JPH05507842A - 生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生ワクチン 本発明は、弱毒化した微生物、その生産方法、動物や人間での免疫予防的使用法 、及びワクチンに関する。

ワクチン接種や免疫予防の背景となる原理は病原生物の弱毒株を接種することに 依り動物に免疫応答を引き起こし、その後の感染に対して防御することである。

１９５０年にベーコンらは（Ｂｒ、　Ｊ、εｘｐ、　Ｐａｔｈ、　第３１巻、７ １４−７２４頁）成る種のチフス菌（Ｓ、５ｔｙｆｉ）株の栄養要求変異体が親 株と比ベマウスの内で弱毒化していることを示している。これらの栄養要求変異 体の成るものは全細胞ワクチンの元になる候補として適しているものと提案され てきた。（例えばホシイースとストッカーのＮａｔｕｒｅ、１９８１年、第２４ １巻、２３８−２３９頁及び欧州特許公開公報第３２２．２３７号を参照のこと ）。本質的な栄養要求性経路における変異の外に、他の遺伝子上にも微生物か弱 毒化する変異が起こることが示されている。その様な遺伝子上の例として多形質 発現効果を示すレギユロン（ｒｅｇｕｌｏｎｓ）例えばｃｙａ／ｃｒｐシステム （ロイ・クルティスｌＩｆらのＶａｃｃｉｎｅ第６巻、１５５〜１６０頁、１９ ８８年）及びＯｍｐＲｅｎｖＺシステム（ドーマンらのＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍ ｕｎ、第５７巻、２１３６−２１４０頁、１９８９年）及びｐｈｏ　Ｒシステム （フィールズら５ｃｉｅｎｃｅ第２４３巻、１０５９−１０６２頁、１９８９年 ）がある。

多くの微生物では、高温や養分喪失や有毒な酸素ラジカルや代謝阻害の様ないろ いろな環境ストレスに応答して、１〜２ダースのタンパク質が産生される。これ らのものは、微生物が受ける特定のストレスに応じて誘導された様々な遺伝子の 調節の一部分を表わしている。主要ストレスタンパク質（ヒートショックタンパ ク質としても知られている）のファミリーは自然界で最も高度に保存されている ものである。大腸菌、ショウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ　ｓｐｐ、） 及び人間から分離されたヒートショックタンパク質において、かなりの相同性が ある（最近の総説にナイドハルトＧ、Ｃとヴアン・ボーゲレンＲ０Ａの１９８７ 年版６大腸菌とネズミチフス菌”　コ　「細胞と分子生物学Ｊ　Ｐ、Ｃ，ナイド ハルトら編集、１３３４〜ｌ３４５頁、米国微生物学会出版、ワシントンＤ。

Ｃ）。例えば：Ｈｓｐ　９０．　Ｈｓｐ　７０及びＨｓｐ　６０がすべての原核 生物及び真核生物に見られるヒートショックタンパク質である。大腸菌及び人間 のＨｓｐ　９０のアミノ酸配列の比較で、アミノ酸残基の約半数が同じである。

他のストレスタンパク質のファミリーのものはＧｒｐＥ。

Ｇｒｏ　Ｅ　Ｌ、　Ｄｎａ　Ｋ、　Ｇｒｏ　Ｅｓ、　Ｌｏｎ及びＤｎａ　Ｊであ る。

ヒートショックタンパク質のファミリーをコードする遺伝子は、ｒｐｏ　Ｈ遺伝 子の産物であるσ３２因子と共作用するＲＮＡポリメラーゼによって転写される （ナイドハルトＦ、Ｃ，及びヴアン・ボーゲルンＲ，Ａによる１９８７年度総説 、“大腸菌とネズミチフス菌”　：　「細胞と分子生物学」ナイドハルトＦ、Ｃ ，ら編集、１３３４〜１３４５頁、米国微生物学会出版、ワシントンＤ、Ｃ）。

最近リピンス力ら（Ｎｕｃｌｅｔｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１９８８年、 第２１巻、１００５３〜１００６７頁）がσ０−非依存と思われるＨｔｒ　Ａと して大腸菌の成るヒートショックタンパク質を述べている。ｈｔｒ　Ａ遺伝子の プロモーター領域を調べてｒｐｏ　Ｈ遺伝子のＰ、３プロモーターとＤＮＡ塩基 配列の相同性があることを示しており、このプロモーターはσ′　（σ！４）因 子に認識されることが知られている。この類似性はｈｔｒ　ＡプロモーターもＲ ＮＡポリメラーゼのσ″（σ２４）ホロ酵素に認識されるのかも知れないことを 示唆している。

