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附件2 : 帛80102452號專利申請案中文說明書修正 LOCbtV_民國80年12月修正 五、發明説明（1)--------- —' 本發明有關經減毒之徹生物，其製法，其在動物或人 類免疫預防之用途，及含彼者之疫苗。 接種疫苗或免疫預防之原理足藉接種有機體之減毒菌 株而誘導動物對病原微生物之免疫反應以對後續侵襲提供 保護。在 1 950 年，Bacon 等人(Br . J . Exp · Path · 31，714-724) 證實傷<捍菌之特定營養缺陷空轡體hh親 代菌株比較在老鼠為減毒。此類營養缺陷症突變體中有些 被建議為全細胞疫苗基礎之適當候選者。（參見例如Ho-sieth and Stocker· Nature» 1981 241 238-239， and European patent publication 322,237) 〇 除在必要營 養缺陷症路徑中之突變外，己確認其他導致微生物減毒之 位點。此類位點之例包括具多效性之調節子，例如cva/ crp %. (Roy Curtiss III 等人，Vaccine 6_, 155-160, 1988)及 ompRenvZ 糸（Dorman 等人，Infect. Immun. 57, 2136-2140, 1989)及 phoP条(Fields 等人，Scien-ce. 243, 1059-1062, 1989) 0 經濟部屮央櫺準局员工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 在許多徹生物中，應不同環境應力，諸如高溫，營養 缺乏，毒氧基及代謝分裂，産生一及二打間之蛋白質。此 示對應於撤生物所承受之特定應力誘導部分各種不同基因 之協調。主應力蛋白質群（亦各為熱休克蛋白質）為高度 保留特性者。在單離自大脹閡.果蠅屬（Drosophilia SPP.)及人類之此群者中具實質同質性（最近之評論參見 Neidhardtf G· C· & Van Bogelen. R.A. (1987) Escherichia co1 i and Salmonella typh i mur i um ? Cellular 本紙張尺度遑用中B B家樣準(CNS)甲4規格(210X297公釐) -3 - m ΐΐ 桃充 Λ 6 Β6 經濟部屮央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（2) and Molecular Biology· F. C. Neidhar.dt 等人 ed s . pp.1334-1345. American Society for Microbiology* Washington DC)。例如：Hsp90，Hsp70 及 Hsp60 為所 有原核生物及真核生物中所發現之熱休克蛋白質。來自太_ 腸捍菌之HSP90及來自人類者間之胺基酸序列比較顯示 約一半胺基酸殘基相同。其他應力蛋白質群中者為GrpE， GroEL， DnaK， GroES» Lon 及DnaJ〇 編碼熱休克蛋白質之群之基因藉RNA聚合酶與σ32 因子，（其為μΗ基因之産物），共操縱而轉錄（評論於 Neidhardt . F. C· and van Bogelen，R· A» 1987 在 Es che r i ch i a co 1 i and Salmonella t yph i mur i um♦ Cell-ular and Molecular Biology. Neidhardt. F· C·等人 eds. pp. 1334-1345» American Society for Microbil-ology，’ Washington，D. C.) 〇 目前，Lipinska 等人（卜 uoleio. Acids.Res. 1988 21_^ 10053-10067)描沭大腸 菌_中之熱休克蛋白質，其稱為iLLLA ,其顯然為σ 3 2 —依附 性的。h t r Α基因之促進子區的檢視顯示與r ρ ο Η基 因之Ρ. 3促進子的DNA序列同質性；一種為 σ24)因子所確認之促進子。此同質性顯示h t r Α促進 子亦可藉RNA聚合酶_σ〃（σ24)全酶確認。 顯型地，在大脹餚中,h t r Α位點之突變阻斷細菌 在高於4 2 *0之溫度存活的能力（Lipinska等人，1989 ,J.Bacteriol, 171 , 1574-1584)。基因在 4 m i η 上 譜入於大腸_染色體中並編碼相對分子量（Mr) 51, (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 裝. 