JP4179627B2 - コレラワクチンとしての欠失変異体 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明の分野はビブリオ・コレレ ワクチンである。１００年以上のコレラの研究の後、効果的なコレラワクチンの必要が残っている。“古典的”な生物型に属するビブリオ・コレレの株により起こされたこの疾患の６回の汎発性流行があった。現在（第７）汎発性流行の病原体は“エルトール”生物型に属する（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２：５５３−６２３，１９７３，Ｗａｃｈｓｍｕｔｈら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１０９７−１０９８，１９９１）。近年、第７回目の汎発性流行が新たな場所、南アメリカの地に及んでいる。１９９１年の１月に始まり、コレラの流行がペルー、エクアドル、コロンビア、およびチリにおいて２５０，０００以上の症例そして２，０００名以上の死者を出した。この流行前には、主にインド、バングラデシュ、アフリカ、および西アジアにおいて年間２００，０００以上のコレラの症例が起こったと見積もられていた（Ｔａｃｋｅｔら、Ｃｈｏｌｅｒａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｗ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９２）。
１９９２年１１月、インドとバングラデシュに抗原的に異なる非０１型ビブリオ・コレレが現われ、８ケ月以内に推定５００，０００の症例と６，０００の死者を出した。血清型０１３９、別名“ベンガル”と命名されたこの新規株の汎発性流行の可能性は確実のようであり、発展途上世界中の新しい懸念の種である。これら最近の経験は、ビブリオ・コレレのエルトール０１およびベンガル０１３９両血清型による疾患に対する効果的なコレラワクチンの必要性を明確にしている。
コレラの自然感染およびコレラからの回復は、少なくとも３年間は継続する免疫を誘発するので（Ｔａｃｋｅｔら、上記；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４３：８１８−８２０，１９８１；Ｃａｓｈら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３０：３２５−３３３，１９７４）、経口投与された場合、その免疫特性において疾患と類似の状態になるが、免疫処置された個体において有害な症状または反応を起こさない（すなわち低い反応産生性を示す）生菌の弱毒化コレラワクチンを産生するために多くの努力がなされて来ている。この型のワクチンは、コレラ毒素のＡサブユニット、すなわち、この疾患にみられる大部分の下痢の原因であるタンパク質をコードする遺伝子を不活性化する欠失変異を含んでいる（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１５１−１５５，１９８２；Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３０６：５５１−５５７，１９８３；Ｋａｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８：６５５−６５８，１９８４；Ｋａｐｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：３４５，１９８４；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：４７７−４８１，１９８７；Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ６：１５１−１５４，１９８８；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｎ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１６１−１６７，１９８８；Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１６８：１４８７−１４９２，１９８８；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：４６７−４７０，１９８８；Ｋａｐｅｒら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：９０１−９０６，１９９０；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：８９３−８９９，１９９０）。また本出願の参照文献として編入したＭｅｋａｌａｎｏｓの米国特許第５，０９８，９９８号および第４，８８２，２７８号ならびにＫａｐｅｒら米国特許第４，９３５，３６４号を参照のこと。経口の死菌全細胞ワクチンおよびいくつかの生菌弱毒化コレラワクチンが開発されたが、これらのうち最も有望なものがビブリオ・コレレのエルトール生物型に対してほとんど保護を提供せず、そして０１３９血清型に対しては恐らく全く保護を提供しない。コレラワクチンに関係した主要な争点（問題）は安全性、安定性およびそれらの抗原性の度合である。
ビブリオ・コレレの毒素遺伝子に関して、毒素産生株と毒素非産生株の間の遺伝的多様性がＣｈｅｎら（１９９１，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１０７：２２５）により調べられている。Ｍｅｋａｌａｎｏｓ（１９８３，Ｃｅｌｌ ３５：２５３）はビブリオ・コレレ毒素遺伝子の重複および増幅に関して報告しており、Ｍｉｌｌｅｒら（１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３４７１）は毒素遺伝子の転写調節を論じている。他のビブリオ・コレレ遺伝子でその産物がこの生物の病原性に役割を演じているものには、毒素とともに調節されている線毛遺伝子（Ｓｈａｗら、１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：３０４２；Ｓｈａｒｍａら、１９８９，Ｖａｃｃｉｎｅ，７：４５１；Ｓｕｎら、１９９０，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１２３１；Ｈａｌｌら、１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２５０８；Ｔａｙｌｏｒら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２８３３）および腸内定着因子をコードする遺伝子（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８，Ｖａｃｃｉｎｅ ６：１５１）が含まれる。
発明の要約
本発明はコレラに対し免疫学的保護を誘発する生菌経口ワクチンとして有用である毒素非産生性で遺伝学的に安定なビブリオ・コレレ変異株を特徴としている。この変異株は機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠失し、またいかなる機能性のａｔｔＲＳ１配列も欠失している遺伝子操作された変異体である。ａｔｔＲＳ１配列とは、ＣＴＸ遺伝因子の組み換えおよび増幅に必要であるＣＴＸ遺伝因子内に含まれる１７塩基対の配列または、そのような組み換えおよび増幅を可能にするために充分なその配列を意味する。“いかなる機能性のａｔｔＲＳ１配列も欠失している”変異体はａｔｔＲＳ１含有伝播体との効果的な部位特異的組み換えを実質的に行うことができないものである。なぜなら、野生型ａｔｔＲＳ１配列が全て欠失されているか、またはそのような組み換えを防ぐために充分に欠失されているか、または変異されているからである。その結果、本発明によるビブリオ・コレレ株は、それらがｃｔｘＡをコードするＤＮＡを含む野生型ａｔｔＲＳ１含有伝播体と組み換えできないので、より安全である。
本発明はまた上記のビブリオ・コレレ株を作成する方法を特徴としている。本方法には、ｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１配列に変異を含むビブリオ・コレレＤＮＡの断片を含むプラスミドの野生型ビブリオ・コレレへの導入が含まれている。このビブリオ・コレレＤＮＡ断片は生物体内で野生型ビブリオ・コレレＤＮＡと組み換えを行い変異株を作成する能力がある。
ビブリオ・コレレのどの血清型も用いることができるが、好ましい実施の形態において、ビブリオ・コレレの変異株はエルトール血清型に属し、さらに好ましくは、イナバまたはオガワ血清型またはビブリオ・コレレ非０１血清型、好ましくは０１３９“ベンガル”血清型に属する。好ましくは、変異体はＣＴＸコアおよびａｔｔＲＳ１配列の全てを欠失しており、さらに好ましくは、変異株はペルー２、バング２、バー２または下記のベンガル２（“ベング２”）またはベンガル３（“ベング３”）のようなベンガル血清型の弱毒化誘導体である。
本発明による変異株は安全性および／またはワクチンの免疫原性を改善するために導入されたさらに追加の変異を随意的に含む。そのような追加の変異には、ＤＮＡ組み替えに関与する一つ或いはそれ以上の遺伝子、例えば、その株によってコードされているｒｅｃＡ遺伝子の不活性化、及びビブリオ・コレレ染色体、好ましくはビブリオ・コレレのｌａｃＺ遺伝子に導入されるさらに別の遺伝子の導入が含まれるが、これらに限定されない。好ましいさらに別の遺伝子には、ビブリオ・コレレのＢサブユニットまたはシガ様毒素のＢサブユニットのような任意の異種抗原をコードする遺伝子、またはＥ．ｃｏｌｉ ＣＦＡ抗原または抗原性ＨＩＶ抗原をコードする遺伝子が含まれる。異種抗原とはビブリオ・コレレにより通常発現されない任意の抗原を意味する。例えば、異種抗原はシゲラリポ多糖（ＬＰＳ）抗原、シガ毒素、毒素原性大腸菌株の種々のＣＦＡ抗原、炭疽毒素、シュードモナス内毒素Ａ、ＨＩＶキャプシド、百日咳毒素、破傷風毒素からの抗原性断片；ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルスからの抗原；そしてマラリア、ニューモシスチス肺炎およびトキソプラズマ症を生じる真核生物寄生体からの免疫原性ポリペプチドであり、ビブリオ・コレレ生ワクチンにおいて発現される。好ましくは、さらに別の変異を有する変異株はペルー１４、ペルー３、ペルー４、ペルー５、バング３、バング５、バー３、バー４、バー５またはベンガルの弱毒化誘導体である。
ｃｔｘＡサブユニットとは、機能している場合、コレラの多くの症状（例えば、悪心、下痢、その他）の原因となるコレラ毒素のＡサブユニットを意味する。最も好ましくは、これらの株はいわゆる“コア遺伝因子”の全体、すなわち下記により詳細に記載される、ｃｔｘＡ／ＢのみならずＩＣＦ（腸内定着因子、恐らくＣＥＰ“ピリンをコードしたコア”と同等）およびＺＯＴとして知られている領域の欠失も含む。
他の態様において、本発明は、コレラに対して免疫学的保護を誘発するための生菌経口ワクチンとして有用である毒素非産生性の遺伝的に安定なビブリオ・コレレ変異株を特徴としている。この変異株は機能性ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠失した遺伝子操作された変異体である。この株は、また軟寒天侵入能を欠損していることがある。軟寒天侵入能欠損とは粘性の高い培地に侵入する能力を欠くことを意味し、０．２５から０．４％の寒天である寒天培地上および培地内を遊走させることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される。好ましい株はまた、糸状、すなわち対数増殖の条件下で２５％以上の細胞の長さが１５ｎＭ長よりも長い。好ましい実施の形態において、この株はまたＡＴＴ-である。
好ましい実施の形態において、本発明は、機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠き、かつ軟寒天侵入能欠損株でもある毒素非産生性の遺伝的に安定な変異体であるビブリオ・コレレの少なくとも２つの異なる株から成るワクチンを含む。２つの株のうちひとつは、好ましくはペルー株から得られ、他のひとつはベンガル株から得られる。本発明はまた成分株のそれぞれがｃｔｘ^-、ａｔｔ^-、およびｒｅｃＡ^-であるワクチンを含む。関係する地方の流行病次第で、ワクチン株は単一用量でいっしょに、またはさらに好ましくは別々に７−２８日間隔をおいて投与される。ひとつの血清型だけが疾患の脅威を示す場合では、ひとつの株だけからなるワクチン処方を投与することが好ましい。
本発明は、少なくとも株のうち２つが異なる血清型であり、混合物中の全ての株が機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠いている少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株からなる死菌経口コレラワクチンをも特徴とする。ワクチンは血清型の少なくともひとつにより産生されるコレラ毒素Ｂサブユニットも含んでいる。好ましくは、ワクチン中の血清型のひとつはオガワ血清型であり、他の血清型はイナバ血清型である。最も好ましくは、死菌経口ワクチンは下記に定義しているように、バー３およびペルー３かまたはバング３、またはペルー３およびバング３の両者から成る。いかなる経口ワクチンの組み合わせも下記に定義されるようにベンガル２とベンガル３を含むベンガル血清型の細胞を含んでいる。これらの株は単独で、共に、または７−２８日間隔をおいて連続用量で投与される。
本発明は死菌ビブリオ・コレレワクチンを生成する方法も特徴とする。本方法には、混合物中の各株が機能性のｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡを欠いている、少なくとも第一と第二のビブリオ・コレレ株の増殖が含まれる。続いて、株を増殖培地から採収し、細胞を殺す。株を繁殖した培地から株の少なくともひとつにより産生されたコレラ毒素Ｂサブユニットを得、殺した細胞に加える。続いて死菌とコレラ毒素Ｂサブユニットの混合物を生理的に許容される担体に懸濁する。
上記のような変異体はコレラワクチンとして有用であり、以前のワクチンと比較してそれらの遺伝的特性において改善されている。
本発明の他の特徴および利点は次の本出願の好ましい実施の形態の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。
発明の詳細な説明
初めに図面を簡単に説明する。
図面
図１は毒素産生ビブリオ・コレレ株Ｐ２７４５９−Ｓｍ、Ｃ６７０９−ＳｍおよびＥ７９４６−ＳｍのＣＴＸ遺伝因子の概略模式図である。網目で満たされたボックスはＲＳ１配列を表す。ＲＳ１配列間にはｃｔｘＡＢ遺伝子およびｚｏｔ、腸内定着因子（ＩＣＦ）をコードする遺伝子を含む、網目のないボックス（コア領域と呼ぶ）として示されている領域がある。ＲＳ１配列の末端には円が填入されており、１７塩基対配列ａｔｔＲＳ１（ＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴ）［配列番号１］と１７塩基中１６が一致する配列のコピーを表す。ＲＳ１およびコア領域のコピー数に基づくと３つの株のＣＴＸ因子はその構造において異なるが、これらの因子はビブリオ・コレレの全てのエルトール株において同じ染色体の部位に挿入されていることに注目すべきである。