大腸菌での表現型として、ｈｔｒ　Ａ遺伝子坐の変異は、細菌が４２℃以上の温 度で生き延びる能力を失うことになる（リビンス力ら、１９８９年Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉａｌ第１７１巻、１５７４−１５８４頁）。この遺伝子は大腸菌染色体 の上で４　ｍｉｎの所に位置し、相対分子量（Ｍｒ）５１゜１６３のタンパク質 をコードしている。このタンパク質の前駆体は、シグナルペプチドを取り除き、 細菌の内膜を通した分泌で成熟したポリペプチドを作るＮ−末端プロセシングを 受ける（リビンス力ら、１９８８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ 、第２１巻、１００５３〜１００６７頁）。別個に、プロテアーゼ活性の低下し た大腸菌変異体を調べていたストラウチュに、　ＬとベックウィズＪによって（ １９８８年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８５巻、１５７６〜１５８０頁）　ｈｔｒ　Ａ遺伝子は、ｄｅｇＰと同定されて おり、ｄｅｇ　Ｐ変異体はＴｎｐｈｏＡ変異導入により単離され（マノイルＣと ベックウィズＪ、１９８５年　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、第８２巻、８１２９−８１３３頁）　、ｄｅｇ　Ｐを背景にハイブリッ ドＴｓｒｐｈｏＡ　（Ｔｓｒ−ＡＰ２　）組換えタンパク質の安定性が向上して いることによって認められた（ストラウチュに、Ｌ。

とベックウィズＪ、！９８８年　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第８５巻、１５７６〜１６８０頁）。大腸菌で、ｄｅｇ　Ｐと ｈｔｒ　Ａとして同定された遺伝子は同じものと思われ、“ストレス一応答″フ ァミリーの一つのタンパク質をコードしている。

本発明は、その弱毒性が、環境的ストレスに応じて産生される蛋白質をコードす る或いはコードＤＮＡの発現を調節する微生物のＤＮＡにおける変異によっても たらされている、免疫予防に用いる弱毒化微生物、異種抗原をコードしているＤ ＮＡを随意に発現出来る微生物を提供するものである。

本発明で用いる微生物は、好ましくは細菌であり、特に真核細胞の中に浸入し成 育しムスコサル（ｍｕｓｃｏｓａｌ）表面を住み場とするグラム陰性細菌である 。これらの具体例としてサルモネラ症、ボルデエテラ属、ヴイブリオ属、ハエモ フィラス属及びエツシャリヒイア属のメンバーか含まれる。特に、次の種、即ち チフス菌（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ）−人の腸チフスを起こす；ネズミチフス菌（Ｓ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　）−幾つかの動物種にサルモネラ症を起こす；サルモ ネラ・エンテリテイディス−人に食中毒を起こす：サルモネラ・コレラニスイス −ブタにサルモネラ症を起こす；百日咳菌（ボルデエテラ・ベルタスシス）−百 日ぜきを起こす：インフルエンザ菌（ハエモフィラス・インフルエンザエ）−髄 膜炎を起こす：及びナイセリア・ゴノールロー了ニー淋疾を起こす：などが挙げ られる。

ＤＮＡの変異は非復帰性の変異、即ち単一ステップでは修復出来ないような変異 である。この種の遺伝学的変異は、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）　、逆位（ｉｎｖ ｅｒｓｉｏｎ　）　、挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　）或いは置換（ｓｕｂｓｔｉ ｔｕｔｉｏｎ）　ニよる変異が含まれる。欠失変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔ ａｔｉｏｎ　）はトランスポゾンを用いて生ずることが出来る。これらは宿主の 染色体ＤＮＡに取り込まれる７５０〜数千塩基対からなるＤＮＡ配列である。関 心ある一連のＤＮＡ配列はこの様にして遺伝子機能を失くすことによって破壊さ れる。

トランスポゾンは宿主の染色体ＤＮＡから削除し得る；即ち最も屡々起こる切除 は、非復帰性の変異に不正確ながらつながっている。置換又は挿入による変異は 、組み換えを起こすベクターの上の不活性化ＰＮＡ配列を用いる或いは宿主染色 体ＤＮＡ内の関心あるＤＮＡ配列と交叉し結果として遺伝子機能を喪失すること により生じ得環境的ストレスに応じて産生されるタンパク質の例としてヒートシ ョックタンパク質（４２℃以上の温度上昇に応じて産生される）：栄養分欠損タ ンパク質（リン酸塩や窒素化合物の如き必須栄養分が微生物の生存に必要な１以 下であるレベルに応じて産生される）；毒物ストレスタンパク質（染料、酸、或 いは）ことによると植物の滲出物の如き毒性化合物に応じて産生される）：或い は代謝危機タンパク質（例えば微生物の浸透圧調節（ｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｅ ）能力に影響するイオンのレベル、ビタミン或いは代謝機構を妨げるような共因 子のレベルの上下変動に応じて産生される）が挙げられる。