訂· 線· 冬紙張尺度遑用中B B家標毕(CHS)甲4規格(210X297公*> 4 修正 補充 Λ 6 Η 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（3) 1 6 3之蛋白質。此蛋白質先質進行Ν —端加工包括訊息 胜肽序列之移除（L i p i nska等人,1988 , Nucleic. Ac-ids· Res. 10053-10067),以産生經細菌内膜分泌時之 成熟型多胜肽。個別地，h t r A某因II Strauch，K. L.及Beckwith，J. 1988 (Proc. Natl. Acad . Sc i USA 85,1576-1580)確認為止e g p .此人檢測具有經減少蛋 白酶活性之大腸菌突變體，d e g P突變體藉TnphoA 突變産生單離（1^11〇丨1，（：.&8扣1^丨1:11，>1.1985，？1'_ oc. Natl. Acad. Sci. USA 82., 8129-8133)並藉在 d 0 g P 货景中雜種 T s r — p h o A ( T s r — AP2)重組蛋白質之增加安定性確認（Strauch, K. L. and Beckwith,· 1988， Proc. Natl.Acad. Sci. SUA 85 1576-1680)。大腸菌中.確認為degP及htrA之 基因顯然相同且編碼應力一反應，群中之一蛋白質。 本發明提出一種用於免疫預防中之經減毒微生物，其 中減毒偽藉撒生物DNA,其编碼，或其調節編碼應環境 應力産生之蛋白質的DNA表現，中突變之存在而産生， 微生物隨意可表現編碼異種抗原之DNA。 用於本發明之撤生物較好為細菌，尤其是革蘭（gram )一陰性細菌，其侵入並在真核細胞中生長並定植於粘膜 表面。吐例包栝沙門捏鍤.mmm.弧蘭·瞎血捏舖及v 歇利希菌（Escherichia)屬者。尤其可提者為以下種類 :傷寒捍菌一造成人類傷害；鼠傷寒捍菌-造成各種動物 之沙門菌病；腺炎捏蘭一造成人類食物中毒；豕霍亂捍閩 本紙5良尺度逍用中B a家標準(CNS)甲4規格(210X297公¢) ik 先. 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 蜞 寫 本 頁 裝 訂 -5 -

一造成豬之沙門薗病；百日咳球捍閉一造成百日咳；流行 性感冒曈血捍菌一造成腦膜炎；及淋球蘭一造成淋病。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 DNA突變為非一可復突變，即不能在單一步驟中修 復。此種基因突變包括缺失，倒位，嵌入，或取代突變。 缺失突變可使用轉因子（transposon)産生。此為包括 7 5 0至數千個可整合成宿主染色體DNA之鹽基對的 DNA序列。所研究之DNA序列的連續性因損失基因功 能而破壞。轉因子可由宿主染色體DNA去除；最頻繁之 切除不定地造成非一可復性突變。取代或嵌入突變可利用 攜於載體上之滅能DNA序列，其與宿主染色體DNA中 所研究之DNA序列重組或互換，接著損失基因功能，而 形成。 對應於環境應力所産生之蛋白質例包括熱休克蛋白質 (其應增至4 2 1C以上溫度而産生）營養缺乏蛋白質（其 應必要營養素諸如磷酸鹽或氮之標準，低於微生物存活所 需者，而産生）；毒應力蛋白質（其應毒性化合物諸如染 料，酸，或植物滲出液而産生）；或代謝分裂蛋白質（其 應例如影響徹生物滲透調節能力之離子濃度，或影響諸如 分裂代謝之維生素或輔一因子濃度之波動而産生）。 較好熱休克蛋白質為以h t r A基因编碼者，如圖1 所示（SEQ ID N 〇 . 1 )(亦具d e g P之待徽 )。其他蛋白質以已知牽涉於應力之基因諸如grPE > groEL，（ moPA) , dnaK，groES，1 on 及 dna J 所编碼。有 許多其他已知應璟境應力誘致之基因所编碼之蛋白質（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· - 線- 本紙張尺度逍用中Η困家標準(CNS)甲4規格(210x297公*) -6 - (Λ a Λ 6 Η 6 充 j 五、發明説明（5)

