DE60119734T2

DE60119734T2 - Hpv-e7 zur behandlung von menschlichem papillomavirus

Info

Publication number: DE60119734T2
Application number: DE60119734T
Authority: DE
Inventors: John Devon NEEFE; Stephen New York GOLDSTONE; Mark Phoenixville WINNETT; Marvin Blue Bell SIEGEL; Leslie Victoria BOUX
Original assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Current assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2021-06-27
Also published as: AU2006203436A1; ATE326236T1; DK1296711T3; ES2263637T3; CZ20024154A3; HRP20021015A2; CN100441223C; US20030170268A1; US7754449B2; AU7144901A; BR0111956A; US20080063661A1; HUP0301308A2; WO2002000242A3; KR20080075560A; NO20026044D0; US20040235741A1; RU2282461C2; JP2004512264A; WO2002000242A2

Description

Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft Behandlungen von menschlichen Papillomavirus-Infektionen.
Hintergrund der Erfindung
Eine Infektion mit menschlichem Papillomavirus (HPV) ist häufig. HPV kann sexuell übertragen werden, und es wird geschätzt, dass 20–80% der sexuell-aktiven Erwachsenen infiziert worden sind. Während die Mehrheit von Infektionen asymptomatisch ist, kann eine Infektion zu der Entwicklung von Genitalwarzen (die eine Prävalenz von etwa 1–5% unter Erwachsenen haben) und Krebs des Anogenitaltrakts führen. Eine andere Art von Krebs, der Gebärmutterhalskrebs, ist stark mit HPV assoziiert (Franzer, Genitourin. Med. 72: 398–403, 1996). Die HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 werden oft mit einem erhöhten Risiko für Krebs assoziiert, wobei die Typen 16 und/oder 18 in mehr als 90% von Gebärmutterhalskrebs nachgewiesen werden (van Driel et al., Arzn. Med. 28: 471–477, 1996). Die Typen 6 und 11 werden auch mit Anogenitalwarzen assoziiert. Für Literaturübersichten über Papillomaviren und ihre assoziierten Pathologien siehe Shah et al., „Kapitel 66: Papillomaviruses", In: Virology, 3. Auflage, Fields et al., Hrsg., Raven Press, Philadelphia, S. 2077–2109, 1996 und zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst. 92: 690–698, 2000.
WO 98/04706 beschreibt Polypeptide und Aggregate von Polypeptiden, die Papilloma-abgeleitete Antigene umfassen, und Zusammensetzungen davon und deren Verwendung zum Beispiel mit Adjuvanzien für immunogene und Impfstoff-Zwecke zum Hervorrufen von HPV-spezifischen Immunantworten. Roden et al., Virology 270: 254–257 (2000) beschreiben die Impfung mit virusähnlichen Partikeln, umfassend sowohl L1 als auch L2 der HPV-Genitaltypen 6, 16 und 18, und beobachten die Induktion von Typ-spezifischen neutralisierenden Antikörpern. Kawana et al., J. Virol. 73; 6188–6190 (1999) beschreiben ein neutralisierendes Epitop im kleineren Kapsidprotein L2 der HPV-Typen 16 und 6.
Derzeit gibt es keinen sicheren und wirksamen Weg, Warzen oder die oben beschriebenen Erkrankungen durch Beeinflussung des Immunsystems zu behandeln oder zu verhindern. Bemühungen, solche Behandlungen zu entwickeln, sind aus mehreren Gründen behindert worden, einer davon ist das Dogma, dass Antigene eines einzelnen HPV-Typs eine limitierte, Typ-spezifische Immunantwort hervorrufen. Folglich ist vorgeschlagen worden, dass ein Cocktail, der Antigene von einigen unterschiedlichen HPV-Typen enthält, für eine allgemein wirksame HPV-Behandlung nötig ist (Caine et al., Science 288: 1753, 2000).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass ein Fusionsprotein, das ein Hitzeschockprotein oder ein immunstimulatorisches Fragment davon und ein HPV-Antigen, das aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, umfasst, verwendet werden kann, um eine Erkrankung oder einen Zustand zu behandeln, die/der durch eine Infektion mit einem anderen HPV-Typ verursacht wurde. Zum Beispiel war ein HPV-Typ 16-Antigen, das an ein bakterielles Hitzeschockprotein (hsp) fusioniert wurde, wirksam im Behandeln von menschlichen Anogenitalwarzen, die durch andere HPV-Typen als Typ 16 (z.B. die HPV-Typen 6 und 11) verursacht wurden. Dieses Ergebnis unterstützt zwei Behauptungen: (1) dass die Warzen mit einem HPV-Protein behandelt werden können und (2) dass therapeutische Mittel, die HPV gerichtet sind, keine Protein-Antigene von anderen HPV-Typen enthalten müssen, um allgemein wirksam zu sein.
Dementsprechend zeigt die Erfindung die Verwendung eines Fusionsproteins, umfassend (1) ein hsp oder ein immunstimulatorisches Fragment davon und (2) ein HPV-Protein, wobei das HPV-Protein aus dem E7-Protein von z.B. HPV-Typ 16 oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Warze in einem Patienten. Diese Komponenten können hierin als „Komponente (1)" beziehungsweise „Komponente (2)" bezeichnet werden. Das hsp (oder das immunstimulatorische Fragment davon) und das HPV-Protein (oder das antigene Fragment davon) können einfach im gleichen Präparat durch Fusion kombiniert werden (d.h. man kann ein Fusionsprotein, das die hierin beschriebenen Komponenten aufweist, oder ein Nucleinsäuremolekül, das sie codiert, verwenden). Wenn fusioniert, würden Komponente (1) und Komponente (2) geeignet sein, gleichzeitig verabreicht zu werden. Die oben beschriebene Verwendung kann einen Schritt einschließen, in dem ein Patient identifiziert wird, der eine Warze aufweist oder bei dem vermutet wird, eine aufzuweisen (in dem Zusammenhang der Behandlung des Patienten würde die Identifizierung durchgeführt, bevor die Verabreichung des Arzneimittels beginnt). Ärzte oder andere Fachleute können solche Patienten gut identifizieren.
Die Verwendungen der Erfindung sind auch geeignet, eine Warze zu verhindern, wobei ein Patient, der die Warzen-Verhinderung wünscht oder der davon profitieren würde (eher als ein Patient, der schon eine Warze hat), identifiziert wird.
Die Erfindung zeigt auch Verwendungen eines Fusionsproteins, umfassend (1) ein hsp oder ein immunstimulatorisches Fragment davon und (2) ein Protein eines HPV eines zweiten Typs, in dem das Protein eines HPV aus dem E7-Protein, z.B. Typ 16, oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln eines Patienten, der eine Erkrankung oder einen Zustand hat, die/der durch eine Infektion mit einem HPV eines ersten Typs (z.B. Typ 5, 6, 11, 18, 31, 33, 35, 45, 54, 60 oder 70) verursacht wird.
Das heißt, das HPV des „ersten Typs" und das HPV des „zweiten Typs" sind verschieden von einander; sie sind von zwei unterschiedlichen HPV-Typen. Das hsp (oder das immunstimulatorische Fragment davon) und das HPV-Protein (oder das antigene Fragment davon) können einfach durch Fusion im gleichen Präparat kombiniert werden (d.h. man kann ein Fusionsprotein verabreichen, das die hierin beschriebenen Komponenten aufweist, oder ein Nucleinsäuremolekül, das sie codiert). Wenn sie fusioniert sind, würden die Komponente (1) und die Komponente (2) geeignet sein, gleichzeitig verabreicht zu werden. Hier kann die Verwendung wieder einen Schritt einschließen, in dem ein Patient identifiziert wird, der eine HPV-Infektion (oder eine Erkrankung oder einen Zustand, die/der damit assoziiert ist) hat, oder bei dem vermutet wird, sie zu haben.
