔOmpFで形質変換した。当該プラスミドp
CVDΔOmpFの構築法についてはすでに説明した。
CVDΔOmpFの構築法についてはすでに説明した。
【００７７】 ２）ETECΔAroCΔOmpC細胞をSM10λpir/pCVDΔOmpF細胞に接合した。当該pCVD
442プラスミドには、プラスミドがRP４転移遺伝子（例えばSM10λpir）を含む授
与菌株から受容菌株への転移を可能にする転移源が含まれている。ETECΔaroCΔ
ompC細胞及びpCVDΔompF組替体を宿している大腸菌株SM10λpirをL-寒天プレー ト上で約10 cm2の面積を覆うように筋状にクロス接種した。当該プレートを37 ℃で20時間インキュベートし、成長組織をL-ブロス４ mlで洗い流し、マクコン キー寒天（Difco社；ストレプトマイシン20 μg/ml及びアンピシリン300 μg/ml
を含有）プレート上に当該懸濁液を塗布した。当該プレートを37 ℃で一晩イン キュベートし、適切なオリゴヌクレオチドをプライマとして使用して、PCRによ り得られたコロニーのメロディプロイディ(merodiploidy)をチェックした。
442プラスミドには、プラスミドがRP４転移遺伝子（例えばSM10λpir）を含む授
与菌株から受容菌株への転移を可能にする転移源が含まれている。ETECΔaroCΔ
ompC細胞及びpCVDΔompF組替体を宿している大腸菌株SM10λpirをL-寒天プレー ト上で約10 cm2の面積を覆うように筋状にクロス接種した。当該プレートを37 ℃で20時間インキュベートし、成長組織をL-ブロス４ mlで洗い流し、マクコン キー寒天（Difco社；ストレプトマイシン20 μg/ml及びアンピシリン300 μg/ml
を含有）プレート上に当該懸濁液を塗布した。当該プレートを37 ℃で一晩イン キュベートし、適切なオリゴヌクレオチドをプライマとして使用して、PCRによ り得られたコロニーのメロディプロイディ(merodiploidy)をチェックした。
【００７８】 ３）推定ETECのトランス接合体をスクリーニングした。10個のコロニーをマク
コンキー寒天プレートから拾い、これをL-アンピシリン（100 μg/ml）寒天上で
一晩成長させた。プライマTT１/TT２を含むPCRによりΔompF遺伝子の存在をチェ
ックした。当該プライマの配列を下表１に示す。
コンキー寒天プレートから拾い、これをL-アンピシリン（100 μg/ml）寒天上で
一晩成長させた。プライマTT１/TT２を含むPCRによりΔompF遺伝子の存在をチェ
ックした。当該プライマの配列を下表１に示す。
【００７９】 ４）当該コロニーをL-ブロス中で５時間成長させた。
【００８０】 ５）当該L-ブロス培養組織を順次希釈し、これを下記媒体上に植えつけた。 ａ）無塩L-寒天 ｂ）無塩L-寒天＋５%蔗糖 これらのプレートを、30 ℃で一晩インキュベートした。
【００８１】 ６）コロニーの計数結果から、L-寒天の場合には、L-寒天＋５%蔗糖の場合よ り105個多いコロニーが成長したことが分かった。このことから、蔗糖の選択が 効いていることが分かる。
【００８２】 ７）蔗糖抵抗コロニーについて、プライマとしてTT１/TT２を使用し、PCRによ
りΔompF遺伝子の有無をスクリーニングした。当該プライマの配列を下表１に示
す。スクリーニングしたコロニーを、L-寒天上で一晩成長させた。47個のコロニ
ーの中３個のコロニーにΔompF遺伝子の存在が認められた。野性型ompF遺伝子が
存在する証拠は見いだされなかった。
りΔompF遺伝子の有無をスクリーニングした。当該プライマの配列を下表１に示
す。スクリーニングしたコロニーを、L-寒天上で一晩成長させた。47個のコロニ
ーの中３個のコロニーにΔompF遺伝子の存在が認められた。野性型ompF遺伝子が
存在する証拠は見いだされなかった。
【００８３】 ８）推定ETECΔAroCΔOmpCΔOmpFコロニーのキャラクタリゼーションをさらに
行うために、これらコロニーを下記媒体上に接種した。 ａ）L-寒天＋100 μg/mlアンピシリン ｂ）L-寒天 ｃ）L-寒天＋５%蔗糖 ΔOmpCコロニーは蔗糖抵抗性を有し、アンピシリンに対しては敏感である
ものと考えられた。
行うために、これらコロニーを下記媒体上に接種した。 ａ）L-寒天＋100 μg/mlアンピシリン ｂ）L-寒天 ｃ）L-寒天＋５%蔗糖 ΔOmpCコロニーは蔗糖抵抗性を有し、アンピシリンに対しては敏感である
ものと考えられた。
【００８４】 ９）３つのΔompFコロニーは、全てアンピシリンに対しては敏感であり、蔗糖
に対しては抵抗性を示した。
に対しては抵抗性を示した。
【００８５】 10）当該コロニーをミクロバンクに保存し、その中の一つを選んでマスター ストックとした。
【００８６】 11）永久保存する目的で、当該マスター ストックから採取したビーズ１個をL