Ronson等人· Ce 1 1 579-581)。其中可述下者：大脹 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I之n t r B / n t r C条，其應氮缺乏而誘出且陽性調 節 g 1 nA 及 n i fA ( Buck 等人.Nature 320 374-378. 1986； Hirschman 等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA, 82> 7525. 1985； Nixon 等人，Proc. Natl. Acad. Sc i · USA 83. 7850-7854. 1986，Reitzer and Magansa-nik .Cell, A5_, 785, 1986)；大膈舖中之 p h o R/ P h ο B条·其應磷酸鹽缺乏誘出（Makino等人，J. Mol. Biol. 192, 549-556, 1986b)；大脹閡中之 c p x A/s f rA糸，其應染料及其他毒性化合物誘出（ 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 A1b i η 等人· J. Biol. Chem. 261 4698» 1986； Drury 等人，J. Biol. Chem. 260. 4236-4272, 1985) 0 相瘤鍤 中類似条為d e t B/ d e t D，其對應於4C 一去羧酸 (Ronson 等人，J. Bacteriol· 169 2424 及 Cell 49» 579-581, 1987)。此種羞件条描沭於 Agrobacter i um。此 為v ί r A / v i r G糸，其應植物滲出液而誘出（le Roux 等人，EMBO J. 6, 849-856，1987; Stache 1 and Zambryski.，am. J. Vet. Res. 45. 59-66, 1986; W i nans 等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA. 83» 8278, 1986)。相同地，百日咳球提蘭中b v g C — b v « A %. (以往名為v_.„i ,r )調節應Mg 2 +及菸酸濃度波動而致 之毒性.決定因素的産製（Ar i co等人，1989，Proc.Natl. Acad . Sci. USA 86., 6671-6675) 0 就ll疫苗形式之用途而言，本發明經減毒撒生物不回 本紙5艮尺度逍用中國B家樣準(CNS)〒4規格(210x297公釐) -7 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（6) 復其毒性態顯然是重要的。此在單一DΝΑ序列中突變發 生之可能生極小。但是•藉存於兩不同D Ν Α序列之一者 中之突變減毒之微生物回復發生之危險則不重要。因此， 較好本發明徹生物之減毒藉在編碼或調節編碼應環境應力 産生之蛋白質的DNA表現之DNA序列中突變的發生且 藉第二DNA序列中突變之發生而産生。對細菌而言，第 二DNA序列較好编碼牽涉於必要營養缺陷症路徑之酶或 為其産物控制滲透反應基因之序列，ΒΠ 〇 m p R . ( Inf- 'ect and Immun 1989 2136-2140)。最好，突變是在牽涉 於芳族胺基酸生物合成途徑之DNA序列中，尤其是编碼 a r 〇 A , a r o C或丑r o D之D N A序列。（歐洲專 利刊物3 2 2 2 3 7 )。 本發明經減毒之微生物可藉熟習此技藝者已知之方法 將突變導入DNA序列而構成（ManiatiS,M0lecularC-loning and Laboratory Manual，1982)。非一可復性突 變可藉將雜種轉因子Tna^A導入，例如，鼠傷寒捍菌之 菌株而産生。以^^可産生酶活性之碱磔酸酶對膜周邊的 或膜蛋白質之蛋白質融合。T n p h ο__Α轉因子(trans-poson)具有基因编碼康徽素（kanamycin)抵抗力。選擇 轉導子（transductants)使其藉在適當選擇培養基上培 養菌落而為抗康黴素（kanamycin)性。 另一種方法包括將DNA序列無性繁殖於載體中，例 如質體或拈接質體（cosm id) ·將可選擇之標記基因嵌入 無性繁殖之DNA序列中，導致其滅能。帶有經滅能 Λ 6 13 6 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂_ -線< 本紙張尺度遑用中國Η家樣準(CNS) τ 4規格(210X297公*) -8 - Λ 6 Η 6 五、發明説明（7 ) DNA序列及不同可選擇標記之質體藉已知技術導入有機 體(Maniatis ， Molecular Cloning and Laboratory Manual，1982)。