図２（Ａ） 図１に概略図で示されたＣＴＸ因子を有するＣ６７０９−Ｓｍ株からのＣＴＸ領域を含む染色体の制限地図である。図１に概略図で示されているＣＴＸ因子のコアまたはＲＳ１配列内にマップされている部位に観察される変異を除いて同じであるＰ２７４５９−ＳｍおよびＥ７９４６−Ｓｍ株の制限地図は示されていない。（Ｂ）バング１、バー１およびペルー１株の対応する染色体領域の制限地図。
図３（Ａ） 図１に模式的に示したＣＴＸ因子を有するＰ２７４５９−Ｓｍ株からのＣＴＸ領域を含む染色体に対応する挿入ＤＮＡ断片を担持しているプラスミドｐＧＰ６０の制限地図。制限地図の下には２つの矢じりを持つ印があり、プラスミドｐＡＲ６２において欠失されているＤＮＡを示している。（Ｂ）プラスミドｐＧＰ６０にクローニングされた領域の外側に位置している制限部位を含むＰ２７４５９−Ｓｍ株のＣＴＸ領域の制限地図を示す。（Ｃ）親株Ｃ６７０９−Ｓｍ、Ｐ２７４５９−ＳｍおよびＥ７９４６−Ｓｍにおいて、それぞれの欠失変異体ペルー２、バング２、そしてバー２を生成するタイプ２欠失を生じるプラスミドｐＡＲ６２と染色体間の組み換え事象（破線）の表示。（Ｄ）ペルー２、バング２およびバー２株の染色体の制限地図。
図４はプラスミドｐＧＰ５２の構築の模式的表示である。
図６はｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２の生成の模式的表示である。プロモーターのないＢサブユニットをコードする０．６ｋｂ断片をＰＣＲにより生成した。このＤＮＡをｐＣＲ１００に連結し、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩを用いて消化した。その結果得られた０．６ｋｂ制限処理断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化したｐＶＣ１００とｐＲＴ４１ベクターに連結し、それぞれｐＪＭ１００１およびｐＪＭ４１１を得た。各プラスミドをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、クレノウで処理し、ＸｂａＩリンカーを隣接結合して、ＸｂａＩで消化した。精製された断片をＸｂａＩで消化したｐＧＰ８４に連結し、ｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２を得た。
図５はｃｔｘＢの染色体への挿入の模式的表示である。非複製的ｐＪＭ８４．１を相同的組み換えによりペルー２、バング２またはバー２に組み込んだ。続いてアンピシリン耐性組み換えコロニーをアンピシリンを含まずストレプトマイシンを含む培地に塗布し、このようにして、アンピシリン耐性に対する選択圧力を減らした。得られたアンピシリン感受性コロニーを単離し、相同ｒｅｃＡ ＤＮＡ配列により隣接されるＤＮＡ間の欠失を選択した。
本発明はコレラおよび可能性のある他の疾患に対して個体を保護するために、生菌、または死菌経口ワクチンとして用いることができる弱毒化ビブリオ・コレレ株を特徴としている。
ワクチンの構築
１９９１年にペルーにおけるコレラ患者から単離されたビブリオ・コレレ株Ｃ６７０９−Ｓｍの弱毒化誘導体が構築されており、生菌経口コレラワクチンとして用いることができる。誘導体ペルー１およびペルー２は、コレラ毒素と関係のない腸内定着因子（ＩＣＦ）、ｚｏｔをコードしているＤＮＡに加えて、コレラ毒素をコードしているＤＮＡを取り除いている小さなタイプ１（コア）および大きなタイプ２欠失をそれぞれ担持している。過剰な腸内定着が初期の原型の生コレラワクチンを投与されたヒトにおいてみられた有害な副作用の原因の可能性があるので、ペルー１およびペルー２においてコレラ毒素およびＩＣＦ両方をコードしている遺伝子の欠失は、これらの株を、ワクチン被接種者においてその免疫原性と、従って保護特性を保持しながら、より少ない反応産生性にするであろう。
ペルー２に存在する大きなタイプ２欠失は、ＣＴＸ遺伝因子と呼ばれる、より大きなＤＮＡ断片の一部として２以上のコピーに存在しているＲＳ１と呼ばれる挿入片のような配列も取り除いている。ＲＳ１配列は、高頻度で重複でき、ビブリオ・コレレ染色体のａｔｔＲＳ１と呼ばれる１７塩基対のターゲット部位にＣＴＸ因子の挿入を引き起こし得る部位特異的組み換え系をコードしている。ａｔｔＲＳ１とほぼ同じ（そして、組み換え活性が全く同じと思われる）配列がＲＳ１配列の末端に存在している。これらの配列は下記のようである。
ａｔｔＲＳ１およびフランキング染色体配列：
５′−ＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＴ−３′
［配列番号２］
ＲＳ１の左側および染色体連接点：
５′−ＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＴ．．．ＲＳ１．．．−３′
［配列番号３］
ＲＳ１の右側および染色体連接点：
５′−ＡＡＡＣＣＣＴＡＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＴ−３′
［配列番号４］
ＲＳ１の末端に存在するａｔｔＲＳ１および類似の配列には下線が引かれている。ａｔｔＲＳ１に隣接する染色体配列がＲＳ１の左側と右側に存在し、重複するのはＲＳ１の左端のａｔｔＲＳ１と同じである１７塩基配列、及び、ａｔｔＲＳ１と１７／１８塩基対が一致する１８塩基配列だけであることに注目。
遺伝子操作された生菌弱毒化コレラワクチンは、それらが元の状態に復帰できないか、ないしは他の方法でコレラ毒素を産生する能力を回復できない場合のみ理論的には安全である。ａｔｔＲＳ１配列のただひとつのコピーだけを担持する株はＰ因子接合またはバクテリファージの形質導入によるＤＮＡ導入を通してＣＴＸ因子の新しいコピーを効率的に獲得できる。従って、ビブリオ・コレレからＲＳ１およびａｔｔＲＳ１配列を全くなくす欠失は、ワクチン株がその自己の部位特異的組み換え系を通して自然におけるＣＴＸ遺伝因子を再獲得することを防ぐことができる。そのような欠失はペルー２株およびその誘導体に存在している。
類似であるが同一ではない特性を有するビブリオ・コレレの６つの変異株を構築した。ペルー１およびペルー２株と同じ２つの型の欠失（タイプ１およびタイプ２）を担持する４つの株をバングラデシュ（Ｐ２７４５９−Ｓｍ）およびバーレーン（Ｅ７９４６−Ｓｍ）の患者から単離したビブリオ・コレレ株に構築した。これらの４つの誘導体、バング１、バング２、バー１およびバー２も、それらが定着性および／または他の特性（例えば血清型）において異なり、従ってそれらが世界の他の地域においてワクチンとして用いるために対応するペルー株よりも、より適している可能性があるので本発明の対象である。
ペルー１、バング１およびバー１の３株に存在するより小さなタイプ１欠失は全てのＲＳ１コピーを取り除いてはいないが、この特定の欠失はペルー２、バング２およびバング２に存在するより大きな欠失よりもいくつかのこれらの株の腸内定着特性に、より過酷な影響を与える。
タイプ２欠失変異体の構築
タイプ２欠失はＲＳ１配列およびａｔｔＲＳ１配列の全てのコピー（図１）を含むＣＴＸ遺伝因子に対応する全ての配列を取り除く。タイプ２欠失をビブリオ・コレレの染色体と図３に示すプラスミドｐＡＲ６２にクロン化されたプラスミド配列との間の組み換えにより構築した。プラスミドｐＡＲ６２はプラスミドｐＧＰ６０の誘導体であり、図３に示すＨｉｎｄIII断片を欠失したタイプ２欠失を担持している。プラスミドｐＧＰ６０は、２０−３０ｋｂのＳａｕ３Ａによる部分消化断片をプラスミドｐＬＡＦＲ２（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９８２，Ｇｅｎｅ １８：２８９）のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、先ずＰ２７４５９株のゲノムライブラリーを作成することにより構築された。コロニーをｃｔｘ領域（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３５：２５３）に由来するプローブを用いてハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。陽性のコロニーを採取しそこから単離されたプラスミドをｐＧＰ６０と命名した。このプラスミドの制限酵素分析により、それが全てのＣＴＸ因子配列および付加的なフランキングＤＮＡを含んでいることを確認した。プラスミドｐＡＲ６２はテトラサイクリンに対する耐性をコードしている。このプラスミドを接合またはエレクトロポレーションによりビブリオ・コレレ株に導入し、続いて３μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地で選択した。次いで、そのようなプラスミドを担持する株をＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）に記載されたように調製した放射性Ｌ−３プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。染色体に挿入されたタイプ２欠失を担持しているコロニーはＬ−３プローブにハイブリッドを形成せず、驚くことに、高い頻度で発生した（すなわちスクリーニングされたコロニーの約１％）。サザンブロット分析を用いて、これらの株に予想された欠失の存在を確認した。
コア（タイプ１）欠失の構築
“コア欠失”はＣＴＸ因子のコアに対応する配列だけを取り除くが、ＲＳ１因子のコピーは染色体上にそのまま残しておく（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）（図２）。これらの欠失は図２に示す様にコア領域の右側と左側に位置するＲＳ１配列間の相同的組み換えにより自然発生的に起こる。コア欠失を含むビブリオ・コレレのコロニーは２つの方法で同定できる。第一に、その株がコア領域に挿入されたカナマイシン耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカーを担持していれば、その場合コア欠失によりそのような株はカナマイシンに対して感受性になる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）。第二に、またこの欠失を担持している株とはハイブリッドを形成しない放射性ＣＴ−１プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションにより、コア欠失を含むコロニーは同定できる（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）。どちらの方法によっても、これらの欠失を担持するコロニーはスクリーニングされた１０００のコロニーに付き約１個の頻度で起こった。続いて、サザンブロットハイブリダイゼーションによる分析を用いて、これらの株における予想された欠失を確認した。
プラスミドｐＧＰ５２の組み込みに基づく機能性ａｔｔＲＳ１配列のアッセイ
プラスミドｐＧＰ５２はＳＭ１０λｐｉｒのようなＥ．ｃｏｌｉ株においてのみ複製可能である自殺プラスミドである（Ｐｅａｒｓｏｎら、１９９０，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：８９３）。プラスミドｐＧＰ５２は、初めにプラスミドｐＧＰ７（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３５：２５３）をＣｌａＩとＳｐｈＩで消化することにより構築された。このプラスミドはビブリオ・コレレ株Ｅ７９４６−Ｓｍに由来する２つのＲＳ１配列（ＲＳ１およびＲＳ２と呼ぶ）を含む。ＲＳ１配列を含むＤＮＡの断片をｐＢＲ３２２にクローニングし、得られるプラスミドをｐＧＰ２０と命名した。続いて、このプラスミドをＥｃｏＲＶ（ＲＳ１配列内で切断する）で消化した。このプラスミドを再連結した時、ハイブリッドＲＳ２配列がコア配列により隣接されているＲＳ２^*と呼ばれるＲＳ２のハイブリッド型を含むｐＧＰ２０Ｒと呼ばれる新規のプラスミドが生成された。続いて、ＲＳ２のＳｓｐＩ−ＳｐｈＩ断片をＮｒｕＩおよびＳｐｈＩで予め消化された自殺プラスミドｐＪＭ７０３．１にサブクローニングした。プラスミドｐＪＭ７０３．１はＭｉｌｌｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３４７１）に記載されている。得られるプラスミドは、ｐＧＰ５２と名づけられた。ｐＧＰ５２の構築を表す図を図４に示す。
ｐＧＰ５２を、ａｔｔＲＳ１配列を含むビブリオ・コレレ株に接合により導入する場合、それは染色体上のａｔｔＲＳ１配列とプラスミドに存在するａｔｔＲＳ１配列との間の部位特異的組み換え事象によりビブリオ・コレレ染色体に組み込まれる。このような組み込み事象は、アンピシリンに対する耐性がｐＧＰ５２によりコードされているのでアンピシリン耐性を安定的に維持している（すなわち、選択されない）コロニーの数を測定することにより定量化できる。組み込みの確認はサザンブロットハイブリダイゼーション実験において得られる。検査されるビブリオ・コレレ株が機能性ａｔｔＲＳ１配列を有していれば、その場合組み込みは検査で観察される。株が機能性ａｔｔＲＳ１配列を含んでいなければ、組み込みは起こらない。
ｐＧＰ５２のレシピエントとして働く種々のワクチン候補の能力を評価するために、下記の実験を行った。ひとつの培養につき、各株から１０⁷個の細胞濃度においてルリアブロス５ｍｌ中でドナーＥ．ｃｏｌｉ株ＳＭ１０λｐｉｒ ｐＧＰ５２をレシピエントのビブリオ・コレレ試験ワクチン株と混合した。混合物を３７℃で５時間インキュベートし、その時点でそれを１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む新たなルリアブロスに入れて１：１００に希釈した。ストレプトマイシンの目的はＥ．ｃｏｌｉドナー株を殺すことにより、それを淘汰することである。従って、ストレプトマイシン耐性ビブリオ・コレレレシピエント株だけが増殖可能である。この培養物を細胞の成長速度が飽和に達するまでインキュベートした。培養物を再び希釈し、ｐＧＰ５２に対するいかなる陽性選択のない状態で各細胞が合計２０回複製するまでさらにインキュベートした。続いて、生存能力のあるコロニー数を定量化するために、この培養物を希釈し、２つの別々の培地組成物に塗布した。これらの培地のうちひとつは、いかなる抗生物質も含まないルリアブロスである。これらのプレートに現れるコロニーの数は培養物中の総細胞数を示す。他の培地はアンピシリンを含むルリアブロスである。これらのプレートに現れるコロニーの数は接合の後起こる組み込み事象の数を示す。結果は、安定的組み込み事象／生存可能な細胞の総数、の比率として表わされ、下記の表１に示されている。