-ブロス１ mlに接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させて寒天スロープ を調製し、これを凍結乾燥保存組織として使用した。E1392/75/2AΔaroCΔompC ΔompFの当該凍結乾燥保存組織をPTL003と命名した。培養組織１ mlの残りにL- ブロス20 mlを添加し、当該培養組織を30 ℃で一晩インキュベートした。当該一
晩培養組織各１ mlを３個の凍結容器に移し、液体チッ素中で保存した。
-ブロス１ mlに接種し、37 ℃で振り混ぜながら４時間成長させて寒天スロープ を調製し、これを凍結乾燥保存組織として使用した。E1392/75/2AΔaroCΔompC ΔompFの当該凍結乾燥保存組織をPTL003と命名した。培養組織１ mlの残りにL- ブロス20 mlを添加し、当該培養組織を30 ℃で一晩インキュベートした。当該一
晩培養組織各１ mlを３個の凍結容器に移し、液体チッ素中で保存した。
【００８７】 （E1392/75/2AΔAroCΔOmpCΔOmpFのキャラクタリゼーション） １）成長の要件： マスター ストック（前節ステップ10で調製）から採取した細胞を、L-寒 天プレート上に筋状接種した。同時に、染色体DNAのサザン ブロット用試料とし
て使用するために、L-ブロス８ mlを接種した。両プレート及び液状培養組織を3
7 ℃で一晩成長させた。
て使用するために、L-ブロス８ mlを接種した。両プレート及び液状培養組織を3
7 ℃で一晩成長させた。
【００８８】 成長プレートから採取した細胞を下記媒体上に筋状接種し、37 ℃で一晩成長 させた。 媒 体 成 長 L-アンピシリン 無 Ｍ９最少媒体 無 Ｍ９最少媒体＋アロミックス 有 Ｍ９＋サルファチアゾール（100 μg/ml） 無 Ｍ９＋サルファチアゾール（100 μg/ml）＋アロミックス 有 L-寒天＋ストレプトマイシン 50 μg/ml 有 L-寒天＋５% 蔗糖 有
【００８９】 期待された通り、当該細胞はアンピシリンに対して敏感であった。当該細胞は
蔗糖、ストレプトマイシン及びサルファチアゾールに対しては抵抗性を示した。
しかし、最少媒体上で成長させるにはアロミックスが必要であった。
蔗糖、ストレプトマイシン及びサルファチアゾールに対しては抵抗性を示した。
しかし、最少媒体上で成長させるにはアロミックスが必要であった。
【００９０】 ２）PTL003のLPS分析 ａ）PTL003の凍結乾燥容器を壊して開けた。当該培養組織をL-ブロス中に
再懸濁させ、成長用L-寒天媒体上に接種した。細胞の一部を掻き落とし、ミクロ
バンクに保存した。 ｂ）さらに細胞を掻き落とし、そのLPSプロフィールを分析した。PTL003 のLPSプロフィールと元のE1392/75/2A菌株の間には、目に見えるような差は存在
しなかった。
再懸濁させ、成長用L-寒天媒体上に接種した。細胞の一部を掻き落とし、ミクロ
バンクに保存した。 ｂ）さらに細胞を掻き落とし、そのLPSプロフィールを分析した。PTL003 のLPSプロフィールと元のE1392/75/2A菌株の間には、目に見えるような差は存在
しなかった。
【００９１】 ３）PCRによる欠失の確認 ａ）２ａ）で調製した細胞をプレートから採取し、これをL-寒天上に筋状
に接種して一晩成長させた。 ｂ）新しく成長させた細胞を、遺伝子aroC, htrA, ompC, ompF, ompRを縁
取るプライマとともに使用してPCRを実施した。 ｃ）PTL003には、aroC, ompC及びompF遺伝子中に欠失が存在するが、htrA
又はompR中には存在しないことが分かった。
に接種して一晩成長させた。 ｂ）新しく成長させた細胞を、遺伝子aroC, htrA, ompC, ompF, ompRを縁
取るプライマとともに使用してPCRを実施した。 ｃ）PTL003には、aroC, ompC及びompF遺伝子中に欠失が存在するが、htrA
又はompR中には存在しないことが分かった。
【００９２】 ４）PTL003外部膜タンパク質プロフィールの分析 菌株PTL010（E1392/75/2A）並びに欠失菌株PTL002及びPTL003から、外部膜タ ンパク質分画を調製した。単一のompF欠失を有する菌株及びaroC及びompC欠失の
両方を有する菌株も分析した。菌株を低モル浸透圧濃度（無塩L-ブロス）及び高
モル浸透圧濃度（無塩L-ブロス＋15%蔗糖）の条件下で成長させた。OmpFタンパ ク質産物は、通常、低モル浸透圧濃度で発現し、OmpC産物は高モル浸透圧濃度で
発現する。OmpC及びOmpFの両タンパク質は、類似の電気泳動易動度を有している
。高モル浸透圧濃度及び低モル浸透圧濃度の両方において、菌株PTL003を野性型
E1392/75/2A 菌株又はΔAroCΔOmpC又はΔOmpF欠失菌株と比較すると、前者はOm
pC/OmpF領域のタンパク質を欠いていた。結果を図４に示す。
両方を有する菌株も分析した。菌株を低モル浸透圧濃度（無塩L-ブロス）及び高
モル浸透圧濃度（無塩L-ブロス＋15%蔗糖）の条件下で成長させた。OmpFタンパ ク質産物は、通常、低モル浸透圧濃度で発現し、OmpC産物は高モル浸透圧濃度で