然後可適當選擇而確認突變體，其中 經滅能之DNA序列重組成微生物之染色體而野生型之 DN A序列在已知為對偶交換（allelic exchange)之程 序中變成無功用。尤其，所用載體較好在微生物中不安定 且會自發性地損失。質體上之突變DNA序列及野生型 DNA序列可藉基因互換而交換。添加法免除外來DNA 序列導入疫苗薗株之突變部位上。 因此本發明提出一種發明之經減毒徹生物的製法，其 包括在撤生物DNA序列中導入突變，其编碼，或其調節 编碼應環境應力産生之蛋白質之DNA序列表現，其藉 a )轉因子（transposon)突變産生；或 b)以載體將微生物轉形，其滲入编碼，或調節編碼應環 境應力産生之蛋白質之DNA序列表現之DNA序列 ，且其含非一可復性突變；並篩選所需之微生物。 本發明經減毒之徹生物隨意可表現異種抗原。此表現 同樣更利於h t r A突變體，因為具d e g P顯型重組抗 原增加的安定性。此類抗原可為病毒，細菌，原生動物或 高等寄生動物之徹生物。此種徹生物接著形成二-或多價 疫苗之基礎。可用抗原之例包括大腸菌熱變毒素B次單元 體（L T 一 B ),大腸閡K 88抗原，FMDV (腳及嘴 )胜肽，流行性感冒病毒蛋白質，來自百日咳球桿菌之 P. 6 9蛋白質。其他可用以表現之抗原為來自衣闺塵( (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂· -線< 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 本紙張尺度逍用中B困家標準(CNS)甲4規格(210X297公*) ! n 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 0ui>6V 修王必Λ6 .丨神.贪. I Β6 Ί_—--------- 五、發明説明（8 ) chlamydia)，蛭，徽漿菌，蛔蟲，條蟲，狂犬病毒及旋 病毒（rotavirus )者。 可表現編碼異種抗原之DNA的徹生物藉以表現匣轉 形微生物而製。表現匣包括DNA序列，除编碼異種抗原 者外，编碼轉錄及轉譯之起始及終止序列。表現匣亦可包 括調節序列。此類表現匣為技越所熟知且其在熟練者構建 能力範圍中。表現匣可形成部分載體構成物或天然質體。 可表現異種抗原之基因工程減毒沙門捍閡之例述於E P 刊物1 27, 1 53。表現匣亦可操作以將異種基因滲入 撤生物之染色體。 另一種包括減毒傷寒捍蘭之二價疫苗，其可表現大脹 M_熱變腸毒素次單兀體B，掲不於Clements等人( Infect ion ad Immunity, 46. No.2 1984, 564-569) 〇 Ty2 1a, —種減毒之傷寒捍菌菌株，用以表現其他抗 原諸如宋内氏捍菌類型I抗原(Formal等人Infection and Immunity，34 > 746-750. 1981) 〇 發明之另一方面提出一種疫苗，其包括有效量之減毒微 生物，較好為細菌，如本文所述者及藥學上可接受之載髖。 疫苗利於以冷凍乾燥形式存在，例如膠囊形式，以經 口給予患者。此類膠囊可具賜塗層，其包括例如 Endragate * S〃 Eudragate、、L々纖•維素乙酸醋，雜維素 酞酸酯或羥丙甲基纖維素。此類膠囊可用其原狀況，或者 ,冷凍乾燥材料可在給藥前恢復原狀，例如，懸浮液。恢 愎原狀利於在適當p Η下之缓衝劑中進行以確定有機體之 (請也閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙尺度逍用中國國家標毕(CNS)甲4規格(210X297公釐) -10 - A6 B 6 五、發明説明（9) 生存能力。為防止減毒細菌及疫苗被冒酸破壞，碩酸氫鈉 配方利於在各疫苗給藥前給予。或者，疫苗可製為非經腸 給藥，鼻ή給藥或乳房内給藥。 本發明亦提出一種具微生物感染之宿主（尤其是人類 宿主之預防療法，其包括給予該宿主有效劑量之發明疫苗 。用於此療法之劑量可依各種臨床因素，包括宿主大小及 重量，所調製之疫苗種類而定。但是，對減毒之傷寒捍菌 而言，對7 0kg成人宿主而言通常毎劑包括10 9至 1 〇 之劑量為便。 以下實施例提供本發明之實驗細節。已知此類實施例 絶不限制發明。 附画説明 圖1 h t r A基因之DNA序列及其编碼之蛋白質胺 基酸序列。 圖2窟.祺案揑舖h t r A突變體046對高於42t： 之溫度與氧基之敏感性。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· •嫁· 圖3 h t r A中潛有突變（BRD726)及 h t r A a r o空變（BRD807)之鼠祺寒捍鍤菌株 之體&動力學。 