CZ28899A3 - Polypeptidy použitelné jako imunoterapeutická činidla a způsoby přípravy polypeptidů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká preparátů polypeptidů HPV a jejich použití při profylaktické nebo terapeutické léčbě chronické infekce HPV. Způsoby přípravy těchto kombinací, které zahrnují metody čištění proteinů a manipulace sekvencí nukleové kyseliny metodami rekombinace DNA, za dosažení vysokého stupně účelem zesílení exprese nebo exprese určitého proteinu v heterogenních buňkách. Pro účely produkce proteinů lze zvláště použít bakteriální buňky E. coli, které tvoří další aspekt vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Lidské papilomaviry (HPV) jsou agens odpovídající za několik druhů benigních a maligních lézí, které se tvoří u lidi na kůži a na povrchu sliznic. Jde o geneticky odlišnou skupinu DNA virů, které infikují epiteliální tkáň a mohou způsobovat řadu různých lidských onemocnění. Na základě křížové hybridizace mezi genomy HPV se stanovilo přes 60 různých typů HPV. Jejich různé podskupiny se primárně spojují s různými typy onemocnění. HPV typu 1 a 2 atd. se například spojují s kožními bradavicemi na rukou a nohách. HPV typu 5 a 8 se spojují se vzácným onemocněním epidermodyspiasia verruciformis.

Genitální sliznici infikuje přibližně 20 typů HPV a mohou se na základě vážnosti onemocnění, s kterými jsou spojovány, rozdělit do dvou podskupin. První skupina zahrnuje viry, jako je HPV-β a HPV-11, které se spojují s většinou benigních kondylomů (bradavic), které zahrnují genitální bradavice. Druhá skupina zahrnuje HPV 16, 18, 31, 33 a 45, které se spojují s plochými bradavicemi na děložním čípku a mají • · · důležitou úlohu v maligní konverzi vedoucí ke zhoubnému bujení na děložním čípku (zur Hausen, Cancer Res, 49 (1989) pp 46774681).

Onemocnění spojované s HPV se obecně charakterizuje jako benigní proliferace epiteliální tkáně (bradavic) způsobená přímo virovou infekcí. Virus infikuje bazální buňky epitelu, které nejsou keratinizované, ale nemůže v těchto buňkách dokončit svůj celý replikační cyklus. Exprese virových genů se omezuje na sadu časných proteinů, které mohou indukovat proliferaci infikované buňky, přičemž vzniká charakteristická bradavice. procházej í

Infikované terminální keratinizovaného stádia.

buňky v horních vrstvách bradavice diferenciací a dosahují konečného Tato diferenciace je dostatečná, aby umožnila viru dokončit svůj replikační cyklus s produkcí virových proteinů a nových virových partikulí.

U těchto lézí, ačkoli proliferují, je malé nebezpečí maligní konverze a v mnoha případech bradavice zůstávají benigní. V některých případech se však buňky nesoucí HPV sekvence mohou během několika let stát tumorogenní. V tomto případě je zřejmé, že se pravděpodobně ztratí velká část virového genomu. Zbytková část genomu obvykle zahrnující virové geny E6 a E7 se integruje do genomu buňky. Tento vývoj zhoubného bujení se však primárně spojuje s omezenými typy HPV, jmenovitě HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45,_λa zvláště s tkáněmi děložním čípku nebo penisu.

Je známo, že imunitní systém může hrát úlohu při kontrole infekce HPV. Je dobře známo, že výskyt bradavic kůže indukovaných HPV a HPV-asociovaných onemocnění se zvyšuje u těch, kdo prochází imunosupresivní léčbou, což naznačuje, že u mnoha případů se virová infekce kontroluje imunulogickými mechanizmy. Dalším důkazem, který naznačuje kapacitu imunitního systému kontrolovat infekci HPV, pochází ze studie spontánní regrese bradavic. Běžně je možné pozorovat, že u některých jedinců, které mají genitální bradavice, bradavice • · náhle zmizí. Takové regresivní bradavice se podrobily histologickému vyšetření, které prokázalo podstatný příliv T lymfocytů do lézí. Věří se, že regrese je zprostředkovaná imunitním systémem.

Uvažuje se, že účinné imunitní odpovědí na infekce HPV jsou hlavně zprostředkované buňkami, protože onemocnění může u jedinců přetrvat, i když vykazují výskyt sérové protilátky proti HPV. Je však známo, že spontánní regrese bradavic je často doprovázena infiltrací lymfocytů, svěděním, začervenáním postižené oblasti a jinými symptomy, které charakterizují imunitní reakci zprostředkovanou buňkami. Infekce viry HPV se také často vyskytují u pacientů s oslabenou imunitou, kde přetrvávání virových onemocnění naznačuje slabý imunitní dozor.

Studie regrese onemocnění asociovaných s papilomaviry u vakcinovaných zvířecích modelů také podporuje předpoklad použití imunního činidla v boji proti tomuto onemocnění. Například tele vakcinované proti bovinním papilomavirům (BPV) produkovalo protilátky, které nejsou neutralizující. Dále se ukázalo, že vakcinace fúzním proteinem, který obsahuje sekvence BPV L2 a sekvence, které nepochází z HPV (betagalaktozidázu), produkuje u těchto zvířat jak profylaktickou tak i terapeutickou odezvu: (popisuje se v publikacích WO 93/00436 Cancer Research Campaign Technology Limited: Jarret et al., and Jarret et al., Virology, 184 (1991) pp 33-42).

Použití proteinů HPV, jako je Ll, L2, při přípravě vakcin se například popisuje v publikaci WO 93/02184 (Univ. Of Queesland & CLS Ltd: I Frazer et al: Papillomavirus vaccine). Jiné HPV proteiny se používají při imunodiagnostice, což se popisuje v publikacích WO 91/18294 (Medscand AB: J Dillner et al.: Synthetic peptides of various human papillomaviruses, for diagnostic immunoassay); a EP 0 375 555 (Medgenix: G De • ·

Martynoff et al.:Peptides, antibodies against them, and methods for detection and dosage of papilloma virus).

Publikace EP 0 456 197 (1991) (Behringwerkw: C Bleul et al.,) popisuje peptidy s jedním nebo více seroreaktivními epitopy definované sekvence proteinů El, E6 a E7 HPV18. Publikace EP 0 451 550 (1991) (Behringwerke: M Mueller et al.) popisuje peptidy s jedním nebo více seroreaktivními epitopy definované sekvence proteinů E4, E6, E7 nebo Ll HPV 16.

Popisuje se použití proteinů pro účelu skreeningových testů a také se zmiňuje použití za účelem vakcinace.