発現する。OmpC及びOmpFの両タンパク質は、類似の電気泳動易動度を有している
。高モル浸透圧濃度及び低モル浸透圧濃度の両方において、菌株PTL003を野性型
E1392/75/2A 菌株又はΔAroCΔOmpC又はΔOmpF欠失菌株と比較すると、前者はOm
pC/OmpF領域のタンパク質を欠いていた。結果を図４に示す。
【００９３】 ５）CFA寒天上におけるCS１及びCS３ピリ（pili）の発現 欠失菌株中におけるCS１及びCS３ピリの発現について調べた。CFA寒天上 、37 ℃で一晩成長させた等数（２Ａ600nm単位）の細菌株PTL010, PTL001, PTL0
02及びPTL003をSDS PAGEにかけ、CS１又はCS３に対して単特異ポリクローン性抗
体でウェスタン ブロットして分析した。CS１及びCS３ピリを４種類の菌株中に 等しく発現させた（図５）。
02及びPTL003をSDS PAGEにかけ、CS１又はCS３に対して単特異ポリクローン性抗
体でウェスタン ブロットして分析した。CS１及びCS３ピリを４種類の菌株中に 等しく発現させた（図５）。
【００９４】 E1392/75/2AのCFAII陰性誘導体を構築して、これを比較対照として使用した。
この操作は、ETEC菌株E1392/75-2A から採取したCSコード化プラスミドを特異熟
成(specific curing)することにより行った。cooB遺伝子から採取したDNAの短フ
ラグメントを、プライマとしてオリゴヌクレオチドCSA01 及びCSA02でPCRを使用
して増幅し、PCR産物をクローン化する目的で設計されたpGEM-T Easy プラスミ ド ベクター（商品名；Promega社）の中へ結紮した。当該フラグメントを、SalI
及びSphI制限酵素サイトの力でpCVD442の中へサブクローン化した。pCVD442-coo
B誘導体を、SM10λpirから接合法によりETEC菌株E1392/75/2Aの中へ導入した。 アンピシリン抵抗性トランス接合体は、pCVD442-cooB誘導体がcooB担持プラスミ
ドと融合した結果生じた可能性が最も高い。次に当該トランス接合体を５%蔗糖 を補ったL-寒天上で成長させ、pCVD442のsacB遺伝子欠失菌株を選別した。この 結果得られたコロニーについて、CSA01及びCSA02をプライマとして使用し、PCR によりアンピシリン敏感性を試験した。E1392/75/2Aの３つのコロニーを正の比 較対照としてこれらのPCRの中に加えた。PCRで産物を与えなかった２個の蔗糖抵
抗性コロニーを５%蔗糖を補った新しいL-寒天上に筋状接種したところ、純粋な 培養組織を得た。これらの培養組織を、次にL-ブロス中で、37 ℃で約16時間成 長させ、-70 ℃でミクロバンクに保存した。アガロース ゲル電気泳動法により 当該誘導体のプラスミド プロフィールを分析した結果、CS１コード化プラスミ ドの欠失が確認された。２種類の誘導体はCS１に関しては陰性であったが、依然
としてCS３+であることが確認された。
この操作は、ETEC菌株E1392/75-2A から採取したCSコード化プラスミドを特異熟
成(specific curing)することにより行った。cooB遺伝子から採取したDNAの短フ
ラグメントを、プライマとしてオリゴヌクレオチドCSA01 及びCSA02でPCRを使用
して増幅し、PCR産物をクローン化する目的で設計されたpGEM-T Easy プラスミ ド ベクター（商品名；Promega社）の中へ結紮した。当該フラグメントを、SalI
及びSphI制限酵素サイトの力でpCVD442の中へサブクローン化した。pCVD442-coo
B誘導体を、SM10λpirから接合法によりETEC菌株E1392/75/2Aの中へ導入した。 アンピシリン抵抗性トランス接合体は、pCVD442-cooB誘導体がcooB担持プラスミ
ドと融合した結果生じた可能性が最も高い。次に当該トランス接合体を５%蔗糖 を補ったL-寒天上で成長させ、pCVD442のsacB遺伝子欠失菌株を選別した。この 結果得られたコロニーについて、CSA01及びCSA02をプライマとして使用し、PCR によりアンピシリン敏感性を試験した。E1392/75/2Aの３つのコロニーを正の比 較対照としてこれらのPCRの中に加えた。PCRで産物を与えなかった２個の蔗糖抵
抗性コロニーを５%蔗糖を補った新しいL-寒天上に筋状接種したところ、純粋な 培養組織を得た。これらの培養組織を、次にL-ブロス中で、37 ℃で約16時間成 長させ、-70 ℃でミクロバンクに保存した。アガロース ゲル電気泳動法により 当該誘導体のプラスミド プロフィールを分析した結果、CS１コード化プラスミ ドの欠失が確認された。２種類の誘導体はCS１に関しては陰性であったが、依然
としてCS３+であることが確認された。
【００９５】 ６）PTL003のサザン ブロット分析 欠失突然変異体の構造：ミクロバンク保存物から成長させた３種類の欠失