啻旃例1 窟.淇案埕舖中h t r A基因之確認及h t r A突變體的産 生 甲4(210父297公釐）80_5_20,000張（11) -11 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B 6 五、發明説明（1(j Τη ρ h ο Α突變産生用於鼠毒性鼠祺寒揑馘m株 C 5 (Miller 等人♦ 1989. Infect. Immunol, 57, 2758 -2763)。‘選定突變體以在具訊息胜肽序列，當經細 菌膜瞄準之蛋白質，之基因中造成障礙。側面嵌入 Τη P h ο Α之DNA單離確認基因為嵌入活化。將此基 因單離並藉一般方法決定其DNA序列（參見圖1, S E Q. ID No. 1) (Maniatis 等人.1982, In Molecular Cloning： A laboratory manual· Cold Spr i -ng Harbour Laboratory . Cold Spring Harbour , N . Y .； Sanger 等人.1977, Proc. Natl. Acad. Sc i . USA 74, 5463-5467)。以EMBL/atabase中之序列與轉譯之蛋白 質序列比較，意外地顯示其與來自大腸菌之h t r A序列 有8 8 %之同質性。 啻旃例2 鼠傷寒捍菌中之h t r A以牽涉於應力反應中之基因確認 h t r A基因中潛有障礙之大腸菌空變體不能在高於 4 2T：之溫度生長。鼠傷寒捍舖h t r A突變體，0 4 6 ,在高溫試驗生長並發現如現存菌株C5般生長。但是， 當試驗對氣基之敏感性時，突變體046顯示比親代C5 菌株低之抵抗力，清楚顯示基因對此種應力反應有反應（ 至少部分）（見圖2 )。 審旃例3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

甲 4 (210X297公笼）80. 5. 20,000張（H) - 12 - 經濟部中央標準局貝工消费合作社印叛 Α6 Β 6 五、發明説明（ 減毒鼠傷寒桿菌菌株046與毒性親代菌株鼠傷寒捍胬 C 5之比較 減毒i株如前述般使用T η p h η Α轉因子突變産生 構成（Miller 等人，1989, Infect. Immun. 5Z，2758-2763)。經口給藥後，突變體菌株046與親代菌株， C5,比較，其具有6. 38細胞之1 〇g;flLD5。，具 有大於9細胞之loguLD5。。（所有LD5。皆在28 曰後計算）。由是046高度減毒。靜脈内給藥後， 046與少於10細胞之C5比較具有5. 13細胞之靜 脈内1 og^LDi。，再一次推論046比C5減毒更多 奮旆例4 經口攻擊後之老鼠的保護 老鼠以046免疫並在2 8日後以毒性親代菌株C 5 攻擊。老鼠使用1細胞046疫苗接種在接種11週 後顯示對C 5攻擊之優越保護性。免疫動物中L o g LD5。比之未免疫對照組之6· 6細胞為9. 64細胞。 因此，經口單劑接種046疫苗之老鼠充分防止毒性C5 攻擊。 奮施例5 既定鼠傷寒捏鍤S L 1 3 4 4 h t r A突變體之構成 甲4(210父297公釐）《).5.2〇,〇〇〇张（11) - 13 - .......................................f……装...........................訂...................C…瘅. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A 6 B 6 五、發明説明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •線· 序列數據有利於可用以將缺失導入h t r A基因之適 當限制核酸内切酶部位的確認。1. 2Kb之缺失藉以 E c 〇 R V水解並再聯結而導入。抗藥性標記藉標準技術 導入基因（康徽素（kanamycin)厘，Pharmacia)以選定 缺失基因之出現。潛有缺乏h t r A基因之質體導入 ρ ο 1 A菌株鼠傷寒捍蘭(BRD 207),其中質質 不能複製。抗康徽素（kanamycin)性能保持於宿主中之 唯一途徑載體上之鼠傷寒捍菌序列與染色體同条區間有重 組情況。保持抗康徽素（kanamycin)性而損失抗氨笮青 徽素性顯示第二同条重组情況，其導致原來之h t r A基 因被缺失者取代。將抗康徽素性之菌落單離並檢測抗氨苄 青徽素性。