これらのデータに基づき、ａｔｔＲＳ１配列の２つのコピーを含むペルー１株は、いかなるａｔｔＲＳ１配列も持っていない検査された他の全ての株よりも少なくとも１０００倍高い頻度でプラスミドｐＧＰ５２をその染色体に組み込み可能なことが明らかである。
ワクチン株の血清学的特徴決定
ワクチン株ペルー２、バング２、およびバー２をそれらの血清学的および定着特性に関してさらに特徴決定した。表２に示すデータは、新たに採収された細菌細胞をＤｉｆｃｏビブリオ・コレレ０１イナバまたはオガワタイピング血清を用いてスライド凝集により検査した場合、各誘導体はその予想された血清型（すなわち各変異体のそれぞれの親株の血清型）を保持していることを示している。この結果は、これらの株が依然としてＬＰＳ抗原を発現することを示している。他の検査はこれらの変異株が運動性、原栄養性で、そして依然としてＴｃｐ線毛を発現することを示している。従って、変異体は生ワクチン株として有用であるための能力にとって重要である多くの特性を発現する。
ワクチン株およびコア欠失変異体の定着特性
これらのワクチン株の定着特性を検査するために、Ｔａｙｌｏｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：２８３３−２８３７，１９８７）に記載されているマウス腸内競合アッセイを用いた。このアッセイは、変異株が後に続いてヒトの志願者において検査された場合（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１６８：１４８７−１４９２，１９８８）、その定着特性と正確な相関関係があることが示されている。アッセイは増殖および生存について競合できる変異株の能力を他の密接に関連している株または同遺伝子型株と比較することにより、変異株の定着性における差異を測定する。このアッセイにおいて、変異体および競合株を約１：１の比率で混合し、次いで、この混合物の約１００万個の細胞を３−５日齢の乳児マウスＣＤ−１の胃に導入した。２４時間後、マウスを殺し、腸を切開し、ホモジナイズし、両株を選別するストレプトマイシンを含む細菌学的培地に塗布した。一晩のインキュベーション次いで増殖したコロニーを競合株から変異株を区別する別のマーカーについて検査する（すなわち、カナマイシンに対する耐性または適切な放射性ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；表３の説明文参照）。
表３に示すようにマウスの腸内における２４時間の増殖後、バング２およびバー２の両方は同遺伝子型の競合株の回収の方が変異株よりも約４−１３倍多い結果となる軽度の腸内定着性欠損を示した。表３にはコア欠損変異株ペルー１、バング１およびバー１を含む競合アッセイの結果も示されている。タイプ２欠損株のバング２およびバー２のように、これらのコア欠損変異体はそれらの同遺伝子型の競合株と比較して定着性において欠損があった。コア欠失はＣＴＸ因子（図１および３）のコアに対応する配列を取り除くので、これらのデータはＣＴＸ因子のコアが“腸内定着因子、すなわちＩＣＦ”をコードしていると示唆している。コレラ毒素そのものはＩＣＦではない。ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）に記載されているようにｃｔｘ遺伝子における欠失およびカナマイシン耐性をコードする遺伝子の挿入によってコレラ毒素産生に欠損のあるＳＭ４４とＳＭ１１５株は、腸内競合アッセイにおいてそれらの各々の変異体（バング１、バング２およびバー１、バー２）より勝っている。従って、ＳＭ４４とＳＭ１１５は、それらがコレラ毒素を産生しないにもかかわらずＩＣＦを産生し、一方変異体は産生しないことが明らかである。さらに、ＣＴＸコア領域はコアならびにタイプ２欠失両方において欠失している唯一のＤＮＡであり、両方の欠失を担持している変異体は定着性において同様に欠損があるので、ＣＩＦは図１に示すＣＴＸ因子のコア領域によりコードされると結論することができる。
最近、ＺＯＴと呼ぶ新規毒素がコア領域によりコードされることが見い出された（Ｂａｕｄｒｙら、１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４２８−４３４）。我々はＺＯＴ遺伝子における変異がタイプ１またはタイプ２欠失変異体に観察される定着性欠損を生じないという証拠を持っている。従って、ＩＣＦはＺＯＴとは別個の、異なる特性と指摘されている。タイプ１またはタイプ２欠損を担持している本出願に記載されたワクチン株はＩＣＦに欠損がある。
対照的に、ペルー２株は、その競合株Ｃ６７０９−Ｓｍと比較して腸内定着性に顕著な欠損を示さなかった（表２）。しかしながら、マウスにおけるＣ６７０９−Ｓｍまたはペルー２株の総細胞生成量は、ＳＭ４４またはＳＭ１１５株よりも一般的には１０−１００倍少なく、ペルー株Ｃ６７０９−Ｓｍおよびその誘導体ペルー２が不確定の定着性欠損をすでに担持していることを示唆している。ＣＴＸ因子のすべてまたは一部のコアの欠失はペルー１またはペルー２株の定着性においてさらなる欠損を生じなかったので、Ｃ６７０９−ＳｍはＣＴＸコア領域に対応するＤＮＡ配列を担持しているにもかかわらず、ＩＣＦにおいてすでに部分的に欠損があると結論できる。ペルー２、バング２およびバー２株に存在するタイプ２変異により明確にされている全ＣＴＸ領域の欠失は、ＩＣＦの遺伝子がワクチン誘導体において再活性化して機能的になることができないことを保証している。ＩＣＦ遺伝子のタイプ２欠失は軽度の定着欠損を引き起こすものと思われる。そのようなことは、コレラワクチン開発において弱毒化変異として有用である。なぜなら野生型ＩＣＦが望ましくない毒性レベルの原因となる可能性があるからである。