突然変異体の培養組織から全DNAを抽出し、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化
し、当該消化DNAを脈動電場アガロース ゲル電気泳動にかけた。DNAをゲルから ハイボンドＮ+（商品名）ナイロン膜上にブロットし、標準的な手順に従って適 切なDNAプローブとハイブリッド化させた。結果（図６）は、当該突然変異体の ハイブリッド化染色体DNAフラグメントが野性型より短いことを示している。こ の事実は、当該突然変異が欠失変異であることを意味している。
突然変異体の培養組織から全DNAを抽出し、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化
し、当該消化DNAを脈動電場アガロース ゲル電気泳動にかけた。DNAをゲルから ハイボンドＮ+（商品名）ナイロン膜上にブロットし、標準的な手順に従って適 切なDNAプローブとハイブリッド化させた。結果（図６）は、当該突然変異体の ハイブリッド化染色体DNAフラグメントが野性型より短いことを示している。こ の事実は、当該突然変異が欠失変異であることを意味している。
【００９６】 （大腸菌株E1392/75-2A中に熱安定性（ST）及び熱不安定性（LT）毒素遺伝 子が存在しないことの確認） この理由により、大腸菌中のST及びLT-AB遺伝子をE1392/75-2A由来の全DNAに 対するDNAプローブとして使用した。毒素の陽性ETEC菌株E1393/75由来の全DNAを
正の比較対照とし、また試験室大腸菌株のJM109を負の比較対照として試験に含 めた。できるだけ大量の信号を得るために、ハイブリッド化膜はHyperfilm-ECL （商品名）の下に１時間保持した。E1392/75-2Aから抽出したプラスミドDNAをテ
ンプレートとし、オリゴヌクレオチドEST01及びEST02をSTに対するプライマとし
て、或いはLT-R1及びLT-03をLT-ABに対するプライマとしてPCRを行い、プローブ
を調製した。正の比較対照として使用した全DNAからは非常に強い信号が得られ たにも拘らず、LT-AB又はSTプローブを使用した場合には、全DNAとハイブリッド
化が行われたという明確な証拠は存在しなかった。
正の比較対照とし、また試験室大腸菌株のJM109を負の比較対照として試験に含 めた。できるだけ大量の信号を得るために、ハイブリッド化膜はHyperfilm-ECL （商品名）の下に１時間保持した。E1392/75-2Aから抽出したプラスミドDNAをテ
ンプレートとし、オリゴヌクレオチドEST01及びEST02をSTに対するプライマとし
て、或いはLT-R1及びLT-03をLT-ABに対するプライマとしてPCRを行い、プローブ
を調製した。正の比較対照として使用した全DNAからは非常に強い信号が得られ たにも拘らず、LT-AB又はSTプローブを使用した場合には、全DNAとハイブリッド
化が行われたという明確な証拠は存在しなかった。
【００９７】 （欠失突然変異体の染色体に由来するpCVD442配列が存在しないことの確認 ） プラスミドpCVD442を標識化し、EcoRVで消化した欠失突然変異体PTL001, PTL0
02及びPTL003由来の全DNAにハイブリッド化させた。ETEC菌株E1392/75-2A由来の
全DNAを比較対照として含めた。その結果、ハイブリッド化DNAフラグメントの複
合パターンが得られた。しかし、野性型について得られたパターンと突然変異体
について得られたパターンの間には、明瞭な差異が存在しなかった。この事実は
、恐らく突然変異体ゲノム中に、pCVD442ヌクレオチドの残存配列が存在しない ことを示している。ハイブリッド化フラグメントの複合パターンは、E1392/75-2
A菌株及び突然変異体誘導体のプラスミドDNA成分とハイブリッド化したpCVD442 プローブによる可能性が高い。
02及びPTL003由来の全DNAにハイブリッド化させた。ETEC菌株E1392/75-2A由来の
全DNAを比較対照として含めた。その結果、ハイブリッド化DNAフラグメントの複
合パターンが得られた。しかし、野性型について得られたパターンと突然変異体
について得られたパターンの間には、明瞭な差異が存在しなかった。この事実は
、恐らく突然変異体ゲノム中に、pCVD442ヌクレオチドの残存配列が存在しない ことを示している。ハイブリッド化フラグメントの複合パターンは、E1392/75-2
A菌株及び突然変異体誘導体のプラスミドDNA成分とハイブリッド化したpCVD442 プローブによる可能性が高い。
【００９８】 （例２：腸毒素産生性大腸菌〔ΔaroC/ΔompC/ΔompF〕弱毒化ワクチン菌株
のヒト ボランティア体内における安全性及び免疫付与能） 本試験は、腸毒素産生性大腸菌、即ち上記ΔaroC/ΔompC/ΔompF PTL003の弱 毒化生ワクチン菌株の評価を目的として設計した。