Publikace WO 93/00436 (Cancer Research Campaign Technology: WFH Jarrett et al.) popisuje použití papilomavirových proteinů a fragmentů, které se vztahují k proteinu L2, pro profylaxi a terapii papilomavirových nádorů, přičemž se také zmiňuje příprava proteinu E7.

Publikace WO 92/16636 (Immunology Ltd: MEG Boursnell et al.) popisuje genetické sekvence HPV16 a HPV18 E6 a E7, jako fúzované geny začleněné v rekombinantním virovém vektoru vakcinie, což způsobuje expresi in vivo antigenů po aplikaci živého virového vektoru.

Publikace WO 92/05248 (Bristol-Myers Squibb: EK Thomas et al.) popisuje materiál pro inhibici a testování papilomavirové infekce u lidí a transformaci buněk, přičemž se zmiňují rekombinantní buňky (zahrnující virové vektory), které obsahují gen kódující peptid, jenž podstatně odpovídá oblasti genového produktu E6 a/nebo E7 nebo chimérické peptidové látky jednoho nebo více oblastí proteinů HPV.

Publikace CP Crum et al., Virology 178 (1990) pp 238-246 popisuje expresi fúzované části sekvencí HPV-16 Ll a E4 a použití proteinů s Freundovým kompletním adjuvans při • · « • · · · · • ft · · · · imunizace králíků za účelem přípravy antiséra pro diagnostické a jiné testovací účely.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje fúzní polypeptidy a agregáty polypeptidů, které obsahují antigeny odvozené od papilomavirů, jak se zvláště popisuje déle v textu, a jejich kompozice a jejich použití pro účely imunizace a vakcinace, která vyvolává papilomavirus-specifické imunitní odpovědi.

Dále se popisují metody produkce a čištění takových polypeptidů a kompozic, jak se popisuje dále v textu.

Vynález popisuje polypeptidy a kompozice polypeptidů, které obsahují antigenní determinantu papilomavirového proteinu vyskytující se v agregované formě, která když je ve formě roztoku nebo disperze může projít sterilizačním filtrem, nebo se může vyskytovat v amorfní agregované formě.

Vynález dále popisuje fúzní polypeptidy, které kombinují antigeny získané z papilomavirů, například alespoň dva různé papilomavirové proteiny, které například zahrnují a) alespoň antigenní determinantu papilomavirového proteinu L2 a b) alespoň antigenní determinantu vybranou ze skupiny zahrnující papilomavirové proteiny El, E2, E4, E5, E6 a E7 a L2 papilomavirové proteiny odlišných typů, než se uvádí v odst. a). Další zde popsané fúzní polypeptidy zahrnují antigenní determinanty alespoň dvou papilomavirových proteinů vybraných ze skupiny zahrnující El, E2, E4, E5, E6 a E7, kde uvedené papilomavirové proteiny pochází z odlišných typů papilomavirů.

Zvláště preferované polypeptidy a jejich kompozice zahrnují antigenní determinanty lidských papilomavirových proteinů, například ze skupiny zahrnující HPV typ 6, 11, 16, 18. Mohou se také připravit a použít antigenní determinanty proteinů z jiných typů HPV a antigenní determinanty proteinů ze zvířecích papilomavirů.

Dále vynález popisuje například polypeptidy obsahující antigenní determinanty alespoň ze dvou různých proteinů HPV. Antigenní determinanta papilomavirového proteinu může být například reprezentována a produkována podle vynálezu, buď celou sekvencí papilomavirového proteinu nebo podle potřeby sub-sekvencemi, například fragmentem sekvence obsahující alespoň 25 % , například alespoň 50 % nebo 75 %, plné délky sekvence uvažovaného proteinu, například fragment C- nebo Nkonce sekvence. Sekvence se mohou získat z klinických izolátů papilomavirů nebo z publikovaných sekvencí nebo jejich muteinů.

Proteiny HPV, jejichž antigenní determinanty mohou tvořit část fúzního polypeptidu, se mohou vybrat například ze skupiny, která zahrnuje proteiny LI, L2, El, E2, E4, E5, E6 a E7. Mohou se použít proteiny například lidských papilomavirů typu HPV 6, 11, 16 a 18 stejně jako proteiny jiných typů lidských nebo zvířecích papilomavirů. Pak antigenní determinanty alespoň dvou papilomavirových proteinů mohou být například L2 a jiné proteiny a/nebo E7 a další.

U určitých příkladů polypeptid může obsahovat alespoň antigenní determinantu alespoň ze dvou různých papilomavirových proteinů a to ze stejných nebo různých papilomavirových typů. Například alespoň jeden z proteinů se může vybrat ze skupiny zahrnující LI nebo L2 a/nebo alespoň jeden z proteinů se může vybrat ze skupiny zahrnující El, E2, E4, E5, E6 a E7.

V určitých příkladech vynález popisuje polypeptid obsahující antigenní determinantu proteinu HPV L2 a antigenní determinantu proteinu HPV E7, dále je vhodné, aby obsahoval například v podstatě celou délku proteinu L2 a/nebo E7 lidských papilomavirů nebo jejich antigenní fragmenty nebo muteiny.

Fúzní protein zahrnující L2 a E7 proteiny HPV může obsahovat sekvenční fragment tvořící alespoň 50% celé sekvence • · · každého z proteinu L2 a E7, například celou sekvenci L2 a E7: běžně dále zahrnuje sekvenci proteinu LI.

Polypeptid může dále zahrnovat antigenní determinanty jiných HPV proteinů nebo je ve směsi s nebo tvoří agregát s jinými HPV proteiny nebo proteinovými fragmenty, jako je LI nebo jiný zástupce nebo zástupci série proteinů L nebo E kódovaných papilomaviry.

Polypeptid může obsahovat jediný protein, který zahrnuje fúzi L2 a E7 nebo fúzi L2, E7 a LI. V jiném případě polypeptid může obsahovat fúzi L2-E7 kombinovanou s proteinem LI, což je vhodné při profylaktické nebo terapeutické aplikací.

Polypeptid může obsahovat fúzní molekulu nebo může být odvozen od jednotlivých polypeptidu, které jsou spojeny nebo agregovány dohromady. Rozpustné nebo rozpuštěné formy polypeptidu spadají do vynálezu.

V jednotlivých provedeních vynálezu se může polypeptid spojovat známým způsobem, kterým je chemické síťování, například standardními způsoby zahrnující kovalentní spojení například s exponovanými tyrozinovými zbytky nebo s aminokyselinovou skupinou lyzinových zbytků v pozici epsilon nebo s karboxylovými skupinami aspartátových a glutamátových zbytků. Preferovaná provedení jsou však fúzní proteiny, které vznikají expresí polynukleotidové sekvence v rekombinantní hostitelské buňce, jejíž část kóduje část celé aminokyselinové sekvence prvního proteinu papilomaviru a jiná část kóduje část nebo celou aminokyselinovou sekvenci druhého proteinu papilomaviru.