＊ 株名の後の“Ｓｍ”の名称はストレプトマイシン耐性を意味することに注意。これは１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンに耐性のある自然発生的な選択株であり、リボソームタンパク質の遺伝子における自然発生的点突然変異の結果であった。この耐性マーカーはプラスミドまたはトランスポゾンと関連しておらず、その結果腸内フローラに伝染性がない。全ての変異株は表示された親株から誘導されるので、全ての変異株もまたストレプトマイシン耐性である。

ａ 幼児マウス定着アッセイをＴａｙｌｏｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２８３３−２８３７，１９８７）に記載された方法に従い行った。株の比率を抗生物質に対する感受性の差異か、または追加された下記の脚注に記載されているように適切なプローブとのコロニーハイブリダイゼーションにより決定した。
ｂ ＳＭ４４株はＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）に記載されており、親株Ｐ２７４５９−Ｓｍのカナマイシン耐性誘導体である。ＳＭ４４においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をｃｔｘ遺伝子座に挿入した。バング１およびバング２はＰ２７４５９−Ｓｍの誘導体なので、ＳＭ４４との競合はｃｔｘの喪失よりもむしろタイプ２の影響に帰することが出来る定着性の差異を測定する。バング１およびバング２株はカナマイシン感受性であり、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることにより、これらの競合アッセイにおいてＳＭ４４から区別された。
ｃ ＳＭ１１５株はＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）により記載されており、親株Ｅ７９４６−Ｓｍのカナマイシン耐性誘導体である。ＳＭ１１５においてカナマイシン耐性をコードする遺伝子をｃｔｘ遺伝子座に挿入した。バー１およびバー２はＰ２７４５９−Ｓｍの誘導体なので、ＳＭ１１５との競合はｃｔｘの喪失よりむしろタイプ２欠損の影響に帰することが出来る定着性の差異を測定する。バー１およびバー２株はカナマイシン感受性であり３０μｇ／ｍｌカナマイシンに対する耐性のコロニーを数えることによりこれらの競合アッセイにおいてＳＭ１１５から区別された。
ｄ Ｃ６７０９−Ｓｍ株はペルー１およびペルー２の親株である。ペルー２はタイプ２欠失を担持し、一方ペルー１はコア欠失を担持する。これらの両欠失はｃｔｘ遺伝子を取り除き、その結果ペルー１およびペルー２はＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７２３−７３１，１９８６）に記載されたＣＴ−１プローブで探査した場合、コロニ−ハイブリダイゼーションブロットにおいて陰性であったが、Ｃ６７０９−Ｓｍ株は同じプローブを用いて陽性であった。従って、ペルー１およびペルー２両者は、ＣＴ−１プローブを用いるハイブリダイゼーションのコロニーを数えることにより、これらの競合アッセイにおいてＣ６７０９−Ｓｍから区別された。
記載された変異株は、ワクチンの安全性および免疫原性を強化する役目を果たす、さらに追加の変異を各株内につくることによりワクチン候補としてさらに改良できる。
安全性に関して、第２の変異を上記の任意の株のｒｅｃＡ遺伝子に導入することがその変異はそのｒｅｃＡ遺伝子を不活性化するように設計されているものである。従って、そのような二重変異株は組み換えにおいて欠損があり、自然環境においてビブリオ・コレレの野生型と組み換え不可能である。その結果、それらは野生型毒素遺伝子を獲得することおよびＣＴＸ因子を発現することは不可能である。その株に、コレラ毒素関連抗原（例えばコレラ毒素のＢサブユニット）、または他の異種抗原、例えばシガ様毒素の非毒性Ｂサブユニットまたは毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ株の種々のＣＦＡ抗原、シガ毒素、炭疽毒素、シュードモナス内毒素Ａ、百日咳毒素、破傷風毒素；ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルスからの抗原、ＨＩＶキャプシドからの抗原性断片；そしてマラリア、ニューモシスチス肺炎およびトキソプラズマ症を生じる真核生物寄生体からの免疫原性ポリペプチド（Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎら、１９８９，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１１２６；Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌら、１９９０，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：３５９４）を発現させるように、さらに別の変異を各株に導入することにより免疫原性も改善できる。従って、一連の変異された誘導体も本発明において有用であり、それぞれ株をより安全に、遺伝子的により安定で、さらに広範囲の免疫原性があるようにする、さらに別の特性を各々が組み込んでいる。そのような誘導体の構築を下記に記載する。
ｒｅｃＡ／ｃｔｘＢ対立遺伝子の構築
コレラ毒素Ｂサブユニットはコレラ毒素中和抗体を誘発することができる非毒性で、非常に免疫原性のある分子であることが知られている。さらに免疫原性のあるワクチン株を作成するために、新しいｃｔｘＢ遺伝子のコピーを上記のタイプ２欠失を含むワクチン株に導入した（なぜなら、タイプ２欠失はコレラ毒素Ｂサブユニットのコード配列全てを取り除くからである）。これは、下記の一連の段階で達成された。
第一に、ｃｔｘＢ遺伝子のプロモーターのないコピーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて構築した。ＰＣＲのために、ｃｔｘＢ遺伝子の終結コドンからすぐ下流に位置するａｔｔＲＳ１部位を除去するようにｃｔｘＢをコードする配列が合成され得るように下流のプライマーを設計した。このプライマーは下記の配列を有した。
５′−ＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣ−３′［配列番号５］。上流プライマーはＡ２サブユニットのカルボキシ末端の最後の２４個のアミノ酸残基だけが反応の産物によりコードされ得るように設計された。このプライマーは下記の配列を有した。
５′−ＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＴＡＣＣＧ−３′［配列番号６］。ＡサブユニットをコードするＤＮＡにおける、他の全てのヌクレオチドは反応から除外された。ｃｔｘＢ遺伝子発現の翻訳共役を可能にするために、ＣｔｘＡ２のカルボキシ末端アミノ酸をコードするＤＮＡを最終産物に保持した。コレラ毒素に関連した毒素活性はＣｔｘＡ１ポリペプチドに由来するので、Ａ１ポリペプチドをコードする全ての配列はＰＣＲ反応から除外された。
ＰＣＲは上記のようにｃｔｘＢプライマーを用いペルー株Ｃ６７０９−Ｓｍ（図６）からのビブリオ・コレレＤＮＡを用いて行われた。反応の産物である、０．６キロ塩基対断片をプラスミドｐＣＲ１００にクローニングした。続いて、この断片を０．６キロ塩基対ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドから切り出し、２つの別個の受容体プラスミド、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ消化のｐＲＴ４１とＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ消化のｐＶＣ１００にクローニングした。そこで、得られるプラスミドｐＪＭ４１１およびｐＪＭ１００１は、それぞれビブリオ・コレレのｃｔｘプロモーター（ｃｔｘＰ）か、またはｈｔｐＧプロモーター（ｈｐｔＰ）の制御下にあるｃｔｘＢ遺伝子のコピーをコードしている。次いでこれらのプラスミドを毒素非産生株ビブリオ・コレレ０３９５−ＮＴ（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０６：５５１および米国特許第４，９３５，３６４号）に導入し、０３９５−ＮＴ ｐＪＭ４１１および０３９５−ＮＴ ｐＪＭ１００１と呼ばれる２つの新規株が生成された。各株により産生されるコレラＢサブユニットの量をＧＭＩ ＥＬＩＳＡ（エライサ）により測定した。ＬＢ培養上清液中に０３９５−ＮＴ ｐＪＭ４１１株は３０μｇ／ｍｌを産生し、一方０３９５−ＮＴ ｐＪＭ１００１株は１００μｇ／ｍｌを産生した。これらの結果は、ＰＣＲ産物がガングリオシドＧＭＩに結合可能な抗原性コレラＢサブユニットをコードする機能性ｃｔｘＢ遺伝子であり、従って、正常の野生型ビブリオ・コレレにより分泌されるものと類似であったことを示している。
次の段階において、プロモーター・ｃｔｘＢ構築物を指定するＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を自殺ｒｅｃＡプラスミドｐＧＰ８４にサブクローニングした。このプラスミドはビブリオ・コレレのｒｅｃＡ遺伝子に隣接するＤＮＡに対応するビブリオ・コレレ染色体ＤＮＡ挿入断片（すなわち、ｒｅｃＡの内部欠失）を含んでいる。プラスミドｐＧＰ８４は自殺プラスミドｐＪＭ７０３．１の誘導体（Ｍｉｌｌｅｒら、１９８８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５）であり、左側にＢｇｌII−ＰｖｕII断片そして右側にＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含む、ビブリオ・コレレのｒｅｃＡ遺伝子のフランキング領域に対応する配列をコードしている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：７１５）。カナマイシン耐性をコードする１．３ｋｂ断片をこれら２つの断片間に配置する。プラスミドｐＧＰ８４は、ストレプトマイシンに対する感受性をコードするＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片も含む。この後者の断片はプラスミドｐＮＯ１５２３に由来する（Ｄｅａｎ，１９８１，Ｇｅｎｅ １５：９９）。ｐＧｐ８４をＸｂａＩで消化した時、１．３ｋｂ断片を取り除き、他のＸｂａＩ断片を、この欠失したｒｅｃＡ領域に挿入できる。サブクローニングを下記のように達成した。プロモーター・ｃｔｘＢ構築物を指定する、２つのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片それぞれをＸｂａＩリンカーの付加により修飾した。それらを個々にＸｂａＩ消化ｐＧＰ８４に連結し、２つの新しいプラスミドｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２を生成した。各々はｈｔｐＰ−ｃｔｘＢ構築物およびｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ構築物をそれぞれ指定しているＤＮＡを含んでいる（図６）。
次に、プラスミドｐＪＭ８４．１およびｐＪＭ８４．２をビブリオ・コレレ株ペルー２、バング２およびバー２に導入し、アンピシリン耐性のコロニーを選択した。これらのプラスミドはビブリオ・コレレ中で複製できないので、それらは相同的組み換えにより宿主細胞染色体に組み込まれ図５に示す構造物を生成する。両プラスミドはまたストレプトマイシン耐性（すなわち、ペルー２、バング２、およびバー２株）である株においてプラスミド組み込み事象に対陽性の淘汰を可能にするストレプトマイシン感受性の遺伝子をコードしている。従って、染色体ＤＮＡに組み込まれたプラスミドを有する株を２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培地で増殖した場合、アンピシリン感受性に復帰したコロニーを単離できる。次いで、ｃｔｘＢ構築物とともにｒｅｃＡ欠失変異を残したままにするように組み込まれたプラスミドを、ここで抹殺された株は、これら後者の株の間から選択された。これらの株は下記の特性を有しているので容易に同定された。
１．それらはアンピシリン感受性であった。
２．それらはｒｅｃＡ^-細胞の特徴的な表現型である、ＬＢ １ｍｌに付き０．１ｍｌのメチルメタンスルホネートの存在下で殺された。
３．それらはＧＭＩ−ＥＬＩＳＡにより測定されるコレラＢサブユニットを産生した。
４．ｒｅｃＡおよびｃｔｘＢプローブを用いるサザンブロット分析により、それらがｃｔｘＢ構築物の存在および適切なｒｅｃＡ配列の欠失と一致しているＤＮＡ断片を含むことを確認した。
上記の方法により単離された細菌株は下記の通りである。

ｌａｃＺ−ｃｔｘＢ対立遺伝子の構築
上記のワクチン株内に含まれるｒｅｃＡ変異は、株を相同的組み換え欠損にする。依然として相同的組み換えが可能なワクチン候補をつくるために、ｃｔｘＢ遺伝子を下記のようにビブリオ・コレレのｌａｃＺ遺伝子に挿入した。
ビブリオ・コレレのｌａｃＺ遺伝子をコードするプラスミドｐＣＧ６９８はｌａｃＺコード配列の中ほどにユニークなＨｐａＩ部位を含んでいる。プラスミドｐＣＧ６９８を下記のように構築した。ビブリオ・コレレのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は記載された（Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，１９８３，Ｃｅｌｌ ３５：２５３）ようにＥ７９４６株からの染色体ＤＮＡ断片のライブラリーからクローニン化された。それはβ−ガラクトシダーゼを発現することが見い出され、制限酵素マッピングの後、ｌａｃＺ遺伝子に（各々２．１ｋｂのＤＮＡにより隔離された）２つのＨｐａＩ部位を含む６ｋｂの挿入断片を包含することが見い出された。このプラスミドをＨｐａＩで鎖状化しＸｂａＩリンカーを末端に連結した。ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ構築物を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を上記のようにｐＪＭ４１１から取り出し、末端をＸｂａＩリンカーの付加により修飾し、この断片を同様に修飾したｐＣＧ６９８に連結した。得られたプラスミドｐＪＭ６８９１は今ではｌａｃＺ遺伝子の中央に挿入されたｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ構築物を含んでいた。このプラスミドをビブリオ・コレレ株ペルー２、バング２、およびバー２に導入し、各々得られた株をＸ−ｇａｌの存在下での増殖についてスクリーニングした。不活性化されたｌａｃＺ遺伝子を含む白いコロニーを採取し精製した。宿主細胞染色体に組み込まれたｌａｃＺ：：ｃｔｘＰ−ｃｔｘＢ配列を含む株をアンピシリンの非存在下での増殖により細菌からｐＪＭ６８９１をキュアリングすることにより得た。適切な配列の存在はサザンブロット分析により確認され、これらの細菌がコレラ毒素Ｂサブユニットを産生する能力はＧＭＩ−ＥＬＩＳＡにより確認された。この方法に従って単離された細菌株を下記に示す。

マウス定着性に関して、これら担体コレラワクチン候補のいくつかを特徴決定するために、下記に示した株をマウスに感染させた。ＴｃｐＡ欠失を含みヒトの志願者の腸に定着しない０３９５−Ｎ１の誘導体であるＴＣＰ２株が対照としての役目をした。５匹のマウスを各株に用いた。感染２４時間後、腸上部を各マウスから取り出し、ホモジナイズし、単純なプレーティングアッセイを用いて存在するビブリオ・コレレの数をアッセイした。結果を下記の表に示す。本質的には、ＴＣＰ２で感染されたマウスの腸において細菌ＴＣＰ２は検出されず、従って下記に示す値はバックグランドレベル０より上でマウスの腸に定着した各株の細菌の数を示している。

