CZ20024154A3 - Použití prostředku obsahujícího napojený protein pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení bradavic a chorob a stavů souvisejících s papiloma virem - Google Patents

Description

Použití prostředku obsahujícího napojený protein pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení bradavic a chorob a stavů souvisejících s papiloma virem

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití prostředku obsahujícího napojený protein pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení bradavic a chorob a stavů souvisejících s papiloma virem.

Dosavadní stav techniky

Infekce lidským papiloma virem (HPV - human papilloma virus) je běžná. HPV může být přenášen pohlavní cestou, odhaduje se, že je infikováno 20 až 80 % pohlavně aktivní dospělé populace. Zatímco většina infekcí je bezpříznaková, mohou tyto infekce vést k vývoji genitálních bradavic (které jsou rozšířené asi u 1 až 5 % dospělých) a karcinomu anogenitálního traktu. S HPV mají též silnou spojitost další typy karcinomů, jako cervikální karcinom (karcinom děložního hrdla) (Frazer, Genitourin. Med. 72: 398-403, 1996). HPV typy 6, 11, 18, 31 a 33 často souvisejí se zvýšeným rizikem rakoviny, s typy 16 a/nebo 18 zjištěnými ve více než 90 % případech cervikální karcinomy (van Driel et al., Chapter 66: Papillo-maviruses ve: Virology, třetí vydám, Fields a spol.., red., Raven Press, Philadelphia, str. 2077 až 2109, a zuř Hausen, J. Nati. Cancer Inst. 92: 690 až 698,2000.

V současné době neexistuje bezpečný a účinný způsob léčení nebo prevence bradavic nebo výše popsaných chorob zaměřený na imunitní systém. Úsilí vyvinout takové terapeutické postupy byly komplikovány z několika

99999« 999

9 9 9 9 9 9

999 9999 9

999 9999999

9 9 ·· 9

999« 9·· 99 · 99 99

9 příčin; jednou z nich je dogma, že antigeny z jednotlivého HPV typu vzbuzují limitovanou typově specifickou imunitní odpověď. V důsledku toho bylo doporučeno, že pro široce účinnou léčbu HPV je nezbytný koktejl obsahující antigeny z několika různých typů HPV (Caine et al., Science 288: 1753, 2000).

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen částečně na objevu, že fúze proteinu obsahujícího protein z jednoho typu HPV může být použita k léčení choroby nebo stavu, který byl zaviněn infekcí jiným typem HPV. Například antigen HPV typu 16 fúzovaný k bakteriálnímu proteinu teplotního šoku (heat shock protein - hsp) byl účinný při léčbě lidských análně genitálních bradavic způsobených jiným typem HPV než typem 16 (např. HPV typem 6 a 11). Tento výsledek podporují dvě tvrzení: 1) že bradavice mohou být léčeny HPV proteinem a 2) že pro širokou účinnost terapeutických prostředků zaměřených na HPV není nezbytné, aby obsahovaly proteinové antigeny z odlišných HPV typů.

V souladu s tím se tento vynález týká použití prostředku obsahujícího 1) hsp nebo jeho imunostimulační fragment a 2) HPV protein (např. antigenní protein, jako je E7 protein, např. HPV typu 16) nebo jeho antigenní fragmenty pro léčení bradavic u takto postižených osob podáváním prostředku těmto osobám. Tyto složky zde mohou být uváděny jako složka 1 a složka 2. Protein hsp (nebo jeho imunostimulační fragment) a HPV protein (nebo jeho antigenní fragment) mohou být buď jednoduše kombinovány v témž preparátu nebo mohou být pevněji vázány chemickou konjugací nebo fůzí (tj. může být podáván fúzní protein obsahující výše uvedené složky nebo molekula nukleové kyseliny, která ho kóduje). Jestliže jsou složka 1 a ·· ···· • to < to·· ·· toto·· ·· • toto · « to · v to to · to · • · to • to ♦ · · · to ·· toto to to · · to · to · to • · to to · • toto ·· složka 2 kombinované, konjugované nebo fúzované, měly by být podávány současně. Každá složka může být však též podávána samostatně (například postupně) a složka 2 může být podávána bez složky 1. Výše popsané použití může obsahovat krok, v němž je u osoby, která má bradavice, nebo která je podezřelá, že má bradavice, provedeno průkazní vyšetření (v souvislosti s léčbou pacienta by tato identifikace měla být provedena před tím než začneme podávat terapeutický prostředek). Praktičtí lékaři a ostatní odborníci v oboru jsou schopni dobře rozpoznat tyto subjekty.

Použití podle tohoto vynálezu mohou být též využita k prevenci bradavic, přičemž v takovém případě je identifikován pacient, který tuto léčbu požaduje nebo pro kterého by mohla být přínosná pro prevenci bradavic (spíše nežli u osob, u nichž se již bradavice projevily).

Vynález se týká také použití prostředku obsahujícího fuzní protein nebo nukleové kyzeliny kódující fuzní polypeptid pro léčení osob, které trpí chorobami nebo stavy zaviněnými HP V prvního typu (například typem 5, 6,11, 18, 31, 33, 35, 45, 54, 60 nebo 70), přičemž těmto pacientům je podáván prostředek obsahující: 1) protein hsp nebo jeho imunostimulaění fragment a 2) protein HPV druhého typu (například typu 16) nebo jeho antigenní fragment. To znamená, že HPV prvního typu a HPV druhého typu se vzájemně liší, jsou to tedy dva rozdílné typy HPV. Protein hsp (nebo jeho imunostimulační fragment) a HPV protein (nebo jeho antigenní fragment) mohou být bud’ jednoduše kombinovány v témže přípravku nebo těsněji vázány chemickou konjugací nebo fúzí (tj. můžeme podávat fúzní protein obsahující výše uvedené složky nebo molekulu nukleové kyseliny, která ho kóduje). Pokud podáváme kombinovanou, konjugovanou nebo fúzovanou složku 1 a složku 2, měly by být podávány současně. Každá složka však může být též podávána samostatně (tj. postupně) a složka 2 může být podávána bez složky 1. Zde opět může použití zahrnovat krok průkazního ·· φ*φ>

«φ «*Φ· ·· « • · * φ * · · « «·· « Φ « φ > φ • Φ Φ φ φ φ·«· · « φ vyšetření u pacienta, který je infikován HPV nebo u kterého existuje podezření, že je infikován HPV (nebo chorobou nebo stavem s ním souvisejícím).

Má-li být subjektu, který je infikován HPV prvního typu, podáván prostředek obsahující HPV druhého typu, může být toto použití provedeno před stanovením typu HPV infekce, před tím, než se projeví, nebo před tím před tím, než k ní dojde (tj. před započetím léčby nebo profylaxe není nutné znát přesný typ HPV, jímž byla nebo bude osoba infikována). Jedná-li se o preventivní použití, mohou tato použití zahrnovat krok identifikace u pacientů, kteří to požadují, nebo u kterých by byla prospěšná prevence infekce HPV.

Přípravky zde uvedené mohou být podávány v množstvích, která jsou postačující pro léčení bradavic [například pro zmenšení velikosti nebo změně tvaru bradavic nebo pro zlepšení příznaku souvisejícího s bradavicí (např. bolesti často související s bradavicemi na nožní klenbě); má-li subjekt více než jednu bradavici, léčení umožní zvládnout snížení počtu bradavic]. Přípravky zde uvedené mohou být podávány v množstvích postačujících pro léčení chorob [např. rakoviny (jako je cervikální karcinom nebo anální karcinom) nebo jiných stavů (např. dysplazie, jako je cervikální nebo anální dysplazie)], které jsou způsobeny nebo které souvisejí s infekcí HPV. Ačkoli bra-davice jsou samostatně uvedeny výše, tvoří též stav zaviněný nebo související s HPV. Praktičtí lékaři a ostatní rutinní pracovníci v oboru znají účinnou léčbu bradavic nebo chorob nebo stavů souvisejících s HPV, jedná-li se o zeslabení nežádoucího fyziologického narušení souvisejícího s bradavicemi nebo těmito chorobami či stavy. Klinické a fyziologické projevy bradavic, stejně jako choroby nebo stavy související s infekcí HPV, jsou uvedeny například ve Fauci a spol., Harrisonů Principles of Intemal

9« •9 ·«·* • 9 9 99» • 9 1 · 9 9 • 9 · · 9 • 9 999· 9 9

9« 9

999« • 9

9 ·

9 9

Medicine, 14^th Edition, McGrav-Hill Press, New York, str. 302 až 303 a 1098 až 1100,1998.

Subjekty, pro které mohou být výše uvedená použití přínosná, jsou ty, které mohou být infikovány papiloma viry [např. savci, jako jsou lidé, hospodářská zvířata (např. krávy, koně, prasata, ovce a kozy) a domácí zvířata (např. kočky a psy)]. Bradavice se mohou u těchto subjektů vyskytovat na genitáliích, na kůži nebo na vnitřních orgánech [jako jsou bradavice, které se objevují na hlasivkách při opakovaných respiračních papilomatózách (RRP - recurrent respirátory papillomatosis; známých také jako papilomatóza hrtanu mladistvých (JLP - juvenile laryngeal papillomatosis) nebo prudký nástup opakované papilomatózy dospělých (adult-onset RRP))].

Vynález dále zahrnuje použití jednoho nebo více zde uvedených prostředků (včetně těch, které obsahují proteiny, konjugáty proteinů nebo fuzní proteiny nebo molekuly nukleových kyselin, které je kódují) pro léčení subjektu, který má bradavice nebo choroby nebo stavy související s (nebo zaviněné) infekcí HPV, podle zde uvedených použití.

Antigenní fragment proteinu (např. HPV proteinu) je kterákoli část proteinu, která, je-li podávána podle zde uvedených způsobů, vyvolává u subjektu imunitní odpověď, která je buď specifická vůči fragmentu nebo která je specifická pro protein, z něhož byl fragment získán. Imunitní odpověď může být buď humorální odpověď nebo buňkami zprostředkovaná odpověď. Například antigenní fragment může být HLA peptidový antigen třídy I, jak je uvedeno níže. Odborníci z oblasti techniky jsou si vědomi toho, že imunitní odpověď vyžadovaná v kontextu tohoto vynálezu může být vytvářena nejen intaktními proteiny, ale také mutantními proteiny [např. těmi, které obsahují jednu nebo více adicí, substitucí (např. konzervativních substitucí aminokyselin) nebo delecí ve svých aminokyselinových sekven·· «4·· ·4 4 ·· «··« * · · « · · ♦ · · • 444 · · 4 · 4 · 4 • · · · · 4444 4 · 4 · • 4 4 4 4 4 4 9 9 ···· 444 44 · 99 99 cích], Mutantní HP V antigeny mohou být snadno připraveny a testovány z hlediska své práceschopnosti v souvislosti s tímto vynálezem..