Wenn einem Patienten, der mit einem ersten HPV-Typ infiziert ist, eine Zusammensetzung gegeben wird, die ein HPV eines zweiten Typs einschließt, kann die Verwendung ausgeführt werden, bevor eine HPV-Infektion typisiert wird, bevor sie manifestiert ist oder bevor sie erfolgt ist (d.h. man muss nicht den bestimmten HPV-Typ kennen, mit dem ein Patient infiziert worden ist oder infiziert werden wird, bevor die Behandlung oder Prophylaxe beginnen kann). Wenn die Verwendungen vorbeugend sind, können sie einen Schritt einschließen, in dem ein Patient identifiziert wird, der die Verhinderung einer HPV-Infektion wünscht oder der davon profitieren würde.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen sind geeignet, in Mengen verabreicht zu werden, die ausreichend sind, um die Warze zu behandeln (durch zum Beispiel Reduzieren der Größe oder Verändern der Form der Warze oder durch Bessern eines Symptoms, das mit einer Warze assoziiert ist (z.B. der Schmerz, der oft mit einer Fußsohlenwarze assoziiert ist); wenn ein Patient mehr als eine Warze hat, kann die Behandlung die Reduzierung der Zahl der Warzen umspannen). In ähnlicher Weise sind die hierin beschriebenen Zusammensetzungen geeignet, in Mengen verabreicht zu werden, die ausreichend sind, um die Erkrankung (z.B. Krebs (wie Gebärmutterhalskrebs oder Analkrebs) oder den anderen Zustand (z.B. Dysplasie (wie cervicale oder Analdysplasie)) zu behandeln, die/der durch eine HPV-Infektion verursacht wird oder damit assoziiert ist. Obwohl Warzen oben getrennt erwähnt wurden, stellen Warzen auch einen Zustand dar, der durch HPV verursacht wird oder damit assoziiert ist. Ärzte oder andere Fachleute werden eine wirksame „Behandlung" einer Warze oder einer/eines HPV-assoziierten Erkrankung oder Zustands erkennen, wenn es eine Abnahme einer unerwünschten physiologischen Auswirkung gibt, die mit der Warze oder der Erkrankung oder dem Zustand assoziiert ist. Die klinischen und physiologischen Erscheinungsformen einer Warze so wie von jenen einer Erkrankung oder eines Zustands, die/der mit einer HPV-Infektion assoziiert ist, werden zum Beispiel in Fauci et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., McGraw-Hill Press, New York, S. 302–303 und 1098–1100, 1998 diskutiert.
„Patienten", die von den hierin beschriebenen Verfahren profitieren können, sind jene, die durch Papillomaviren infiziert werden können (z.B. Säuger wie Menschen, Nutztiere (z.B. Rinder, Pferde, Schweine, Schafe und Ziegen) und Haustiere (z.B. Katzen und Hunde)). Die Warze kann eine sein, die auf den Genitalien, der Haut oder inneren Organen auftritt (wie die Warzen, die auf den Stimmbändern in rezidivierender Atemwegspapillomatose auftreten (RRP; auch bekannt als juvenile Kehlkopfpapillomatose (JLP) oder im Erwachsenenalter auftretende RRP)).
Die Erfindung schließt darüber hinaus die Verwendung von einer oder mehreren der hierin beschriebenen Zusammensetzungen (einschließlich jenen, die Fusionsproteine oder die Nucleinsäuremoleküle, die sie codieren, enthalten) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten ein, der Warzen oder eine Erkrankung oder Zustände hat, die mit einer HPV-Infektion assoziiert sind (oder dadurch verursacht werden), gemäß den hierin beschriebenen Verfahren.
Ein „antigenes Fragment" eines Proteins (z.B. eines HPV-Proteins) ist irgendein Teil des Proteins, der, wenn er in der Form eines Arzneimittels gemäß den hierin beschriebenen Verwendungen verabreicht wird, in einem Patienten eine Immunantwort hervorruft, die entweder Fragment-spezifisch oder spezifisch für das Protein ist, von dem das Fragment erhalten wurde. Die Immunantwort kann entweder eine humorale oder eine Zell-vermittelte Antwort sein. Zum Beispiel kann ein antigenes Fragment ein HLA-Klasse I-Peptidantigen, wie unten beschrieben, sein. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Immunantwort, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erwünscht wird, nicht nur durch intakte Proteine und Fragmente davon hergestellt werden kann, sondern auch durch mutierte Proteine (z.B. jene, die eine oder mehrere Additionen, Substitutionen (z.B. konservative Aminosäure-Substitutionen) oder Deletionen in ihrer Aminosäuresequenz enthalten). Mutierte HPV-Antigene können leicht gemacht und auf ihre Fähigkeit, im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung zu funktionieren, getestet werden.
Ein „immunstimulatorisches Fragment" eines Proteins (z.B. eines hsp) ist irgendein Teil des Proteins, der, wenn er in der Form eines Arzneimittels gemäß den hierin beschriebenen Verwendungen verabreicht wird, eine Immunantwort durch ein Antigen ermöglicht. Wenn zum Beispiel die Immunantwort auf ein HPV-Protein ermöglicht wird, wenn jenes HPV-Protein in der Form eines Arzneimittels mit (z.B. fusioniert an) einem Fragment eines hsp verabreicht wird, ist jenes Fragment ein immunstimulatorisches Fragment eines hsp. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Immunantwort auch durch mutierte hsps (z.B. hsps, die eine oder mehrere Additionen, Substitutionen (z.B. konservative Aminosäure-Substitutionen) oder Deletionen in der Aminosäuresequenz enthalten) ermöglicht werden kann. Mutierte hsps können leicht gemacht und auf ihre Fähigkeit, eine Immunantwort auf ein HPV-Antigen zu ermöglichen, getestet werden.
Die Verwendungen der Erfindung liefern ein wirksames Mittel der: (1) Behandlung oder Verhinderung von Warzen und (2) Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung oder eines Zustands, der durch eine Infektion mit einem HPV-Typ mit (d.h. unter Verwendung) einer Zusammensetzung, die ein HPV-E7-Protein eines anderen Typs enthält, verursacht wird (oder damit assoziiert ist). Folglich kann eine Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen enthält, das aus einem HPV-E7-Protein besteht, in vielen, wenn nicht in den meisten Patienten verwendet werden, unabhängig vom HPV-Typ, mit dem sie infiziert sind (oder mit dem sie infiziert werden können). Es ist überraschend, dass HPV-Zusammensetzungen unter diesen Umständen (d.h. Umständen, die eine Kreuzreaktivität erfordern) wirksam sind. Es ist angenommen worden, dass HPV-Antigene von einem Typ keine wirksame Immunantwort gegen einen anderen Typ hervorrufen können. Andere Eigenschaften oder Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende, detaillierte Beschreibung und auch durch die Ansprüche offensichtlich.
Detaillierte Beschreibung
Die Erfindung betrifft allgemein wirksame, auf HPV basierende therapeutische Mittel, die ein hsp und ein HPV-Protein (z.B. ein Protein-Antigen) umfassen, wobei das HPV-Protein aus einem HPV-E7-Protein besteht. Ohne die Erfindung auf Verwendungen zu beschränken, in denen HPV-basierende Therapeutika ihre Wirkung durch einen bestimmten Mechanismus ausüben, wird von den Mitteln angenommen, dass sie eine Immunantwort produzieren, die Warzen und andere Zustände (z.B. Dysplasie) und Erkrankungen (z.B. Krebs), die mit HPV-Infektionen assoziiert sind, zurückdrängt bzw. verbessert. Zusammensetzungen, die ein HPV-E7-Protein von einem HPV-Typ enthalten, sind nützlich in der Behandlung oder Verhinderung von Warzen oder anderen HPV-assoziierten Erkrankungen oder Zuständen, die durch eine HPV-Infektion eines anderen (d.h. eines unterschiedlichen) Typs verursacht werden. Verschiedene Materialien und Vorgehensweisen, die für die Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung geeignet sind, werden unten diskutiert.
Herstellung von Fusionsproteinen
Die Nucleinsäuresequenzen, die hsps und HPV-Proteine codieren, sind bekannt und für Fachleute erhältlich. Daher können Nucleinsäure-Konstrukte, die Fusionspolypeptide codieren, die in den Verwendungen der Erfindung nützlich sind, leicht unter Verwendung von Routineverfahren hergestellt werden. Beispiele von Nucleinsäuresequenzen, die ein hsp codieren, das wahlweise an ein Antigen (z.B. ein HPV-Antigen) fusioniert ist, können in den Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 89/12455, WO 94/29459, WO 98/23735 und WO 99/07860 gefunden werden. Verfahren, durch die Proteine, einschließlich Fusionsproteine, exprimiert und aufgereinigt werden können, werden weiter unten diskutiert.
Unabhängig von der endgültigen Konfiguration der Zusammensetzung, die für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Verabreichung geeignet ist, verwendet wird, können die Komponente (1) und die Komponente (2) das Folgende einschließen.
HPV-Protein-Antigene
Jegliches HPV-E7-Antigen ist geeignet für die Verwendung in den Zusammensetzungen (z.B. den hierin beschriebenen Fusionsproteinen) der vorliegenden Erfindung.
Hsps
Eine Vielzahl von hsps sind von einer Ansammlung unterschiedlicher Organismen isoliert, cloniert und charakterisiert worden (Mizzen, Biotherapy 10: 173–189, 1998; wie hierin verwendet, ist der Ausdruck „Hitzeschockprotein(e)" oder seine Abkürzung (hsps(s)) synonym mit oder umspannt Proteine(n), die als „Stressproteine" bezeichnet werden). Immunstimulatorische hsps oder immunstimulatorische Fragmente davon sind für die Verwendung in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen geeignet (z.B. als ein Teil eines Fusionspolypeptids). Hsp70, hsp60, hsp20–30 und hsp10 sind unter den Hauptdeterminanten, die durch Wirts-Immunantworten auf eine Infektion durch Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae erkannt werden. Zusätzlich wurde gefunden, dass das hsp65 von Bacille Calmette Guerin (BCG), einem Stamm von Mycobacterium bovis, ein wirksames immunstimulatorisches Mittel ist, wie im Beispiel unten beschrieben.