ａ １匹のマウスに付き回収されたコロニー形成単位（５匹のマウスの平均）
ｂ 構築物ａｔｔＲＳ１欠失＃２は図３に記載されたプラスミドｐＡＲ６２を用いて構築されたタイプ２欠失である。
構築物ｒｅｃＡ：：ｈｔｐＧ−ｃｔｘＢはｒｅｃＡ遺伝子の欠失、およびビブリオ・コレレのｈｔｐＧ
熱ショックプロモーターの制御下にあるコレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子の挿入である。
構築物ｒｅｃＡ：：ｈｔｐＧ−ｃｔｘＢはｒｅｃＡ遺伝子の欠失とビブリオ・コレレの超毒素産生性５６９８株のｃｔｘ遺伝子に由来するコレラ毒素プロモーターの制御下にあるコレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子の挿入である。
構築物ｌａｃＺ：：ｃｔｘ−ｃｔｘＢはビブリオ・コレレの超毒素産生性５６９８株のｃｔｘ遺伝子に由来するコレラ毒素プロモーターの制御下にあるコレラ毒素Ｂサブユニットから成るビブリオ・コレレのｌａｃＺ遺伝子中の挿入物である。
結果は、ｒｅｃＡ：：ｈｔｐＰ−ｃｔｘＢ対立遺伝子の存在がペルー誘導株の腸に定着する能力を減らす役目をする（例えば、ペルー３とペルー２を比較）ことを示唆している。しかしながら、バング誘導株の定着性に関するこの構築物の効果はそれほど顕著ではなかった（バング３とバング２を比較）。一般に、ｃｔｘＢがその自己のプロモーターの制御下にある構築物の導入は、それが熱ショックプロモーターの制御下に置かれた構築物よりも定着性に及ぼす影響は少なかった。ペルー２、ペルー３およびバング３株がそれらの定着特性において２８倍以上の範囲で異なることに注目すべきである。その定着特性において、さらに一層広く異なる、追加のワクチン候補を単離することは上記のプロトコールに従う技術内に十分入ることである。
要約すると、このデータはｃｔｘＢ遺伝子の発現が２つのビブリオ・コレレのプロモーター（ｃｔｘＰおよびｈｔｐＰ）のどちらかの制御下に置かれる新規のｃｔｘＢ含有ビブリオ・コレレ株を作成するために遺伝子操作技術を用いることができる可能性を示している。操作された遺伝子はビブリオ・コレレ染色体のターゲット遺伝子、例えばｒｅｃＡまたはｌａｃＺに組み換えられ、大量のコレラ毒素Ｂサブユニットを安定に発現する株を作成することができる（例えば、ペルー３、ペルー４およびペルー５株）。
ビブリオ・コレレの自然発生的軟寒天侵入能欠損株の単離
軟寒天侵入能に欠損のあるビブリオ・コレレの変異体はワクチンの産生に有用である。これらの変異体を使用する合理性を下記に示す。腸の粘液層は、粘性があると考えられており、軟寒天の侵入能に欠損のある変異体は、この粘液への侵入に欠陥がある可能性がある。粘液を通る侵入に欠損があるが、これらの変異体は、濃い粘液のゲルにより被覆されていない、そしてＩｇＡ抗体産生に特異的な抗原試食細胞を含むパイエル板に抗原を依然として提示する。その結果、侵入能欠損変異体は低い反応産生性を有するが、抗原性が高いと予測されており、これらの特徴は、生ワクチンに望ましい。非運動性変異体は、軟寒天の侵入能に欠損のある変異体のひとつの種類であるが、他の型の変異体も軟寒天侵入能欠損表現型（すなわち、遊走表現型）を生じ、ワクチンに有用である。この論法の線に沿って、完全に非運動性変異体、すなわち、寒天を含まない培地で遊走できない変異体は有用なワクチン候補である。
そのような変異体を得るために、下記のように、軟寒天を用い、高い粘性の培地（０．２５％−０．４％寒天の軟寒天培地）に侵入する細菌の能力を評価することができる。高い治療上の価値を有する、ひとつのそのような軟寒天侵入能欠損ワクチンはペルー１４である。
ペルー１４は、軟寒天侵入能欠損であり、そしてさらに、ペルー１４細胞の５０％以上は、らせん状の外観を有し、正常の細胞の長さの５倍以上の細胞の長さ（野生型の細胞の長さ５ｎＭに対し２５ｎＭ）を有する線状である。
ペルー１４は、下記に示すように（表７）、副作用がなく、被接種者に定着する能力を依然として保持している３重欠失のペルー株（ペルー３）（ｃｔｘＡ^-，ａｔｔ^-，およびｒｅｃＡ^-）の軟寒天侵入能欠損誘導体として単離された。
ペルー１４は、上記の理論に基づき単離されたが、この機能の理論は、ワクチンとしてペルー１４の効果を正確にかつ完全に説明できるかもしれないし、できないかもしれない。効果的なワクチンとしてペルー１４の有用性は、この理論の正確性に依存していない。

詳細には、ペルー１４軟寒天侵入能欠損株を下記のように生成した。ペルー３をストレプトマイシンスルフェート１００μｇを含むＬＢブロス中で、３０℃で一晩増殖した。培養物を約２０００ｃｆｕ／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌをストレプトマイシン１００μｇを含むＬＢプレートに塗布した。プレートを３０℃で、一晩インキュベートした後、約１０００コロニーをつま楊枝採取して軟寒天プレート（ＬＢブロス＋０．４５％バクト寒天）に入れ３０℃で一晩インキュベートした。接種するつま楊枝を軟寒天プレートの表面に１−２ｍｍだけ挿入する。採取した１０００コロニーのうち、２５が非侵入のようであった。非侵入単離体は、２ｍｍ径のコロニーとして現れるが、一方侵入単離体は寒天上および寒天内に５ｍｍ以上の径にまで遊走した。これらのコロニーを再採取し、既知の非侵入コレラ株、非運動コレラ株、および最初のペルー３株とともに、もう一度軟寒天に入れた。２５のうちひとつのコロニーは寒天非侵入（対照と比較した場合）であった。ペルー１４と命名された、このコロニーは、凝集血清で依然としてイナバ陽性であり、ＢサブユニットＥＬＩＳＡで検査した場合、ペルー３と同じレベルのＢサブユニット毒素を産生した。上記の方法はいかなるビブリオ・コレレ株の軟寒天侵入能欠損変異体を単離することにも用いることができる。遺伝的欠損を有している変異体のような非復帰の侵入能欠損変異体を上記の方法を用いて作成できる。
ベンガル株
非常に珍しい非０１で強毒性の株がインド亜大陸におけるコレラ流行の原因であると、最近発見された。初期の０１血清型流行病の生存者は、この株に対して免疫学的に保護されていない。
この株は、メリーランド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ベンガル株は他の株について上に記されているように、例えば、１つ以上の下記の変異：ｃｔｘ^-，ａｔｔ^-，またはｒｅｃＡ^-、または軟寒天浸入能欠損表現型によって、弱毒化でき、ベンガル２（“ベング２”）およびベンガル３（“ベング３”）はペルー２およびペルー３と遺伝子的に同等である。そのような弱毒化ベンガル株を上記の弱毒化ペルー株のひとつと組み合わせ２重または多重のコレラ株ワクチンを提供する。
ペルー３およびペルー５のヒトでの検査
ペルー３およびペルー５の効果のヒトでの研究を下記のように行った。
血液試料を免疫前、そして免疫後７日、１４日、２１日および２８日目に志願者から取った。彼等の血流におけるビブリオ・コレレ抗体を測定し、そのレベルを表４に示す。ワクチンの原型であるペルー３およびペルー５の免疫原性をヒト志願者研究において評価した。志願者は、新たに採収したペルー３またはペルー５を１０％重炭酸ナトリウム１００ｍｌ中の３つの異なる用量で摂取した。ペルー３およびペルー５は、また抗毒素抗体を誘発することを示した（表５）。さらに、ペルー３およびペルー５は、野生型エルトールビブリオ・コレレ（表６、Ｎ１６９６１株）の攻撃から志願者を保護することを示した。我々は、ヒトでの研究においてペルー３が特に強力な免疫応答（表４および５）を刺激し、コレラからの保護を提供する（表６）と結論する。

熱活性化血清試料をマイクロタイターウエルで連続希釈し、対数期のビブリオ・コレレ（最終濃度５×１０⁷）およびモルモットの補体（最終濃度１１％）と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。
続いて、脳・心臓注入（点滴）ブロスをプレートに加え、３７℃で２．７５時間インキュベートした。表の値は、ビブリオ・コレレの抗体媒介による死滅が５０％以上の時の逆数の力価を示す。

血清試料を前処理にガングリオシド／コレラ毒素Ｂサブユニットを塗布した９６ウエルマイクロタイタープレートで連続希釈し、３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ヤギ抗ヒト抗体アルカリホスファターゼ接合体（１／１０００）を加え３７℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、２ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰを各ウエルに加え１５分インキュベートした。反応を０．１Ｍ Ｋ₂ＰＯ₄で停止し、Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍで読んだ。表の値は、逆数の力価および２日目と比較したピーク力価の増加を示す。