好ましくはヒートショックタンパク質は図１　（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ：　１）　（ ｄｅｇ　Ｐとも記述される）に示した様なｈｔｒ　Ａ遺伝子にコードされるタン パク質である。他のタンパク質はｇｒｐ　Ｅ、　ｇｒｏ　Ｅ　Ｌ、（ｍｏＰＡ） 　、ｄｎａ　Ｋ、　ｇｒ。

ＥＳＳＩｏｎ及びｄｎａ　Ｊの如きストレス応答に関与しているのが知られてい る遺伝子にコードされている。環境的ストレスに応じて誘導されることの知られ ている遺伝子にコードされているタンパク質が他にも多（ある（ロンマンらＣｅ １ｌ　第４９巻、５７９−５８１頁）。これらの中で、次のものが挙げられる； 即ち窒素喪失に応じて誘導され積極的にｇｉｎ　Ａ及びｎ１ｆＬＡを調節する大 腸菌のｎｔｒ　Ｂ／ｎｔｒ　Ｃシステム（バックらＮａｔｕｒｅ　ｉ　３２０巻 、３７４−３７８頁、１９８６年：ヒルシュマンらＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ１８２巻、７５２５頁、１９８５年： ニクソンらＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ、第８３巻 、７８５０−７８５４頁、１９８６年；ライツアーとマガンサニクＣｅ１ｌ、第 ４５巻、７８５頁、１９８６年）；リン酸塩喪失に応じて誘導される大腸菌のｐ ｈｏ　Ｒ／ｐｈｏＢシステム（マキノらＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ１１第１９２巻 ５４９−５５６頁、１９８６ｂ）、染料や他の有毒化合物に応答して誘導される 大腸菌のｃｐｘ　Ａ／ｓｆｒ　Ａシステム（アルビンらＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、ｔＪ２６１巻、４６９８頁、１９８６年：ドゥルーリイーらＪ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、第２６０巻、４２３６−４２７２頁、１９８５年）である。根 粒菌での類似のシステムはｄｃｔ　Ｂ／ｄｃｔ　Ｄで、これは４Ｃ−ディスカル ボン酸（４Ｃ−ｄｉｓｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄｓ　）　ｊ：応答してい る（ロンマンらＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　第１６９巻、２４２４頁及びＣｅ １ｌ第１ｌ巻、５７９−５８１頁）。この型の毒性のシステムが癌腫菌（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）で述べられてきた。これは植物滲出物に応答して誘導 されるｖｉｒ　Ａ／ｖｉｒ　Ｃシステムである（し・ロークスらＥＭＢＯＪ第６ 巻、８４９−８５６頁、１９８７年；スタセルとザンブリスキイ−Ａｍ、　Ｊ、 　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、第４５巻、５９−６６頁、１９８６年：ウィナンスらＰｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３巻、８２７８頁、１９８６年）。同じ様に百日咳菌での ｂｖｇ　Ｃ−ｂｖｇ　Ａシステム（先にｖｉｒとして知られている）がＭｇトや ニコチン酸のレベルの上下変動に応答して毒性決定因子の産生を調節している。

生ワクチンの形で使用するには、本発明の弱毒化微生このことが単−ＤＮＡ配列 内での変異の起こる可能性は小さいと考えられる。しかしながら二つの別々のＤ ＮＡ配列の各々における変異によって弱毒化された微生物に復帰の起こる危険性 は、僅かであると考えられる。それ故に本発明の微生物の弱毒化は、環境的スト レスに応じて産生されるタンパク質をコードしている或いはコードＤＮＡの発現 を調節しているＤＮＡ配列に変異を入れること及び第２のＤＮＡ配列に変異を入 れることによって、もたらされることが好ましい。細菌にとって、第２のＤＮＡ 配列は、好ましくは必須の栄養要求性経路に関与する酵素をコードしている或い は浸透圧的応答の遺伝子の調節を行う産物の塩基配列即ちｏｍｐ　Ｒである（　 Ｉｎｆｅｃｔａｎｄ　［ｍｍｕｎ、　１９８９年　２１３６−２１４０頁）。最 も好ましくは、変異は芳香族アミノ酸生合成経路に関与するＤＮＡ配列内にあり 、一層特別に好ましくはａｒｏ　Ａ、ａｒｏ　Ｃ又はａｒｏ　ＤをコードするＤ ＮＡ配列である。（ＥＰ公開公報番号３２２２３７）。