Imunostimulačním fragmentem proteinu (např. hsp) je kterákoli část proteinu, která, je-li používána podle vynálezu, zlepšuje imunitní odpověď antigenu. Například, jestliže se zlepší imunitní odpověď vůči HPV proteinu, je-li tento HPV protein podáván s (např. fúzován k) fragmentem hsp, pak je tento fragment imunostimulačním fragmentem hsp. Odborníci z oblasti techniky jsou si vědomi toho, že imunitní odpověď může být též zlepšena mutantními hsp [např. hsp, které obsahují jednu nebo více adicí, substitucí (např. konzervativních substitucí aminokyselin) nebo delecí ve své aminokyselinové sekvenci]. Mutantní hsp mohou být snadno připraveny a testovány z hlediska své schopnosti zlepšovat imunitní odpovědi vůči HPV antigenu.

Použití podle tohoto vynálezu zabezpečují vhodné možnosti: 1) léčení nebo prevenci bradavic a 2) léčení nebo prevenci chorob nebo stavů způsobených (nebo souvisejících s) infekcí jedním z typů HPV (tj. používání) po-mocí prostředku obsahujícího HPV jiného typu. U mnoha subjektů, ne-li většinou, může být následně použit prostředek obsahující jediný typ HPV, nehledě na to, kterým typem jsou infikováni (nebo kterým mohou být infikováni). Je překvapivé, že prostředky na bázi HPV jsou účinné za těchto o-kolností (tj. okolností vyžadujících zkříženou reaktivitu). Předpokládalo se totiž, že antigeny jednoho typu HPV nemohou vzbudit účinnou imunitní odpověď proti jinému typu. Další rysy nebo výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a také z nároků.

Tento vynález se týká použití široce účinných farmaceutických přípravků založených na HPV, které obsahují hsp a HPV protein (např. proteinový antigen). Bez omezení tohoto vynálezu pouze na ta použití, v nichž léčiva založená na HPV uplatňují svůj účinek prostřednictvím zvláštního mecha• 0 • · · · · · ·· ·

0 0 ··· ·· 0

0 0 0 0 ··· · · · • 0 0 0 00000·· · 0 r-j 0 0 00 0 0000 / 0000 000 00 0 0· ·· nismu, jsou tyto přípravky zamýšleny pro vytvoření imunitní odpovědi, která zlepšuje bradavice a jiné stavy (např. dysplazie) a choroby (např. karcinom) související s infekcemi HPV. Je patrné, že ačkoli prostředky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat HPV protein od více než jednoho typu HPV, mohou obsahovat také HPV protein pouze z jednoho samostatného typu. Kromě toho přípravky, které obsahují HPV protein z jediného typu HPV, jsou užitečné při léčení nebo prevenci bradavic nebo jiných chorob souvisejících s HPV nebo stavů zaviněných jiným (tj. odlišným) typem HPV. V souvislosti s tímto vynálezem jsou mze diskutovány různé další materiály a postupy.

Příprava fúzních proteinů

Sekvence nukleových kyselin kódujících proteiny hsp a HPV proteiny jsou známy a jsou dostupný rutinním odborníkům v oboru. Konstrukty nukleových kyselin kódující tedy fuzní polypeptidy užitečné pro použití podle tohoto vynálezu mohou být snadno připraveny za použití rutinních metod [podobně, jako mohou být použity molekuly nukleových kyselin pro produkci proteinů hsp a HPV proteinů jednotlivě; jednotlivé proteiny hsp a HPV proteiny mohou pak být kombinovány fyzikálně (např. jednoduchým smícháním dohromady) nebo spojeny chemickou konjugací (viz níže) nebo prostřednictvím disulfídových vazeb]. Příklady sekvencí nukleových kyselin, které kódují hsp volitelně fúzovaný k antigenu (např. HPV anti-gen) můžeme nalézt v mezinárodních spisech č. WO 89/12 455, WO 94/29 459, WO 98/23 735 a WO 99/07 860 a v nich uvedených odkazech. Způsoby, při kterých mohou být exprimovány a purifikovány proteiny včetně fúzovaných proteinů, jsou dále uvedeny níže.

Ίζ

Příprava proteinových konjugátu

Složka 1 a složka 2 mohou být též spojeny potranslační konjugací jednotlivých proteinů hsp a jednotlivých HPV antigenů. Způsoby pro chemické konjugování dvou proteinů (nebo jejich částí) jsou známé odborníkům v oboru (viz například techniky popsané v Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academie Press, San Diego, CA, 1996; Lussow et al., Eur, J. Immun. 21:2297-2302,1991 aBanios et al., Eur. J. Immun. 22: 1365-1372, 1992). Konjugáty mohou být připraveny pomocí způsobů, které používají křížově vázaná činidla, jako je glutaraldehyd (který se stane částí výsledného konjugátu) nebo takových, které spojují složku 1 a složku 2 pomocí disulfídových vazeb. Pro usnadnění tvorby disulfídových vazeb mohou být použity cysteinové zbytky, které jsou buď přirozeně přítomné nebo rekombinantně vložené do hsp, HPV antigen nebo obojí. Prostředky ·· ···» ·· ···· «· 0000 » · · 0 0 « * · 0 «0··· 00 0 · · 0

00 0 0 0 0 0*0« 0 • 0 * · · · 0 · · · ·

00· 00 00 00 00 obsahující proteiny hsp nebo jejich imunostimulační fragmenty (tj. složku 1), které jsou nekovalentně spojeny s HPV antigeny, mohou být připraveny tak, jak je popsáno v US Patent Nos. 6 048 530; 6 017 544; 6 017 540; 6 007 821; 5 985 270; 5 948 646; 5 935 576; 5 837 251; 5 830 464 nebo 5 750 119. Viz též US Patent Nos. 5 997 873; 5 961 979; 6 030 618;

139 841; 6 156 302; 6 168 793 a International Publication No.

WO 97/06 821.

Bez ohledu na konečnou konfiguraci podávaného prostředku, mohou složka 1 a složka 2 obsahovat následující komponenty.

Antigeny HPV proteinu

Pro použití do prostředků je vhodný kterýkoli antigen HPV (například výše popsané směsi, konjugáty a fuzní proteiny) podle tohoto vynálezu. Avšak zvláště vhodné by byly HPV antigeny, které exprimují rozpoznatelné epitopy na povrchu buněk infikovaných HPV. HPV exprimuje šest nebo sedm nestrukturálních proteinů a dva strukturální proteiny a každý z nich může sloužit jako cíl při zde uvedených imunoprofylaktických nebo imunoterapeutických přístupech.

Virové kapsidové proteiny (viral capsid proteins) LI a L2 jsou bývalé strukturální proteiny. Lije hlavní kapsidový protein, jehož sekvence aminokyselin je vysoce zachována mezi různými typy HPV. Existuje zde sedm časných nestrukturálních proteinů. Protein y E, E2 a E4 hrají důležitou roli při replikaci viru. Protein E4 hraje též roli při zrání viru. Úloha E5 proteinu je méně dobře známa. Proteiny E6 a E7 jsou onkoproteiny, které jsou rozhodující pro virovou replikaci, stejně tak pro transformaci hostitelské buňky a učinění ji nesmrtelnou.

Hsp proteiny

Bylo izolováno, klonováno a charakterizováno velké množství hsp proteinů z různých skupin organizmů [Mizzen, Bioťherapy 10: 173-189, 1998;

přičemž zde použitý termín protein teplotního šoku (heat shock prote·· ···» ·· ···< φφ φφφφ φφφ φφ φφφ φ φφφφφ φφ φ φφ φ φφ φφφφ φφφφ φ

Q φφ φφφ « φφφφφ s φφφφφ φφ φφ φφ φ. φ in(s), zkráceně hsp(s) je synonymem k proteinům uváděným jako stresové proteiny (stress proteins) neboje zahrnuje], Imunostimulační proteiny hsp nebo jejich fragmenty jsou vhodné do zde popsaných prostředků (například jako části fiízního polypeptidu). Proteiny Hsp70, HspóO, Hsp 20-30 a HsplO patří mezi hlavní rozhodující činitele rozpoznávané hostitelskou imunitní odpovědí k infekci Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae. Kromě toho, protein Hsp65 z Bacille Calmette Guerin (BCG), kmene Mycobacterium bovis, byl shledán účinným imunostimulaěním činidlem, jak je popsáno v níže uvedených příkladech.

Rodiny genů hsp a proteiny hsp, z nichž kterýkoli může být použit jak je zde popsáno pro složku 1, jsou dobře známé odborníkům v oboru. Tyto zahrnují například Hsp 100-200, Hsp 100, Hsp90, Lon, Hsp70, HspóO, TF 55, Hsp40, FKBP proteiny cyklofíliny, Hsp20-30, ClpP, GrpE, HsplO, ubichitin, calnexin a proteiny disulfidových izomeras. Viz například Macario, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59-70, 1995; Parsell et al., Rev.Genet. 27: 437-496, 1993 a US Patent No. 5 232 833. Proteiny Hsp mohou být, ale není to podmínkou, savčí, bakteriální nebo mykobakteriální hsp.

Grpl70 (pro glukosou řízený protein - glucose-regulated protein) je příkladem z rodiny proteinů hsp100-200. Grpl70 sídlí v dutině (lumen) endoplazmatického retikula, v pre-Golgiho aparátu a může hrát roli při konfonnaci a kompletování imunoglobulínů.

Příklady proteinů hsp z rodiny proteinů hsp 100 zahrnují savčí Hspl 10, kvasničný Hsp 104 a E. coli proteiny hsp ClpA, ClpB, ClpC, ClpX a ClpY. Příklady proteinů hsp z rodiny hsp90 zahrnují HtpG v E. coli, Hsp83 v kvasinkách Hsp90 alfa, Hsp90 beta a Grp94 u lidí. Hsp90 váže skupiny proteinů, které jsou typické molekuly buněčných regulátorů, jako jsou receptory steroidních hormonů (například receptory glukokortikoidu, estrogenu, progesteronu a testosteronu), transkripční faktory a proteinkinasy,

9 · 9 « 9

9 9 9

9999 9 · *♦· · 9 99« 9

99999 99 9 99 9 ίο ί ;

9 9 9 9 9 9 99 99 99 které hrají roli v signálních mechanizmech transdukce. Proteiny Hsp 90 se též účastní při tvorbě rozsáhlých hojných komplexů, které zahrnují další stresové proteiny.

Lon je tetramerickou ATP-dependentní (závislou na přítomnosti ATP v médiu) proteasou, která degraduje nepůvodní proteiny v E. coli.