異型抗原を発現するビブリオ・コレレワクチンの構築
上記の手順はいかなる当業者によっても、広範囲の種々の外来抗原または異種抗原、例えば、ビブリオ・コレレに通常発現されない抗原を発現する能力のあるペルー２、バング２、バー２、ペルー１４株および関連株の誘導体の構築に適用することが出来る。そのような誘導体は、生ワクチンとして用いられた場合、ビブリオ・コレレの抗原およびそれがコードしている外来抗原の両者に対して強力な免疫応答を誘発すると予想される。他の原形ビブリオ・コレレワクチンでの予防接種が全細胞抗原（例えば、ＬＰＳ）ならびにコレラ毒素Ｂサブユニット（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１４８７−１４９２）のような個々のタンパク質に特異的である循環ＩｇＧと局所ＩｇＡ抗体の誘発をもたらしているので全身的免疫応答および局所的免疫応答の両方が誘発されるようである。ビブリオ・コレレにより発現される外来抗原は個々のコレラタンパク質の免疫応答に類似の免疫応答を誘発すると予想される。
ビブリオ・コレレへの異種抗原の導入に有用な方法はｃｔｘＢ遺伝子のペルー３、ペルー４、ペルー１４、ペルー５、バング３、バー３およびバー４への再導入に関する上記の方法と同様である。実質的にどんな異種抗原もこれらの方法を用いてビブリオ・コレレに挿入できる。
新規プロモーター下にｃｔｘＢを含む株を構築するために用いられる同じプロトコールが実質的に全ての異種抗原またはバクテリア、ウイルスまたは寄生体のどれかにより通常コードされる抗原を発現できるペルー２、バング２およびバー２の誘導体の構築に用いることができる。従って、本発明に記載された方法はコレラに対してだけでなく他の病原体に対してもヒトを免疫化するために他の抗原をコードし発現するように操作でき、そしてヒトに投与できる多価ビブリオ・コレレワクチン“担体株”の生成を教示している。
ビブリオ・コレレ／毒素原性 Ｅ．ｃｏｌｉワクチン
コレラ毒素（ＣＴ）に対する抗体を誘発するビブリオ・コレレワクチンは熱不安定性毒素（ＬＴ）を産生する毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４９：８８４−８９３，１９８４）の株に対する交差保護をヒト被接種者に与えることが証明されている。しかしながら、ワクチン被接種者は、依然として熱不安定性毒素（ＳＴ）産生ＥＴＥＣ株の攻撃を受けやすい。ビブリオ・コレレの弱毒化株、ペルー３を定着因子抗原ＣＦＡ／ＩＶ線毛の主要なサブユニットおよびＳＴの遺伝的トキソイドをコードする、ＥＴＥＣ由来の外来遺伝子を収容するワクチンベクターとして使用できる。そのようなワクチンベクターは、ｉ）病原性ＥＴＥＣ株のヒト消化管上皮への結合を排除する抗線毛抗体およびｉｉ）ＳＴの下痢効果を無効にする抗ＳＴ抗体を誘導する。その結果は単一用量の経口投与される生菌弱毒化ビブリオ・コレレベクター化ＥＴＥＣワクチンである。
弱毒化ビブリオ・コレレベクター化ＥＴＥＣワクチンは下記の利点の１以上を有する。ｉ）それは長期保存のために凍結乾燥できる、ｉｉ）それはコールドチェーンを必要としない、ｉｉｉ）それは経口投与される、ｉｖ）それは単一用量だけ必要とする、ｖ）それは費用に比べて効果がよい、そしてｖｉ）それは大部分のＥＴＥＣ株に対して防御する。
腸管内病原体である、ビブリオ・コレレおよび毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）を指向する単一用量の生菌経口ワクチンはＥ．ｃｏｌｉからの抗原をコードする配列をビブリオ・コレレワクチン株へ遺伝子操作して入れることにより作成される。そのようなワクチン株の構築において、定着性および毒素産生の両方を中和することが望ましい。これは上記のようにビブリオ・コレレの弱毒化株、ペルー３を改変することにより達成できる。
ペルー３株はＥＴＥＣの熱不安定性毒素Ｂサブユニットとほぼ同一のコレラ毒素Ｂサブユニットをすでに発現しており、交差保護抗体を誘導する。この株を改変してＥＴＥＣの線毛抗原、およびコレラ毒素ＡサブユニットとＥＴＥＣの熱安定性毒素の変異型のオリゴマー化ドメインから成るキメラタンパク質を発現することが出来る。この様にして、ビブリオ・コレレとＥ．ｃｏｌｉ両者への免疫の誘発を達成できる。
ビブリオ・コレレ／ＥＴＥＣワクチン株の生成は微生物学および分子生物学における通常の技術を用いて達成される。動物に定着し免疫応答を誘発する株の能力は確立されたウサギの腸内感染モデルで分析できる。
線毛抗原のクローニングおよび発現
ＥＴＥＣのヒトの腸内上皮への定着能力は定着因子抗原（ＣＦＡｓ）および推定の定着因子（ＰＣＦｓ）として知られている血清学的に異なる線毛により仲介されている。ＣＦＡ／４線毛は、全ＥＴＥＣ臨床単離体の約１／４から１／３に同定される主要な定着因子である。グループ（ＣＳ６）の原型の一員の主要なサブユニットをコードする遺伝子が他（の研究者）によりクローン化され配列決定されている。
高コピー数のプラスミドに担持されるクローン化ＣＳ６遺伝子を電気形質転換によりペルー３に導入し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリア・バータニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス中で培養して維持した。ＣＳ６配列を含む、ペルー３の全細胞溶菌液をタンパク質抗原発現について変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び抗ＣＳ６ポリクローナルウサギ血清を用いるイムノブロットにより分析した。イムノブロットを抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体およびＢＣＩＰを用いて展開（現像）した。ＣＳ６遺伝子の発現は１７キロダルトンタンパク質の産生として検出された。従って、ＣＳ６抗原はワクチンの製剤化のためにペルー３中で発現できる。
しかしながら、ワクチン株候補を生成するために、抗生物質選択の非存在下で安定的にＣＳ６遺伝子を維持させ、それをビブリオ・コレレにより活発に転写されるプロモーターから発現させるようにすることが望ましい。その目的のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてプラスミドに担持されているＣＳ６遺伝子を特異的に増幅し、ビブリオ・コレレの染色体への組み込みを可能にするアンピシリン耐性でストレプトマイシン感受性の“自殺”ベクターへの後に続くクローニングのためにその末端にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を作成することが出来る。詳細には、ＰＣＲで生成されＰａｃＩ部位及び３’ＮｏｔＩ部位にはさまれたＣＳ６ＤＮＡをＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化されたｐＪＭ６８９１ＤＮＡに連結してＣＳ６遺伝子をコレラ毒素プロモーターの制御下に配置する。複製のためにｐＪＭ６８９１に必要なｐｉとして知られている特異的なトランス作用タンパク質を提供するＥ．ｃｏｌｉ ＳＭ１０ｐｉｒ株に連結混合物を電気形質転換により導入する。しかしながら、ｐＪＭ６８９１およびその誘導体をビブリオ・コレレ（ｐｉタンパク質を欠いている）に導入する場合、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する耐性の選択はプラスミドが染色体に組み込まれることを必要とする。組み込みの部位は、ビブリオ・コレレ染色体の配列に同一で、相同的組み換えが起こるのを可能にするＣＳ６に隣接するビブリオ・コレレのｌａｃＺＤＮＡ配列の存在により決定される。その結果得られた子孫はアンピシリン耐性であり、プラスミドの組み込まれたコピーとｌａｃＺ遺伝子の繰返しＤＮＡ配列により囲まれたＣＳ６配列を収容している。
繰返しは分離してベクター配列（アンピシリン耐性決定基を含む）を除去し、ＣＳ６遺伝子を毒素プロモーターの制御下に残すことができる。これは、２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で株を培養し、ペルー３に本来備わっているストレプトマイシン耐性対立遺伝子について、またプラスミドにより導入されたストレプトマイシン感受性対立遺伝子に対して淘汰することにより行われる。ストレプトマイシンの存在下で一晩増殖した後、培養物を単一コロニーに関して１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天に塗布し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する感受性を採点した。予想された組み込みと切断事象が起こったかどうか決定するためにストレプトマイシン感受性でかつアンピシリン耐性の単離体を染色体ＤＮＡのサザンブロットにより分析する。
これらの単離体をイムノブロット法を用いて抗原産生レベルを分析することが出来る。ＣＳ６線毛抗原の産生は、コレラ毒素プロモーターの転写に影響を与えることが知られている種々の増殖条件下で評価することが出来る。ＣＳ６発現のレベルに関して培地のｐＨ（６．５対８．０）、温度（３０℃対３７℃）、ＮａＣｌ濃度（５０から５００ｍＭ）およびアミノ酸濃度（０から２５ｍＭ）の影響を測定することが出来る。
続いて、安全性および免疫原性を証明するためにワクチン株候補ペルー３／ＣＳ６をウサギモデルに用いる。ＣＦＡ抗原を産生するＥＴＥＣのヒト臨床単離体は、通常、実験動物に病原性がないので、安全性および免疫原性を証明するためにＥ．ｃｏｌｉ株ＲＤＥＣ−１のＡＦ／Ｒ１線毛抗原を発現する他のペルー３誘導体を構築する。この抗原は消化管上皮への吸着に介在し、ウサギに下痢疾患を生じる。プラスミドｐＷ１に担持されるＡＦ／Ｒ１をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｐＪＭ６８９１にクローン化し、ＣＳ６と同じような方法で染色体に組み込む。ＡＦ／Ｒ１の発現レベルをイムノブロットにより評価する。これはヒトのワクチン候補を生成しないが、それは改変ペルー３株により修飾された異種抗原の発現および異種生物による攻撃からの保護の誘導を示すモデルとしての役目を果たす。
高コピー数のプラスミドに担持される、クローン化ＡＦ／Ｒ１遺伝子も電気形質転換によりペルー３に導入され５０μ／ｍｌのアンピシリンを含むルリア・バータニブロス中での培養により維持された。ＡＦ／Ｒ１配列を含むペルー３の全細胞溶菌物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および抗ＡＦ／Ｒ１ポリクローナルウサギ血清を用いるイムノブロットによりタンパク質抗原の発現に関して分析した。イムノブロットを抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体およびＢＣＩＰを用いて展開（現像）した。ＡＦ／Ｒ１遺伝子の発現は約１８キロダルトンタンパク質の産生として検出された。従って、ＡＦ／Ｒ１抗原はワクチンの製剤のためにペルー３中で発現できる。
類似の方法を用いて、リポ多糖（ＬＰＳ）およびプラスミド由来侵入性タンパク質のようなシゲラの保護的抗原を発現するワクチン株を作成し、シゲラ・ソンネイのような感染性シゲラ種により引き起こされる感染性下痢に対して保護することが出来る。
シゲラ・ソンネイにおいて、ひとつの血清型のＬＰＳだけがあり、この細菌に対する保護において、それは主要な抗原決定基である。Ｅ．ｃｏｌｉへのＬＰＳオペロンをコードするプラスミドクローンの導入はＬＰＳの発現をもたらし、抗シゲラソンネイＬＰＳ抗体により凝集される能力をＥ．ｃｏｌｉに付与するのに充分である。ペルー３欠失変異株に導入された同じプラスミドは、それを凝集可能にする。オペロンのさらに別の分析は、ｐＢＲ３２２にサブクローン化された、このプラスミドの１２キロ塩基のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１断片が依然として凝集表現型を付与することを示した。次いで、この断片を上記のようにビブリオ・コレレ染色体の１ａｃＺ遺伝子に導入する。
ＳＴ−ＣＴＡ２融合体の構築および安全性
ＥＴＥＣは定着および２つの別々の毒素の産生により下痢を引き起こす。熱不安定性毒素（ＬＴ）は配列、構造、および生物活性においてコレラ毒素（ＣＴ）とほぼ同じである。従って、ペルー３誘導体によるＣＴの産生は両毒素を中和できる抗体を誘発するのに充分である。しかしながら、ＣＴでの免疫処置は多くの臨床単離体、そのうちのいくつかはＬＴを産生しないことにより産生される非常に小さなポリペプチド（１９のアミノ酸）であるＥＴＥＣ熱不安定性毒素（ＳＴ）からの保護を付与しない。従って、この毒素に対する抗体を誘発するためにコレラ／ＥＴＥＣワクチン候補における重要な要素は、ペルー３にＳＴ配列を包含することである。
毒素活性の全く無い［ＳＴオキソイド（ＳＴｏｘｏｉｄｓ）］多くの明確に特徴決定されたＳＴの誘導体が作成されている。これらの誘導体は、通常、毒素の断片またはタンパク質の３つのジスルフィド結合を形成しているシステイン残基における置換変異体である。残基５および１０においてシステインからアラニンへの変異を有する完全な成熟ポリペプチドからなるＳＴオキソイドを構築して毒素活性を最小にするかまたは除去することが出来る。このＳＴオキソイドをコードする遺伝子はＤＮＡ自動合成装置で生成された相補オリゴヌクレオチドから全て作成することが出来る。合成遺伝子は後に続くプラスミドベクターへのサブクローニングのためにユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位によって隣接される。
ＳＴのサイズ（１９のアミノ酸）は、それを本質的に不十分な免疫原にしている。完全なＳＴまたはさらに小さなペプチド断片も他の大きなタンパク質（担体）と化学的または遺伝子的に結合すれば、ＳＴはより良好な免疫原になり中和抗体を誘発する。使用される主要な担体はＬＴまたはＣＴのＢサブユニットであった。コレラ毒素Ａ２サブユニット（Ａ断片がＢサブユニットペンタマーとオリゴマー化するのを可能にする酵素性サブユニットのドメイン）と融合した外来タンパク質がペンタマーと結合し、完全毒素状の複合体を形成するので、これらのキメラ複合体はｉ）ビブリオ・コレレにより分泌され、ｉｉ）ガングリオシドレセプターに結合でき、且つ、ｉｉｉ）免疫反応性である。
ＳＴオキソイドをコードする合成遺伝子はインフレームでＣＴ Ａ２をコードする遺伝子の５′末端に融合されてＳＴオキソイド・Ａ２キメラを生成する。この遺伝子融合構築物を上記のようにペルー３染色体に組み込める。ＣＴ Ｂサブユニットとともに発現させた場合、このタンパク質はＳＴとＣＴ両方の生物活性を全く欠く完全毒素状の複合体を形成しガングリオシドレセプターに結合できる。ＳＴオキソイド・Ａ２キメラタンパク質を発現する株は、置換変異が抗原的に関係するタンパク質を生じるかどうかを決定するために抗ＳＴ抗血清を用いてイムノブロットにより分析できる。ＳＴオキソイドはまた幼児マウスアッセイにおいて毒性を比較できる。
幼児マウスアッセイを下記のように行う。２−３日齢のマウスに、これらのコレラワクチン株（または対照として精製されたＳＴ）から得られたタンパク質抽出物を胃内部に注射し、注射３−４時間後に殺して、消化管と体の重量比率の増加を検査した。最低の毒性を示すＳＴオキソイド・Ａ２キメラ候補は、続いてウサギにおける免疫原性について分析することが出来る。
ペルー３／ＡＦ／Ｒ１の安全性、免疫原性および効能
ＡＦ／Ｒ１を発現するペルー３の最初の検査をウサギで行う。細菌をニュージーランドホワイトラビットに用量２×１０²、２×１０⁴、２×１０⁶、２×１０⁸で経口投与する。便の試料を採集し１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを有するＬＢ寒天プレートで培養し細菌の定着性および放出を数える。血液をワクチンの投与前、ならびに投与後７日、１４日、２１日、そして２８日目に取る。血清を調製し、マイクロタイタープレートに結合した精製されたＡＦ／Ｒ１を用いて酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＡＦ／Ｒ１タンパク質に特異的な抗体の存在、およびＲＤＥＣ−１細菌を凝集する能力を分析する。
ペルー３／ＡＦ／Ｒ１株を接種された動物を続いてＲＤＥＣ−１の病原株で攻撃する。攻撃用量２×１０⁶の微生物を免疫したウサギおよび免疫していないウサギに経口投与し、便の試料を下痢（直腸部分を汚すゆるい水分のある便と、檻の底のゆるい便とに定義）について観察する。下痢は、非免疫動物には通常３−４日以内に発生する。定着性をアッセイするために、直腸スワブ試料をラクトースマッコンキー寒天プレートで培養し、ラクトース陽性コロニーをスライド凝集検査において抗ＲＤＥＣ−１抗体との陽性反応について採点する。保護は４日後下痢および細菌定着の阻害の両方で定義される。
ペルー３／ＣＳ６およびペルー３／ＳＴオキソイドの安全性および免疫原性
ＣＳ６およびＳＴオキソイド・Ａ２を発現するペルー３株の最初の検査を上記のように行う。血清を調製し精製したＣＳ６かまたはマイクロタイタープレートに結合したガングリオシドを用いて酵素結合抗体免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）によりＣＳ６またはＳＴオキソイド・Ａ２キメラタンパク質に特異的な抗体の存在を分析する。抗ＣＳ６血清は補体を固定でき、ＣＳ６産生Ｅ．ｃｏｌｉを溶菌できる抗体の存在についても分析できる。このアッセイにおいて、ＣＳ６を担持する細菌を血清およびモルモットの補体と混合し、ＬＢブロスを加え、細菌をＬＢ寒天に塗布する。殺菌作用の結果、回収される生存菌数の減少を生じる。最後に幼児マウス毒性アッセイにおいて抗ＳＴオキソイド・Ａ２血清をＳＴ活性を中和できる抗体について検査する。
組み換えコレラホロトキソイドとしてＨＩＶ−１抗原を発現する弱毒化ビブリオ・コレレの構築
上記の方法と類似のアプローチを用いてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の抗原を発現するビブリオ・コレレワクチン株を構築する。