本発明の弱毒化微生物は、当業界での技術を持った者なら誰でも知っている方法 （マニアナイス、モリキュラー・クローニング・アンド・ラボラトリ−・マニュ アル、１９８２年）を用いてＤＮＡに変異を導入することによって構築される。

非復帰性変異は、例えばネズミチフス菌株へハイブリッド　トランスポゾン　Ｔ ｎｐｈｏＡを導入することにより生じさせ得る。ＴｎｐｈｏＡは細胞周辺質の或 いは膜のタンパク質にアルカリホスファターゼの酵素的に活性なタンパク質の融 合したものを作ることが出来る。ＴｎｐｈｏＡ）ランスボゾンはカナマイラン耐 性をコードした遺伝子を持っている。適当な選抜培地の上でコロニーを成育させ ることによりカナマイシン耐性の形質導入体（ｔｒａｏｓｄｕｃｔａｎｔ）を選 抜する。

択一的な方法は、ベクター例えばプラスミド或いはコスミドにＤＮＡ配列をクロ ーニングすること、クローン化したＤＮＡ配列に選抜マーカー遺伝子を挿入する こと、その結果遺伝子の不活性化されること、を含んでいる。

不活性化したＤＮＡ配列及び別の選抜マーカーを持つプラスミドは、公知の技術 （マニアナイス、モリキュラー・クローニング・アンド・ラボラトリ−・マニュ アル、１９８２年）を用いて生物に導入することが出来る。それから、不活性Ｄ ＮＡ配列が微生物の染色体の中へ組み換えを起こし入って行き、野性型ＤＮＡ配 列が対立遺伝子交換で知られる工程を経て非機能性になっていることを同定する ことが適当な選抜にて可能である。特に、使用するベクターは、好ましくは微生 物の内で不安定であり、自然に失くなってしまうであろう。プラスミド上の変異 ＤＮＡ配列及び野性型ＤＮＡ配列は遺伝学的交叉によって交換されるかも知れな い。補足的な方法はワクチン株の変異部位に外来性ＤＮＡを導入することを除い ている。

それ故に、本発明は、環境的ストレスに応答して産生するタンパク質をコードし ている、或いはコードしているＤＮＡ配列の発現をｔｉｉｔｍする微生物のＤＮ Ａ配列に次のいずれかの方法即ち ａ）トラスボゾン変異又は ｂ）環境的ストレスに応答して産生ずるタンパク質をコードしている或いはコー ドするＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列で非復帰性の変異を持っているＤ ＮＡ配列を用いて微生物の形質転換を行なうことによって、微生物のＤＮＡ配列 へ変異を導入すること、 及び好ましい微生物を選抜スクリーニングすることから構成される本発明の方法 に従って弱毒化微生物を生産する為の工程を提供するものである。

本発明の弱毒化微生物は随意に異種抗原を発現する。

この発現はｄｅｇ　Ｐの表現型と関連する組み換え抗原の安定性を増した故に、 ｈｔｒ　Ａ変体様でもつと好ましいものとなっているようだ。かかる抗原として 、ウィルス性、細菌性、原生動物或いは高等な寄生性微生物であろう。

その様な微生物は、それから、二価又は多価のワクチンの元を作り出す。有用な 抗原の例として、大腸菌の熱不安定性毒素Ｂユニット（ＬＴ−Ｂ）　、大腸菌に ８８抗原、ＦＭＤＶ　（口・啼）のペプチド及びインフルエンザウィルスタンパ ク質、百日咳菌からのＰ６９タンパク質などが挙げられる。通常発現出来る他の 抗原は、クラミドモナス属、吸虫類、マイコプラズマ、線虫属、さなだ虫、ラビ ーウィルス及びロタウィルスからのものであろう。

異種抗原をコードしているＤＮＡを発現し得る微生物は発現カセットを持って微 生物の形質転換を行うことによって作り出せる。発現カセットは、異種抗原をコ ードしたＤＮＡ配列の他に、転写及び翻訳の開始及び終止配列もコードするＤＮ Ａ配列を含んでいる。発現カセットは調節配列も含んでいてもよい。かかる発現 カセットは当技術分野でよく知られていて、それらの構築は当分野の技術ある者 の能力内で充分出来るものである。発現カセットはベクター構造物或いは自然に 生じるプラスミドの一部分を形成するかも知れない。異種抗原を発現し得る遺伝 学的操作の弱毒化サルモネラ菌の例がＥＰ公開公報１２７．１５３に開示されて いる。発現カセットは微生物の染色体に異種遺伝子を取り込ませるのに使うこと も出来るであろう。