Die Familien der hsp-Gene und hsps, wobei jedes davon, wie hierin beschrieben, als die Komponente (1) verwendet werden kann, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Diese schließen zum Beispiel Hsp100–200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, Cyclophiline, Hsp20–30, ClpP, GrpE, Hsp10, Ubiquitin, Calnexin und Protein-Disulfid-Isomerasen ein. Siehe z.B. Macario, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59–70, 1995; Parsell et al., Rev. Genet. 27: 437–496, 1993; und US-Patent Nr. 5,232,833. Das hsp kann ein Säuger-, bakterielles oder mycobakterielles hsp sein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Grp170 (für Glucose-reguliertes Protein) ist ein Beispiel eines hsp in der hsp100–200-Familie. Grp170 befindet sich im Lumen des endoplasmatischen Retikulums im prä-Golgi-Kompartiment und kann eine Rolle in der Immunglobulin-Faltung und dem Immunglobulin-Zusammenbau spielen.
Beispiele von hsps in der hsp100-Familie schließen das Säuger-Hsp110, das Hefe-Hsp104 und die E. coli-hsps ClpA, ClpB, ClpC, ClpX und ClpY ein.
Beispiele von hsps in der hsp90-Familie schließen HtpG in E. coli, Hsp83 und Hsc83 in Hefe und Hsp90alpha, Hsp90beta und Grp94 in Menschen ein. Hsp90 bindet Gruppen von Proteinen, die typischerweise zelluläre, regulatorische Moleküle wie Steroidhormon-Rezeptoren (z.B. Glucocorticoid-, Östrogen-, Progesteron- und Testosteron-Rezeptoren), Transkriptionsfaktoren und Proteinkinasen sind, die eine Rolle in Signaltransduktions-Mechanismen spielen. Hsp90-Proteine nehmen auch an der Bildung von großen, reichlich vorhandenen Proteinkomplexen teil, die andere Stressproteine einschließen.
Lon ist eine tetramere ATP-abhängige Protease, die nicht-natürliche Proteine in E. coli degradiert.
Beispiele von hsps in der hsp70-Familie schließen Hsp72 und Hsc73 von Säugerzellen, DnaK von Bakterien oder Mycobakterien wie Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis (wie Bacille-Calmette Guerin; hierin als hsp71 bezeichnet), DnaK von E. coli, Hefe und anderen Prokaryonten und BiP und Grp78 ein. Hsp70 ist zu spezifischer Bindung von ATP so wie ungefalteten Polypeptiden und Peptiden in der Lage; hsp70 nimmt an der Proteinfaltung und -Entfaltung so wie am Zusammenbau und Abbau von Proteinkomplexen teil.
Ein Beispiel eines hsp aus der Hsp60-Familie ist Hsp65 von Mycobakterien. Bakterielles Hsp60 ist allgemein auch als GroEL bekannt. Hsp60 bildet große, homo- oligomere Komplexe und scheint eine Schlüsselrolle in der Proteinfaltung zu spielen. Hsp60-Homologe sind in eukaryontischen Mitochondrien und Chloroplasten vorhanden.
Beispiele von hsps in der TF55-Familie schließen TcpI, TRiC und Thermosom ein. Diese Proteine treten typischerweise im Cytoplasma von Eukaryonten und manchen Archaebakterien auf, und sie bilden vielgliedrige Ringe, was die Proteinfaltung fördert. Sie sind auch schwach homolog zu Hsp60.
Beispiele von hsps in der Hsp40-Familie schließen DnaJ von Prokaryonten wie E. coli und Mycobakterien und HSJ1, HDJ1 und Hsp40 ein. Hsp40 spielt unter anderen zellulären Aktivitäten als ein molekulares Chaperon in der Proteinfaltung, Wärmetoleranz und DNA-Replikation eine Rolle.
Beispiele von FKBPs schließen FKBP12, FKBP13, FKBP25 und FKBP59, FprI und NepI ein. Diese Proteine weisen typischerweise eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität auf und interagieren mit Immunsuppressoren wie FK506 und Rapamycin. Die Proteine werden typischerweise im Cytoplasma und im endoplasmatischen Retikulum gefunden.
Beispiele von Cyclophilinen schließen die Cyclophiline A, B und C ein. Diese Proteine weisen eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität auf und interagieren mit dem Immunsuppressor Cyclosporin A.
Hsp20–30 wird auch als kleines Hsp bezeichnet. Hsp20–30 wird typischerweise in großen homo-oligomeren Komplexen oder möglicherweise hetero-oligomeren Komplexen gefunden. Ein Organismus oder ein Zelltyp kann einige unterschiedliche Typen von kleinen Hsps exprimieren. Hsp20–30 interagiert mit Strukturen des Cytoskeletts und kann eine regulatorische Rolle in der Polymerisierung/Entpolymerisierung von Aktin spielen. Hsp20–30 wird bei Stress oder Aussetzen von ruhenden Zellen gegenüber Wachstumsfaktoren schnell phosphoryliert. Hsp20–30-Homologe schließen alpha-Crystallin ein.
ClpP ist eine E. coli-Protease, die in den Abbau von abnormalen Proteinen involviert ist. Homologe von ClpP werden in Chloroplasten gefunden. ClpP bildet einen hetero-oligomeren Komplex mit ClpA.
GrpE ist ein E. coli-Protein von etwa 20 kDa, das in die Rettung von Stress-geschädigten Proteinen so wie den Abbau von beschädigten Proteinen involviert ist. GrpE spielt eine Rolle in der Regulierung der Stressgen-Expression in E. coli.
Hsp10-Beispiele schließen GroES und Cpn10 ein. Hsp10 wird in E. coli und in den Mitochondrien und Chloroplasten von eukaryontischen Zellen gefunden. Hsp10 bildet einen siebengliedrigen Ring, der mit Hsp60-Oligomeren assoziiert. Hsp10 ist auch in die Proteinfaltung involviert.
Es ist gefunden worden, dass Ubiquitin in Koordination mit der proteolytischen Entfernung der Proteine durch ATP-abhängige cytosolische Proteasen Proteine bindet.
Die Stress-Proteine, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können von Enterobakterien (z.B. E. coli), Mycobakterien (insbesondere M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis und M. bovis), Hefe, Drosophila, Wirbeltieren (z.B. Vögel oder Säuger wie Nager oder Primaten, einschließlich Menschen) erhalten werden.
Protein-Expression und -Aufreinigung
Proteine können rekombinant produziert werden. Genauer können hsps (oder Fragmente davon) und die HPV-E7-Antigene (oder Fragmente davon), die geeignet sind, in Kombination als Fusionsproteine verabreicht zu werden, die die Komponente (1) und die Komponente (2), die aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, enthalten, rekombinant in Bakterien, Hefe, Pflanzen oder Pflanzenzellen oder Tieren oder tierischen Zellen produziert werden. Zum Beispiel können hsps, HPV-Antigene und Fusionsproteine, die sie enthalten, durch Transformation (d.h. Transfektion, Transduktion oder Infektion) einer Wirtszelle mit einer Nucleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionsvehikel produziert werden. Geeignete Expressionsvehikel schließen Plasmide, virale Partikel und einen Phagen ein. Für Insektenzellen sind Baculovirus-Expressionsvektoren geeignet. Das gesamte Expressionsvehikel oder ein Teil davon kann in das Wirtszell-Genom integriert werden. In machen Fällen ist es wünschenswert, einen induzierbaren Expressionsvektor, zum Beispiel das LACSWITCH^® Inducible Expression System (Stratagene; La Jolla, CA), anzuwenden.
Fachleute auf dem Gebiet der Molekularbiologie werden verstehen, dass jedes einer breiten Vielfalt von Expressionssystemen verwendet werden kann, um rekombinante Proteine (z.B. Fusionsproteine), die in den hierin beschriebenen Verfahren nützlich sind, zu liefern. Die genaue Wirtszelle und der genaue Vektor, die/der verwendet wird, ist für die Erfindung nicht entscheidend.
Wie oben erwähnt, können die Komponente (1), die Komponente (2) und Fusionsproteine, die sie enthalten, durch Pflanzenzellen produziert werden. Für Pflanzenzellen sind virale Expressionsvektoren (z.B. das Blumenkohl-Mosaikvirus und das Tabak-Mosaikvirus) und Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) geeignet. Solche Zellen sind von einer breiten Auswahl von Quellen (z.B. der American Type Culture Collection, Manassas, VA; siehe auch z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1994) erhältlich. Die Verfahren der Transformierung und die Wahl des Expressionsvehikels werden vom ausgewählten Wirtssystem abhängen. Transformierungsverfahren sind z.B. in Ausubel (vorstehend) beschrieben. Die Expressionsvehikel können aus jenen ausgewählt werden, die in z.B. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Ergänz. 1987 geliefert werden.