Příklady proteinů hsp z rodiny hsp70 zahrnují Hsp72 a Hsc73 ze savčích buněk, DnaK z bakterií nebo mykobakterií jako jsou Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium bovis (jako je Bacille-Calmette Guerin; zde uvedeném jako hsp71), DnaK z E. coli, kvasinky a jiná prokaryonta a BiP a Grp78. Hsp70 je schopný specificky vázat ATP stejně tak jako rozvinuté pólypeptidy a peptidy; protein hsp70 se účastní v procesu svinutí (konformace) a rozvinutí proteinů, stejně jako při kompletování a dekompletování proteinových komplexů.

Příkladem proteinu hsp z rodiny Hsp60 je Hsp65 z mykobakterií. Bakteriální HspóO je též obvykle znám jako GroEL. HspóO tvoří homooligomemí komplexy a zdá se, že hraje klíčovou roli při svinutí proteinů. Homology HspóO jsou přítomné v mitochondriích a chloroplastech eukaryontů.

Příklady proteinů hsp z rodiny TF55 zahrnují Tcpl, TRiC a termosomy. Tyto proteiny se typicky vyskytují v cytoplazmě eukaryontů a některých archeobakterií a tvoří mnohočlenné kruhy podporující svinutí (konformaci) proteinů. Jsou též slabě homologické k HspóO.

Příklady proteinů hsp z rodiny Hsp40 zahrnují DnaJ z prokaryontů jako jsou E. coli a mykobakterie a HSJ1, HDJ1 a Hsp40. Protein Hsp40 hraje roli jako molekulární průvodce při svinutí proteinů, termální toleranci a replikaci DNA, kromě dalších buněčných aktivit.

Příklady proteinů FKBP zahrnují FKBP12, FKBP13, FKBP25 a FKBP59,

Fprl a Nepl. U těchto proteinů je typická peptidyl-prolyl izomerasová aktivita a interagují s imunosupresivními látkami jako jsou FK506 a rapamy·· · · cin. Typicky se tyto proteiny vyskytují v cytoplazmě a endoplazmatickém retikulu.

Příklady cyklofilinů zahrnují cyklofiliny A, B a C. Tyto proteiny mají peptidylprolyl izomerasovou aktivitu a interagují s imunosupresivní látkou cyklosporin A.

Protein Hsp20-30 je také uveden jako malý Hsp. Protein Hsp20~30 se typicky vyskytuje ve velkých homooligomemích komplexech nebo případně též v heterooligomemích komplexech. Organizmus nebo buněčný typ mohou exprimovat několik různých typů malých proteinů Hsp. Protein Hsp20-30 interaguje se strukturami cytoskeletu a může hrát regulační roli při polymeraci/depolymeraci aktinu. Protein Hsp20-30 je iychle fosforylován při stresu nebo vystavení klidových buněk růstovým faktorům. Homology Hsp obsahují alfa-krystalin.

Protein ClpP je proteasa E. coli zapojená při degradaci abnormálních proteinů. Homology ClpP se vyskytují v chloroplastech. Proteiny ClpP tvoří heterooligomemí komplexy s ClpA.

Protein GrpE je protein E. coli o molekulové hmotnosti okolo 20 kDa, kteiý se účastní při záchraně stresem poškozených proteinů, jakož i degradace poškozených proteinů. GrpE hrají roli při řízení exprese stresových genů v E. coli.

Příklady proteinů Hsp 10 zahrnují GroES a CpnlO. Hsp 10 se vyskytuje v E. coli a v mitochondriích a chloroplastech eukaryontních buněk. Hsp 10 tvoří sedmičlenné kruhy, které se vážou s HspóO oligomery. Hsp 10 se též účastní při svinutí (konformaci) proteinů.

Bylo zjištěno, že ubichitin váže proteiny v kordinaci s proteolytickými přesuny proteinů pomocí ATP-dependentních cytosolických proteas.

Stresové proteiny užitečné v tomto vynálezu mohou být získány z enterobakterií (například E. coli), mykobakterií (zvláště M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis a M. bovis), kvasinek, mušek Drosophila, * · ··· · ·· ··♦· obratlovců (například ptáků nebo savců jako hlodavců nebo primátů včetně člověka).

Exprese a purifikace proteinů

Proteiny mohou být připraveny rekombinantním způsobem. Přesněji, proteiny hsp (nebo jejich fragmenty) a HPV antigeny (nebo jejich fragmenty), které mohou být podávány samostatně, v kombinacích nebo po konjugaci, případně fůzi proteinů obsahujících složku 1 a složku 2, mohou být připraveny rekombinantním způsobem v bakteriích, kvasinkách, rostlinách nebo rostlinných buňkách nebo zvířatech nebo živočišných buňkách. Například proteiny hsp, HPV antigeny a fuzní proteiny, které je obsahují mohou být připraveny transformací (přeměnou) (například transfekcí, transdukcí nebo infekcí) hostitelské buňky sekvencí nukleových kyselin ve vhodném expresívním nosiči. Vhodné expresívní nosiče zahrnují plazmidy, virové částice a fágy. Pro buňky hmyzu jsou vhodné expresívní vektory baculoviru. Do genomu hostitelské buňky může být integrován úplný expresívní nosič nebo jeho část. Za některých okolností je požadavkem použít indukovatelný expresívní vektor, například LACSWITCH® Inducible Expression System (Stratagene; La Jolla, CA).

Odborníci v oblasti molekulární biologie vědí, že získám rekombinantních proteinů potřebných pň zde uvedených způsobech je možné použít kterýkoli z velkého množství typů expresívních systémů (např. fuzní proteiny). Přesné použití hostitelské buňky a vektoru není pro tento vynález rozhodující.

Jak je uvedeno výše, složka 1, složka 2 a fuzní proteiny, které tyto složky obsahují, mohou být produkovány rostlinnými buňkami. Pro rostlinné buňky jsou vhodné virové expresívní vektory (např. virus květákové mozaiky a virus tabákové mozaiky) a plazmidové expresívní vektory (např. Ti plazmid). Takové buňky jsou dostupné od širokého spektra zdrojů (např.

toto·· • •49 • · * · · · 4 4 · ♦ · ··· · · « · · · :: ....... :

• · · · · · · ···· ♦· *·· ·· ·· ♦· ·9 the American Type Culture Collection, Manassas, VA; viz též např. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1994). Způsoby transformace a výběru expresívmch nosičů budou záviset na vybraném hostitelském systému. Způsoby transformace jsou popsány např. v Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manuál 1985, Supp. 1987.

Hostitelské buňky pro expresívní nosiče mohou být kultivovány v konvenčních živných médiích upravených dle potřeby pro aktivaci nebo represi vybraného genu, selekci transformantů (transformovaných buněk) nebo amplifíkaci vybraného genu.

Tam, kde je to vhodné nebo užitečné, může nukleová kyselina kódující fuzní protein obsahovat signální sekvenci pro exkreci fuzního proteinu například usnadnění izolace proteinu z buněčné kultury. Specifické iniciační signály mohou být též požadovány pro účinnou translaci vložených sekvencí nukleových kyselin. Tyto signály obsahují ATG iniciační kodon a přilehlé sekvence. V některých případech musí být zajištěny exogenní translační kontrolní signály, které snad obsahují ATG iniciační kodon. Dále je důležité, aby iniciační kodon byl ve fázi čtecího rámce požadované kódující sekvence, aby byla zajištěna translace úplného inzertu. Tyto exogenní translační kontrolní signály a iniciační kodony mohou být různého původu, jak přírodní tak i syntetické. Účinnost exprese může být zvýšena inkluzí vhodných zesilovačů transkripce nebo translace, (jsou např.uvedeny v Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516, 1987).

Složka 1, složka 2 a fuzní proteiny, které tyto složky obsahují mohou být rozpustné za normálních fyziologických podmínek. Kromě toho mohou takové fuzní proteiny obsahovat jeden nebo více nepříbuzných (tj. non-hsp, non-HPV) proteinů (v celém nebo částečném rozsahu) za účelem vytvoření alespoň jednoho trojitého fuzního proteinu. Třetí protein může být takový, který usnadňuje purifikaci, detekci nebo rozpouštění fuzního • · · · · · proteinu nebo obstarává některé jiné funkce. Například expresívní vektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983) může být použit k vytvoření lacZ íuzních proteinů a vektory pGEX mohou být použity k expresi cizích polypeptidů jako íuzních proteinů obsahujících glutathion S-transferasu (GST). Obvykle jsou takovéto fuzní proteiny rozpustné a mohou být snadno purifikovány z lyžovaných buněk adsorpci na glutathion-agarózových perlách s následnou elucí v přítomnosti volného glutathionu. Vektory pGEX jsou konstruovány tak, aby obsahovaly trombin nebo faktor Xa pro místa proteasového štěpení tak, že klonovaný cílový genový produkt může být uvolněn z GST skupiny. Tímto třetím proteinem může být také doména imunoglobulinu Fc. Takový fuzní protein může být ihned purifikován za použití afinitní kolony. Fúzní proteiny používané ve způsobech podle tohoto vynálezu mohou samozřejmě obsahovat více než jednu složku 1 a/nebo více než jednu složku 2 a složky 1 a 2 mohou být přímo nebo nepřímo vázané (např. mezi nimi mohou být jeden nebo více zbytků aminokyselin.

Protein (např. protein hsp, HPV antigen nebo fuzní protein obsahující hsp protein) může být purifikován s využitím protilátky, ke které se tento protein specificky váže. Odborní pracovníci v oboru používají běžně k purifikaci proteinů způsoby založené na afinitní chromatografií. Viz například Janknecht et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88: 8972,1981, pro purifikaci nedenaturovaných fuzních proteinů exprimovaných v lidských buněčných liniích. V tomto systému je zainteresovaný gen subklonován do vakcinia rekombinantního plazmidu tak, že otevřený čtecí rámec genu je translačně fúzován k aminovému konci skládajícího se ze šesti histidinových zbytků. Extrakty z buněk infikovaných rekombinantním vakcinia virem jsou naneseny na Ni²⁺ nitriloacetát-agarózové kolony a proteiny s histidinovými konci jsou selektivně eluovány za použití pufrů obsahujících imidazol. Stejný postup může být použit pro bakteriální kulturu.