大腸菌の熱不安性胃腸障害毒素（エンテロトキシン）サブユニットＢを発現出来 る弱毒化チフス菌から成る二価ワクチンがタレメンツらによって開示されている （Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第４６巻、Ｎｏ、２．１９８ ４年、５６４−５６９頁）。

弱毒化チフス菌株、Ｔｙ２１ａはシゲラ・ソネイ菌のＩ型抗原の如き他の抗原を 発現するのに使用されている（フォーマルら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉ ｍｍｕｎｉｔｙ、第３４巻、７４６−７５０頁、１９８１年）。

本発明の更なる態様に従えば、ここで述べる如く弱毒化微生物、好ましくは細菌 の弁動な量と薬学的に受容し得るキャリアーとから構成されるワクチンを提供す るものである。

ワクチンは患者に経口投与する為に好ましくは凍結乾燥した形で、例えばカプセ ルに入れた形で提供される。

かかるカプセルは、例えばニードラゲイト“Ｓ″　ニードラゲイト“Ｌ″セルロ ースアセテートセルロース・フタレート、又はヒドロキシ・プロピルメチル・セ ルロースからなる腸溶性コーティングとともに提供される。

これらのカプセルはその様なものとして使えよう。或いは他のやり方で、凍結乾 燥したものを投与に先立ち、例えば懸濁液として、水で元に戻し再構成されるで あろう。

再構成は、好ましくは、微生物の生存を確保するのにふされしいｐＨの緩衝液に てなし遂げられる。胃酸から弱毒化細菌及びワクチンを守る為に、好ましくはワ クチンの各投与の前に炭酸水素ナトリウムｍ製物を投与しておく。

或いは、ワクチンは非経口投与、鼻経（１ｎｔｒａｎａｓａｌ）投与或いは乳房 内投与（ｉｎｔｒａｍｍａｒｙ）向きに調製されよう。

本発明は、また、微生物にて起こる感染で宿主（特に人間宿主）を、本発明に従 って弁動な投与量のワクチンを先述の宿主に投与することから構成される、予防 的処置を行う方法を提供するものである。その様な予防処置方法に用いる投与量 は、様々な臨床的因子、宿主の大きさや体重、処決されたワクチンの型に依存す るであろう。

しかしながら、弱毒化されたチフス菌では１回投与当り、１０１〜１０１６ケの チフス菌の投与量が、７０ｋｇの成人宿主にとって一般に好都合である。

以下に述べる実施例は、本発明に従って実験的な詳細を提供するものである。こ れらの実施例は本発明を何ら制限するものではないことは理解されるべきであろ う。

図の説明 図１．ｈｔｒＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列とそこにコードされているタンパク質の アミノ酸配列。

図２．ネズミチフス菌のｈｔｒ　Ａ変異株０４６の４２℃以上の温度と酸素ラジ カルに対する感受性。

図３．ｈｔｒＡに変異を持った株（ＢＲＤ７２６）とｈｔｒＡ　ａｒｏの変異を 持った株（ＢＲＤ　８０７）の１ｎｖｉｖｏでのカイネティクス。

菌株Ｃ５に行った（ミラーら、１９８９年　Ｉｎｆｅｃｔ。

［ｍｍｕｎｏｌ、第５７巻、２７５８−２７６３頁）。

変異体は、単一ペプチド配列、例えば細菌の膜を通して襟的にされそうなタンパ ク質の遺伝子に損傷を持っていそうなものを選んだ。ＴｎｐｈｏＡ挿入に隣接し たＤＮＡの分離によって挿入されて活性化している遺伝子を同定できる。このよ うな遺伝子が分離されて、そのＤＮＡ塩基配列は標準的な方法で決定した（図１ ．ＳＥＱ　ＩＤＮｏ：１）。（マニアティスら、１９８２年「モリキュラー・ク ローニングニア・ラボラトリ−マニュアル」コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボラトリ−出版、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク：サンガー ら、１９７７年　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ 、第７４巻、５４６３−５４６７頁）。翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を ＥＭＢＬデータベースに収録されているアミノ酸配列と比較して、驚くべきこと に大腸菌からのｈｔｒ　Ａ産物のアミノ酸配列（図ｌ５ＳＥＱ　ＩＤＮａ１ｌ） と８８％の相同性があることがわかった。