のヒト ボランティア体内における安全性及び免疫付与能） 本試験は、腸毒素産生性大腸菌、即ち上記ΔaroC/ΔompC/ΔompF PTL003の弱 毒化生ワクチン菌株の評価を目的として設計した。
【００９９】 （ワクチン シード ロットの調製） 精製及び確認の目的で、当該細菌株をマクコンキー寒天上にプレート接種した
。５つのコロニーを、ルリア ブロス200 mlを入れたフラスコに接種した。+37 ℃で８時間インキュベートした後、当該ブロス培養組織に30 mlの滅菌グリセリ ンを添加し、これをいくつかの容器に等分し（１容器当たり１ ml）、100個の当
該容器を-70 ℃で凍結した。これら容器の内容物を、ワクチン菌株用のシード ロットとして使用した。 P.29
。５つのコロニーを、ルリア ブロス200 mlを入れたフラスコに接種した。+37 ℃で８時間インキュベートした後、当該ブロス培養組織に30 mlの滅菌グリセリ ンを添加し、これをいくつかの容器に等分し（１容器当たり１ ml）、100個の当
該容器を-70 ℃で凍結した。これら容器の内容物を、ワクチン菌株用のシード ロットとして使用した。 P.29
【０１００】 ランダムに10個の容器を選別し、細菌類及び真菌類が含まれていないことをチ
ェックして当該シード ロットの純度を確認した。さらに３個の容器について、 培養ブロスを順次希釈して行く標準的なプレート計数法により、当該容器中の細
菌数を測定した。
ェックして当該シード ロットの純度を確認した。さらに３個の容器について、 培養ブロスを順次希釈して行く標準的なプレート計数法により、当該容器中の細
菌数を測定した。
【０１０１】 （ワクチンの調製） 接種を行う前に、ワクチンを毎回新しく調製した。当該ワクチンの調製におい
て、全ステップを安全キャビネットの中で実施した。接種を行う前日に、0.2 ml
をルリア寒天プレート表面に滅菌綿棒で延ばし、細菌ローン（芝生）を調製した
。同じ培養ブロスをマクコンキー及びルリア寒天プレート上に筋状接種して、そ
の純度を調べた。培養中の干渉を避けるために、当該寒天プレートを干渉抵抗指
示計付きの密閉容器に入れ、37 ℃で18時間インキュベートした。培養終了後、 滅菌リン酸塩で緩衝した食塩水５ mlで当該細菌ローンを収穫し、当該懸濁液の 光学濃度を測定した。次に、希望接種量に対応する当該懸濁液の適量（体積）を
、重炭酸塩緩衝液30 mlを入れた単位接種用ボトルに入れ、ボランティアに投与 した。さらに余分な当該ワクチンを調製して、これを試験室に保存した。ボラン
ティアにワクチンを接種した直後に、標準的なコロニー計数法により、10倍希釈
ワクチンについて各投与細菌の実数を検証した。
て、全ステップを安全キャビネットの中で実施した。接種を行う前日に、0.2 ml
をルリア寒天プレート表面に滅菌綿棒で延ばし、細菌ローン（芝生）を調製した
。同じ培養ブロスをマクコンキー及びルリア寒天プレート上に筋状接種して、そ
の純度を調べた。培養中の干渉を避けるために、当該寒天プレートを干渉抵抗指
示計付きの密閉容器に入れ、37 ℃で18時間インキュベートした。培養終了後、 滅菌リン酸塩で緩衝した食塩水５ mlで当該細菌ローンを収穫し、当該懸濁液の 光学濃度を測定した。次に、希望接種量に対応する当該懸濁液の適量（体積）を
、重炭酸塩緩衝液30 mlを入れた単位接種用ボトルに入れ、ボランティアに投与 した。さらに余分な当該ワクチンを調製して、これを試験室に保存した。ボラン
ティアにワクチンを接種した直後に、標準的なコロニー計数法により、10倍希釈
ワクチンについて各投与細菌の実数を検証した。
【０１０２】 ボランティアに投与したワクチン製剤と正確に同じ手順で調製してインキュベ
ートしたローン培養組織について予備試験を行い、これにより細菌の希釈手順を
確立した。懸濁液を調製し、順次希釈して試験を行うコロニー計数法により生存
可能細菌数を数え、その結果と光学濃度との関係を求めた。細菌を正確に希釈し
、ボランティアに所定のワクチン量を投与できるように、これらの予備試験結果
に基づいて調製及び検証に関する標準手順を開発した。
ートしたローン培養組織について予備試験を行い、これにより細菌の希釈手順を
確立した。懸濁液を調製し、順次希釈して試験を行うコロニー計数法により生存
可能細菌数を数え、その結果と光学濃度との関係を求めた。細菌を正確に希釈し
、ボランティアに所定のワクチン量を投与できるように、これらの予備試験結果
に基づいて調製及び検証に関する標準手順を開発した。
【０１０３】 （緩衝液の調製） 試験には、重炭酸ナトリウムを含む緩衝水溶液を使用した。ワクチンの各投与
量に対し、重炭酸ナトリウム２グラムを含む脱イオン水150 mlを調製し、これを
濾過滅菌した。当該緩衝液30 mlを50 mlの滅菌容器に入れ、これらの容器に所要
投与量のワクチン細菌を添加した。残った緩衝液120 mlを別の滅菌ボトルに入れ
た。ワクチン投与時に、ボランティアに先ず緩衝液120 mlを投与し、その１分後
に、ワクチンを含む緩衝液30 mlを投与した。