Vynález zvláště popisuje například polypeptid obsahující antigenní determinantu každého z alespoň dvou různých papilomavirových proteinů vyskytující se v agregované formě, která je-li v roztoku nebo v disperzi může projít sterilizačním filtrem; například filtrem s velikostí pórů v rozmezí 0,16 až 0,22 mikronů, například 0,2 mikronů.

• · · ·

Je zřejmé, že vynález popisuje například polypeptid obsahující antigenní determinantu každého z alespoň ze dvou různých papilomavirových proteinů, například L2 nebo Ll a alespoň jeden další protein ze skupiny zahrnující Ll, L2, El, E2, E4, E6 a E7 v agregované formě, která když je v roztoku nebo v disperzi může procházet sterilizačním filtrem; například filtrem s velikostí pórů v rozmezí 0,16 až 0,22 mikronů, například 0,2 mikronů.

Vhodné formy přípravy jsou například denaturace nebo denaturace s redukcí, např. s následnou re-agregací polypeptidu, kterým může být fůzní protein nebo jiný papilomavirový protein, například jediný papilomavirový protein exprimovaný ve formě inkluzních tělísek v rekombinantní hostitelské buňce. Taková forma je výhodná, protože její způsob čištění v případě použití jako vakciny je jednoduchý.

Alternativní agregované přípravy polypeptidů není nutné za účelem sterilizace filtrovat a mohou se připravit a čistit aseptickým způsobem.

Zde popsané agregované a re-agregované polypeptidy vykazují molekulové hmotnosti například v rozmezí okolo 100 000, například 160 000 až 10 000 000. Molekulová váha dimeru L2E7 je okolo 130 000. Agregáty mohou mít například průměr v rozmezí okolo 4 až 50 nm, například 10 až 15 nm, jak se zjistilo elektronovou mikroskopií.

Například polypeptid, který se detailně popisuje v příkladech vynálezu déle v textu obsahuje agregovaný fůzní polypeptid L2E7 obsahující agregáty o molekulové hmotnosti 500 000, přičemž jejich průměr zjištěný elektronovou mikroskopií je přibližně 10 až 15 nm nebo 15 až 20 nm, kdy agregát tvoří okolo 7 až 10, například okolo 8, řetězců fúzního polypeptidu L2E7. Produkt může mít okolo 2 až 200, například 5 až 50 řetězců v agregované partikul! a přípravky agregátu mohou obsahovat partikule, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí • · · • · · · • · ······ kompozice. Vhodné re-agregace se dosáhne například pomalým nebo postupným odstraňováním močoviny a působením činidla redukujícího thiol (často například dithiothreitol nebo jiného přijatelného činidla redukujícího thiol, jako je glutathion) při denaturované a redukované přípravě fúzního polypeptidu v močovině (např. přibližně 8 M močovina) a při působení činidla redukujícího thiol, což je například přibližně 10 mM dithiotreitol (upřednostňuje se, aby se koncentrace reagregátovaném produktu snížila na hodnotu okolo 0,1 mM nebo nižší, například okolo 0,04 mM nebo méně). Takové postupné odstranění se může například provést kolonovou chromatografii popsanou dále v textu. Denaturovaný a redukovaný přípravek fúzního polypeptidu je možné získat například rozpuštěním v močovině a v činidle redukujícím thiol nebo jako nerozpustná inkluzní tělíska produkovaná expresí polypeptidů v systému E. coli T7.

Takové agregované rozpustné nebo dispergované produkty jsou často amorfní, může jim chybět protein LI a i jinak se odlišují od partikul! podobných virovým partikulím založených na papilomavirovém proteinu LI (a někdy zahrnují jiné papilomavirové proteiny), jak se potvrzuje výsledek exprese genů HPV (zahrnující Ll) v systémech, jako jsou například rekombinantní bakuloviry ve hmyzích buňkách nebo v buňkách kvasinek. U partikul! podobných virům polypeptidy neprocházejí rozpouštěcí denaturaci a redukcí thiolu následovanou reagregací.

Shora zmiňované polypeptidy je možné připravovat za použití metod rekombinace DNA. Vynález také popisuje nukleové kyseliny, které kódují shora zmiňované polypeptidy, klónovací a expresivní vektory, které je zahrnují, a jejich části a transfekované a transdukované hostitelské buňky, které obsahují uvedené nukleové kyseliny a jsou schopny je exprimovat ve formě proteinu. V preferovaném příkladu nukleová kyselina obsahuje fúzní gen, který obsahuje například geny L2 a E7 izolované například z ízolátu HPV-6 získaného z klinického specie genitální bradavice.

Upřednostňuje se, aby se shora popsané polypeptidy připravovaly expresí nukleové kyseliny v prokaryontním nebo eukaryontním hostiteli za použití metod rekombinace DNA.

Nukleová kyselina, která kóduje požadovaný polypeptid se začlenila do vhodného vektorového systému jako vhodný otevřený čtecí rámec s libovolnými připojenými sekvencemi, které umožňují její expresi ve vybraném systému. Hostitelská buňka se transformuje vektorem. Transformované hostitelské buňky se pak kultivují a z kultury se izoluje požadovaný peptid a to buď ze supernatantu nebo z buněk, jak se uvádí v příkladech dále v textu. Shora uvedené vektory stejně jako transformované hostitelské buňky tvoří další předmět vynálezu.

Popisovaná exprese polypeptidů se testovala na kvasinkách a v bakulovirových expresivních systémech, které se zmiňují shora v textu a které umožňují expresi genů získaných z HPV. Zjistilo se, že v obou případech je možné dosáhnout exprese molekuly v celé délce, ale síla exprese je někdy nižší. V současné době se preferuje, za účelem optimalizace síly exprese, použít prokaryontní hostitelský expresivní systém (zvláště systém E. coli T7), spíše než dva testované eukaryontní systémy (kvasinky a bakuloviry).