ｈｔｒ　Ａ遺伝子に損傷を持つ大腸菌変異株は４２℃以上の温度で成育出来ない 。ネズミチフス菌のｈｔｒ　Ａ変異株０４６を高い温度で成育するかテストし、 元の株Ｃ５と同様に成育することがわかった。しかし、酸素ラジカルに対する感 受性テストで、変異株０４６は親株Ｃ５と比べて抵抗性が低下していることがわ かり、このことはその遺伝子が酸素ラジカルのストレス一応答の様相に（少くと も部分的に）５ｉ係している事を明らかに示している（図２を参照せよ）。

実施例３ 弱毒化したネズミチフス菌株０４６と有毒親株ネズミチフス菌Ｃ５との比較 したと同じ様に用いて構築した（ミラーら、１９８９年、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ ｍｕｎ、第５７巻、２７５８−２７６３頁）。

経口投与後、変異株０４６は、親株Ｃ５がＬｏｇ　、。ＬＤ、。

＝６．３８細胞数なのに比べてＬＯｇ＋ｏ　ＬＤｓｏ＞　９細胞数であった（す べてのＬＤ、。は２８日後に計算した）。この様にして０４６株は高度に弱毒化 されている。静脈投与後、０４６株は静脈投与ＬＯｇ＋ｏ　ＬＤｓｏ＝５．１３ 細胞数で０５株での１０細胞数より少なく、この事より再び０４６株は０５株と 比べて高度に弱毒化されていると結論した。

マウスを０４６株で免疫し２８日後存毒親株Ｃ５でチャレンジした。０４６株の １０１０ケの細胞でワクチン接種したマウスは接種後１１週口の０５株のチャレ ンジテストに対し優秀な抵抗性を示した。免疫された動物でのＬｏｇ、。ＬＤｓ ＝は、非免疫の対照群での６．６細胞数に比べて９．６４細胞数であった。この 様にして、０４６株の単一投与で経口的にワクチン接種したマウスは、有毒法Ｃ ５のチャレンジに対してうまく防面されていた。

実施例５ 規定したネズミチフス菌５ＬＩ３４４　ｈｔｒＡ変異株の構築 塩基配列のデータに基づいてｈｔｒ　Ａ遺伝子に削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を入 れるのに使える適当な制限酵素切断部位を決めた。ＥｃｏＲＶで分解し、再結合 することによって１．２Ｋｂの削除を入れた。薬剤耐性マーカー（カナマイシン カセット、ファルマシア製）も、削除を受けた遺伝子を選抜し得る様に標準的方 法で遺伝子の中に導入した。

削除を受けたｈｔｒ　Ａ遺伝子を持ったプラスミドをｐｏｔ　Ａ株ネズミチフス 菌（ＢＲＤ　２０７）　□この菌の内でプラスミドは複製出来ない□に導入した 。カナマイシン耐性が宿主の内で維持され得る唯一の道は、ベクター上のネズミ チフス菌塩基配列と染色体上の相同領域との間に組換えが起った場合である。カ ナマイシン耐性を維持する一方アンビシリン耐性を失くした場合、２回目の相同 組換えが起こり無傷ｈｔｒ　Ａ遺伝子が削除を受けた遺伝子に置き換わったこと を示している。カナマイシン耐性のコロニーを分離しアンピシリン耐性を調べた 。カナマイシン耐性かつアンピシリン感受性のコロニーを更に調べるのに選抜し 、ＢＲＤ　６９８と名付けた６１コリンデイル・アベニュー、ロンドンＮＷ９． ５ＨＴのＮＣＴＣのＰＨＬＳにブダペスト条約の約款に従って受託番号・・・・ ｏｎ・・・・で寄託しである）。

Ｐ２２ライゼートを標準的方法を用いてこの株で調製しくドーガンらＪ、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ　第１５８巻、１３２９−１３３５頁、１９８８年）、５Ｌ １３４４の感染に用いた。カナマイシン耐性コロニーを分離しサザーンハイプリ ダイゼーションにて削除があるか調べた。ＢＲＤ　７２６（プダベスト条約の約 款に従って受託番号・・・・Ｏｎ・・・・でＰＨＬＳに寄託しである）と名付け た、一つの株を更に調べるのに選抜した。

実施例６ ネズミチフス菌５Ｌ１３４４のａｒｏＡｈｔｒＡ二重変異体の構築 ＢＲＤ６９８でｇ！１１２シたＰ２２ライゼートを、既にａｒｏ　Ａに削除を受 けたネズミチフス菌５Ｌ１３４４株にｈｔｒ　Ａ削除を導入した。ａｒｏ　Ａ削 除の導入方法は既にドーガンらによってＪ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、の第１ ５８巻、１３２９−１３５５頁（１９８８年）に述べられている。