選擇抗康徽素性且胺笮青徽素敏感性之一菌落 進一步研究並名為BRD698 (於西元199 1年3月 22日，依照布逹佩斯修約，以Accession No. NCTC 12457 登記號碼，登記於 PHLS，NCTC，61 Colindale Avenue， London NW9 5HT ) 〇 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 Ρ 2 2溶胞産物藉一般技術於此菌株製備（Dougan等 人，J. Infect.Dis. 158, 1329-1335，1988)並用以感染 SL 1 344。將抗康徽素之菌落單離並藉Souther雜化 作用檢測缺乏之存在。選擇一菌株，名為BRD726 ( 於西元1991年3月22日，依照布達佩斯修約，以 Accession No. NCTC 12458登記號碼登記於 Ρ H L S )進 一步研究。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -14 - A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（β 啻施例6 鼠傷寒捍菌S L 1 3 4 4 a r 〇 A h t r A雙突變體之構 « · 成 於B R D 6 9 8製備之P 2 2溶胞産物用以將 h t r A缺失導入在a r o A已涫有缺失之鼠傷寒捍蘭 SL 1 344菌株中。導入a r ο A缺失之方法述於 Dougan 等人，J · Infect.Dis. 158. 1329-1355. 1988 〇 發現在a r ο A及h t r A中皆具缺失之一菌株用於進一 步研究且名為BRD807 〔於1991年3月22曰， 依照布達佩斯修約，以Accession No. NCTC 12459登 記號碼，登記於P H L S )。 奮施例7 S L 1 3 4 4 h t r A (BRD726)及 SL1344 h t r A與a r o A與毒性親代®株SL 1 344之減毒 比較 經口給藥後，BRD726及BRD807與毒性親 代菌株，其具6. 8細胞之Logi〇LD5。，比較具> 10. 0細胞之L〇guLD5。*。而菌株因此與毒性親 代菌株SL1344比較皆高度減毒。 *所有L D5D皆在2 8日後計算。 窨旆例8 BRD726及BRD807口服疫苗效能評估 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· •線· 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（H〉 - 15 - Α6 Β 6

五'發明説明（U 請 先 閲 讀 •背 面 之 注 意 事 項 再 BALB/C鼠如前述以約1 〇s細胞之BRD 726 及 BRD807 免疫（Dougan 等人.J. Infect-Dis.‘1329-1335, 1988)並在4及10週後以毒性親 代菌株S L 1 3 4 4攻擊。L D 5。以Reed及Muench之 方法計算（Am. J. Hyg.红，493-487, 1934)。所有決 定值皆進行至少兩次。接種BRD726及BRD807 之老鼠對4週之SL 1 344攻擊顯示優越保護性， Log: 〇LD5。各為>10. ◦及9. 7細胞。比與未 免疫之對照組的log 6. 1細胞比較。10週時 BRD726 及 BRD807 之 LogLD5。與 SL13 44之6. 5比較為9. 1及8. 11細胞。因此以BR D726免疫之老鼠對毒性SL1344攻擊具優越之長 期免疫性。此比SL 1 344之雙a r 〇突變體所具之保 護性有利（Dougan 等人.J. Infect. Dis. 158,1329-1335，1988)。BRD 8 0 7疫苗所具之長期保護性比未 免疫對照組強46倍。因此BRD726及BRD807 二者皆為BAL B/C老鼠之良疫苗薗株。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 奮旃例9 BALB/C鼠中BRD726及BRD807之賻内 動力學 評估靜脈内給藥後BRD726及BRD807體 生長之能力。老鼠以約1 0 5有機體感染。肝及脾中之細 菌數在達21日感染之不同時間計數。所得結果示於圖3 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -16 - A 6 B 6 五、發明説明（^ 。BRD726及BRD807皆不進行鼠组織中之複製 初期。