• · · · • · ··· ·

....... .· :

Proteiny obsahující fuzní proteiny (zejména ty, které obsahují krátké antigenní fragmenty) mohou být též připraveny chemickou syntézou (např. pomocí způsobů uvedených v Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Takto izolované proteiny mohou být, je-li třeba, dále purifíkovány a/nebo koncentrovány a to tak dlouho, aby se těmito úpravami nesnížila jejich schopnost vzbuzovat imunitní odpověď postačující k tomu, aby byly účinné při použitích pro léčení podle tohoto vynálezu. V oboru je známo velké množství způsobů purifikace a koncentrace proteinů (viz např. Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, red., Elsevier, 1980), zahrnující ultracentrifugaci a/nebo precipitaci (např. síranem amonným), mikrofíltraci (např. pomocí 0,45 pm celulózoacetátových filtrů), ultrafíltraci (např. membránová a recirkulační filtrace), gelová filtrace (např. kolona plněná materiály Sepharose CL-6B, CL-4B, CL-2B, 6B, 4B nebo 2B, Sephaciyl S400 nebo S-300, Superose 6 nebo Ultrogel A2, A4 nebo A6; všechny dosupné od Pharmacia Corp.), rychlou proteinovou kapalinovou chromatografíi (FPLC) a vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Křížově reaktivní sekvence HPV

Pracovníci v oboru jsou schopni rozhodnout, zda prostředek obsahující HPV antigen prvního typu může být použit pro léčení subjektů infíkovaných druhým typem HPV. Stanovení na nichž mohou být takováto rozhodnutí založena zahrnují prognostické zkoušky (např.ty, které používají počítačové modely) a biologická stanovení (v nichž se skutečně provádí test křížové reaktivity. Mohou být použity jeden nebo oba typy stanovení (předpokládá se, nikoli náhodou, že výsledky získané v prognostickém stanovení budou dále testovány biologickými zkouškami). Jednotlivé příklady jsou uvedeny níže.

·· ···· ·· · ·· ···· ··· · · · · · · • ··· · · · · « · · • · 4t · ······· · · • · · 9 9 9 9 9 9

.......

Testování zkřížené reaktivity (tj. schopnost prostředku obsahujícího HPV antigen jednoho typu účinně léčit subjekt infikovaný jiným typem HPV nebo jenž má chorobu nebo stav související s HPV jiného typu) může být provedeno dobře zavedenými imunologickými metodami. Jako příklad demonstrace imunitní zkřížené reaktivity mohou být uvedeny bitransgenické myši konstruované pro expresi vazebné oblasti antigenů lidské MHC třídy I molekul a lidského genu CD8 (Lustgarten et al., Human Immunol. 52: 109,

1997; Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:1007,1991).

Přesněji, HLA-A2/CD8 bitransgenická myš (Lustgarten et al., supra) může být použita pro demonstraci křížové reaktivity cytotoxických T lymfocytů (CTL) vzbuzené vůči HPVI6 E7 proti peptidům odvozeným od proteinu E7 HPV6 a 11 za použití standardních imunologických technik (viz např. Coligan et al. Eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley &

Sons, 1999). Stručně řečeno, myši jsou jednou až třikrát imunizovány fuzním proteinem HspE7 (na bázi BCG Hsp65 a HPV16 E7 molekulách) v časových intervalech sedm až 21 dnů. Protein Hsp E7 je suspendován ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a podáván subkutánně v rozmezí dávkování od 1 pg do 1000 pg na myš. Po sedmi dnech ukončeno podávání Hsp E7, myši usmrceny, těmto myším byly odebrány sleziny a tkáň byla disociována do podoby monobuněčné suspenze. Buňky CTL, které jsou specifické pro HPV6 E7 jsou restimulovány (povzbuzeny) přídavkem HLA-A2 vazebných peptidů, odvozených od HPV16 E7, HPV6 E7 a HPV11 E7, do kultivačního media při koncentraci 1 pM. Buňky mohou být restimulovány například v 6 jamkových plotnách, které mají v každé jamce různý peptid. Peptidy (například deset peptidů) s nejvyšší předpokládanou vazebnou afinitou, jak je definováno pomocí počítačového algoritmu, mohou být použity pro každý z typů HPV16, HPV6 a HPV11 [nebo kterýkoli jiný typ HPV; viz Parker a spol.., J. Immunol. 152: 163,1994; algoritmus je • · • · · · • · ··· · * · frfr fr • · ·· · · · · · · · • · · · ······· · fr • ···· to··· ······· ·· · ·· ·· též dostupný na internetu prostřednictvím BIMAS (Bioinformatics & Molecular Analysis Section) Webové sítě National Institutes of Health zpřístupněné 26. června 2001 na http://bimas.dcrt.nih.gov/]. Kromě toho, jestliže se od sebe liší, mohou být též použity odpovídající peptidy z jiných 2 genotypů HPV (tj. HPV16 E7 peptid 11-20 a HPV6 a 11 peptidy 11-20).

Následuje období (např. jeden týden) restimulace in vitro, přičemž by měla být měřena CTL aktivita pomocí lýze T2 cílových buněk pulzovaných HLA-A2 vazebnými peptidy odvozenými od HPV16 E7, HPV6 E7 a HPV11 E7. Kromě toho, antigenspecifícké T lymfocyty, které rozpoznají HLA-A2 vazebné peptidy odvozené od HPV16 E7, HPV6 E7 a HPV11 E7, mohou být měřeny pomocí ELISPOT analýzy buněk se sekrecí INF-á za použití dříve popsaných metod (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:

145, 2000). Tyto analýzy by mohly být provedeny v myších transgenických pro jiné HLA alely.

Jinou možností je měření schopnosti CTL, které jsou indukovány imunizací pomocí HspE7 za účelem křížové reakce s peptidy odvozenými od proteinů HPV6 nebo 11 E7 v HLA-A2 pozitivních lidských subjektech, kteří se podrobili léčbě genitáhnch bradavic za použití HspE7. Monojaderné buňky periferní krve (PBMC - peripheral blood mononuclear cells) mohou být izolovány ze subjektů (např. lidských pacientů) před léčením a několik dní (např. 7 dní) po každém léčení pomocí HspE7. Buňky mohou být analyzovány pomocí fluorogenických MHC-peptidových komplexů (tetramery, Altman et al., Science 274: 94, 1996) nebo pomocí ELISPOT analýzy (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145,2000). Buňky mohou být stanoveny přímo z periferní krve a pak následuje restimulace in vitro, jak je popsána v (Youde et al., Cancer Res. 60: 365, 2000). Pro restimulaci in vitro jsou kultivovány buňky PBMC (2 x 10⁶/ml) v RPMI1640 s 10% ·· ···· «··· lidským AB sérem (RAB) a peptidem o koncentraci 10 pg/ml. Restimulované peptidy by měly být odvozené od HPV16 E7 a měly by obsahovat peptidy (např. deset peptidů) s nejvyšší předpokládanou HLA-A2 vazebou afinitou, jak je definováno počítačovým algoritmem (Parker et al., supra). Čtvrtý den je ke každé jamce přidáno 4,1 ml RAB obsahujícího IL-2 v koncentraci 25 jednotek/ml. Šestý den je 1 ml média nahrazen 1 ml média obsahujícího 10 jednotek IL-2/ml. Sedmý den jsou ozářené autologní buňky PBMC (čerstvé nebo zmrazené a pak roztáté) resuspendovány v RAB obsahujícím 10 pg/ml peptidu a 3 pg/ml [L-mikroglobulinu při koncentraci 3 χ 10⁶ buněk/ml. Buňky vykazující antigen se ponechají po dobu dvou hodin ulpívat (adheze) a pak jsou promyty za účelem odstranění nezachycených buněk před přídavkem 1 až 2 χ 10⁶ efektorových buněk/ml. Devátý den je ke každé jamce přidán 1 ml RAB obsahující 25 jednotek IL-2/ml. Třináctý den jsou obsahy jamek rozděleny do složených destiček a médium (obsahující 10 jednotek IL-2/ml) upraveno na původní objem. Buňky jsou použity čtrnáctý den. Pro analýzu FACS jsou připraveny tetramery podle již dříve popsaného způsobu (Altman et al., Science 274: 94, 1996). Peptidy použité pro dávko vám tetramerů jsou HLA-A2 vazebné peptidy odvozené od E7 molekul HPV16, HPV6 a HPV11. Peptidy (např. deset peptidů) s nejvyšší předpokládanou HLA-A2 vazebnou afinitou, jak jsou definovány počítačovým algoritmem (Parker et al., supra) jsou použity pro každý z HPV16, HPV6 a HPV11. Kromě toho, pokud jsou rozdílné, jsou též použity korespondující peptidy z jiných dvou HPV genotypů (tj. HPV 16 E7 peptid 11-20 a HPV6 all peptidy 11-20). Čerstvé nebo restimulované buňky PBMC jsou napuštěny PE-značenými HPV-E7 peptidovými tetramery a FITC značenou anti-CD8 protilátkou a analyzovány průtokovou cytometrií, jak bylo již popsáno. ELISPOT analýzou antigen specifických T lymfocytů, které rozpoznají HLA-A2 vazebné peptidy pocházející z HPV 16 E7, HPV6 E7 a HPV11 E7 přítomné v čerstvých a

94 • * ··« · • · · • · · • · · 4

4 4 4 ·· ·♦ restimulo váných buňkách PBMC, je provedena za použití dříve popsaných metod (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000). Podobně mohou být tyto techniky aplikovány v případě subjektů s jinými HLA haplotypy.

Kromě toho je možné testovat schopnost lidských buněk PBMC pocházejících od zdravých HLA-A2 pozitivních dobrovolníků, kteří nebyli předtím léčeni pomocí HspE7, stimulovaných in vitro HspE7 proteinem nebo peptidy pocházejícími z HPV typu 16 E7, za účelem křížové reakce s buňkami pulzovanými korespondujícími peptidy z jiných dvou HPV genotypů (6 a 11). Buňky jsou stimulovány a stanoveny pomocí postupů v oboru běžných. Krátce řečeno, buňky PBMC jsou izolovány z periferní krve, adhezí zachycené buňky jsou odděleny od nezachycených buněk a tyto zachycené buňky jsou kultivovány za účelem vytvoření dendritických buněk (dendritic cells-DC), jak je popsáno v Current Protocols in Immunology (Coligan et al., Eds., John Wiley & Sons, pp 7.32.7-8, 1999). Adhezi nezachycené buňky jsou kryoskopicky konzervovány v 90% FCS/ 10% DMSO pro použití v dalším stupni stanovení.