ａｒｏ　Ａ及びｈｔｒ　Ａの両方に削除のあるのが判った一つの株を更に調べる 為に選び、ＢＲＤ８０７と命名しくブダペスト条約の約款に従って受託番号・・ ・・ｏｎ・・・・でＰＨＬＳに寄託しである）。

実施例７ ＳＬ　１３４４ｈｔｒ　Ａ　（ＢＲＤ７２６）株及び５Ｌ１３４４ｈｔｒ　Ａ　 ａｒｏ　Ａ　（ＢＲＤ８０７）株の弱毒性の有毒親株５ＬＩ３４４との比較 経口投与後、ＢＲＤ　７２６及ヒＢＲＤ　８０７ハ、有毒親株がＬｏｇ、。ｔ、 ｏｓｏ＝　６．８　ｍ胞数８に対し、ＬＯｇ＋ｏ　ＬＤｓｏ＞　１０．０細胞数 ０であった。両様は、それ故に、有毒親株５Ｌ１３４４に比べ高度に弱毒化して いた。

”すべでのＬＤ、。は２８日後針算。

ＢＲＤ７２６及びＢＲＤ８０７の経口ワクチンの可能性の評価 ＢＡＬＢ／ｃマウスを先に述べた様に（ドーガンらＪ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、の第１５８巻、１３２９−１３３５頁、１９８８年） 、ＢＲＤ７２６及びＢＲＤ８０７の約１Ｏ１０ケ細胞で経口的に免疫し、４週後 、１０週後に有毒親株５Ｌ１３４４でチャレンジを行った。ＬＤｉｏはリードと ミュエンチの方法（Ａｍ−Ｊ、　Ｈｙｇ、第２７巻　４９３−４９７頁、１９３ ４年）で計算した。全ての決定は少くとも２回実行した。ＢＲＤ　７２６及びＢ ＲＤ８０７でワクチン接種したマウスは４週での５Ｌ１３４４のチャレンジに対 し優れた防御性を示し、”ｇｏｏ　ＬＤ５゜は各々＞１０．０及び９．７細胞数 であった。このことは免疫していない対照群での対数値が６．１細胞数と比較さ れる。１０週でのｌｏｇ、。ＬＤｓ。は５ＬＩ３４４で６．５細胞数に比べてＢ ＲＤ７２６及びＢＲＤ８０７で各々９．１１及び８．１１細胞数であった。この 様に、ＢＲＤ　７２６で免疫したマウスは有毒性５Ｌ１３４４のチャレンジに対 し優れた長期間免疫性を持っていた。このことは、好ましくは５Ｌ１３４４の二 重のａｒｏ変異株にて導き出される防御性と比較される（ドーガンら、Ｊ、［ｎ ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、第１５８巻、１３２９−１３３５頁、１９８８年）。ＢＲ Ｄ８０７のワクチン接種で得られる長期間防御性は非免疫対照群より４６倍良い 。この様にＢＲＤ　７２６及びＢＲＤ８０７の両方はＢＡＬＢ／ｃマウスにとっ て良いワクチン株である。

実施例９ ＢＲＤ７２６及びＢＲＤ８０７のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスでのｉｎ　ｖｉ ｖｏ力イネティクス ＢＲＤ　７２６及びＢＲＤ８０７の静脈投与後のｉｎ　ｖｉｖ。

での生育能力を評価した。マウスに約１０’ケの生物を感染させた。肝臓及び牌 臓における細菌数を感染後２１日迄いろいろな日時に数えた。得られた結果を図 ３に示した。ＢＲＤ７２６株もＢＲＤ８０７株も、ネズミの組織の内で複製の開 始を受けていない。両様は、ゆっ（りと肝臓及び牌臓から消えていき、２１日迄 にＢＲＤ８０７はネズミの組織からほとんどきれいになくなっていて一方ＢＲＤ 　７２６は低レベルにまだ残っている。

本発明の弱毒化微生物は好ましくは経口錠剤型で与える１、、Ｉ　Ｏ”　１０１ ０の弱毒化細菌を含有する凍結賦形剤　７０．０ ２、　二酸化ケイ素（エアロシル２００）　０．５３、　ダイパック（９７％蔗 糖）　２３５．０４、　架橋ボヴイドン（コリトンＣＬ）　７．０５、　微結晶 性セルロース　３５．０ （アヴイセルｐＨ１０２） ６、　ステアリン酸マグネシウム　２．５コーテイング ７、　オパドライ・エンテリツク、０Ｙ−Ｐ−７１５６３５，０ （ポリビニルアセテートフタレート 水性溶媒に５％蔗糖、１％グルタミン酸ナトリウム及び１％バクト・カシトンを 含有するキャリアーを調製した。