Die Wirtszellen, die das Expressionsvehikel beherbergen, können in konventionellen Nährmedien gezüchtet werden, die, wie benötigt, für die Aktivierung oder Unterdrückung eines ausgewählten Gens, die Selektion von Transformanten oder die Amplifikation eines ausgewählten Gens angepasst werden.
Wo es passend oder vorteilhaft ist, kann die Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, eine Signalsequenz für die Absonderung des Fusionsproteins einschließen, um z.B. die Isolierung des Proteins aus einer Zellkultur zu ermöglichen. Spezifische Startsignale können auch für eine wirksame Translation der inserierten Nucleinsäuresequenzen nötig sein. Diese Signale schließen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In manchen Fällen müssen exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich vielleicht des ATG-Startcodons, geliefert werden. Darüber hinaus muss das Startcodon phasengleich mit dem Leseraster der erwünschten codierenden Sequenz sein, um die Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Startcodons können von einer Vielzahl von Ursprüngen, sowohl natürlicher als auch synthetischer, stammen. Die Wirksamkeit der Expression kann durch das Einschließen von geeigneten Transkriptions- oder Translations-Enhancer-Elementen (z.B. die in Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516, 1987 offenbarten) verstärkt werden.
Komponente (1), Komponente (2), wie hierin beschrieben, und Fusionsproteine, die sie enthalten, können unter normalen physiologischen Bedingungen löslich sein. Zusätzlich können solche Fusionsproteine ein oder mehrere nicht-verwandte(s) (d.h. ein nicht-hsp, nicht-HPV) Protein(e) (ganz oder zum Teil) einschließen, um ein zu mindestens dreiteiliges Fusionsprotein zu bilden. Das „dritte" Protein kann eines sein, dass die Aufreinigung, den Nachweis oder die Solubilisierung des Fusionsproteins ermöglicht oder das irgendeine andere Funktion liefert. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983) verwendet werden, um lacZ-Fusionsproteine zu bilden, und pGEX-Vektoren können verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine zu exprimieren, die die Glutathion-S-Transferase (GST) enthalten. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht von den lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarosekugeln, gefolgt von Elution in der Anwesenheit von freiem Glutathion aufgereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind gestaltet, um Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Spaltungsstellen einzuschließen, so dass das clonierte Zielgenprodukt von der GST-Einheit freigesetzt werden kann. Das „dritte" Protein kann auch eine Immunglobulin Fc-Domäne sein. Solch ein Fusionsprotein kann leicht unter Verwendung einer Affinitätssäule aufgereinigt werden. Natürlich können die Fusionsproteine, die in den Verwendungen der Erfindung nützlich sind, mehr als eine Komponente (1) und/oder mehr als eine Komponente (2) einschließen, und die Komponenten (1) und (2) können direkt oder indirekt verknüpft sein (z.B. ein oder mehrere Aminosäure-Rest können zwischen ihnen vorhanden sein).
Ein Protein (z.B. ein hsp, ein HPV-Antigen oder ein hsp-enthaltendes Fusionsprotein) kann durch Anwenden eines Antikörpers, an den das Protein spezifisch bindet, aufgereinigt werden. Ein Fachmann kann affinitätsbasierende Aufreinigungsverfahren verwendet, um Proteine aufzureinigen. Zum Beispiel, siehe Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8972, 1981, für die Aufreinigung von nicht-denaturierten Fusionsproteinen, die in menschlichen Zelllinien exprimiert werden. In diesem System wird das Gen von Interesse in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subcloniert, so dass das offene Leseraster des Gens translationell an eine Amino-terminale Markierung, die aus sechs Histidin-Resten besteht, fusioniert ist. Extrakte von Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert werden, werden auf Ni²⁺-Nitrilessigsäure-Agarosesäulen geladen, und die Histidin-markierten Proteine werden selektiv mit Imidazol-enthaltenden Puffern eluiert. Die selbe Vorgehensweise kann für eine bakterielle Kultur verwendet werden.
Proteine, einschließlich Fusionsproteine (insbesondere jene, die kurze antigene Fragmente enthalten), können auch durch chemische Synthese produziert werden (z.B. durch die Verfahren, die in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL beschrieben sind).
Sobald sie isoliert sind, können die Proteine, wenn erwünscht, weiter aufgereinigt und/oder konzentriert werden, so lange die weitere Verarbeitung nicht ihre Fähigkeit beeinträchtigt, eine Immunantwort hervorzurufen, die ausreichend ist, um in den Verfahren der Erfindung wirksam zu sein. Eine Vielzahl von Verfahren zum Aufreinigen und Konzentrieren von Proteinen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe z.B. Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work und Burdon, Hrsg., Elsevier, 1980), einschließlich Ultrazentrifugation und/oder Präzipitation (z.B. mit Ammoniumsulfat), Mikrofiltration (z.B. durch 0,45 μm-Celluloseacetat-Filter), Ultrafiltration (z.B. mit der Verwendung einer Größeneinteilungs-Membran und Rezirkulierungs-Filtration), Gelfiltration (z.B. Säulen, gefüllt mit Sepharose CL-6B, CL-4B, CL-2B, 6B, 4B oder 2B, Sephacryl S-400 oder S-300, Superose 6 oder Ultrogel A2, A4 oder A6; alle erhältlich von Pharmacia Corp.), schnelle Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC).
Kreuzreaktive HPV-Sequenzen
Ein Fachmann kann bestimmen, ob eine Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen enthält, in dem das Antigen ein HPV-E7-Protein oder ein antigenes Fragment davon eines ersten Typs ist, für die Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann, um einen Patienten zu behandeln, der mit einem zweiten Typ von HPV infiziert worden ist. Die Tests, auf denen solch eine Feststellung basieren kann, schließen vorhersagende Tests (z.B. jene, die Computermodelle ausnutzen) und biologische Tests (in denen man tatsächlich auf Kreuzreaktivität testet) ein. Ein oder beide Typen von Tests können verwendet werden (nicht überraschenderweise würde man erwarten, dass die Ergebnisse, die in einem vorhersagenden Test erhalten wurden, weiter in einem biologischen Test getestet werden). Beispiele von beiden folgen.
Man kann unter Verwendung von gut etablierten immunologischen Verfahren auf eine Kreuzreaktivität testen (d.h. die Fähigkeit einer Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen eines Typs enthält, wobei das Antigen ein HPV-E7-Protein ist, einen Patienten, der mit einem HPV eines anderen Typs infiziert ist oder der eine Erkrankung oder einen Zustand hat, die/der mit einem HPV eines anderen Typs assoziiert ist, wirksam zu behandeln). Zum Beispiel können bi-transgene Mäuse, die gentechnisch manipuliert wurden, um die Antigen-Bindungsregion des menschlichen MHC-Klasse I-Moleküls und des menschlichen CD8-Gens zu exprimieren (Lustgarten et al., Human Immunol. 52: 109, 1997; Vitiello et al., J. Exp. Med. 173: 1007, 1991), verwendet werden, um Immun-Kreuzreaktivität zu zeigen.
Genauer, die HLA-A2/CD8-bi-transgene Maus (Lustgarten et al., vorstehend) kann verwendet werden, um die Kreuzreaktivität von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL), die gegen HPV16-E7 hervorgerufen wurden, mit Peptiden, die vom E7-Protein von HPV6 und 11 abstammen, unter Verwendung von immunologischen Standardtechniken (siehe z.B. Coligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, 1999) zu zeigen. Kurz, die Mäuse werden ein- bis dreimal in Abständen von sieben bis 21 Tagen mit dem HspE7-Fusionsprotein (basierend auf den BCG-Hsp65- und HPV16-E7-Molekülen) immunisiert. HspE7 wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst und subcutan in einer Dosis im Bereich von 1 μg bis 1000 μg pro Maus verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung von HspE7 werden die Mäuse getötet, ihre Milzen entfernt und das Gewebe in eine Einzelzell-Suspension zerteilt. CTLs, die spezifisch für HPV-E7 sind, werden durch die Zugabe von HLA-A2-Bindungspeptiden, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 abgeleitet wurden, in einer Konzentration von 1 μM zum Kulturmedium re-stimuliert. Die Zellen können zum Beispiel in Platten mit 6 Vertiefungen, die ein unterschiedliches Peptid in jeder Vertiefung haben, re-stimuliert werden. Die Peptide (z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus definiert, können für jedes von HPV16, HPV6 und HPV11 verwendet werden (oder jeden anderen HPV-Typ; siehe Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994; der Algorithmus ist auch im Internet durch die BIMAS (Bioinformatics & Molecular Analysis Section)-Webseite der National Institutes of Health (Zugriff am 26. Juni, 2001 unter http://bimas.dcrt.nih.gov/) verfügbar). Zusätzlich, wo sie anders sind, würden die entsprechenden Peptide von den anderen zwei HPV-Genotypen auch verwendet werden (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und HPV6- und 11-Peptide 11–20).