Pro stimulaci jsou DC pulzovány 50 pg/ml HspE7 nebo 40 pg/ml příslušného peptidů a 3 pg/ml p₂-mikroglobulinu po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C, 5% CO₂ (Kawashima et al., Human. Immunol. 59:1,1998). Použitými peptidy jsou HLA-A2 vazebné peptidy pocházející z E7 molekul HPV 16, HPV6 a HPV 11. Peptidy (např. deset peptidů) s nejvyšší předpokládanou HLA-A2 vazebnou afinitou, jak jsou definovány počítačovým algoritmem (Parker et al., supra) jsou použity pro každý z HPV 16, HPV6 a HPV 11. Kromě toho, pokud jsou rozdílné, by měly být též použity korespondující peptidy z jiných dvou HPV genotypů (tj. HPV16 E peptid 11-20 a HPV6 a 11 peptidy 11-20). Buňky CD8⁺jsou izolovány pomocí metody pozitivní selekce z kryoskopicky konzervovaných autologmch buněk, které se nezachytily adhezi, za použití imunomagnetických perel (Miltenyi ·· 4444

4444 ·*· ·· 44« 4 * · ··· 4 4 4 4 4 4

OH ! ! 4444 4444 4

XV 44 4 4444 4444 ·* ·44 44 44 44 4 4

Biotec). Peptid/protein-dávkované DC jsou ozářeny 4200 rady a smíchány s autologními CD8⁺ buňkami v poměru 1 : 20 do např. 48 jamkových ploten obsahujících 0,25 χ 10⁵ DC a 5 χ 10⁵ CD8⁺ buněk a 10 ng/ml IL-7 v 0,5 ml RAB. Sedmý a Čtrnáctý den jsou buňky restimulovány pomocí autologních peptidem pulzovaných adhezí zachycených APC (Kawashima et al., Human Immunol. 59: 1, 1998). Kultuiy jsou přiživovány každé 2 až 3 dny 10 U/ml hIL-2. HPV E7 peptid specifické T lymfocyty jsou analyzovány pomocí fluorogenických MHC-peptidových komplexů (tetramery, Altman et al., Science 274: 94, 1996) nebo ELISPOT analýzy (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) po sedmi a čtrnácti dnech stimulace in vitro. Tetramery pro analýzu FACS jsou připraveny podle dříve uvedeného způsobu (Altman et al., Science 274: 94, 1996). Peptidy použité pro dávkování tetramerů by měly být HLA-A2 vazebné peptidy pocházející z E7 molekul HPV16, HPV6 a HPV11, jak je popsáno výše. Peptid specifické T lymfocyty jsou napuštěny PE-značenými HPV-E7 peptidovými tetramery a FITC značenou anti-CD8 protilátkou a analyzovány metodou průtokové cytometrie (Youde et al., Cancer Res. 60: 365, 2000). ELISPOT analýza antigen specifických T lymfocytů, které rozpoznají HLA-A2 vazebné peptidy pocházející z HPV16 E7, HPV6 E7 a HPV11 E7 je provedena za použití dříve popsaných metod (Asal et al., Clin.

Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000). Podobně mohou být tyto techniky aplikovány v případě subjektů s jinými typy HLA haplotypů.

Podávání prostředků

Tento vynález zahrnuje prostředky obsahujících alespoň jeden HPV proteinový antigen [např. HPV proteinový antigen (nebo jeho antigenní fragmenty), HPV proteinový antigen smíchaný nebo konjugovaný s hsp (nebo jeho imunostimulačními fragmenty) nebo fuzní protein obsahující HPV proteinový antigen (nebo jeho antigenní fragmenty) a hsp (nebo jeho ·· »«·· imunostimulační fragmenty)]. Tyto proteiny mohou být dle potřeby suspendovány ve farmaceuticky přijatelném nosiči jako je rozpouštědlo (např. PBS) nebo uhličitanový roztok (např. 0,24M NaHCCh). Vhodné nosiče jsou vybírány na základě způsobu a cesty podávání a normách farmaceutické praxe. Vhodné farmaceutické nosiče a rozpouštědla, stejně tak jako nutné farmaceutické požadavky pro jejich použití, jsou uvedeny v Remington's Pharmaceutical Sciences. V prostředcích mohou být též obsažena adjuvans, jako například cholera toxin, termolabilní enterotoxin Escherichia coli (LT), lipozómy, nebo komplex stimulující imunitu (ISCOM - immune-stimulating complex).

Není nutné, aby byly proteiny (např. fuzní protein) podávány subjektu přímo. Místo nich mohou být podávány sekvence nukleových kyselin kódující příslušný protein; protein bude pak exprimován přímo v subjektu in vivo. Nukleová kyselina může být buď částí vektoru (jako je virový vektor, například část genornu virového vektoru) nebo zapouzdřená (encapsulated), například v lipozómech. Jinou možností je dodávání nukleových kyselin v podobě nechráněných nukleových kyselin.

Prostředky mohou být připraveny ve formě roztoku, suspenze, čípků, tablet, granulí, prášku, kapslí, masti nebo krému. Jak je zmíněno výše, do přípravy těchto prostředků mohou být zahrnuty jeden nebo více farmaceutických nosičů. Následující příklady farmaceuticky přijatelných nosičů nebo jiných aditiv zahrnují rozpouštědla (např. ethanol, polysorbáty nebo Cremophor EL®), činidlo pro upravení izotonicity, konzervační látky, antioxidační činidlo, pomocné prostředky (např. laktosa, škrob, krystalická celulosa, manitol, maltosa, kyselý fosforečnan vápenatý, slabý anhydrid kyseliny křemičité nebo uhličitan vápenatý), pojidla (např. škrob, polyvinylpyrolidon, hydroxypropylcelulosa, ethylcelulosa, karboxymethylcelulosa nebo arabská guma), mazadla (např.hořečnatá sůl kyseliny stearové, mastek nebo ztužené tuky). Je-li to nutné (nebo požadované ), mohou být ·« ···· • · · • * ··· • * t · • · · tf 990 »

··

0900 9 0

0 • 0 0 • 0 0

090

9

0 0

0

9 9

00 ·« 00 přidány též glycerin, dimethylacetamid, laktát sodný, povrchově aktivní látka, hydroxid sodný, ethylendiamin, ethanolamin, kyselý uhličitan vápenatý, arginin, me-glumin nebo trisaminomethan. Biologicky rozložitelné polymery jako jsou poly-D,L-laktid-ko-glykolid nebo polyglykolid mohou být použity jako objemná matrice, pokud je požadováno pomalé uvolňování prostředku (viz například US Patent Nos. 5 417 986, 4 675 381 a 4 450 150). Farmaceutické přípravky jako jsou roztoky, tablety, granule nebo kapsle mohou být tvořeny těmito složkami. Pokud je prostředek podáván orálně, mohou být přidána též barviva, aromatické přísady a příchutě.

Terapeutické prostředky mohou být podávány jakoukoli vhodnou cestou, například intravenózně, intraarteriálně, lokálně, intraperitoneálně (do pobřišnice), intrapleurálně (do pohrudnice), orálně, subkutánně, intramuskulámě, intradermálně, sublinguálně, intraepidermálně, nasálně, intrapulmonámě (např. inhalací), vaginálně nebo rektálně.

Množství podávaného prostředku bude závislé, například, na konkrétním prostředku, zdaje adjuvans podáváno současně s prostředkem, typu současně podávaného adjuvans, na způsobu a frekvenci podávání a požadovaném účinku (např. ochrana nebo léčení). Dávky jsou určovány podle předpisů odborníků zabývajících se vývojem léčiv a profylaktických agens. Obvykle jsou prostředky podle tohoto vynálezu podávány v množstvích v rozsahu mezi 1 pg a 100 mg na dávku pro dospělého člověka. Je-li s prostředkem současně podáváno adjuvans, množství, které může být použito na dávku pro dospělého člověka, se pohybuje v rozsahu mezi 1 ng a 1 mg. Podávání prostředkuje opakováno jak je nezbytné, což může být rozhodnuto odborníkem s praxí v oboru. Například po základní dávce mohou následovat tři podpůrné dávky v týdenních nebo měsíčních intervalech. Podpůrná injekce může být podána ve 3. až 12. týdnu po prvním podání a druhá podpůrná injekce může být podána o 3 až 12 týdnů později za • · · · • · • · · · ·· ; * ί ί, ί * !

·· · · · · · *· použití stejného přípravku. Subjektu mohou být provedeny odběry séra nebo T buněk za účelem testování imunitní odpovědi vzbuzené léčebným prostředkem proti HPV antigenu obsaženém například ve íuzním proteinu nebo v konjugátu proteinů. Způsoby stanovení protilátek nebo cytotoxických T buněk proti specifickému antigenu jsou dobře známy odborníkům v oboru. Podle potřeby mohou být podávány další podpůrné dávky. Imunizační protokol může být optimalizován s cílem vzbuzení maximální imunitní odpovědi, například proměnlivým množstvím fůzního proteinu v prostředku.

Proteiny zde popsané mohou být samozřejmě podávány poskytnutím nukleové kyseliny jako virového vektoru (např. retrovirový nebo adenovirový vektor).

Předpokládá se, že odborníci v oboru mohou využít tento vynález v plném rozsahu na základě výše uvedeného popisu a příkladu níže uvedeného, aniž by bylo třeba dalšího podrobného zpracování. Následující příklad je chápán pouze jako znázornění toho, jakým způsobem mohou odborníci v oboru izolovat a použít fůzní polypeptidy a nijak nelimituje zbytek popisu.

Příklady provedeni vynálezu

Fůzní polypeptid obsahující M. bovis BCG Hsp65 vázaný na E7 protein HPV typu 16 byl připraven rekombinantním způsobem a vytvořen jak je popsáno v WO 99/07 860. Hsp65 patří do rodiny stresových proteinů Hsp60. Ve směni klinických zkoušek na lidech za účelem testování účinnosti těchto lůzních polypeptidů při léčení análních intraepiteliálních poškození s vysokým stupněm šupinovitosti (HSIL - higli-grade squamous intraepithelial lesions) byla provedena následující pozorování.

• · · ·

Dvacet dva pacientů se účastnilo v pokuse metodou náhodného výběru, prováděného ve více spolupracujících střediscích zaměřeného na zkoušku HspE7 při léčbě anální HSIL, přičemž byly provedeny kontroly s placebem a dvojitými slepými pokusy. Vhodní pacienti měli biopsií potvrzené anální poškození (HSIL) a byli negativní na lidský virus ztráty imunity (HIV - human immunodeficiency virus). U pacientů byl stanoven typ HPV použitím buněk získaných análním výtěrem, avšak nebylo požadováno, aby měli typ HPV-16. U jednotlivých poškození nebyl stanovován typ HPV. Pacienti dostali tři subkutánní injekce bud’ lOOpg HspE7 nebo placeba v měsíčních intervalech. Byli hodnoceni z hlediska léčebné odpovědi na základě vyšetření stolice, anoskopie vysokého rozlišení (HRA - highresolution anoscopy) s biopsií a komplexním vyšetřením praktického lékaře. Pokud byli pacienti po 12 nebo 24 týdnech v kontrolním pokuse bez odezvy [tj. ti, u nichž přetrvávalo anální poškození (HSIL)], bylo přistoupeno k přechodu na tzv. open-label pokus (tj. s přesně známým postupem léčby), přičemž tito pacienti dostali tři injekce po 500 pg HspE7 v měsíčních intervalech. Léčebný přiřazení bylo opět metodou dvojitého slepého pokusu v placebem kontrolované zkoušce, přičemž slepý pokus nebyl přerušen.