菌株漸脱離器官且在2 1日前BRD807幾乎完 全脱離鼠Μ織，而BRD726仍保持低濃度。 奮掄例1 0 配方 本發明之減毒微生物較好以口服錠型存在。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -17 - A 6 B 6 五、發明説明（^ 組份 MG/錠 核錠 1 .含1 0S1 Oie減毒細菌之 冷凍乾燥賦形載體 70.0 2.二氣化砂（Aerosil 200) 0.5 3 . Dipac ( 9 7 %蔗糖） 235.0 4 .交聯之 Povidone (Kol1idon CL) 7.0 5 .微晶缕雒素 (Avicel pH102) 35.0 6 ,硬脂酸鎂 2.5 塗層 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂· •Γ .線- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 7 . Opadry Enteric. OY-P-7156 (聚乙酸乙烯酯酞酸酯+ 35.0 酞酸二乙酯） 385.0 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -18 - A 6 B 6 五、發明説明（ 製備含5%蔗糖，1%谷胺酸納及1% bactocasi-tone在水性溶劑中之載體。有機體懸浮於此載體並進行 冷凍乾燥 乾燥材料摻以Aerosil 200 且摻和之混合物過篩。 過篩之粉末在接和器中混以Dipac，Kolidan CL. Arice-1 PH102及硬脂酸鎂。此摻和物壓成後缠腸塗層用之錠。 熟習者已者許多此配方之组份可由官能相當之藥學可 接受輔劑取代。 (請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 訂· :線. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -19 -

Claims (1)

1. Α7 --D7 B7 C7

   經濟部中央揉準房貝工消費合作社印製 六、申請專利範困 附件2 ( a ): 第80102452號申請專利案 中文申請專利範圍修正本 民國82年1月修正 1 . 一種産製經減毒之鼠傷寒捍薗或傷寒桿菌細籲的 方法，其包括 (i)藉以下二方式在鼠傷寒捍菌或傷寒捍菌細菌之 基因中導入非可復性之突變， a) 轉因子（transposon)突變作用，或 b) 以一載體將鼠傷寒桿薗或傷寒捍菌細菌轉形，而 該載體中併入含非可復性突變之該li t r A基因；且 (i i )筛選所需之經.減毒細菌。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中突變是缺失 或嵌入突變。 3·如申請專利範圍第1項之方法，其中突變亦被導 入一與芳族胺基酸生化合成途徑有開之DNA序列中。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中與芳族胺基 酸生化合成途徑有關之DNA序列你選自a r 〇 C , a r ο A 及 a r ο D 〇 5. —種産製疫苗的方法，其包括混合一經減毒之鼠 傷寒桿菌或傷寒桿菌細菌與一藥學上可接受之載劑或稀釋 劑，其中減毒作用傜於一 h t r A基因中，藉非可復性之 突變作用之存在而完成。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中突變作用傺 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ Λ 本紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210χ·29^Τϋη 81.9,10,000 A6 B6_ 五、發明説明（） 缺失或嵌入突變。 7. 如申請專利範圍第5項之方法其中減毒作用係 在一與芳族胺基酸生化合成途徑有親之D N A序列中藉突 變作用而完成。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中與芳族胺基 酸合成途徑有關之DNA序列像選自a r Q-C , a r.p_A 及 a r ο D 〇 (請先閲f面之注意事項再塡寫本頁) i裝· 訂· 經濟部中央標準居負工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國园家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐4 2 -