熱ショックタンパク質ｈｔｐのプロモーターおよびコレラＣＴ−Ｂ遺伝子を含む細菌転写ユニットを包含するコレラシャトルプラスミドを構築した。転写ユニットはコレラのｒｅｃＡ遺伝子座に由来するＤＮＡ配列に隣接されているので、コレラゲノムのｒｅｃＡ遺伝子座とプラスミドの両方に存在するＤＮＡ配列間の相同的組み換えによりＣＴ−Ｂ遺伝子とそのプロモーターがコレラの染色体に組み込まれることが出来る。シャトルプラスミドはまた選択マーカーとしてアンピシリン耐性をコードする遺伝子およびストレプトマイシン感受性をコードする遺伝子をも含んでいる。
ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質はＨＩＶ抗原がＣＴ−Ａポリペプチドのシグナル配列により先行され、ＣＴ−Ａ２ドメインによりあとに続かれる“サンドイッチ”融合タンパク質の形態で細菌により分泌される組み換えビブリオ・コレレホロトキソイドの一部として発現される。ＣＴ−Ａおよびその上流の非翻訳領域のシグナル配列は細菌におけるＨＩＶ−１抗原の発現および分泌のために必要になる。ＨＩＶ−１抗原に融合されたＣＴ−Ａ２ドメインは組み換えコレラホロトキソイドを形成するためにＣＴ−Ｂタンパク質と組み立てられる融合タンパク質に必要である。上記のプラスミドは修飾してシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列およびＣＴ−Ａ遺伝子のシグナル配列を含むＰＣＲ断片、およびＨＩＶ−１抗原の挿入のためのユニークな制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩ部位がそのＰａｃＩ部位に挿入されるようにすることができる。プラスミドはさらに修飾してＣＴ−Ａ２ドメインおよびＣＴ−Ｂ遺伝子の両方を含む第二のＰＣＲ断片がＣＴ−Ｂ遺伝子を置換するようにすることができる。ＤＮＡ挿入の方向性およびＰＣＲ断片の連接点はＤＮＡ配列決定により確認できる。
この研究で用いられるＨＩＶ−１抗原は主要な中和ドメイン（ＰＮＤ）を含むＨＩＶ−１エンベロープの糖タンパク質の一部である。以前の研究はＰＮＤから誘導された一群の合成ペプチドが動物に中和抗体を誘発すると証明している。ＰＮＡを含むがシグナル配列および初めの１２０のアミノ酸のないＨＩＶ−ＬＡＩエンベロープ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を、ＣＴ−Ａ２ドメインとＣＴ−Ｂ遺伝子の両方を含む、上記のプラスミドのＰｍｅＩ部位にクローニングする。ＨＩＶ抗原およびＣＴ−ＡシグナルペプチドならびにＣＴ−Ａ２ドメインのインフレーム融合は、ＤＮＡ配列決定により確認できる。
ＨＩＶ−１抗原を担持する遺伝子的に弱毒化されたコレラ株を構築するために、ペルー２を親株に用いた。ＨＩＶ配列を含むプラスミドは、交配によりペルー２株に導入することが出来る。ｃｔｘおよびｒｅｃＡ遺伝子座の欠失を含み、ＨＩＶ−１抗原の非毒性組み換え融合タンパク質を発現するビブリオ・コレレの組み換え株が作成されて、ペルー１０１と命名された。サザンブロット分析を用いてペルー１０１がＨＩＶ−１抗原のＤＮＡを含むことを確認し、ウエスタンブロット分析を用いて組み換え細菌によるＨＩＶ−Ａ２融合タンパク質の発現を証明することが出来る。抗ＣＴ−Ｂと抗ＨＩＶ抗体両方を用いるＥＬＩＳＡは、組み換えコレラホロトキソイドが細菌により分泌されているかどうかを検査できる。
ＳＨＩＶモデルを用いる経口ＨＩＶ−１ワクチンの免疫原性と保護的効能の霊長類における前臨床評価
経口ＨＩＶ−１予防ワクチンとしてビブリオ・コレレ組み換え体ペルー１０１の免疫原性を検査するために、成熟した（おとなの）雌アカゲザル［マカカ・マラッタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）］６匹それぞれに重炭酸水３０ｍｌ中に含まれる新たに調製した生菌２×１０⁶ＣＦＵを与える。同じ年齢と性別群のさらに別の動物２匹に対照として同じ用量のペルー２を与える。予防接種の２日後、動物の便の試料を分析し、ＬＢストレプトマイシンプレート上でのコロニー形成単位を測定することにより腸内のビブリオ・コレレの増殖を検出することが出来る。ＨＩＶ−１およびＣＴ−Ｂに特異的な、ＩｇＡとＩｇＧを含む、膣、直腸、唾液および血清の抗体を予防接種後２週間毎に検査する。投入ＨＩＶ−１抗原に特異的な宿主動物のＴ細胞増殖およびＣＴＬ応答も検査する。予防接種した動物の最初の免疫応答のレベルによるが、精製されたＨＩＶ−１抗原の経口による、または筋内および静脈注射による１回または数回の追加免疫を必要とすることがある。
ペルー１０１が動物を刺激して抗ＨＩＶ抗体または細胞性ＨＩＶ−１特異的免疫応答を生成できる場合、ＨＩＶ−１ワクチンとしてのペルー１０１の効能を膣内注入による生きたＳＨＩＶ−ＬＡＩ保存菌で動物を攻撃することにより検査する。２匹のペルー２動物（ペルー２株を接種されたサル）および６匹のペルー１０１動物のうち２匹（ペルー１０１を接種されたサル）を２×ＶＩ−ＡＩＤ₅₀の用量で攻撃する。他のペルー１０１動物のうち２匹は１０×ＶＩ−ＡＩＤ₅₀を受け、残りのペルー１０１サルは最大の５０×ＶＩ−ＡＩＤ₅₀の用量を受ける。抹消血試料を感染後２週間毎に採取し、培養ＰＢＭＣ中にウイルス抗原を検出することにより動物が感染されたかどうか決定する。ワクチンが同種のＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を担持するＳＨＩＶによる攻撃に対して動物に予防効果を有する場合、異型のＨＩＶ−１エンベロープを含むＳＨＩＶ−Ｅｌｉを用いて動物を再攻撃することが出来る。
生ワクチン株の用途
ビブリオ・コレレ変異株ペルー１、ペルー２、バング１、バング２、バー１、バー２、ベンガル２、ベンガル３、ペルー１４および上記の追加の変異体は生ワクチンとして用いられた場合、コレラおよび他の関連毒素産生疾患に対して免疫学的保護の供給源として有用である。他のそのような疾患には、コレラＢサブユニットと免疫学的交差中和可能な毒素を産生する毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌により誘発される疾患が含まれるがこれらに限定されない。
実験動物またはヒトの腸に接種した場合、ビブリオ・コレレの変異体はオガワおよびイナバ０１ＬＰＳ抗原、鞭毛抗原、Ｔｃｐ線毛の抗原性ドメインおよび外膜タンパク質を含む、但しこれらに限定されないが、これらの株により作り上げられる全ての細菌成分に対して強力な免疫応答を刺激し誘発する筈である。他の原型コレラワクチンを用いた公表された研究に基づけば、これら細菌成分に対して向けられた抗体のＩｇＡとＩｇＧクラスの両方が接種された動物またはヒトにおいて合成され、ビブリオ・コレレの病原性の株による後に続く攻撃に対して動物またはヒトを保護する役目を果たすであろう。
用量
これらワクチンの適切な用量および投与の決定は本質的にはＨｅｒｒｉｎｇｔｏｎら（１９８８，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１６８：１４８７−１４９２）に記載されているように行う。一般的に、そのような用量は用量当たり１０⁵から１０⁹の間の生存している細菌であるが、これらの数値には限定されない。
ワクチン株の増殖
ワクチンとして用いられる細菌は標準的ビブリオ・コレレ実験培地で増殖できる。細胞を採集し、次いで生存性を保存する製剤中で冷凍乾燥する（例えば、５ｍＭ ＣａＣｌ₂および容積で１０％重量のグリゼロールを含む減菌スキムミルクまたは食塩水）。
投与
ワクチンの投与は２つのエンベロープまたはバイアル、すなわちひとつは凍結乾燥したワクチン株または株の組み合わせを含み、もうひとつは水および胃酸を中和するために充分な重炭酸ナトリウムかまたは代わりの緩衝液を含む（約２グラム）、内容物の組み合わせを必要とする。次に、ワクチンは被接種者により飲み込まれる。または、凍結乾燥したワクチンを耐酸性“腸溶被覆”で被覆される錠剤に組み込まれる。そのような形態のワクチンは、数日から数週間の間隔をおいて１以上（３まで）の用量で被接種者に投与される。“追加免疫”ワクチンとして使用される場合、ワクチンは同じように数日から数週間の間隔をおいて１以上（３まで）の用量を以前予防接種を受けた個人に投与される。２以上の株が投与されている場合、それらは共に、または個々の用量で７−２８日間をおいて提供されてもよい。
改良された死菌経口コレラワクチン
改良された死菌経口コレラワクチンの調製は上記の株から行われる。現在入手できる実験コレラワクチンは精製されたコレラ毒素Ｂサブユニットと混合されたホルマリンおよび熱で死滅したビブリオ・コレレ約１０¹¹個から成る（Ｂｌａｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：１１１６，１９８７）。このワクチンの細菌成分の調製に用いられる４つの株は被接種者に投与される前に完全に不活性化されなければならない活性コレラ毒素を産生する。上記の新規株は下記のそれぞれの理由によりＢｌａｃｋら（上記）のワクチンと比較して著しく改良されているワクチンを提供する。
（１）ペルー２、バング２、およびバー２に由来し、そしてこれらを含む株はコレラ毒素の非毒性Ｂサブユニットだけ産生し毒性のＡサブユニットは産生しないので、これらの株の培養は被接種者への投与前に緩和な不活性化のみ必要とし、従ってホルマリンまたは熱のようなさらに過酷な変性処理を避けている。より緩和な処理の利点は抗原がより大きな度合いでそれらの本来の立体配置を保持し、その結果、それらにはさらに免疫原性がある。細菌のタンパク質を化学的に不活性化するのを避ける不活性化の緩和な方法は、生物のマイクロ波処理、他の放射線源または緩和な有機溶媒か或いは界面活性剤による処理を含み、または細胞を音波処理またはフレンチプレスの使用のような機械的方法により溶菌させてもよい。
（２）ペルー３、バング３およびバー３株において、ｃｔｘＢ遺伝子はｈｔｐプロモーターの制御下に置かれている。その結果、これらの株はＬＢのような標準的実験培地において多量のコレラ毒素Ｂサブユニット（１ｍｌ培養液当り１０μｇ以上）を合成する。これは多量のコレラＢサブユニットの精製を容易にし、従って、これらの株は緊縮増殖条件下では少量のＢサブユニットだけしか産生しない他の株に勝る著しい利点を提供する。
（３）既存の死菌コレラワクチンの調製において、別々の細菌株を用いて全細胞抗原として用いられる株からＢ毒素サブユニットを産生する。従って、Ｂサブユニットの調製中、生化学的方法を用いて毒性Ａサブユニットから離してＢサブユニットを精製する必要がある。そのような精製は少量のＡサブユニットがＢサブユニットの調製に混入する危険を生じる。上記の株を用いることにより、Ｂサブユニット調製物を得るために用いられる同じ培養物から全細胞抗原調製物を生成することが可能である。第一の事例では、Ｂサブユニットの精製は、今や、不必要である。なぜならこの株はＡサブユニットを産生しないので、その結果、ワクチンの産生に必要な時間量とかなりの費用を減らす。第二に、調製においてＡサブユニットの、いかなる混入も有する危険がない。なぜなら、細菌は、このサブユニットの遺伝子を全くコードしないので、従って、それを産生できないからである。その結果、全細胞調製物を被接種者に最小の危険性を有するワクチンとして用いることができる。
（４）本発明のいくつかの細菌株はエルトール生物型のビブリオ・コレレの誘導体であり、さらに詳細には、ペルー２、ペルー３およびペルー４の場合、それらはラテンアメリカで実際に現在流行の原因微生物である単離体（Ｃ６７０９−Ｓｍ）の誘導体である。この特定の親株に特有の抗原があれば、上記のワクチン誘導体はラテンアメリカおよび恐らく世界の他の地域において、エルトール疾患に対して、一般的により良好な保護を提供する。
改良された経口死菌コレラワクチンの調製
改良された経口死菌コレラワクチンは下記のように調製できる。好ましくはオガワ血清型（例えば、バー３）からイナバ血清型（例えば、ペルー３、ペルー１４またはバング３）までから選択される最小限２つの株およびベンガル血清型（例えば、ベンガル２またはベンガル３）を別々の培養で増殖する。当業者は、３７℃で細胞増殖を最大にするために条件、培地等の調製の仕方を知っている。例えば、ＣＹＥ（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、１９７７，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１６：７８９）またはグルコース、すなわちＡＧＭ４（ｖａｎ ｄｅ Ｗａｌｌｅら、１９９０，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：３８９）を含む最小培地のような培地中で高いレベルの通気下で増殖した培養物を用いる。細菌の増殖が飽和に達した時、全細胞を遠心により培地から回収し、一方上清フラクション内に含まれるタンパク質（Ｂサブユニットを含む）は超遠心によりまたは沈殿により得られる。細胞はＢｌａｃｋらの方法（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：１１１６，１９８７）を用いて、またはより緩和な方法（例えば、マイクロ波処理、アルファー、ベータ、またはガンマ線を用いる照射）、エタノールまたはアセトンのような有機溶媒での処理により不活性化でき、または細胞を界面活性剤での処理により、または例えば音波処理またはフレンチプレスの使用による機械的方法により溶菌してもよい。次いで不活性化した細胞を細菌のタンパク質（Ｂサブユニットを含む）を含む、濾過し濃縮した上清と混合し、混合物を経口投与に適切な製剤学的に許容できる溶液（例えば滅菌した食塩水また２％重炭酸ナトリウム）に懸濁する。
投与
ワクチンは被接種者が２グラムの重炭酸ナトリウムを摂取した数分後に被接種者により飲み込まれる経口食塩水溶液として被接種者に投与される。または、調製物は凍結乾燥され、錠剤に圧縮され、続いて、被接種者への投与前に耐酸性“腸溶被覆”で被覆される。錠剤は、また、腸内の粘液性組織による調製物の摂取を促進するためにポリマーを用いてマイクロカプセルに封入することができる。
用量
ワクチンの単一用量は約１０¹¹の細胞および約１００−５０００μｇのコレラＢサブユニットを含むべきである。被接種者は約２週間以上の間隔をおいて投与される約２つ以上の個別用量のワクチンを必要とすることが予想される。
寄託
特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下でビブリオ・コレレ株Ｃ６７０９−Ｓｍ、Ｐ２７４５９−Ｓｍ、Ｅ７９４６−Ｓｍ、ベンガル２、ベンガル３、ＭＯ１０、およびペルー１４が米国メリーランド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託物はＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ５５３３１（Ｃ６７０９−Ｓｍ）、ＡＴＣＣ５５３３３（Ｐ２７４５９−Ｓｍ）、ＡＴＣＣ５５３３２（Ｅ７９４６−Ｓｍ）、ＡＴＣＣ５５４３６（０１３９、ベンガル２）、ＡＴＣＣ５５４３７（０１３９、ベンガル３）およびＡＴＣＣ５５４３８（０１３９、ＭＯ１０）を与えられた。ペルー１４は１９９３年６月３０日にＡＴＣＣに寄託された。
出願人の譲受人、ハーバード・カレッジの学長および特別研究員は、特許が許可された場合、ＡＴＣＣが寄託物の永続性を可能にし公共による寄託物への利用の準備をする受託機関であることを申し立てている。そのように寄託された物質の公共の入手に関する全ての制約は特許の許可後、完全に取り除かれる。物質は、特許出願の系属中、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４および３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２下で特許商標庁長官により物質に対して権利があると決定された者に入手可能になる。寄託された物質は、寄託物質の試料の分譲のための最も直近の要請後少なくとも５年間、そしてどんな事情があろうとも、寄託の日付後少なくとも３０年間、または特許の施行期間のいずれか長い方の期間、寄託物質を生存させ汚染させないように保存するために必要なあらゆる配慮を払って維持する。出願人の譲受人は、要請された場合、寄託物の状況により受託機関が試料を分譲できない場合、寄託物を交換するその義務を承諾する。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊｏｈｎ Ｊ．
（ｉｉ）発明の名称：コレラワクチンとしての欠失変異体
（ｉｉｉ）配列の数：６
（ｉｖ）住所：
（Ａ）受信人：Ｆｉｓｈ ＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ
（Ｂ）通り：２２５ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ
（Ｃ）都市：Ｂｏｓｔｏｎ
（Ｄ）州：Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
（Ｅ）国：Ｕ．Ｓ．Ａ．
（Ｆ）ＺＩＰコード：０２１１０−２８０４
（ｖ）コンピュータ及びＯＳの名前及び型：
（Ａ）ディスク：３．５インチ ディスク、１．４４Ｍｂ
（Ｂ）機器：ＩＢＭ ＰＣ／２ モデル５０Ｚ又は５５ＳＸ
（Ｃ）ＯＳ：ＭＳ−ＤＯＳ（バージョン５．０）
（Ｄ）ソフト：ワードパーフェクト（バージョン５．１）
（ｖｉ）本出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：
（Ａ）名前：Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊｈｏｎ Ｗ．
（Ｂ）登録番号：２９，０６６
（Ｃ）処理番号：００７４２／００７００１
（ｉｖ）通信情報：
（Ａ）電話：（６１７）５４２−５０７０
（Ｂ）電話ファックス：（６１７）５４２−８９０６
（Ｃ）テレックス：２００１５４
（２）配列番号：１
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１７
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：１