Za účelem určení typů HPV infikovaných pacientů byly při výběru pacientů (screening visit) těsně před biopsií odebrány vzorky z řiti pacientům účastnícím se namátkového placebem kontrolovaného pokusu, při odběru byla použita metoda Darconova výtěru. Po převedení do transportního média pro vzorky [Sample Transport Medium (Digene)], byla izolována DNA a použita pro určení typu HPV. Pro zesílení HPV DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR - polymerase chain reaction) byla použita souhlasná sada primerů MY09/MY11. Následoval zesilovací krok, vzorky byly přeneseny odsátím na nylonovou membránu (blotted) a zkoušeny pomocí biotinem značených oligonukleotidů specifických pro 29 odlišných typů

0 0 0

0

0 0 0

000 0 · 000

00000 00 · · · ::

0000· ·· 0 0 · ·

HPV (6, 11, 16, 18, 26,31,32, 33, 35, 39,40, 45,51,52, 53, 54, 55, 56,

58, 59, 61, 66, 68, 69, 70, 73, AE2, Papl55 aPap291) plus spojené sondy obsahující příměry pro typy HPV (2, 13, 34, 42, 57, 62, 64, 67, 72 a W13B). Vzorky, které vytvářely tečkový otisk (dot blot), byly hodnoceny buď pozitivně nebo negativně pro jednotlivé typy HPV srovnáním se standardizovanými kontrolami za použití 5 bodové stupnice; stav 1 nebo vyšší byl hodnocen jako pozitivní.

Pro ověření úspěšnosti PCR bylo provedeno u každého vzorku betaglobinem řízené zesílení a detekční zkouška. Jestliže vzorek nebyl pozitivní na beta-globin, byl PCR krok považován za technicky chybný. Pokud souhlasná zkouška nekončila stavem 2 nebo vyšším, byl vzorek považován za HPV negativní.

V čase svého vstupu do tzv. open label pokusu mělo čtrnáct z dvaceti dvou pacientů (64 %) anogenitální bradavice, které přetrvávaly i během předcházejícím dvojitém slepém pokusu, při němž dostali v měsíčních intervalech tri injekce, každou po 100 pg HspE7 nebo placeba. U osmi (57 %) z těchto čtrnácti pacientů došlo ke zhoršení, čtyři pacienti (29 %) zůstali beze změny a u dvou pacientů (14 %) došlo ke zlepšení (u jednoho výraznému, u druhého k minimálnímu), což bylo zjištěno v čase jejich přechodu na open labeled pokus. Další pacient měl kondyloma přítomné na počátku dvojitého slepého pokusu, které se rozpustilo ještě před počátkem open labele a je vyloučen z této analýzy, stejně jako sedm dalších pacientů, kteří neměli detektovatelné bradavice během žádného pokusu. Kondylomata byla přítomna v anorektálním kanálu u všech čtrnácti pacientů (100 %) a rovněž na pokožce v okolí anální oblasti u šesti ze čtrnácti pacientů (43 %). Ze čtrnácti pacientů na počátku open label pokusu byla vyšetřujícím lékařem doporučena potřeba chirurgického odstranění u jedenácti pacientů (79 %), potřeba lokálního odstranění (ablativní léčba) (např. kapalným dusíkem, elektrokauterem) u dvou pacientů (14 %) a jednomu pacientovi (7 %) byla doporučena povrchová léčba (tj. imiquimod). U těchto pacientů byla odložena léčba doporučená vyšetřujícím lékařem, v souladu s tím dostali místo toho v rámci open label” pokusu tři injekce HspE7 po 500 Lig v měsíčních intervalech.

Měsíc po konečném léčeni pomocí 500 pg HspE7 neměli již dva pacienti (14 %) detektovatelné bradavice, u jedenácti pacientů (79 %) bylo zaznamenáno zmenšení velikosti a snížení poctu bradavic ve srovnání s jejich stavem při nástupu do open label pokusu au jednoho pacienta (7 %) došlo naopak ke zvětšení velikosti bradavic (tabulka 1). V čase primárního bodu vyhodnocení open label pokusu (4 měsíce po poslední dávce) zaznamenal další pacient zlepšení z částečné do úplné odezvy (tj. nebyly vidět bradavice), což činilo (21 %) ze všech tří zúčastněných (tabulka 1). U žádného z těchto testovaných nedošlo v průběhu šesti měsíců vyhodnocování open label pokusu k recidivě. U deseti pacientů (71 %) pokračovalo zlepšení částečné odezvy (tj. bradavice se dále značně zmenšily co do velikosti a zmenšení rozsahu léčby potřebné pro úplné odstranění zbylých bradavic). Pouze u jednoho pacienta (bez odezvy) (7 %) nedošlo ke zlepšení v open label pokuse.

Tabulka 1:	27 ; - ’ ·· ·	·· · · · · · ··· · · · · · 4 4 4 4 4 4 4 4 « * · · · · · · ·
Shrnutí odezvy pozorované u	anogenitálních bradavic po léčbě HspE7
Počet pacientů (%)
	12. týden*	24. týden**
Výsledek	(n = 14)	(n=14)
Pacienti s úplnou odezvou	2(14)	3(21)
Pacienti s částečnou odezvou	11(79)	10(71)
Pacienti bez odezvy	1(7)	1(7)

* jeden měsíc po ukončení léčení 500 pg HspE7 ** čtyři měsíce po ukončení léčení 500 pg HspE7

Na konci pokusu u výše uvedených tří pacientů s úplnou odezvou nedoporučil vyšetřující lékař další léčbu. Jak je uvedeno v tabulce 2, léčbou doporučenou vyšetřujícím lékařem byla u pacientů s částečnou odezvou ablativní léčba (kapalný dusík atp.) (6 ze 14, tj. 43 %) nebo léčení povrchovým činidlem (4 ze 14, tj. 29 %); další chirurgické odstranění bylo doporučeno jednomu pacientovi bez odezvy (1 ze 14, tj. 7 %). Všech dvacet dva pacientů se nechalo zaregistrovat do seznamu pro dlouhodobé pokračování sledování jejich odezvy (na léčbu) a souhlasilo s odložením léčby doporučené vyšetřujícím lékařem.

• · • · · ·

Tabulka 2:

Zhodnocení odezvy anogenitálních bradavic a klinicky doporučená léčba
	Počátek*	12.	týden**	24. t	ýden***
Pacient	Doporučená	Odezva	Doporučená	Odezva	Doporučená
(číslo)	léčba	bradavic	léčba	bradavic	léčba
003	chirurgická	ÚO	povrchová	ÚO	žádná
004	chirurgická	ČO	ablativní	ČO	ablativní
005	povrchová	ČO	povrchová	ÚO	žádná
006	chirurgická	ČO	chirurgická	v co	ablativní
008	ablativní	ČO	povrchová	v co	povrchová
009	chirurgická	ČO	ablativní	ČO	povrchová
010	chirurgická	co	ablativní	v co	ablativní
011	chirurgická	ÚO	povrchová	ÚO	žádná
014	chirurgická	ČO	povrchová	ČO	povrchová
016	chirurgická	zhoršení	chirurgická	zhoršení	chirurgická
017	ablativní	ČO	povrchová	ČO	povrchová
020	chirurgická	v co	ablativní	ČO	ablativní
021	chirurgická	ČO	ablativní	ČO	ablativní
022	chirurgická	v co	ablativní	ČO	ablativní

* počátek se vztahuje k začátku open-label pokusu ** jeden měsíc po ukončení léčení 500 gg HspE7 *** čtyři měsíce po ukončení léčení 500 gg HspE7

Zkratky: ČO = částečná odezva; ÚO = úplná odezva

U všech čtrnácti pacientů u nichž byly diagnostikovány anogenitální bradavice, byla detekována HPV DNA mnoha HPV typů ve vzorcích • · · ·

• 999 · · · · · · · · · · · · • · · · · · «9 9 9·· · • · · · ····

9· 9 9 ·· * * análních výtěrů během výběru pro první namátkový placebem kontrolovaný pokus (tabulka 3). U dvanácti pacientů (86 %) byl přítomen HPV-6 a/ nebo 11. Jeden pacient měl pouze HPV-16 a příbuzné typy a u dalšího pacienta nemohl být určen typ. Tři ze čtrnácti pacientů (21 %) byli pozitivní pro HPV-16. Většina pacientů, kterým se bradavice zlepšily (11 ze 13, tj. 85 %), nemělo HPV-16. Pacient bez odezvy také neměl HPV-16 (viz tabulka 3).

Tabulka 3:

HPV typy pacientů s anogenitálními bradavicemi
Pacient	HPV typ ve vzorcích análního výtěru, Odezva bradavic
(číslo)	při výběru*	ve 24. týdnu **
003	6,11,16	ÚO
004	6, 54	ČO
005	6, 70	ÚO
006	6, 11,45	ČO
008	16,31, 55	ČO
009	6, 11,59	ČO
010	6, 11,45, 54	co
011	HPV pozitivní, typ neznámý	ÚO
014	6, 11	ČO
016	11,61	zhoršení
017	HPV negativní	ČO
020	6, 11, 16	ČO
021	6,31,53, 58, 59,61,66	ČO
022	6	ČO

* Výběrové vyšetření namátkového klinického pokusu kontrolovaného placebem ** Čtyři měsíce po posledním léčení 500 pg HspE7

Zkratky: HPV = human papillomavirus; ÚO = úplná odezva; ČO = částečná odezva • ·· ·

V tomto open-label přechodovém pokusu s HspE7 (500 gg ve tříměsíčních intervalech), zahrnujícím pacienty s přetrvávajícími HSIL a průvodními bradavicemi, tři ze čtrnácti pacientů (17 %), kteří měli bradavice na počátku pokusu, je neměli čtyři měsíce po poslední dávce. Dalších deset pacientů (71 %) zaznamenalo zlepšení příznaků (tj. bradavice se význačně zmenšily co do velikosti a pokračovalo i omezení rozsahu léčby potřebné pro odstranění zbylých bradavic. U jednoho pacienta (7 %) nedošlo ke zlepšení po proběhnutí pokusu a kromě toho, mu byla vyšetřujícím lékařem doporučena chirurgická léčba.