量に対し、重炭酸ナトリウム２グラムを含む脱イオン水150 mlを調製し、これを
濾過滅菌した。当該緩衝液30 mlを50 mlの滅菌容器に入れ、これらの容器に所要
投与量のワクチン細菌を添加した。残った緩衝液120 mlを別の滅菌ボトルに入れ
た。ワクチン投与時に、ボランティアに先ず緩衝液120 mlを投与し、その１分後
に、ワクチンを含む緩衝液30 mlを投与した。
【０１０４】 （ワクチン投与のスケジュール） ワクチンの投与量を次第に増やして、ボランティアのグループに投与試験を実
施した。第一のグループには約5 x 107個の細菌を、第二のグループには約5 x 1
09個の細菌を、第三のグループには約5 x 108個の細菌を投与した。
施した。第一のグループには約5 x 107個の細菌を、第二のグループには約5 x 1
09個の細菌を、第三のグループには約5 x 108個の細菌を投与した。
【０１０５】 当該ボランティアには、シプロフロキサチン500 mg BIDを、第４日目から３日
間に亘って投与した。これらのボランティアは、血液検査及び化学スクリーニン
グを行うために、第６日目に放免した。また、抗体測定のために血清を採取して
これを保存した。
間に亘って投与した。これらのボランティアは、血液検査及び化学スクリーニン
グを行うために、第６日目に放免した。また、抗体測定のために血清を採取して
これを保存した。
【０１０６】 第９日目及び第14日目に、ボランティアはフォローアップを行うために外来で
病院を訪れた。この時、血液サンプルを採取して血清分析を行い、区間歴を調べ
た。ワクチン投与前並びに第９日及び第14日に、血液（各40 ml）を採取して合 計３回の血清検査を行った。
病院を訪れた。この時、血液サンプルを採取して血清分析を行い、区間歴を調べ
た。ワクチン投与前並びに第９日及び第14日に、血液（各40 ml）を採取して合 計３回の血清検査を行った。
【０１０７】 （試験室における分析手順） ボランティアが入院している間、毎日最高２回まで糞便試料の培養を行った。
定量培養を行うために、糞便の付いた綿棒をカリ−ブレア輸液媒体中に入れ、こ
れを試験室に持ち帰り、そこで当該ワクチン菌株に対して選択した抗体を含むマ
クコンキー寒天上に直接接種した。当該ワクチン菌株固有の抗血清抗体を使用す
ると、最高５つのコロニーまで膠着することが分かった。定量培養を行うために
、（毎日最初の試料だけについて）糞便試料を秤量し、10-4まで順次PBS中で10 倍に希釈し、希釈液各100 μlを、抗菌剤を含むマクコンキー寒天上に広げた。 疑いのあるコロニーについて、抗Ｏ血清で膠着して確認を行った。
定量培養を行うために、糞便の付いた綿棒をカリ−ブレア輸液媒体中に入れ、こ
れを試験室に持ち帰り、そこで当該ワクチン菌株に対して選択した抗体を含むマ
クコンキー寒天上に直接接種した。当該ワクチン菌株固有の抗血清抗体を使用す
ると、最高５つのコロニーまで膠着することが分かった。定量培養を行うために
、（毎日最初の試料だけについて）糞便試料を秤量し、10-4まで順次PBS中で10 倍に希釈し、希釈液各100 μlを、抗菌剤を含むマクコンキー寒天上に広げた。 疑いのあるコロニーについて、抗Ｏ血清で膠着して確認を行った。
【０１０８】 血清を採取して保存し、後でCFA II抗原に対する抗体をELISAにより分析し、 ワクチン菌株に対する殺菌抗体の分析にこれを使用した。
【０１０９】 クエン酸塩の中へ採取した全血から、抹消血液単核細胞を分離し、これを洗浄
した。RPMI培養媒体中において、これらの細胞を濃度107個/ml、37 ℃で48時間 培養した。48時間後、凍結容器に上澄液を移して-20 ℃で凍結し、後に、ELISA によるCFA IIに対するIgG及びIgA抗体の分析に使用した。
した。RPMI培養媒体中において、これらの細胞を濃度107個/ml、37 ℃で48時間 培養した。48時間後、凍結容器に上澄液を移して-20 ℃で凍結し、後に、ELISA によるCFA IIに対するIgG及びIgA抗体の分析に使用した。
【０１１０】 （結果） 6.8 x 107及び3.7 x 108 cfuいずれの投与量においても、症状は何も認められ
なかった。これより高い4.7 x 109の投与量においては、６人に１人のボランテ ィアが下痢を、また６人に２人が軽度の胃痙攣を経験した。全ボランティアで、
投与量5 x 109cfuにおいて、ワクチン投与後第１日目から、プロトコル通りワク
チン投与後第４日目にシプロフロキサシン投与を開始するまで、細菌の流出が認
められた。この事実は、腸の中でコロニー化が旨く進んでいることを示しており
、従って良好な免疫反応が得られる可能性が高いことを物語っている。これより
低い２水準の投与量においては、少なくとも１回、ワクチン投与後にワクチン菌
株が全ボランティアから回収された。しかし、当該排泄の継続期間は、最高投与
量における場合より短かった。