Nach einem Zeitraum (z.B. einer Woche) der Re-Stimulierung in vitro würde die CTL-Aktivität durch die Lyse von T2-Zielzellen, die mit HLA-A2-Bindungspeptiden, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 abgeleitet sind, gepulst wurden, gemessen werden. Zusätzlich können Antigen-spezifische T-Lymphocyten, die HLA-A2-Bindungspeptide erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 abgeleitet wurden, durch ELISPOT-Analyse von IFN-γ-sezernierenden Zellen unter Verwendung von kürzlich beschriebenen Verfahren (Asal et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) gemessen werden. Diese Analysen könnten in Mäusen, die für andere HLA-Allele transgen sind, durchgeführt werden.
Alternativ kann man die Fähigkeit von CTL messen, die durch Immunisierung mit HspE7 induziert werden, mit Peptiden, die von HPV6- oder 11-E7-Proteinen abgeleitet wurden, in menschlichen, HLA-A2-positiven Patienten, die sich einer Therapie gegen Genitalwarzen unter Verwendung von HspE7 unterziehen, kreuzzureagieren. Mononucleäre periphere Blutzellen (PBMC) können von Patienten (z.B. menschlichen Patienten) vor der Behandlung und einige Tage (z.B. 7 Tage) nach jeder Behandlung mit HspE7 isoliert werden. Die Zellen können durch fluorogene MHC-Peptid-Komplexe (Tetramere, Altman et al., Science 274: 94, 1996) oder durch ELISPOT-Analyse (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) analysiert werden. Die Zellen können direkt aus dem peripheren Blut und nach in vitro-Re-Stimulierung, wie von Youde et al. (Cancer Res. 60: 365, 2000) beschrieben, getestet werden. Für die in vitro-Re-Stimulierung werden 2 × 10⁶/ml PBMC in RPMI1640 mit 10% menschlichem AB-Serum (RAB) und dem Peptid in einer Konzentration von 10 μg/ml kultiviert. Re-stimulierende Peptide würden von HPV16-E7 abgeleitet sein und würden die Peptide (z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus definiert (Parker et al., vorstehend), umfassen. Am Tag 4 wird 1 ml RAB, enthaltend 25 Einheiten/ml IL-2, zu jeder Vertiefung zugefügt. Am Tag 6 wird 1 ml Medium durch 1 ml Medium, enthaltend 10 Einheiten/ml IL-2, ersetzt. Am Tag 7 werden bestrahlte autologe PBMC (frisch oder tiefgefroren – dann aufgetaut) zu 3 × 10⁶ Zellen/ml in RAB, enthaltend 10 μg/ml Peptid und 3 μg/ml β₂-Mikroglobulin, resuspendiert. Man läßt Antigen-präsentierende Zellen für zwei Stunden anhaften und sie werden dann gewaschen, um nicht-anhaftende Zellen vor der Zugabe von 1–2 × 10⁶ Effektorzellen/ml zu entfernen. Am Tag 9 wird ein ml RAB, enthaltend 25 Einheiten/ml IL-2, zu jeder Vertiefung zugefügt. Am Tag 13 werden die Inhalte der Vertiefungen auf mehrere Platten verteilt, und das Medium (enthaltend 10 Einheiten/ml IL-2) wird auf das ursprüngliche Volumen zurück gebracht. Die Zellen werden am Tag 14 verwendet. Für die FACS-Analyse werden Tetramere, wie früher beschrieben (Altman et al., Science 274: 94, 1996), hergestellt. Die Peptide, die für das Beladen der Tetramere verwendet werden, sind HLA-A2-Bindungspeptide, die von dem E7-Molekül von HPV16, HPV6 und HPV11 stammen. Die Peptide (z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus definiert (Parker et al., vorstehend), werden für jedes von HPV16, HPV6 und HPV11 verwendet. Zusätzlich, wo verschieden, werden auch die entsprechenden Peptide von den anderen zwei HPV-Genotypen verwendet (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und HPV6- und 11-Peptide 11–20). Frische oder re-stimulierte PBMCs werden mit PE-markierten HPV-E7-Peptid-Tetrameren und FITC-markiertem anti-CD8-Antikörper gefärbt und durch Durchflusscytometrie analysiert, wie es beschrieben worden ist. ELISPOT-Analyse von Antigen-spezifischen T-Lymphocyten, die HLA-A2-Bindungspeptide erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 stammen, und in frischen und re-stimulierten PBMC vorhanden sind, wird unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) durchgeführt. In ähnlicher Weise können diese Techniken auf Patienten mit anderen HLA-Haplotypen angewendet werden.
Zusätzlich ist es möglich, die Fähigkeit von menschlichen PBMC zu testen, die von HLA-A2-positiven, gesunden Freiwilligen stammen, die nicht vorher mit HspE7 behandelt worden sind, und die in vitro mit HspE7-Protein oder -Peptiden, die vom HPV-Typ 16-E7 stammen, stimuliert worden sind, mit Zellen kreuzzureagieren, die mit den entsprechenden Peptiden von den anderen zwei HPV-Genotypen (6 und 11) gepulst wurden. Zellen werden unter Verwendung von Vorgehensweisen, die auf dem Fachgebiet üblich sind, stimuliert und getestet. Kurz, PBMC werden aus dem peripheren Blut isoliert, adhärente Zellen werden von nicht-adhärenten Zellen getrennt, und die adhärenten Zellen werden kultiviert, um dentritische Zellen (DC) herzustellen, wie in Current Protocols in Immunology (Coligan et al., Hrsg., John Wiley & Sons, S. 7.32.7–8, 1999) beschrieben. Die nicht-adhärenten Zellen werden in 90% FCS/10% DMSO für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt im Test tiefgefroren.
Für die Stimulation werden DC mit 50 μg/ml HspE7 oder mit 40 μg/ml des geeigneten Peptids und 3 μg/ml β₂-Microglobulin für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ gepulst (Kawashima et al., Human Immunol. 59: 1, 1998). Die verwendeten Peptide sind HLA-A2-Bindungspeptide, die von dem E7-Molekül von HPV16, HPV6 und HPV11 abstammen. Die Peptide (z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus definiert (Parker et al., vorstehend), werden für jedes von HPV16, HPV6 und HPV11 verwendet. Zusätzlich, wo verschieden, würden auch die entsprechenden Peptide von den anderen zwei HPV-Genotypen verwendet werden (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und HPV6- und 11-Peptide 11–20). CD8⁺-Zellen werden von tiefgefrorenen, autologen, nicht-adhärenten Zellen durch positive Selektion unter Verwendung von immun-magnetischen Kugeln (Miltenyi Biotec) isoliert. Peptid/Protein-beladene DC werden bei 4200 rad bestrahlt und mit autologen CD8⁺-Zellen in einem Verhältnis von 1:20, z.B. in Platten mit 48 Vertiefungen, enthaltend 0,25 × 10⁵ DC und 5 × 10⁵ CD8⁺-Zellen und 10 ng/ml IL-7 in 0,5 ml RAB, gemischt. An den Tagen 7 und 14 werden die Zellen mit autologen, Peptid-gepulsten, adhärenten APC re-stimuliert (Kawashima et al., Human Immunol. 59: 1, 1998). Den Kulturen werden alle 2–3 Tage 10 E/ml hIL-2 zugesetzt. HPV-E7-Peptid-spezifische T-Lymphocyten werden durch fluorogene MHC-Peptid-Komplexe (Tetramere, Altman et al., Science 274: 94, 1996) oder durch ELISPOT-Analyse (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) nach 7 und 14 Tagen der in vitro-Stimulierung analysiert. Für die FACS-Analyse werden Tetramere hergestellt, wie früher beschrieben (Altman et al., Science 274: 94, 1996). Die Peptide, die für das Beladen der Tetramere verwendet werden, würden HLA-A2-Bindungspeptide sein, die vom E7-Molekül von HPV16, HPV6 und HPV11 abstammen, wie oben beschrieben. Peptid-spezifische T-Lymphocyten werden mit PE-markierten HPV-E7-Peptid-Tetrameren und FITC-markiertem anti-CD8-Antikörper gefärbt und durch Durchflusscytometrie analysiert (Youde et al., Cancer Res. 60: 365, 2000). ELISPOT-Analyse von Antigen-spezifischen T-Lymphocyten, die HLA-A2-Bindungspeptide erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 stammen, wird unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) durchgeführt. In ähnlicher Weise könnten diese Techniken auf Patienten mit anderen HLA-Haplotypen angewendet werden.
Verabreichung der Zusammensetzungen
Die Erfindung schließt ein Fusionsprotein ein, umfassend ein HPV-Protein-Antigen, wobei das HPV-Protein-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon und einem hsp (oder einem immunstimulatorischen Fragment davon) besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der hierin erwähnten Zustände. Gegebenenfalls können diese Proteine in einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie einem Verdünner (z.B. PBS) oder einer Bicarbonat-Lösung (z.B. 0,24 M NaHCO₃) suspensiert sein. Nützliche Träger werden auf der Basis der Art und Weise und des Wegs der Verabreichung und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt. Geeignete pharmazeutische Träger und Verdünner sowie pharmazeutische Notwendigkeiten für ihre Verwendung sind in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben. Es können auch ein Adjuvans, zum Beispiel ein Cholera-Toxin, Escherichia coli-hitzelabiles Enterotoxin (LT), ein Liposom oder ein immunstimulierender Komplex (ISCOM) eingeschlossen sein.