Před přihlášením k open-label pokusu by většina pacientů na tomto místě podstoupila chirurgický zásah za účelem odstranění bradavic (11 ze 14, tj. 79 %). Na konci pokusu byla chirurgická léčba doporučena pouze jednomu pacientovi. Místní ablativní terapie (např. kapalný dusík, elektrokauter) byla doporučena šesti pacientům (43 %) a léčba pomocí povrchového činidla (např. imiquimod) byla doporučena čtyřem pacientům (29 %). Tři pacienti nepotřebovali žádnou další léčbu.

Odezva je považována za progresivní zlepšení, pokud po dobu více než šest měsíců nedojde k recidivě, což ani u jednoho z účastníků nedošlo. Postupné a progresivní rozpuštění kondylomat je v souladu s předpokládanou imunologickou odpovědí hostitele po indukci (vzbuzení) buněčné imunity pomocí HspE7.

Dvěma pacientům v dvojitém slepém pokusu se troch zlepšila kondilomata před vstupem do open label pokusu. Zatím jsme slepý pokus neukončili a nevíme tedy, zda tito pacienti obdrželi 100 gg HspE7 nebo placebo. Nicméně, vzhledem k odezvě pozorované při open-label pokuse aplikací tří injekcí 500 gg HspE7 v měsíčním intervalu, se jeví vyšší dávka účinnější než 100 gg.

HPV-16 DNA byla detekována ve vzorcích análních výtěrů pouze u tří ze třinácti pacientů (23 %) jimž se zlepšily bradavice po léčbě HspE7.

t) 9

99

999

DNA z HPV-6, HPV-11 nebo obou byla detekována u většiny pacientů, jejichž bradavice reagovaly na léčbu HspE7. Tyto výsledky naznačují, že zde existuje imunologická křížová reaktivita mezi HPV typy v odezvě vůči HspE7.

Shmeme-li výsledky zde uvedené, naznačují, že HspE7 má široké spektrum účinku při působení na anogenitální bradavice. Tato účinnost se nejeví býti omezena pouze na pacienty HPV-16 pozitivní, ale přechází na velké množství HPV typů. Předpokládá se, že HspE7 bude účinkovat při léčbě chorob v anogenitální oblasti vyvolaných HPV a že tento účinek nebude omezen pouze na HPV-16 pozitivní pacienty.

Pozorování zde uvedená naznačují, že terapeutické ošetření pomocí HspE7 se může stát podstatou nového jednoduchého a nechirurgického způsobu léčení anogenitálních bradavic, který by při minimálním zatížení umožnil zmenšení bradavic, čímž by se snížil rozsah léčení a výsledná nemocnost. Vnitřní anorektální choroby často vyžadují další léčbu, která může být poměrně bolestivá a oslabující. Jakákoliv léčba, která zajišťuje dokonce alespoň částečnou odezvu, která zmenší nebo vyloučí množství nebo rozsah chirurgické nebo ablativní terapie, se převádí na snížení nemocnosti, zmenšení ztrát pracovního času a zlepšení kvality života.

Tyto výsledky ukazují, že prostředek o složení protein teplotního šoku/ antigen HPV typ 16 je účinný při odstranění nebo zmenšení bradavic, u kterých se předpokládá, že jsou způsobeny převážně HPV typy 6 a 11. Značný význam mají pozorování, že 1) bradavice vůbec mohou být léčeny prostředky založenými na HPV a 2) prostředky na bázi HPV typu 16 byly účinné při léčbě stavu zaviněného pravděpodobně jiným typem HPV než je typ 16. Poslední výsledek, objevení křížové reaktivity, byl úplně neočekávaný, vzhledem k všeobecně rozšířené domněnce, že pouze typově specifický prostředek může vyvolat typově specifickou imunitní odpověď.

• · · ·

Pro vysvětlení možného mechanizmu křížové reaktivity fuzních polypeptidů byly vypočítány teoretické vazby pro různé molekuly HLA třídy I a peptidy E7 HPV typů 16, ó a 11. T./₂ disociace (poločas disociace) byl vypočítán za použití algoritmu uvedeného v Parker et al., J. Immunol. 152: 163,1994 (viz též výše uvedená webová adresa). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4:

HLA Typ	HPV Typ' 16	HPV Typ 6	HPV Typ 11
	start | sekvence	Tib	start	•sekvence	Tm	start	sekvence	Tw
	I
A1	44	QAEPDRAHY	900	44	DSQPLKQHY	8	44	DAQPLTQHY	5
16	ÓPETTDLYCY	23	17	PPDPVGLHCY	6	17	PPDPVGLHCY	6
						68	WECTDGDIR	9
A 0201	11	YMLDLQPET	375
7	TLHEYMLDL	201	7	TLKDIVLDL	7	7	TLKDIVLDL	7
82	LLMGTLGIV	54	82	LLLGTLNIV	412	82	LLLGTLNIV	412
			28	QLVDSSEDEV	140	28	QLEDSSEDEV	9
78	TLEDLLMGT	5	79	VQQLLLGTL	1	78	QLQDLLLGT	70
A 0205	7	TLHEYMLDL	50	7	TLKDIVLDL	4	7	TLKDIVLDL	4
11	YMLDLQPET	27	12	VLDLQPPDPV	1	12	VLDLQPPDPV	1
82	LLMGTLGIV	20	82	LLLGTLNIV	20	82	LLLGTLNIV	20
78	TLEDLLMGT	2	79	VQQLLLGTL	19	78	QLQDLLLGT	42
5	TPTLHEYML	0	5	HVTLKDIVL	14	5	LVTLKDIVL	24
A24	56	TFCCKCDSTL	20
51	HYNIVTFCC	11	51	HYQIVTCCC	11	51	HYQILTCCC	9
24	CYEQLNDSS	9	25	CYEQLVDSS	9	25	CYEQLEDSS	9
4	DTPTLHEYML	6	5	HVTLKDIVL	4	4	RLVTLKDIVL	12
			39	EVDGQDSQPL	5	39	KVDKQDAQPL	10
A3	88	GIVCPICSQK	14	88	NIVCPICAPK	5	88	NIVCPICAPK	5
	7	TLHEYMLDL	8	7	TLKDIVLDL	5	7	TLKDIVLDL	5
A68.1	68	CVQSTHVDIR	200	68	WQCTETDIR	200	68	WECTDGDIR	200
	89	IVCPICSQK	180	89	IVCPICAPK	180	89	IVCPICAPK	180
A 1101	89	IVCPICSQK	2.0	89	IVCPICAPK	2	89	IVCPICAPK	2.0
	68	CVQSTHVDIR	1.8	68	WQCTETDIR	1	68	WQCTETDIR	0.6
A_3101	69	VQSTHVDIR	4.0	69	VQCTETDIR	2	68	WECTDGDIR	2.0
	88	GIVCPICSQK	0.4	88	NIVCPICAPK	0	88	NIVCPICAPK	0.4
A_3302	68	CVQSTHVDIR	15	68	WQCTETDIR	15	68	WECTDGDIR	15
	58	CCKCDSTLR	3	58	CCGCDSNVR	3	58	CCGCDSNVR	3
B14	65	LRLCVQSTHV	30	65	7RLWQCTE	1	65	VRLWECTD	1

·· ···· • · ··· · • · • · ··

HLATyp	I HPV Typ 16	HPV Typ 6	HPV Typ 11
	start	sekvence	Tin	start	sekyence	T,c	start	sekvence	Tic
	Λ	1 DTPTLHEYML	11	3	3 GRHVTLKDI		í	3 GRLVTLKDI	60
j	5 TPTLHEYML		3	5 VTLKDIVLDL	1(		5 VTLKDIVLDL	15
7í	5 RTLEDLLMGT	1	7ť	3IREVQQLLL		7<	5IRQLQDLLL	20
B40	3ť	DEIDGPAGQA	12C	3£	> DEVDEVDGQ		3£	DEVDKVDKQ	2
	VDIRTLEDL	1C	7t	TDIREVQQL	1C	7i	GDIRQLQDL	20
r>	RTLEDLLMGT	C	77	REVQQLLLGT	16
87	LGIVCPICS	0	87	LNIVCPICA	2	87	LNIVCPICA	2
B60	79	LEDLLMGTL	176	79	VQQLLLGTL	2	79	LQDLLLGTL	2
2C	TDLYCYEQL	44	21	VGLHCYEQL	9	21	VGLHCYEQL	9
74	VDIRTLEDL	40	74	TDIREVQQL	44	74	GDIRQVQDL	44
			40	VDGQDSQPL	20	40	VDKQDAQPL	20
B61	36	DEIDGPAGQA	40	35	DEVDEVDG	1	35	DEVDKVDKQ	1
34	EEDEIDGPA	20	33	SEDEVDEV	40	33	SEDEVDKV	40
			72	TETDIREV	80	72	TDGDIRQL	1
29	NDSSEEEDEI	1				29	LEDSSEDEV	40
862	15	LQPETTDLY	88	15	LQPPDPVGL	6	15	LQPPDPVGL	6
43	GQAEPDRAHY	44	44	DSQPLKQHY	1	44	DAQPLTQHY	5
7	TLHEYMLDL	3	7	TLKDIVLDL	16	7	TLKDIVLDL	16
82	LLMGTLGIV	2	83	LLGTLNIVC	11	83	LLGTLNIVC	11
B7	5	TPTLHEYML	80	5	HVTLKDIVL	20	5	LVTLKDIVL	20
75	DIRTLEDLL	40	75	DIREVQQLL	40	75	DIRQLQDLL	40
46	EPDRAHYNI	2	46	QPLKQHYQI	8	46	QPLTQHYQIL	80
B8	58	CCKCDSTLRL	16	58	CCGCDSNVRL	1	58	CCGCDSNVRL	1
	75	DIRTLEDL	8	75	DIREVQQL	12	75	DIRQLQDLL	8
			7	TLKDIVLDL	12	7	TLKDIVLDL	12
B_2702	48	DRAHYNIVTF	60	49	KQHYQIVTC	6	49	TQHYQILTC	2
	76	IRTLEDLLM	20	76	IREVQQLLL	60	76	IRQLQDLLL	60
	65	LRLCVQSTH	20	65	VRLWQCTET	20	65	VRLWECTD	2
	2	HGDTPTLHEY	1	3	GRHVTLKDIV .	20	3	GRLVTLKDIV	20
B_2705	76	IRTLEDLLM	600	76	IREVQQLLL	2000	76	IRQLQDLLL	2000
	65	LRLCVQSTHV	600	65	/RLWQCTET	200	65	VRLWECTD	20
				3	GRHVTLKDIV	600	3	GRLVTLKDIV	600
B_3501	5'	tPTLHEYML	20	5	HVTLKDIVL	1	5	LVTLKDIVL	1
	16	QPETTDLYCY	18	15	.QPPDPVGL	2	15	LQPPDPVGL	2
	43	GQAEPDRAHY	6	44	DSQPLKQHY	10	44	DAQPLTQHY	6
	46	-PDRAHYNIV	1	46	QPLKQHYQI	8	46	QPLTQHYQIL	20
B 3701	74'	/DIRTLEDLL	200	74'	rDIREVQQLL	300	74	GDIRQLQDLL	200
	20'	rDLYCYEQL	40	21	/GLHCYEQLV	1	21	/GLHCYEQL	1
				40'	/DGQDSQPL	40	40'	/DKQDAQPL	40
	80 f	EDLLMGTLGI	40	80 <	QQLLLGTLNI	1	80	□DLLLGTLNI	40
B 3801	78'	rLEDLLLMGTL	8	78	EVQQLLLGTL	1	79	LQDLLLGTL	4
	50 t	\HYNIVTFC	4	50	QHYQIVTCC	4	50	QHYQILTCC	4
	51	rPTLHEYML	2.	4	^HVTLKDIVL	30	4	^LVTLKDIVL	1