Zde popsané imunogenní polypeptidy a vakcinové kompozice se používají k vyvolání imunitní odpovědi specifické pro HPV, například jako vakciny pro profylaxi nebo terapii stavů spojených s papilomaviry. Imunogeny, například imunoterapeutické nebo profylaktické vakciny vhodné pro použití při profylaxi nebo léčbě onemocnění spojených s HPV, se mohou použít při vyvolání imunitní odpovědi u pacientů, například odpovědi zahrnující buněčnou imunitu, která je schopná zprostředkovat regresi chronických infekcí HPV. Sem • · • ·

• * · · · · · • · · · « · · · • ······ ··· ·· · • · · · · ·· · ·· ·· patří genitální bradavice (zvláště v případě, že produkty a infekce jsou spojeny s HPV typu 6 a/nebo 11) nebo intraepiteliální neoplázie cervixu (zvláště v případě, že produkty a infekce jsou spojeny s HPV typu 16 a/nebo 18) . Taková imunitní odpověď může směřovat na T-buňky, například buňky CD4+.

Vynález dále popisuje způsob prevence nebo léčby infekce HPV nebo lézí spojených s tímto virem, přičemž uvedené metody zahrnují, jak se zde popisuje, aplikaci účinného množství polypeptidu pacientovi.

Provedení podle vynálezu zahrnují vakcinační přípravky založené na polypeptidech podle vynálezu, které vzhledem ke své specifitě jsou vhodné při použití k vyvolání imunitní odpovědi proti papilomavirům, zvláště například proti papilomavirům typu HPV 6 a 11 a HPV 16 a 18, při použití pro profylaxi a terapii genitálních bradavic u lidí a intraepiteliální neoplázie cervixu.

Pozorovala se zkřížená reaktivita mezi HPV různých typů. Vzhledem k této pozorovatelné křížové reaktivitě se polypeptidy a vakciny mohou použít při vyvolání imunitní odpovědi proti papilomavirům jiného typu než jsou typy, ze kterých se odvodily.

Vynález popisuje imunogenní kompozice polypeptidů podle vynálezu, které jsou vhodné pro aplikaci injekcí a zahrnují nosič jako imunologické adjuvans. V určitých preferovaných příkladech adjuvans obsahuje hydroxid hlinitý a/nebo monofosforyllipid A, jak se popisuje dále v textu.

Takové imunogenní kompozice, které je možno aplikovat jako terapeutickou nebo profylaktickou vakcínu u lidí nebo u zvířat, může obsahovat absorpční komplex zahrnující „alum (to znamená hydroxid hlinitý obvykle Alhydrogel (™) nebo Rehydrogel (™) , což se běžně používá jako vakcinační adjuvans) , na kterém je adsorbovaný polypeptid podle vynálezu.

• ·

Adsorpční komplex může být binární komplex, který obsahuje alum a polypeptid nebo další koňštítuentv, například MPL, jak se popisuje dále v textu, tvořící ternární komplex MPL, alum a polypeptid.

Rozpustný polypeptid nebo polypeptid ve formě agregátů se může použít jako vakcína přímo nebo se může aplikovat jako farmaceutická kompozice, jenž obsahuje také farmaceuticky přijatelný vehikl, pufr, adjuvans nebo jiný přijatelný materiál. Protože vynález dále popisuje vakcínu nebo farmaceutickou kompozici, která obsahuje polypeptid podle vynálezu v kombinaci s vhodným nosičem nebo ekcipientem.

Polypeptidem může být buď rozpustný monomer například L2E7 nebo polypeptidový agregát. Upřednostňuje se, aby se polypeptid, například fúzní protein L2E7, připravil kombinací s adjuvans nebo s jinou připojenou látkou, jako je molekula imunostimulátoru, za účelem zesílení terapeutického účinku polypeptidu nebo stimulace preferovaného typu imunitní odpovědi u recipienta. Použitelné adjuvans zahrnuje, ale neomezuje se na hydroxid hlinitý („alum), například ve formě Alhydrogelu (™) nebo Rehydrogelu (™) ; 3D-MPL (3-deacylovaný monofosforyllipid A) , jak se například popisuje v patentu US č. 4,912,094 (Ríbí Immunochem Research: KR Myers and AT Truchot, kde se popisuje adjuvans založené na modifikovaném lípopolysacharidu, de-3-0-acylmonofosforyllipidu A) , který se může aplikovat způsobem popsaným v publikacích US patent č. 4,912,094 nebo WO 94/21292 (Smithkline Beecham: P. Hauser et al: zde se popisuje vakcinační kompozice obsahující 3-0deacylovaný monofosforyllipid A) . V případě, že se používá alum a MPL, protein se přednostně adsorbuje na alum a MPL se přidá později. Použitelné jsou také diestery trehalosy, jako je dimycolat trehalosy; saponiny a jejích deriváty, jako je Quil A nebo QS-21, které se popisují v publikacích WO 88/09336 (Cambridge Bioscience: CA Kensíl et al, kde se popisuje saponinové adjuvans) a WO 93/05789 (Cambridge Biotech: CA ft ftftftft • · 4 ftft • ft ftft > · · 4 » ftft 4

Kensil et al., kde se popisují konjugáty saponin-antigen); ISCOMS nebo ISCOMS matrice, jak se popisuje v publikacích WO 90/03184 (B. Morein et al., kde se popisuje matrice ISCOM, které vykazují imunomodulační aktivitu a obsahuje lipid a někdy také adjuvans) a WO 92/21331 (Kabi Pharmacia AB: B. Morein et al., kde se popisují farmaceutické nosiče obsahující sterol a saponin); nebo muramyldipeptid nebo B toxin cholery. Další připojené nebo imunostimulační molekuly použitelné v tomto spojení zahrnují cytokiny, jako jsou interleukiny, například GM-SCF, IL-3, IL-2, IL-12 a IL-7 . Taková adjuvans a/nebo připojení látky se mohou použít odděleně nebo v kombinaci podle potřeby.

Zde popisované farmaceutické kompozice, jako jsou vakcíny, se připravují například ve formě emulze v přijatelném minerálním a/nebo uhlíkatém oleji, který zahrnuje, ale není omezen na squalen, nebo biologicky rozložitelné minerální oleje, jak se popisuje v publikacích WO 91/00106 a WO 91/00107 (SEPPIC: B. Brancq et al., kde se popisuje injektovatelné multifázové emulze a emulzní vektory s kontinuální olejovou fází); a nebo ve formě kapsulí, které vznikají například kapsulizací biologicky rozložitelných mikropartikulí nebo lipozómů nebo neiontových povrchově aktivních vehiklů. Tyto metody se popisují například v publikacích WO 94/27718 (DT O'Hagan et al., kde se popisují mikropartikule obsahující zachycené antigeny a jejich použití při imunizaci) a WO 93/19781 (PCT/GB93/00716) (Próteus Molecular Design: J. Alexander et al., popisují se vakcíny obsahující neiontová povrchově aktivní činidla se zachyceným antigenem.).