なかった。これより高い4.7 x 109の投与量においては、６人に１人のボランテ ィアが下痢を、また６人に２人が軽度の胃痙攣を経験した。全ボランティアで、
投与量5 x 109cfuにおいて、ワクチン投与後第１日目から、プロトコル通りワク
チン投与後第４日目にシプロフロキサシン投与を開始するまで、細菌の流出が認
められた。この事実は、腸の中でコロニー化が旨く進んでいることを示しており
、従って良好な免疫反応が得られる可能性が高いことを物語っている。これより
低い２水準の投与量においては、少なくとも１回、ワクチン投与後にワクチン菌
株が全ボランティアから回収された。しかし、当該排泄の継続期間は、最高投与
量における場合より短かった。
【０１１１】 本特許出願を行う時点において、本ワクチンが引き起こす免疫反応の分析方法
は未だ完成されていなかった。
は未だ完成されていなかった。
【０１１２】 しかし、第０日（ワクチン投与前）並びにワクチン投与後第７日及び第10日に
最高量投与のボランティアから採取した血液をPBMNCで精製して得た培養組織の 上澄液について、IgAの抗CFA II反応を調べた（図７参照）。精製CFA II抗体で 被覆した分析プレート上の上澄液をELISAにより分析した。第７日及び第10日目 のサンプルで観察されたOD値は、ワクチン投与前のサンプルのOD値より著しく高
かった。この事実は、これらの時点で固有IgA反応が誘発されていることを示し ている。期待通り、当該反応は第７日にピークを示し、第10日には減少している
。この現象は、プライムIgA分泌B-細胞が、血液から内蔵関連リンパ組織の粘膜 エフェクタ サイトへ回帰する現象と一致している。
最高量投与のボランティアから採取した血液をPBMNCで精製して得た培養組織の 上澄液について、IgAの抗CFA II反応を調べた（図７参照）。精製CFA II抗体で 被覆した分析プレート上の上澄液をELISAにより分析した。第７日及び第10日目 のサンプルで観察されたOD値は、ワクチン投与前のサンプルのOD値より著しく高
かった。この事実は、これらの時点で固有IgA反応が誘発されていることを示し ている。期待通り、当該反応は第７日にピークを示し、第10日には減少している
。この現象は、プライムIgA分泌B-細胞が、血液から内蔵関連リンパ組織の粘膜 エフェクタ サイトへ回帰する現象と一致している。
【０１１３】 （結論） ETEC（ΔaroC/ΔompC/ΔompF）の弱毒化生菌株は、健康な大人のボランティア
がこれに充分耐えることができ、ワクチンとして経口投与することにより、腸で
コロニー化して旅行者を下痢症状から守る働きを有することが明らかになった。
また、特有の粘膜免疫反応を引き出す効果があることも明らかになった。
がこれに充分耐えることができ、ワクチンとして経口投与することにより、腸で
コロニー化して旅行者を下痢症状から守る働きを有することが明らかになった。
また、特有の粘膜免疫反応を引き出す効果があることも明らかになった。
【０１１４】
【配列表】
【図１】 上重ね延長PCR突然変異生成による接合法を使用して、標的遺伝 子中に明確な欠失を構築するシステムを示している。
【図２】 欠失構築用の組替え及び選択後における標的遺伝子の期待配列を
示している。
示している。
【図３】 欠失カセットがプラスミドpCVD442中へクローン化する様子を示 している。
【図４】 ETEC菌株から低モル浸透圧濃度（無塩L-ブロス）及び高モル浸透
圧濃度（無塩L-ブロス＋15%蔗糖）の条件下で調製した外膜のSDS-PAGE分析結果 を示している。Ｍ＝標識；サンプル１＝PTL010；サンプル２＝PTL002；サンプル
３＝PTL003；サンプル４＝ΔaroCΔompC；サンプル５＝ΔompF
圧濃度（無塩L-ブロス＋15%蔗糖）の条件下で調製した外膜のSDS-PAGE分析結果 を示している。Ｍ＝標識；サンプル１＝PTL010；サンプル２＝PTL002；サンプル
３＝PTL003；サンプル４＝ΔaroCΔompC；サンプル５＝ΔompF
【図５】 CFA寒天上で成長させた欠失菌株中のCS１及びCS３の発現状況を 示している。各菌株から等数の細胞を15% SDS-PAGEゲル上に負荷し、単一特異性
の抗CS１又は抗CS３ポリクローン性抗体でウェスタン ブロットした。抗体特異 性の比較対照は、CS１の主要ピリン タンパク質を発現したTG１細胞の全細胞リ ゼート、又はCS３の精製主要ピリン タンパク質であった。レーンＭ：レインボ ー低分子量標識；レーン１：pKK223を宿した誘発TG１細胞；レーン２：pKKcs1を
宿した誘発TG１細胞；レーン３：CS１-ETEC菌株；レーン４：PTL010；レーン５ ：PTL001；レーン６：PTL002；レーン７：PTL003；レーン８：精製CS３主要ポリ
ン タンパク質
の抗CS１又は抗CS３ポリクローン性抗体でウェスタン ブロットした。抗体特異 性の比較対照は、CS１の主要ピリン タンパク質を発現したTG１細胞の全細胞リ ゼート、又はCS３の精製主要ピリン タンパク質であった。レーンＭ：レインボ ー低分子量標識；レーン１：pKK223を宿した誘発TG１細胞；レーン２：pKKcs1を