•· ···· > · ·· * • · • · ·· » 9 9 4 ·· ··

HLATyp	HPV Typ 16	HPV Typ 6	HPV Typ 11
	start	sekvence	T«2	start	sekvence	T«2	start	sekvence	T,n
				3!	)ÉVDGQDSQPL	(	3!	) KVDKQDAQPL	3
7'	STHVDIRTL		7'	CTETDIREV		71	CTDGDIRQL	6
Β 3901	7£	TLEOLLMGTL	27	7S	) VQQLLLGTL	c	7£	LQDLLLGTL	14
7·	HVDIRTLEDL	1-1	7Z	ETDIREVQQL	14	74	GDIRQLQDL	1
77	RTLEDLLMGT	1	7£	IREVQQLLL	45	7£	DIRQLQDLL	1
4	DTPTLHEYML		4	RHVTLKDIVL	90	3	GRLVTLKDI	15
Β_3902	5S	CKCDSTLRL	20	5£	CGCDSNVRL	2	59	CGCDSNVRLV	3
7	TLHEYMLDL	2	7	TLKDIVLDL	1	6	VTLKDIVLDL	9
79	LEDLLMGTL	1	79	VQQLLLGTL	24	79	LQLQDLLLGTL	24
15	LQPETTDLY	1	15	LQPPDVGL	20	15	LQPPDPVGL	20
Β_4403	36	DEIDGPAGQA	90	35	DEVDEVDGQ	7	35	DEVDKVDKQ	16
3	GDTPTLHEY	45
44	QAEPDRAHY	6	44	DSQPLKQHY	18	44	DAQPLTQHY	27
			77	REVQQLLLGT	12
Β 5101	46	EPDRAHYN1	680	46	QPLKQHYQI	440	46	QPLTQHYQI	400
84	MGTLGIVCPI	114	84	LGTLNIVCPI	114	84	LGTLNIVCPI	114
Β 5102	46	EPDRAHYNI	220	46	QPLKQHYQI	1452	46	QPLTQHYQI	1452
84	MGTLGIVCPI	88	84	LGTLNIVCPI	88	84	LGTLNIVCPI	88
			21	VGLHCYEQLV	145	21	VGLHCYEQL	73
Β_5103	46	EPDRAHYNI	58	46	QPLKQHYQI	83	46	QPLTQHYQI	58
84	MGTLGIVCPI	44	84	LGTLNIVCPI	44	84	LGTLNIVCPI	44
			21	VGLHCYEQLV	53
Β_5201	46	ĚPDRAHYNIV	100	46	QPLKQHYQIV	132	46	QPLTQHYQIL	22
	81	DLLMGTLGIV	33	82	LLLGTLNIV	50	62	LLLGTLNIV	50
				60	GCDSNVRLW	40	60	GCDSNVRLW	40
Β 5801	49	RAHYNIVTF	79.0	49	KQHYQIVTCC	0	48.0	LTQHYQILTC	3.0
	77	RTLEDLLMGT	24.0	77	REVQQLLLGT	0	77.0	RQLQDLLLGT	0.1
	6	PTLHEYMLDL	0.2	6	VTLKDIVLDL	8	6.0	VTLKDIVLDL	8.0
	44	QAEPDRAHY	6.0	44	DSQPLKQHY	5	44.0	DAQPLTQHY	3.0
	85	GTLGIVCPI	4.0	85	GTLNIVCPI	4	85.0	GTLNIVCPI	4.0
CW.0301	20	TDLYCYEQL	100	21	VGLHCYEQL	100	21	VGLHCYEQL	100
	74	VDIRTLEDL	30	74	TDIREVQQL	36	74	GDIRQLQDL	36
				46	QPLKQHYQIV	6	46	QPLTQHYQIL	120
Cw_0401	56	TFCCKCDSTL	200				57	CCCGCDSNV	1
	5'	TPTLHEYML	88
	73 I	HVDIRTLEDL	14	73	ETDIREVQQL	12	73	DGDIRQLQDL	12
	46 I	EPDRAHYNI	17	46	QPLKQHYQIV	11	46	QPLTQHYQIL	88
Cw_0602	79	„EDLLMGTL	6	79 1	/QQLLLGTL	13	79	LQDLLLGTL	13
	85	3TLGIVCPI	6	85 (	3TLNIVCPI	6	85	GTLNIVCPI	6
	7'	rLHEYMLDL	2	7‘	rLKDIVLDL	12	7	TLKDIVLDL	12
Cw 0702	3	3DTPTLHEY	27	3<	3RHVTLKDI	1	3	GRLVTLKDI	1
	15 1	.QPETTDLY	8	16 (	3PPDPVGLHC	3	16	QPPDPVGLHC	3J

ΦΦΦ φ φ • · φφ

• Φ ·φφ · φφ φφφ

HLA Typ	HPV Typ 16	HPV Typ 6	HPV Typ 11
	start	sekvence	Tw	start	seKyence	T«2	start	sekvence	Tc
	43	GQAEPDRAHY	2	43	QDSQPLKQHY	11	43	QDAQPLTQHY	32
7	TLHEYMLDL	1	7	TLKDIVLDL	4	7	TLKDIVLDL	4

Tučně vytištěné sekvence peptidů udávají dva vrcholové spojovníky pro každou molekulu HLA a pro každý protein E7 z každého typu HP V.

Výsledky v tabulce 4 naznačují, že antigen HPV typ 16E7 může spustit buňkami zprostředkovanou imunitní odpověď proti E7 antigenu jiných typů HPV v závislosti na té které zkoušené HLA molekule. Například pro HLA B 2705 se předpokládá vysoká úroveň vazebnosti pro peptidy startující z aminokyselinové pozice 76 E7 u všech tří typů HPV. Je tedy možné, že pro pacienty, kteří exprimují tuto molekulu HLA, by byl prostředek na bázi HPV typu 16E7 křížově reaktivní a tedy užitečný při léčbě nebo prevenci infekce typy 6 a 11. Každý z těchto tučně vytištěných peptidových fragmentů v tabulce 4 představuje možný antigenní fragment, který múze být obsažen v prostředku (např. zde uvedené tužní polypeptidy) jako náhrada za úplný virový antigen E7. Samozřejmě mohou být použity dva nebo více takovýchto zdánlivých epitopů HLA nebo může být též použit dlouhý fragment obsahující mnoho zdánlivých epitopů HLA.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití prostředku obsahujícího fuzní protein, který obsahuje 1) protein teplotního šoku (hsp) nebo jeho imunostimulační fragment a 2) protein lidského papiloma viru (HPV) nebo jeho antigenní fragment, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení bradavic u subjektu, který byl identifikován jako subjekt, který má bradavice nebo je podezřelý z toho, že má bradavice.
2. 2. Použití prostředku obsahujícího fuzní protein, který obsahuje 1) hsp nebo jeho imunostimulační fragment a 2) protein HPV nebo jeho antigenní fragment, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení onemocnění nebo stavu subjektu souvisejícího s lidským papiloma virem (HPV), přičemž subjekt je infikován takovým typem HPV, který je odlišný od HPV typu obsaženého ve farmaceutickém přípravku určeném pro podávání subjektu pro léčení tohoto onemocnění nebo stavu.
3. 3. Použití nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid, který obsahuje 1) hsp nebo jeho imunostimulační fragment a 2) protein HPV nebo jeho antigenní fragment, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení bradavic u subjektu, který byl identifikován jako subjekt, který má bradavice nebo je podezřelý z toho, že má bradavice.
4. 4. Použití nukleové kyseliny kódující fuzní polypeptid, který obsahuje 1) hsp nebo jeho imunostimulační fragment a 2) protein HPV, pro výro• · · · • · • · · · bu farmaceutického přípravku pro léčení onemocnění nebo stavu subjektu souvisejícího s HPV infekcí, přičemž subjekt je infikován takovým typem HPV, který je odlišný od HPV typu obsaženého ve farmaceutickém přípravku určeném pro podávání subjektu pro léčení tohoto onemocnění nebo stavu.
5. 5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž hsp znamená mykobakteriální hsp.
6. 6. Použití podle nároku 5, v němž mykobakteriální hsp znamená Mycobacterium bovis hsp.
7. 7. Použití podle nároku 6, v němž hsp znamená Mycobacteriurn bovis Hsp65.
8. 8. Použití podle nároku 7, v němž hsp znamená člen rodiny proteinů Hsp60 nebo Hsp70.
9. 9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž HPV znamená typ 16 HPV.
10. 10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž HPV protein znamená E7 protein.
11. 11. Použití podle nároku 1, v němž farmaceutický přípravek obsahuje 50 až 5000 pg fůzního proteinu nebo 100 až 2000 pg fuznflio proteinu.

    • · · ·

    38 ··;· * ·····«« «· ·
12. 12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž je prostředek určen pro podávání bez adjuvans.
13. 13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž subjektem je savec.
14. 14. Použití podle nároku 13, v němž savcem je člověk.
15. 15. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž farmaceutický přípravek je určen pro podávání v množstvím postačujícím ke snížení velikosti bradavic.
16. 16. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž subjekt má chorobu nebo stav související sHPV typu 5, 6, 11, 18, 31, 33, 35, 45, 54, 60 nebo 70.
17. 17. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž u subjektu nebyla před podáváním farmaceutického přípravku identifikována infekce typu HPV.
18. 18. Použití podle nároku 3 nebo 4, v němž nukleová kyselina je obsažena ve virovém vektoru.
19. 19. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž choroba nebo stav znamená jsou anogenitální bradavice, bradavice na nožní klenbě, karcinom děložního hrdla, dysplazii děložního hrdla, anální karcinom, anální dysplazii nebo opakované respirační papilomatózy.