（２）配列番号：２
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：２

（２）配列番号：３
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４８
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：３

（２）配列番号：４
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５０
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：４

（２）配列番号：５
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：５

（２）配列番号：６
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列： 配列番号：６

Claims (23)

1. 毒素非産生性で遺伝学的に安定なビブリオ・コレレの変異株であって、前記変異株はｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡの遺伝子操作による欠失を含み、そのために、前記変異株はコレラ毒素の反応産生性のサブユニットＡを欠き、前記変異株は更にａｔｔＲＳ１配列ＣＣＴＡＧＴＧＣＧＣＡＴＴＡＴＧＴの一部または全部の欠失を含み、そのために、前記変異株は機能的ａｔｔＲＳ１配列を欠き、且つ、機能的なａｔｔＲＳ１配列を持つ親株に比べて少なくとも１０００倍低いａｔｔＲＳ１介在の部位特異的な組換えを示す、ビブリオ・コレレの変異株。
2. ｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡの欠失を含む遺伝学的に安定なビブリオ・コレレの変異株を作成する方法であって、前記株はｃｔｘＡサブユニットをコードするＤＮＡの欠失を含み、そのためにコレラ毒素の反応産生性のサブユニットＡを欠き、且つ、前記株は更にａｔｔＲＳ１配列の欠失を含み、前記方法は
   そのｃｔｘＡ及びａｔｔＲＳ１配列において変異しているビブリオ・コレレＤＮＡの断片を含むプラスミドを野生型ビブリオ・コレレに導入することから成り、前記ＤＮＡは前記野生型ビブリオ・コレレ内で野生型ビブリオ・コレレＤＮＡと組換えをする能力を持ち、その結果、前記変異株を生成し、前記変異株は、ａｔｔＲＳ１の少なくとも２つのコピーを持つ親株に比べて少なくとも１０００倍低いａｔｔＲＳ１介在の部位特異的な組換えを示す、遺伝学的に安定なビブリオ・コレレの変異株を作成する方法。
3. 請求項１に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がエルトール血清グループに属する親株に由来するビブリオ・コレレ株。
4. 請求項３に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がイナバまたはオガワ血清型に属する親株に由来するビブリオ・コレレ株。
5. 請求項４に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がペルー２（ATCC寄託番号55865）、バング２（ATCC寄託番号55862）、バー２（ATCC寄託番号55859）、または、ペルー１４（ATCC寄託番号5544）であるビブリオ・コレレ株。
6. 請求項１に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株が非０１血清グループに由来するビブリオ・コレレ株。
7. 請求項１に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がＣＴＸコア配列の欠失を含み、且つ、全ての前記ａｔｔＲＳ１配列を完全に欠失している、ビブリオ・コレレ株。
8. 請求項１に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株が更にｒｅｃＡ遺伝子を欠失し、そのために、ルリアブロス１ｍｌあたり０．１μｌのメチルメタンサルフォネートが前記株に致命的である、ビブリオ・コレレ株。
9. 請求項１、７または８に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株が更にコレラ毒素のＢサブユニットをコードするビブリオ・コレレ株。
10. 請求項１、７、または８に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がさらに異種抗原をコードするビブリオ・コレレ株。
11. 請求項１０に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記異種抗原がシガ様毒素またはシゲラリポ多糖抗原、またはＥ．ｃｏｌｉ線毛抗原またはＨＩＶ抗原であるビブリオ・コレレ株。
12. 請求項１０に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記異種抗原をコードするＤＮＡ配列がビブリオ・コレレのｌａｃＺ遺伝子に挿入されているビブリオ・コレレ株。
13. 請求項９に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がペルー３（ATCC寄託番号55865）、ペルー４（ATCC寄託番号55866）、バング３（ATCC寄託番号55863）、またはバー３（ATCC寄託番号55860）であるビブリオ・コレレ株。
14. 請求項２に記載の方法であって、前記ビブリオ・コレレ株がペルー２（ATCC寄託番号55865）、バング２（ATCC寄託番号55862）、またはバー２（ATCC寄託番号55859）である方法。
15. 請求項２に記載の方法であって、前記変異株がＣＴＸコア配列及び全てのａｔｔＲＳ１配列を欠失している方法。
16. 請求項２に記載の方法であって、前記変異株がさらにｒｅｃＡ遺伝子を欠失し、そのために、ルリアブロス１ｍｌあたり０．１μｌのメチルメタンサルフォネートが前記株に致命的である方法。
17. 請求項２に記載の方法であって、前記変異株がさらに異種抗原をコードする方法。
18. 請求項２に記載の方法であって、前記方法がさらに抗原をコードするＤＮＡの断片を前記変異株のｌａｃＺ遺伝子への導入を含む方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、前記変異株がペルー５（ATCC寄託番号55868）である方法。
20. 生理学的に許容される担体中に請求項１に記載の株を含むワクチン。
21. 請求項６に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がベンガル血清グループのものであるビブリオ・コレレ株。
22. 請求項６に記載のビブリオ・コレレ株であって、前記株がベンガル２（ATCC寄託番号55436）またはベンガル３（ATCC寄託番号55437）であるビブリオ・コレレ株。
23. 請求項１に記載のビブリオ・コレレ株であって、少なくとも２つの機能的ａｔｔＲＳ１配列を持つ親株に比べて少なくとも１０００倍低いａｔｔＲＳ１介在の部位特異的組換えを示す株。

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