Das (die) Protein(e) (z.B. das Fusionsprotein) muss (müssen) nicht geeignet sein, direkt an den Patienten verabreicht zu werden. Stattdessen ist eine Nucleinsäuresequenz, die das Protein codiert, geeignet, verabreicht zu werden; das Protein wird in dem Patienten in vivo exprimiert. Die Nucleinsäure kann ein Teil eines Vektors (wie eines viralen Vektors, zum Beispiel ein Teil eines viralen Vektor-Genoms) oder zum Beispiel in Liposomen verkapselt sein. Alternativ ist die Nucleinsäure geeignet, als eine nackte Nucleinsäure abgegeben zu werden.
Die Zusammensetzungen können als eine Lösung, eine Suspension, ein Suppositorium, eine Tablette, Granula, ein Pulver, eine Kapsel, eine Salbe oder eine Creme formuliert sein. Wie oben bemerkt, können beim Herstellen dieser Zusammensetzungen ein oder mehrere pharmazeutische Träger eingeschlossen sein. Zusätzliche Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Trägern oder anderen Zusätzen schließen Lösungsmittel (z.B. Wasser oder physiologische Kochsalzlösung), solubilisierende Mittel (z.B. Ethanol, Polysorbate oder Cremophor EL^®), Mittel zum Erbringen der Isotonie, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Excipienten (z.B. Lactose, Stärke, kristalline Cellulose, Mannit, Maltose, Calciumhydrogenphosphat, leichtes Kieselsäure-Anhydrid oder Calciumcarbonat), Bindemittel (z.B. Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropyl-Cellulose, Ethyl-Cellulose, Carboxymethyl-Cellulose oder Gummi arabicum), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder gehärtete Öle) oder Stabilisatoren (z.B. Lactose, Mannit, Maltose, Polysorbate, Makrogele oder Polyoxyethylen-gehärtete Castoröle) ein. Wenn nötig (oder erwünscht) können Glycerin, Dimethylacetamid, Natriumlactat, ein grenzflächenaktives Mittel, Natriumhydroxid, Ethylendiamin, Ethanolamin, Natriumbicarbonat, Arginin, Meglumin oder Trisaminomethan zugefügt werden. Biodegradierbare Polymere wie poly-D,L-Lactid-co-glycolid oder Polyglycolid können als eine Hauptmatrix verwendet werden, wenn eine langsame Freigabe der Zusammensetzung erwünscht wird (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,417,986, 4,675,381 und 4,450,150). Pharmazeutische Präparate wie Lösungen, Tabletten, Granula oder Kapseln können mit diesen Komponenten gebildet werden. Wenn die Zusammensetzung oral verabreicht werden soll, können Geschmackstoffe und Farben zugefügt werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen sind geeignet, auf irgendeinem geeigneten Weg, zum Beispiel intravenös, intraarteriell, örtlich, intraperitoneal, intrapleural, oral, subcutan, intramusculär, intradermal, sublingual, intraepidermal, nasal, intrapulmonal (z.B. durch Inhalation), vaginal oder rektal verabreicht zu werden.
Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird zum Beispiel von der bestimmten Zusammensetzung, ob ein Adjuvans zusammen mit der Zusammensetzung verabreicht wird, dem Typ des zusammen verabreichten Adjuvans, der Art und Weise und der Frequenz der Verabreichung und der erwünschten Wirkung (z.B. Schutz oder Behandlung) abhängen. Dosierungen werden routinemäßig durch Fachleute im Verlauf der Entwicklung von Arzneistoffen oder prophylaktischen Mitteln bestimmt. Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet, in Mengen im Bereich zwischen 1 μg und 100 mg pro Dosis für einen erwachsenen Menschen verabreicht zu werden. Wenn Adjuvantien mit den Zusammensetzungen verabreicht werden, können im Allgemeinen Mengen im Bereich zwischen 1 ng und 1 mg pro Dosis für einen erwachsenen Menschen verwendet werden. Die Verabreichung wird, wenn nötig, wiederholt, was durch einen Fachmann bestimmt werden kann. Zum Beispiel können auf eine Grunddosierung drei Auffrischungs-Dosierungen in wöchentlichen oder monatlichen Abständen folgen. Eine Auffrischungs-Impfung kann drei bis zwölf Wochen nach der ersten Verabreichung gegeben werden, und eine zweite Auffrischung kann drei bis zwölf Wochen später unter Verwendung des selben Präparats gegeben werden. Serum oder T-Zellen können von dem Patienten für das Testen der Immunantwort genommen werden, die durch die Zusammensetzung gegen das HPV-Antigen, das zum Beispiel in dem Fusionsprotein oder Protein-Konjugat eingeschlossen ist, hervorgerufen wird. Verfahren zum Testen von Antikörpern oder cytotoxischen T-Zellen gegen ein spezifisches Antigen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zusätzliche Auffrischungen können, wenn nötig, gegeben werden. Durch Variieren der Menge zum Beispiel des Fusionsproteins in der Zusammensetzung kann das Immunisierungsprotokoll für das Hervorrufen einer maximalen Immunantwort optimiert werden.
Natürlich sind die hierin beschriebenen Proteine auch geeignet, durch Verabreichen einer Nucleinsäure wie eines viralen Vektors (z.B. eines retroviralen oder adenoviralen Vektors) abgegeben zu werden.
Ohne weitere ausführliche Darstellung wird angenommen, dass ein Fachmann basierend auf der obigen Offenbarung und den Beispielen unten die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß ausnutzen kann.
BEISPIEL
Ein Fusionspolypeptid, enthaltend das M. bovis-BCG Hsp65, gekoppelt an das E7-Protein des HPV-Typ 16, wurde rekombinant produziert und, wie in WO 99/07860 beschrieben, formuliert. Hsp65 ist ein Mitglied der Hsp60-Familie von Stress-Proteinen. Im Verlauf eines menschlichen klinischen Versuchs zum Testen der Wirksamkeit dieses Fusionspolypeptids bei der Behandlung von analen hochgradigen schuppenartigen intraepithelialen Läsionen (HSIL) wurde die folgende Beobachtung gemacht.
22 Patienten nahmen an einem randomisierten, Placebo-kontrollierten, multizentrischen Doppelblindversuch von HspE7 bei der Behandlung von analer HSIL teil. Geeignete Patienten hatten eine durch Biopsie bestätigte anale HSIL und waren negativ für das menschliche Immunschwächevirus (HIV). Die Patienten wurden unter Verwendung von Zellen, die von einem Anal-Abstrich erhalten wurden, auf HPV typisiert, mussten aber nicht HPV-16 haben. Individuelle Läsionen wurden nicht auf HPV typisiert. Die Patienten erhielten drei subcutane Injektionen von entweder 100 μg HpsE7 oder Placebo in monatlichen Abständen. Sie wurden durch anale Abstriche, hoch-auflösende Anoskopie (HRA) mit Biopsie und allgemeiner ärztlicher Bewertung auf die Behandlungs-Antwort beurteilt. Patienten, die nach 12 oder 24 Wochen im kontrollierten Versuch nicht antworteten (d.h. jene mit persistierender analer HSIL), wurde erlaubt, in einen Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung überzuwechseln, wo sie drei Injektionen von 500 μg HspE7 in monatlichen Abständen erhielten. Die Behandlungszuteilung unterlag im Placebo-kontrollierten Versuch einer Doppelblindheit, und der Blindversuch ist nicht aufgedeckt worden.
Um den (die) HPV-Typ(en), der (die) Patienten infiziert (infizieren), zu bestimmen, wurde ein Dacron-Abstrich verwendet, um Proben vom Anus der Patienten beim Screening-Besuch des randomisierten, Placebo-kontrollierten Versuchs gerade vor der Biopsie zu sammeln. Nach dem Transport in Sample Transport Medium (Digene) wurde DNA isoliert und verwendet, um den HPV-Typ zu bestimmen. Kurz, der Konsens-Primersatz MY09/MY11 wurde verwendet, um die HPV-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Nach dem Amplifizierungsschritt wurden die Proben auf eine Nylonmembran geblottet und mit Biotin-markierten Oligonucleotiden, die für 29 verschiedene HPV-Typen spezifisch waren (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 66, 68, 69, 70, 73, AE2, Pap155 und Pap291), und einer gepoolten Sonde, die Primer für 10 HPV-Typen (2, 13, 34, 42, 57, 62, 64, 67, 72 und W13B) enthielt, sondiert. Proben, die einen „Dot-Blot" produzierten, wurden durch Vergleich mit standardisierten Kontrollen unter Verwendung einer 5-Punkt-Skala als positiv oder negativ für den HPV-Typ bewertet; eine Bewertung von 1 oder mehr war positiv.