Polypeptidy se mohou využívat pro účely terapie a profylaxe. Způsoby a postupy aplikace zahrnují, ale nejsou omezeny na standardní intramuskulární, podkožní, intradermální, intravenózní, orální nebo rektální cesty.

Množství aplikovaného polypeptidů se zvolí v závislosti na formulaci a léčenému stavu. Obecně lze očekávat, že dávky se • · • · ·· · · · ···· • · * · · ···· • · · · ···· · ··· ··· • · · · · · ····· ·· · · · ·· pohybují mezi hodnotami 1 až 2 000 μς proteinu, upřednostňuje se 10 až 300 μ9, například 10 až 250 μς. Optimální množství je snadno stanovitelné. Jedna nebo více dávek vakciny se může aplikovat opakovaně v časových intervalech (popisuje se například v příkladu 13) . Tento režim se může snadno optimalizovat.

V jiném případě nukleová kyselina kódující uvedený polypeptid se může začlenit do vhodného rekombinantního virového vektoru a zavést do hostitelského organizmu, jako je člověk tak, aby expresí nukleové kyseliny vznikl polypeptid in šitu. Příklady virů, které jsou vhodné jako základ rekombinantních virových vektorů, jsou například viry popisující se v publikacích WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al.) a WO 92/16636 (Immunology Ltd: MEG Boursnell et al., ) .

Zde popsané vakciny obsahující polypeptidy odvozené od HPV mohou aktivovat rozsáhlou imunitní odpověď specifickou pro HPV. Takové imunitní odpovědi mohou zahrnovat specifické protilátky zahrnující protilátky neutralizující HPV6 a HPV11, buňkami zprostředkovanou imunitu zahrnující lymfoproliferační odpověď specifickou pro HPV6 a HPV11, opožděný typ odpovědi hypersenzitivity, cytotoxické T buňky a produkci cytokinů.

Za účelem přípravy vhodného vektoru pro expresi polypeptidů podle vynálezu se může použít metoda, která umožňuje dosažení vysoké exprese určitého polypeptidů v heterogenních buňkách, zvláště v bakteriálních buňkách E. coli.

Vynález dále popisuje způsob přípravy rekombinantního polypeptidů, přičemž dochází k expresi sekvence nukleové kyseliny v bakteriální buňce. Sekvence kóduje požadovaný polypeptid, ale je mutována tak, že kodony a skupiny kočonů, které způsobují předčasnou terminaci transkripce nebo translace se mohou nahradit degenerovanými kodony.

9

9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 ···· « 999 999 9 9 9 9 9 f ,

999 9999 ·· « ,,

Zjistilo se, že v případě expresivního systému T7 v bakteriích E. coli se může výskytu předčasné terminace transkripce nebo translace předejít nebo se může redukovat odstraněním alespoň jedné poly-T sekvence, jako je [TTT]n, kde n jsou 2 nebo více. Taková sekvence se může nahradit přijatelnou alternativou, např. sekvencí [TTC]n, která kóduje stejné aminokyseliny, což vede k vysokému výtěžku požadovaného polypeptidu.

V bakteriálních expresivních systémech, jako je systém T7, se rekombinantní polypeptidy v buňkách vyskytují ve formě nerozpustných agregátů nebo inkluzních tělísek (IB) . Metoda pro získání uvedeného rekombinantního polypeptidu se upravila.

Vynález dále popisuje metodu izolace rekombinantního polypeptidu z inkluzních tělísek v prckaryontní hostitelské buňce. Suspenze obsahující uvedené inkluzní tělíska s nežádoucím materiálem (např. odpad z rozbitých buněk) projdou filtrací s příčným tokem a z inkluzních tělísek se separuje rekombinantní polypeptid. Tato metoda kombinuje separaci inkluzních tělísek přítomných v buněčném homogenátu a buněčného odpadu a ve stejném okamžiku jejich promytí, přičemž se dosáhlo použitelného stupně čištění.

Pří preferovaném provedení uvedeného postupu se separovaná inkluzní tělíska v podstatě rozpouštějí in šitu a polypeptid se získá z roztoku. Příklady rozpouštěcích činidel zahrnují močovinu a směs močoviny a dithiotreitolu nebo jiného činidla redukujícího sulfydryl, například v přibližné koncentraci 8 M až 10 M.

Je zvláště výhodné přefiltrovat surovou suspenzi, která je výsledkem rozbití buněk obsahujících požadovaný exprimovaný polypeptid ve formě inkluzních tělísek, na filtraci s příčným tokem ve dvou fázích, které probíhají na stejném filtračním přístrojí. V první fázi požadovaná inkluzní tělíska zůstávají v nerozpuštěné formě na filtru a promývají se. Ve druhé fázi uvedená inkluzní tělíska přicházejí do kontaktu s rozpouštěcí • ·« ·· · ·· ·· •« · · 4 · · 4 · 4 · • · 4 4 4 4 4 4 4 4 • «44« 44 44 · 444 «44 • · · 4 4 9 9

999 9999 99 9 99 9· kapalinou a hromadí se ve filtrátu uvedené kapaliny (například to může být 8 až 10 M močovina s činidlem redukujícím sulfydryl, jako je dithiothreitol). Pak obvykle následuje odstranění rozpouštědla a re-agregace.

Zvláštní příklad proteinového preparátu podle vynálezu bude zahrnovat fúzní protein obsahující proteiny L2E7 odvozené od HPV-6. Je vhodné protein exprimovat v buňkách bakterie E. coli, čistit ho do dosažení homogenity a pak ho formulovat s adjuvans, například alum. Přípravek se používá při léčbě genitálních bradavic a formuluje se tak, že je ve formě vhodné pro aplikací pacientovi parenterální Injekcí.

Izolovaly se geny viru HPV, zvláště geny viru HPV-6 LI, L2 a E7. Genové sekvence se použily, jak se zde popisuje, pro konstrukci genových fúzí pro silnou expresi proteinů HPV 6 v prokaryontních a eukaryontních systémech.

Pro účely exprese shora popsaných polypeptidů, jako jsou L2 a E7 HPV-6 ve formě jednoho fúzního proteinu v bakterii E. coli, se zkonstruovaly plazmidové veknory.

Geny viru HPV-6 se amplifikovaly polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) ze vzorku virové EVA, která se připravila z jednoho klinického izolátu tkáně bradavice infikované HPV-6. Izolované geny se používaly ke konsurukci genové fúzní kazety pro expresi proteinu odvozeného cd HPV 6 v heterogenním systému.

Za účelem zlepšení procesu produkce se provedla řada modifikací genové konstrukce. Zvláště použitelné modifikace jsou následující:

1. Zavedení vedoucí sekvence (vedoucí sekvence „pelB) na

N konec kódované proteinové sekvence za účelem zesílení exprese proteinu v buňkách E. coli (ale exprese se nesměřuje do periplazmy).