このキャリアーに細菌を懸濁し、それから凍結乾燥を行った。

凍結乾燥したものをエアロシル２００と混ぜ合わせ、この混合物をふるいにかけ る。ふるいにかけた粉末をブレンダーの中で、ダイパック、コブイランＣＬ、ア リセルｐＨ１０２及びステアリン酸マグネシウムと混合する。この混合物を次の 腸溶性コーティングのために圧縮成形し錠剤化する。

当業界の技術を持つ者ならば、本製剤の多くの成分が機能的に等しい薬学的に受 容される賦形剤に置き換え得ることを充分理解するであろう。

ｇ　号　＝　艮　；′−８テ：ｇ　ｉｉｌ良う　見杢芒　ちら＝　！１？　ｙｅ ｔ、ａ二二　二二二ａｌ　１０ｍＭ過酸化水素 チャレンジ後時間（分） ＬＯＧ１０生物数／Ｎ官 浄書（内容に変更なし） 要　約　書 環境的ストレスに応じて産生されるタンパク質をコードしている或いはコードし ているＤＮＡの発現を調節している微生物のＤＮＡ塩基配列の変異によって弱毒 性がもたらされている免疫予防に用いる弱毒化微生物であり、異種抗原をコード するＤＮＡを随意に発現し得る微生物。

補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法Ｉｌ！１８４条ノ８）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．環境的ストレスに応じて生ずるタンパク質をコードしている微生物のＤＮＡ 塩基配列或いはコードしているＤＮＡの発現を調節するＤＮＡ塩基配列における 変異の存在によって弱毒性のもたらされた、免疫予防に使用される弱毒化微生物 であって、異種抗原をコードするＤＮＡを任意に発現し得る該微生物。
2. ２．タンパク質がヒートショックタンパク質、栄養分損失タンパク質、毒物スト レスタンパク質及び代謝危機タンパク質から選ばれることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の弱毒化微生物。
3. ３．タンパク質がヒートショックタンパク質であることを特徴とする請求の範囲 第２項記載の弱毒化微生物。
4. ４．タンパク質がｈｔｒＡ遺伝子にコードされていることを特徴とする請求の範 囲第３項記載の弱毒化微生物。
5. ５．変異が削除或いは挿入による変異であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の弱毒化微生物。
6. ６．微生物が細菌であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の弱毒化微生物 。
7. ７．細菌がサルモネラ属、ボルデェテラ属、ヴィプリオ属、ヘモフィルス属及び エッシャリヒィア属から選ばれる請求の範囲第６項記載の弱毒化微生物。
8. ８．サルモネラ細菌が、チフス菌、ネズミチフス菌、サルモネラエンテリティデ ィス及びサルモネラコレラスイスから選ばれる請求の範囲第７項記載の弱毒化微 生物。
9. ９．弱毒化が第２のＤＮＡ塩基配列の変異によってももたらされていることを特 徴とする請求の範囲第１項記載の弱毒化微生物。
10. １０．２番目のＤＮＡ塩基配列の変異が芳香族アミノ酸の生合成経路に関与する ＤＮＡ塩基配列内にあることを特徴とする請求の範囲第９項の弱弱毒化微生物。
11. １１．芳香族アミノ酸の生合成経路に関与するＤＮＡ塩基配列がａｒｏ　Ｃ、ａ ｒｏＡ及びａｒｏ　Ｄから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１０項の弱毒 化微生物。
12. １２．異種抗原をコードするＤＮＡを発現し得る請求の範囲第１項記載の弱毒化 微生物。
13. １３．請求の範囲第１項〜第１２項に請求した弱毒化微生物の有用な量とその為 に薬学的に受容し得るキャリアーとから成るワクチン。
14. １４．経口投与用に適合する様にした請求の範囲第１３項記載のワクチン。
15. １５．微生物によって引き起こされる感染に対する宿主の予防処置方法であって 、請求の範囲第１３項記載のワクチンを有効量、前記宿主に投与することを含む 予防処理方法。
16. １６．請求の範囲第１項記載の微生物の生産工程であって、 ａ）トランスポゾン変異又は ｂ）環境的ストレスに応じて生じる非復帰の変異を含むタンパク質をコードする 或いはコードするＤＮＡ塩基配列の発現を調節するＤＮＡ塩基配列を取り込んだ ベクターを用いて微生物を形質転換するそして ｃ）好ましい微生物を選抜する為にスクリーニングを行う のいずれかによって、環境的ストレスに応じて生ずるタンパク質をコードする或 いはコードするＤＮＡの発現を調節する微生物のＤＮＡ塩基配列に変異を導入す ることから成る微生物の生産工程。