Um zu bestätigen, dass die PCR erfolgreich war, wurde eine beta-Globin-Kontrollamplifikation und ein Sondennachweis für jede Probe durchgeführt. Wenn die Probe nicht positiv für die Anwesenheit von beta-Globin war, wurde der PCR-Schritt als ein technisches Versagen angesehen. Wenn die Konsensus-Sonde nicht in einer Bewertung von 2 oder mehr resultierte, wurde die Probe als „HPV-negativ" angesehen.
Zum Zeitpunkt ihres Eintretens in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung hatten 14 der 22 Patienten (64%) Anogenitalwarzen, die durch den vorherigen Doppelblindversuch persistierten, in dem sie drei monatliche Injektionen von entweder 100 μg HspE7 oder Placebo erhielten. Von diesen 14 Patienten trat bei acht Patienten (57%) eine Verschlechterung ein, 4 Patienten (29%) zeigten keine Änderung und bei zwei Patienten (14%) trat eine Verbesserung ein (bei einem dramatisch und bei dem anderen minimal) zum Zeitpunkt, als sie zum Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung überwechselten. Ein zusätzlicher Patient wies ein Kondylom am Beginn des Doppelblindversuches auf, das sich vor dem Beginn des Versuches mit offen gelegter Kennzeichnung auflöste, und wurde von dieser Analyse ausgelassen, so wie die sieben anderen Patienten, die während der beiden Versuchen keine nachweisbaren Warzen aufwiesen. Kondylomen waren im Anorektalkanal in allen 14 Patienten (100%) und auch auf der perianalen Haut in sechs von 14 Patienten (43%) vorhanden. Von den 14 Patienten mit Warzen am Beginn des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung bestimmte der Untersucher vor Ort, dass für elf (79%) Patienten eine chirurgische Entfernung nötig war, lokale Entfernung (z.B. flüssiger Stickstoff, Elektro-Versengen) war für zwei Patienten (14%) nötig, und örtliche Behandlung (z.B. Imiquimod) war für einen Patienten (7%) nötig. Diese Patienten wählten, die vom Untersucher vor Ort empfohlene Behandlung zu verschieben, und stimmten zu, an deren Stelle drei Injektionen von HspE7, 500 μg in monatlichen Abständen, im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung zu erhalten.
Einen Monat nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7 hatten zwei Patienten (14%) keine nachweisbaren Warzen, elf Patienten (79%) hatten eine Reduzierung der Größe oder Zahl der Warzen im Vergleich zu ihrem Zustand beim Eintreten in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung, und ein Patient (7%) erfuhr eine Steigerung der Warzengröße (Tabelle 1). Zum Zeitpunkt des ersten Bewertungspunkts des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung (vier Monate nach der letzten Dosis) erfuhr ein zusätzlicher Patient eine Verbesserung von teilweiser zu vollständiger Antwort (d.h. keine sichtbaren Warzen), was insgesamt drei (21%) Patienten, die eine vollständige Antwort zeigten, ergibt (Tabelle 1). Keiner dieser Patienten, die eine Antwort zeigten, zeigte während der sechs Monate der Bewertung im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung Rezidive. Zehn Patienten (71%) fuhren fort, eine Verbesserung der teilweisen Antwort (d.h. Warzen, die sich signifikant weiter verkleinerten, mit fortgesetzter Abnahme des Ausmaßes der benötigten Behandlung, um die verbleibenden Warzen zu entfernen) zu zeigen. Der eine Patient, der keine Antwort zeigte (7%), zeigte bis zum Ende des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung keine Verbesserung. TABELLE 1 Zusammenfassung der Antwort für Anogenitalwarzen nach einer Behandlung mit HspE7

* Einen Monat nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
† Vier Monate nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.

Am Ende des Versuchs empfahl der Untersucher vor Ort keine weitere Behandlung für die drei Patienten, die eine vollständige Antwort zeigten. Wie in Tabelle 2 aufgelistet, war die vom Untersucher vor Ort empfohlene Behandlung vor die Patienten, die eine teilweise Antwort zeigten, eine entfernende Therapie (6 von 14, 43%) oder eine Behandlung mit einem örtlichen Mittel (4 von 14, 29%); zusätzliche Chirurgie wurde für den Patienten, die keine Antwort zeigten, empfohlen (1 von 14, 7%). Alle 22 Patienten traten in ein registriertes Protokoll für ein Langzeit-Verfolgen ihrer Antwort ein, und sie stimmten zu, die vom Untersucher empfohlene Behandlung zu verschieben. TABELLE 2 Beurteilungen der Anogenitalwarzen-Antwort und die vom Kliniker empfohlene Behandlung

* Grundlinie bezieht sich auf den Beginn des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung.
† Einen Monat nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
‡ Vier Monate nach der letzen Behandlung mit 500 μg HspE7.
Abkürzungen: CR = Patienten mit vollständiger Antwort; PR = Patienten mit teilweiser Antwort

Bei allen 14 Patienten, die mit Anogenitalwarzen diagnostiziert wurden, wurde HPV-DNA von mehreren HPV-Typen in den Anal-Abstrichproben während der Durchmusterung für den ersten randomisierten, kontrollierten Versuch nachgewiesen (Tabelle 3). HPV-6 und/oder 11 waren in 12 Patienten (86%) vorhanden. Ein Patient hatte nur HPV-16 und verwandte Typen, und ein anderer Patient konnte nicht typisiert werden. Drei der 14 Patienten (21%) waren positiv für HPV-16. Die meisten Patienten, deren Warzen sich verbesserten (11 von 13, 85%), hatten nicht HPV-16. Der Patient, der keine Antwort zeigte, hatte auch nicht HPV-16 (siehe Tabelle 3). TABELLE 3 HPV-Typen in Patienten mit Anogenitalwarzen

* Durchmusterungs-Besuch bei dem randomisierten, Placebo-kontrollierten klinischen Versuch.
† Vier Monate nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
Abkürzungen: HPV = menschliches Papillomavirus; CR = vollständige Antwort; PR = teilweise Antwort

In diesem Übertreter-Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung von HspE7 (500 μg in drei monatlichen Abständen), der Patienten mit persistierender analer HSIL und begleitenden Anogenitalwarzen involviert, hatten drei der 14 Patienten (17%), die Warzen an der Grundlinie aufwiesen, vier Monate nach der letzten Dosis keine Warzen mehr. Weitere zehn Patienten (71%) erfuhren eine Verbesserung ihrer Symptome (d.h. Warzen, die signifikant verkleinert waren, und eine fortgesetzte Abnahme des Ausmaßes der benötigten Behandlung, um die verbleibenden Warzen zu entfernen). Ein Patient (7%) verbesserte sich im Verlauf des Versuchs nicht, und eine zusätzliche Operation wurde durch den Untersucher vor Ort empfohlen.
Vor dem Einschreiben in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung würden sich die meisten Patienten bei diesem Versuch einem chirurgischen Eingriff für die Entfernung ihrer Warzen unterzogen haben (elf von 14, 79%). Am Ende des Versuchs wurde die chirurgische Behandlung nur für einen Patienten empfohlen. Lokale entfernende Therapie (z.B. flüssiger Stickstoff, Elektro-Versengen) wurde für sechs Patienten (43%) empfohlen, und Behandlung mit einem örtlichen Mittel (z.B. Imiquimod) wurde für vier Patienten (29%) empfohlen. Drei Patienten benötigten keine weitere Behandlung.
Die Antworten schienen über 6 Monate fortschreitend zu sein, und kein Patient mit einer Antwort zeigte in diesem Zeitraum Rezidive. Graduelle und fortschreitende Auflösung eines Kondyloms ist in Übereinstimmung damit, was man von einer immunologischen Wirt-Antwort nach der Induktion von Zell-vermittelter Immunität durch HspE7 erwarten würde.
Zwei Patienten im Doppelblindversuch hatten eine gewisse Verbesserung in ihrem Kondylom, bevor sie in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung eintraten. Bis jetzt haben wir den Blindversuch nicht aufgedeckt und wissen nicht, ob diese Patienten 100 μg HspE7 oder ein Placebo erhielten. Basierend auf der Antwort, die im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung von drei monatlichen Injektionen von 500 μg HspE7 beobachtet wurde, scheint es jedoch, dass die höhere Dosis aktiver ist als 100 μg.
HPV-16-DNA wurde in Analabstrich-Proben von nur drei der 13 Patienten (23%), deren Warzen sich nach der Behandlung mit HspE7 besserten, nachgewiesen. DNA von HPV-6, HPV-11 oder beiden wurde in den meisten der Patienten nachgewiesen, deren Warzen auf die Behandlung mit HspE7 ansprachen. Diese Daten legen nahe, dass es eine immunologische Kreuzreaktivität zwischen diesen HPV-Typen in ihrer Antwort auf HspE7 gibt.