·· *· * ·· ··

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9999 9 999 999

2. Zavedení sekvence („His-Tag) na C konec kódované proteinové sekvence za účelem umožnění čištění proteinu metal-chelatační chromatografii.

3. Mutace řady tymidinových zbytků za účelem odstranění sekvencí, které způsobují předčasnou terminaci transkripce fúzního genu. Mutace ovlivňuje pouze sekvenci DNA genové konstrukce, ale neovlivňuje sekvenci kódovaného proteinu, pak zahrnuje mutaci degenerované třetí pozice v kodonu.

Konstrukce se testovaly transkripcí a translací proteinových otevřených čtecích rámců in vitro. V případě fúzního proteinu L2E7 HPV-6, jestliže se pro expresi in vitro použila genová fúzní konstrukce HPV-6 L2E7, vzniká jak celý protein (s molekulovou hmotností 80 000), tak zkrácený proteinový produkt (s molekulovou hmotností 70 000); tento patern se opakoval in vivo. Výskyt zkrácené formy cílového proteinu koreluje s přítomností sekvence HPV-6 L2 tymidinových (T) zbytků. Také se identifikovala druhá oblast bohatá na T obsahující 6 tymidinových zbytků. Tyto oblasti se také podrobily mutagenezi in vitro za použití oligonukleotidů, které pozměňují sekvenci DNA, ale nepozměňují aminokyselinovou sekvenci proteinu HPV-6 L2. Mutovaná genová fúze HPV-6 L2E7 se subklónovala do plazmidového expresivního vektoru, který umožňuje expresi klonovaných sekvencí z promotoru bakteriofága T7 (expresivní systém pET, Novagen). Získala se plazmidová konstrukce označená pGW53, vhodná pro expresi HPV-6 L2E7, která upstream zahrnuje vedoucí sekvenci, pelB, HPV-6 L2E7 ORF a downstream sekvenci kódující 6 histidinových zbytků (His Tag) „v rámci s C-koncem HPV-6 fúzního proteinu.

Zde popsané genové konstrukce se začlenily do expresivního systému optimalizovaného pro silnou expresi heterogenních proteinů v bakteriálních buňkách E. coli. Tento expresivní systém je založen na růstu bakteriálních buněk E. coli až do • · dosažení určité hustoty, pak následuje v buňkách indukce T7 polymerázy, která vede k silné transkripci genové konstrukce.

Proteinový produkt se pak exprimoval a akumuloval v inkluzních tělískách uvnitř buněk bakterií E. coli. Následuje shromáždění buněk, protein se oddělil od ostatních bakteriálních proteinů a připravil se jako rozpuštěný proteinový extrakt. Tento proteinový extrakt obsahuje agregát proteinových molekul s vysokou molekulovou hmotností, které jsou rozpuštěny ve vodném roztoku.

Takto získaný izolovaný protein se může použít jako základ terapeutického antigenního produktu zvláště pro účely léčby genitálních bradavic.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena nukleotidová sekvence vektoru exprimující fúzní protein HPV L2E7 podle vynálezu.

Obrázky č. la a lb zobrazují sekvence vektoru, který nese počáteční kodon a následující terminační kodon.

Obrázek č. 2 ukazuje odpovídající aminokyselinovou sekvenci; a

Obrázek č. 3 ukazuje postup čištění proteinu za účelem použití podle vynálezu při čištění fúzního proteinu L2E7 zobrazeného na obrázcích 1 a 2.

Obrázky č. 1 až 2:

Sekvenční data na obrázcích č. 1 a 2 indikují bez omezení nukleotidovou a kódovanou aminokyselinovou sekvenci preferovaného příkladu fúzního proteinu L2E7 produkovaného zde popsaným způsobem, který zahrnuje „upstream vedoucí sekvenci a „downstream tag sekvenci. Vedoucí sekvence stejně jako tag sekvence (aa 591 až 601) se mohou, je-li to nutné, vypustit. Obrázky č. la a lb ukazují nekódující sekvence v preferovaném ♦ ·

T7 expresivním vektoru, který znázorňuje počáteční kodon a následný termináční kodon.

Obrázek č. 2 ukazuje sekvenci preferovaného fúzního proteinu L2 a E7. V DNA sekvenci s 1 827 páry baží pozice 7 až 1 812 (zahrnuje termináční kodon) kóduje fúzní protein L2E7 a tag. Zjistilo se, že oblastí sekvencí odpovídající L2 a E7 na obrázcích č. 1 až 2 mají inkorporováno několik rozdílů ve srovnání s publikovanými separovanými aminokyselinovými sekvencemi L2 a E7. Rozdíly jsou následující (nejdříve se uvádí číslo aminokyselinového zbytku v sekvenci na obrázcích č. 1 až 2 a pak (odlišná) aminokyselina v odpovídající pozici publikované sekvence):

105 Gly v publikované sekvenci byl Gin; 215 Ile byl Val; 230 Ile byl Val; 373 Glu byl Asp; 381 Lys byl Glu; 386 Asp byl Gly; 422 Ile byl Leu; 544 Tyr byl Phe.

Navíc se v polynukleotidové sekvenci zjistilo několik „tichých rozdílů, to znamená rozdílů, které nevedou k žádným odlišnostem v překládané aminokyselinové sekvenci. Těmto rozdílům se vzhledem k vynálezu nepřikládá podstatný význam. Dvě tiché mutace z počáteční sekvence TTTTTT _na sekvenci TTCTTC, které vznikly z důvodů popsaných v předchozím textu se nacházejí v pozicích aminokyselin 83 az 4 a 483 až 4.

Fúzní protein exprimovaný ve shodě s publikovanými sekvencemi a inkorporovaný ve zde popsaných kompozicích bude vykazovat silnou křížovou reaktivitu s preferovaným fúzním proteinem L2E7, který je zobrazen na obrázcích č. 1 a 2 a bude vyvolávat podobnou a silně křížově reaktivní imunitní odpověď.

Funkčně podobný budou také fúzní proteiny L2E7 odvozené ze sekvencí jiných klinických izolátů HPV: Takové další izoláty z klinického prostředí mohou mít rozdíly v sekvenci ve srovnání se zde popsanými sekvencemi, ale ty se nepokládají vzhledem k vynálezu za podstatné. Je-li to nutné rozdíly nalezené v určitém klinickém izolátu se mohou jednoduše • · • · eliminovat; například místně specifickou mutagenezí z nich připravených odpovídájicích klónovacích vektorů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Amplifikace a klonování HPV-6 genů

DNA viru typu HPV v infikované tkáni se původně odvodila pomocí PCR za použití metody založené na modifikaci způsobu popsaného v publikaci Snijders et al., 1990, Journal of General Virology, 71: pp. 173-191 se standardními primery pro HPV-6.