宿した誘発TG１細胞；レーン３：CS１-ETEC菌株；レーン４：PTL010；レーン５ ：PTL001；レーン６：PTL002；レーン７：PTL003；レーン８：精製CS３主要ポリ
ン タンパク質
【図６】 突然変異遺伝子座のサザン ブロットを示している。指示通りに 野性型のETEC（E1392/75-2A）, PTL001（htrA aroC）, PTL002 (aroC ompR)及び
PTL003 (aroC ompC ompF）から染色体DNAを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ Ec
oRVで消化し、１%アガロースを通して脈動場をかけて電気泳動させた。DNAをゲ ルからHybond N+ ナイロン膜（Amersham社）上へブロットし、図に示したように
、aroC, htrA, ompR, ompC又はompF遺伝子座から誘導したDNAプローブとハイブ リッド化させた。バンド パターンは突然変異体遺伝子座（欠失）と一致した。
PTL003 (aroC ompC ompF）から染色体DNAを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ Ec
oRVで消化し、１%アガロースを通して脈動場をかけて電気泳動させた。DNAをゲ ルからHybond N+ ナイロン膜（Amersham社）上へブロットし、図に示したように
、aroC, htrA, ompR, ompC又はompF遺伝子座から誘導したDNAプローブとハイブ リッド化させた。バンド パターンは突然変異体遺伝子座（欠失）と一致した。
【図７】 本発明によるワクチンを投与したボランティア体内におけるIgA 反応を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/106 Ａ６１Ｋ 39/108 39/108 39/112 39/112 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA01X AA25X AA26X AA46X AA55X BA14 BA16 CA45 4C085 AA03 BA07 BA16 BA17 BA18 BA20 BA21 BA24 BB23 CC07 CC24 DD04 DD62 EE01 GG08
Claims (16)
- 【請求項１】 aroC遺伝子、ompF遺伝子及びompC遺伝子の中で非可逆突然変
異により弱毒化した細菌 - 【請求項２】 経口ルートで感染する請求項１記載の細菌
- 【請求項３】 ジェネラ エシェリキア菌、サルモネラ菌、ビブリオ菌、ヘ モフィルス菌、ナイセリア菌、エルジニア菌、ボルデテラ菌又はブルセラ菌から
選択した請求項１記載の細菌 - 【請求項４】 大腸菌、ネズミチフス菌、チフス菌、ゲルトネル菌、ブタコ
レラ菌、サルモネラ デュブリン菌(Salmonella dublin)、インフルエンザ菌、淋
菌、エンテロコリチカ菌、百日咳菌又はブルセラ流産菌の菌株である請求項３記
載の細菌 - 【請求項５】 エンテロトキシン性大腸菌（ETEC）の菌株である請求項４記
載の細菌 - 【請求項６】 第四遺伝子中における突然変異によりさらに弱毒化した上記
各請求項いずれか一つの細菌 - 【請求項７】 当該第四遺伝子がaroA, aroD, aroE, pur, htrA, galE, cya
, crp, phoP又はsurAである請求項６記載の細菌 - 【請求項８】 各遺伝子中の突然変異が明確に定義された突然変異である上
記請求項いずれか一つの細菌 - 【請求項９】 各遺伝子中における突然変異が完全コード化配列を欠失した
上記請求項いずれか一つの細菌 - 【請求項１０】遺伝子操作して異種起源の抗原を発現させた上記請求項いず
れか一つの細菌 - 【請求項１１】当該抗原の発現がnirBプロモータ又はhtrAプロモータにより
起こる請求項１０記載の細菌 - 【請求項１２】上記請求項いずれか一つで定義される細菌及び医薬品として
受入可能な担体又は希釈剤で構成されるワクチン - 【請求項１３】ヒト又は動物の予防接種に使用され請求項１−１１のいずれ
かにより定義される細菌 - 【請求項１４】aroC遺伝子、ompF遺伝子及びompC遺伝子において、下痢予防
のためにヒト又は動物に接種するために非可逆的突然変異により弱毒化したエン
テロトキシン性大腸菌細胞 - 【請求項１５】ヒト又は動物に接種するために薬剤調製を目的とする請求項
１−１１の何れかにおいて定義された細菌の使用方法 - 【請求項１６】哺乳類の宿主中において免疫反応を起こさせる方法であり、
aroC遺伝子、ompF遺伝子及びompC遺伝子の各々における非可逆的突然変異により
弱毒化した細菌を宿主に投与することにより構成される方法
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