Zusammengefasst legen die hier dargelegten Ergebnisse nahe, dass HspE7 in Anogenitalwarzen allgemein aktiv ist. Diese Aktivität scheint nicht auf HPV-16-positive Patienten beschränkt zu sein, sondern es gibt eine Kreuzaktivität bei mehreren HPV-Typen. Es wird vorhergesagt, dass HspE7 in der Behandlung von HPV-induzierten Erkrankungen der anogenitalen Region aktiv sein wird und dass diese Aktivität nicht auf HPV-16-positive Patienten limitiert sein wird.
Die hier berichteten Beobachtungen legen nahe, dass eine therapeutische Behandlung mit HspE7 eine neue, einfache und nicht-chirurgische Behandlung für Anogenitalwarzen darstellen kann, die mindestens die Warzen-Belastung verringern würde, wodurch das Ausmaß der Behandlung und die resultierende Morbidität reduziert werden. Eine innere anorektale Erkrankung erfordert oft eine zusätzliche Behandlung, die ziemliche schmerzhaft und schwächend sein kann. Jegliche Behandlung, die sogar eine teilweise Antwort liefert, die die Menge oder das Ausmaß der „chirurgischen" oder entfernenden Therapie reduziert oder eliminiert, überträgt sich auf eine Reduktion der Morbidität, einen geringeren Verlust der Zeit weg von der Arbeit und eine verbesserte Lebensqualität.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Hitzeschockprotein/HPV-Typ 16-Antigen-Zusammensetzung wirksam im Eliminieren oder Reduzieren von Warzen ist, von denen angenommen wird, dass sie vorwiegend durch die HPV-Typen 6 und 11 verursacht werden. Von signifikanter Wichtigkeit sind die Beobachtungen, dass (1) Warzen überhaupt mit einer auf HPV basierenden Zusammensetzung behandelt werden können, und (2) eine HPV-Typ 16-Zusammensetzung wirksam in der Behandlung eines Zustands, der mutmaßlich durch ein anderes HPV als Typ 16 verursacht wurde, war. Das letztere kreuzreaktive Ergebnis war völlig unerwartet, angesichts der allgemein festgehaltenen Annahme, dass eine Typ-spezifische Zusammensetzung nur eine Typ-spezifische Immunantwort hervorrufen könnte.
Um einen möglichen Mechanismus für die beobachtete Kreuzreaktivität des Fusions-Polypeptids herauszufinden, wurde die theoretische Bindung für verschiedene HLA-Klasse 1-Moleküle und E7-Peptide der HPV-Typen 16, 6 und 11 berechnet. Die T_1/2 der Dissoziation wurde unter Verwendung des in Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994 beschriebenen Algorithmus berechnet (siehe auch die oben beschriebene Webseite). Die Daten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
TABELLE 4
Die fett-gedruckten Peptidsequenzen weisen auf die zwei Spitzenbindesequenzen für jedes HLA-Molekül und für jedes E7-Protein von jedem HPV-Typ hin.
Die Ergebnisse in Tabelle 4 legen nahe, dass abhängig vom untersuchten spezifischen HLA-Molekül das HPV-Typ 16-E7-Antigen eine Zell-vermittelte Immunantwort gegen das E7-Antigen von anderen HPV-Typen auslösen kann. Zum Beispiel wurde für HLA-B-2705 eine hoher Grad der Bindung für die Peptide, startend bei Aminosäureposition 76 von E7, für alle drei HPV-Typen vorhergesagt. Daher ist es für Patienten, die dieses HLA-Molekül exprimieren, möglich, dass eine HPV-Typ 16-E7-Zusammensetzung kreuzreaktiv und nützlich für die Behandlung oder Verhinderung einer Infektion durch die HPV-Typen 6 und 11 sein würde. Jedes der fett-gedruckten Peptid-Fragmente in Tabelle 4 repräsentiert ein mögliches antigenes Fragment, das in die Zusammensetzungen (z.B. die hierin beschriebenen Fusionspolypeptide) als ein Ersatz für das vollständige virale E7-Antigen eingeschlossen werden kann. Natürlich können auch zwei oder mehrere solcher mutmaßlichen HLA-Epitope oder ein langes Fragment, das viele mutmaßliche HLA-Epitope enthält, verwendet werden.

Claims

Verwendung eines Fusionsproteins, umfassend (1) ein Hitzeschockprotein (Hsp) oder ein immunstimulierendes Fragment davon, und (2) ein menschliches Papillomavirus(HPV)-Antigen, wobei das HPV-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von rezidivierender Atemwegspapillomatose in einem Patienten, der als an rezidivierender Atemwegspapillomatose leidend identifiziert wurde.
Verwendung einer Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, das (1) ein Hsp oder ein immunstimulierendes Fragment davon und (2) ein HPV-Antigen umfasst, wobei das HPV-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von rezidivierender Atemwegspapillomatose in einem Patienten, der als an rezidivierender Atemwegspapillomatose leidend identifiziert wurde.
Verwendung eines Fusionsproteins umfassend (1) ein Hsp oder ein immunstimulierendes Fragment davon und (2) ein HPV-Antigen, wobei das HPV-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes in einem Patienten, die/der verursacht wird durch eine Infektion mit einem HPV-Typ, welcher unterschiedlich zu dem HPV-Typ ist, aus welchem das HPV-E7-Protein oder das antigene Fragment davon abgeleitet wurde, wobei die Erkrankung oder der Zustand eine Warze, Fußsohlenwarzen, Gebärmutterhalskrebs, cervicale Dysplasie, Analkrebs, Analdysplasie oder rezidivierende Atemwegspapillomatose ist.
Verwendung einer Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, das (1) ein Hsp oder ein immunstimulierendes Fragment davon und (2) ein HPV-Antigen umfasst, wobei das HPV-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes in einem Patienten, die/der verursacht wird durch eine Infektion mit einem HPV-Typ, welcher unterschiedlich ist zu dem HPV-Typ, aus welchem das HPV-E7-Protein oder das antigene Fragment davon abgeleitet wurde, wobei die Erkrankung oder der Zustand eine Warze, Fußsohlenwarzen, Gebärmutterhalskrebs, cervicale Dysplasie, Analkrebs, Analdysplasie oder rezidivierende Atemwegspapillomatose ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Patient rezidivierende Atemwegspapillomatose hat, die mit HPV-Typ 6- oder mit HPV-Typ 11-Infektion in Zusammenhang steht.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Patient eine Warze auf einem inneren Organ oder den Stimmbändern hat.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die rezidivierende Atemwegspapillomatose juvenile rezidivierende Atemwegspapillomatose oder im Erwachsenenalter auftretende rezidivierende Atemwegspapillomatose ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die juvenile rezidivierende Atemwegspapillomatose juvenile Kehlkopfpapillomatose ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 3, wobei das Arzneimittel etwa 50 bis 5000 μg, 100–2000 μg oder 500 μg des Fusionsproteins enthält.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Arzneimittel frei von Zusatzstoffen ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Patient ein Säuger ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Hsp oder immunstimulatorische Fragment davon ein Hsp60, Hsp70 oder ein mycobakterielles Hsp-Protein oder immunstimulatorisches Fragment davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das mycobakterielle Hsp oder immunstimulatorische Fragment davon ein Mycobacterium bovis-Hsp oder ein mycobakterielles Hsp60-Protein oder immunstimulatorisches Fragment davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das HPV-E7-Protein oder antigene Fragment davon ein HPV-Typ 16-E7-Protein oder ein antigenes Fragment davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Hsp oder immunstimulatorische Fragment davon ein mycobakterielles Hsp60-Protein oder das Mycobacterium bovis-Bacille Calmette Guerin(BCG)-Hsp65 oder ein immunstimulierendes Fragment davon ist und das HPV E7-Protein oder antigene Fragment davon das HPV-Typ 16-E7-Protein oder ein antigenes Fragment davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei der Patient eine Erkrankung oder einen Zustand hat, der mit HPV-Typ 5-, 6-, 11-, 18-, 31-, 33-, 35-, 45-, 54-, 60- oder 70-Infektion in Zusammenhang steht.
Verwendung gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei der Patient eine Warze hat, die mit HPV-Typ 6- oder HPV-Typ 11-Infektion in Zusammenhang steht.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Warze eine Anogenitalwarze ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3, 4, 17 oder 18, wobei das HPV-E7-Protein oder antigene Fragment davon ein HPV-Typ 16-E7-Protein oder ein antigenes Fragment davon ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsprotein ein Hsp umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das Hsp ein Hsp60-Protein ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsprotein ein HPV-E7-Protein umfaßt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsprotein ein Hsp und ein HPV-E7-Protein umfaßt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsprotein ein Hsp60-Protein und ein HPV-Typ 16-E7-Protein umfaßt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsprotein das Mycobacterium bovis-Bacille Calmette Guerin (BCG) Hsp65-Protein und HPV-Typ 16-E7-Protein umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 4, wobei die Nucleinsäure in einem viralen Vektor enthalten ist.