Geny LI, L2 a E7 HPV-6 se amplif ikovaly polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) ze vzorku virové DNA připravené z jednoho klinického izolátu (H26), který se vybral jako základ pro vývoj terapeutické entity na základě jednoduchosti izolace genů. Identita klinického izolátu není důležité a každý klinický izolát HPV-6 bude prakticky ekvivalentní, ne-li identický. Počáteční PCR se provedla za použití Taq DNA polymerázy. Při PCR reakcích se použily oligonukleotidové primery kódované 24 nukleotidy s přesnou homologií s genovou sekvencí. Dalšími nukleotidy byly ty, které kódují místa rozeznávaná restrikčním enzymem, nebo se přidaly nukleotidy, aby se udržel čtecí rámec mezi konečnými genovými fúzemi nebo aby se do konečných expresívních konstrukcí zavedly terminační kodony. Příklad používaného oligonukleotidů je následující: JPC08 CAGTGTCGACGGTCTTCGGTGCGGCAGATGGGACA SEQ ID NO: 1

Jde o oligonukleotidový primer nekódujícího řetězce pro amplifikaci genu E7 HPV 7 a restrikčního místa Sall pro přímé klonování.

Jednotlivé produkty PCR vzniklé při amplifikaci genů LI, L2 a E7 se použily jako templátové DNA při sekvenačních reakcích za účelem vzniku obecné sekvence pro každý ze tří uvedených genů. Přijal se konsensus sekvence DNA, kterým je přesný odraz aktuálních sekvencí DNA genů v extraktech virové DNA, protože jde o sekvenci generovanou z mnoha jednotlivých templátových molekul.

Gen L2 HPV-6 se amplifikoval pomocí PCR z HPV-6 virové DNA za vzniku jediného produktu, který je tvořen 1 400 bp. Produkt se izoloval z agarózy a použil se jako templát pro analýzu sekvence DNA. Obecná sekvence pro amplifikovaný gen L2 vznikla použitím oligonukleotidových primerů.

Izolovaný produkt L2 se přímo subklónoval do vektoru pGEMT za vzniku plazmidů pGW12. Celá sekvence DNA subklónovaného genu L2 se vytvořila z templářové DNA pGW12 za použití stejných oligonukleotidových primerů, jako je tomu u obecné sekvence. Ukázalo se, že sekvence DNA klonovaného genu L2 je shodná s obecnou sekvencí. Gen HPV-6 E7 se amplifikoval pomocí PCR z HPV-6 virové DNA, jako jediný produkt, který tvoří přibližně 300 bp. Ten se izoloval z agarozy a použil se jako templát při analýze sekvence DNA. Obecná sekvence amplifikovaného genu se vytvořila za použití oligonukleotidových primerů.

Izolovaný produkt PCR E7 se přímo subklónoval do vektoru pGEM-T za vzniku plazmidů pGW04. Celá sekvence DNA subklónovaného genu E7 se připravila z templátu pGW04 za použití stejných oligonukleotidových primerů jako u obecné sekvence. Ukázalo se, že sekvence klonovaného genu E7 je stejná jako obecná sekvence.

Gen HPV-6 Li se amplifikoval pomocí PCR z viru HPV-6 za vzniku jediného produktu, který tvoří přibližně 1 500 bp. Tento produkt se izoloval z agarozy a použil se jako templát pro analýzu sekvence DNA. Konsensus sekvence amplifikovaného genu vznikl a použití oligonukleotidových primerů.

• ·

Izolovaný produkt PCR LI se přímo subklónoval do vektoru pGEM-T za vzniku plazmidu pGW-A. Celá sekvence DNA subklónovaného genu LI se připravila z templátu pGW-A za použití stejných oligonukleotidových primerů jako u obecné sekvence. Ukázalo se, že sekvence klonovaného genu E7 je stejná jako obecná sekvence.

Produkty PCR se izolovaly z agarozových gelů navázáním na matrici oxidu křemičitého a ligovaly se do DNA vektoru pGEM-T. Produkty těchto ligačních reakcí se použily k transformaci buněk DH5a bakterie E. coli. Izolovaly se rekombinantní klony a dále se testovala přítomnost správných genových inzertů HPV6 pomocí metod založených na PCR.

Získaly se sekvence DNA klonovaných genů HPV-6 L2 a E7 a porovnaly se s obecnou sekvencí připravenou přímo z původních produktů PCR. Klony jejichž sekvence souhlasí s konsensusem sekvence se použily pro konstrukci expresivních kazet rekombinantních proteinů.

Příklad 2: Srovnání sekvencí HPV-6 s databází EMBL

Konsensus sekvence se porovnal se sekvencí příbuzné typům HPV, kam patří HPV-11, HPV-16 a HPV-18 stejně jako publikovaná sekvence HPV-ob z databáze DNA instituce „European Molecular Biology Laboratory (EMBL), aby se potvrdilo, že amplifikované geny pochází z viru typu HPV-6.

Srovnání se provedlo za pomoci software Lasergene Navigátor (DNAStarlnc.) použitím programů EditSeq, SeqMan, Megalign a Protean. Porovnání proběhlo na úrovni DNA a s předpovídanými aminokyselinovými sekvencemi tří genů.

Tato analýza ukazuje, že amplifikované geny L2, LI a E7 se odvodily z viru typu HPV-6. Výsledky ukazují, že ačkoli genová • · · · ···· · ··· ··· • · · · · · · ······· ·· · ·· ·· sekvence je vysoce konzervativní, zjistila se řada odchylek od předpovězené sekvence.

Uvažuje se, že konstrukce vhodné pro použití podle vynálezu se mohou připravit na základě DNA z klinických izolátů HPV divokého typu.

Příklad 3: Konstrukce expresivní kazety

Za účelem vytvoření fúzní molekuly se sestavily jednotlivé geny pro L2 a E7 následujícím způsobem: Oba geny L2 a E7 se klonovaly amplifikaci PCR tak, aby se zavedly nové N- a Cterminální místa, které rozeznávají restrikční enzymy, přičemž je nutné udržet integritu sekvence proteinu. Sekvence těchto genů se pak společně ligovaly do klonovacího vektoru za použití standardních metod rekombinace DNA; vznikl fúzní gen L2E7 tak, že se uchoval otevřený čtecí rámec dvou sekvencí.

Fúzní gen L2E7 se konstruoval následujícím způsobem.

Gen HPV-6 L2 se zpočátku vytvořil jako PCR fragment o velikosti 1,1 kb sousedící s restrikčními místy BamHI a Ncol. Uvedený PCR fragment se subklónoval do klonovacího vektoru pGEM-T. Klony vykazující požadovaný inzert se štěpily dvěma restrikčními enzymy za účelem uvolnění genu L2, který se pak separoval na agarozovém gelu. Následovala extrakce do skelného mléka. Podobně se vytvořil gen HPV-6 E7, kterým je 300 bp velký fragment Ncol-Sall subklónovaný do pGEM-T. Tyto dva genové fragmenty se spolu spojily ligaci za vzniku BamHI -

Sall DNA fragmentu protein L2E7.	0	velikosti 1,4 kb,	který	kóduje fúzní
Výsledný fragment	DNA BamHI-SalI	se pak	ligoval do
derivátu pET16b,	což	je klonovací	vektor	nesoucí gen

rezistence na kanamycin. Tento vektor neumožňuje expresi.

Výsledná konstrukce se nazvala pGW48. Genová fúze L2E7 se • · následně přenesla do expresivního vektoru pET za účelem analýzy exprese proteinu v E. coli.

Následuje analýza exprese fúzního genu v E. coli. Mutace genu se uskutečnila popisovaným způsobem za účelem eliminace řady T zbytků, o kterých se předpokládá, ze způsobují předčasné ukončení transkripce.

Fúzní gen L2E7 se pak modifikoval PCR za vzniku konců BamHI a Notl, které umožňují inzerci genové kazety do expresivního vektoru, který obsahuje na 5'konci rámce vedoucí sekvenci pelB a na 3'konci rámce sekvenci His Tag. PCR fragment se klonoval prostřednictvím vektoru pGEM-T do vektoru pET odvozeného z pET22b. Tento konečný produkt se nazval pGW53.

Fúzní konstrukce se přenesla do série prokaryontních expresivních vektorů, které jsou známy jako vektory pET. Tyto dobře známé vektory obsahují silné transkripčni a translační signály bakteriofága T7. Exprese se pak může indukovat tím, že se v hostitelské buňce zprostředkuje zdroj T7 RNA polymerázy. Expresi řídí indukovatelný promotor lacUV5. Působení indukčního činidla IPTG vede k expresi cílového genu. Požadovaný produkt pak může tvořit více než 50 % celkového buněčného proteinu. Protože však systém je indukovatelný sekvence cílového genu se může držet před indukcí ve stádiu, kdy nedochází k transkripci. Pak následuje exprese genových sekvencí, které jsou pro hostitelskou buňku potencionálně toxické.

Přidání IPTG k rychle rostoucí kultuře buněk transformovaných vektorem pET, který obsahuje cílový gen, proto vede k indukci enzymu polymerázy a k expresi klonovaného genu. Proteinový produkt může být buď vylučován nebo v případě genových produktů HPV je ve formě inkluzních tělísek.

Klonování se uskutečnilo zavedením restrikčního místa Bgl II na každý konec fragmentu genu pomocí PCR mutageneze za použití následujícího oligonukleotidu:

NRW170 GTCGACAGATCTGGCACATAGTAGGGCCCGA SEQ ID NO: 2 (Jedná se o oligonukleotid pro PCR klonování HPV-6 L2E7 do vektoru pET. Zavedení místa BglII do N-konce HPV-6 L2. Pro fúzi do vedoucí sekvence (pelB) vektoru pET není nutný metioninový kodon).

Následuje sekvenace DNA. Fůzní gen L2E7 se pak ligoval do následujících vektorů: pETllb, pET12b, pET16b a pET22b. Tyto vektory se liší v podstatě jejich sekvencí N- a C-konce. Rekombinantní plazmidy se pak použily pro transformaci vhodné hostitelské buňky HMS174, která obsahuje gen kódující T7 polymerázu. Dále jsou dostupné jiné hostitelské buňky, které se liší sílou suprese bazální exprese a úspěšně se používají při této metodě.

Příklad 4: Exprese konstrukce L2E7 v bakteriích E. coli

Z transformační plotny se izolovaly jednotlivé bakteriální kolonie a použily se pro inokulaci 2 ml alikvotů média 2YT. Tyto alikvóty se kultivovaly po dobu 2 hodin, pak se použily pro inokulaci 12 ml kultury teplého média, přičemž se upravil objem inokula, aby se dosáhlo konzistentního počtu bakterií, jak se určí měřením optické hustoty při vlnové délce 600 nm. Tyto kultury se kultivovaly až optická hustota dosáhla hodnoty 0,6. V tomto bodě se kultury rozdělily na dva alikvóty o objemu 5 ml. Do jedné kultury se přidalo IPTG v koncentraci 1,0 mM a obě kultury se inkubovaly za stejných podmínek po dobu 3 hodin.

Na konci uvedené doby se bakterie přenesly na led a změřila se optické hustota. Bakteriální kultury se shromáždily centrifugací ve zkumavkách Falcon o objemu 15 ml po dobu 10 • · minut při otáčkách 4 000 ot/min. Odstranil se supernatant a bakterie se resuspendovaly v pufru TE. Konečný objem je 0,5 ml.

další pruh o produktu buď

Comassieovou modří. Navíc molekulové hmotnosti 80

Analýza SDS-PAGE se provedla následujícím způsobem:

Vzorek se přidal do stejného objemu redukujícího elektroforetického vzorkového pufru a ten se zahřál na teplotu 100 °C po dobu 10 minut. Na 5 až 15 % polyakrylamidový gel se naneslo 50 μΐ vzorku a proběhla elektroforéza při 10 mA po dobu 12 hodin. Proteinové pruhy se zviditelnily obarvením Coomassieovou briliantovou modří v 10 % kyselině octové a v

10% metanolu po dobu 30 minut, pak následuje odbarvení. Hlavní proteinový pruh o molekulové hmotnosti 90 000, který odpovídá celému proteinu L2E7, se může detekovat obarvením gelu alespoň jeden

000 odpovídá proteolytického štěpení nebo předčasného ukončení transkripce nebo translace.

Následuje modifikace genové sekvence místně řízenou mutagenezí, jak se popisuje například v příkladu 6. Pruh o molekulové hmotnosti 80 000 nebyl dále detekovatelný obarvením Coomassieovou modří, což naznačuje, že hypotéza o předčasné terminaci transkripce nebo translokace byla správná.

Srovnání množství proteinu přítomného na gelu se známým standardem umožňuje odhadnout sílu exprese v bakterii. Síla exprese se pohybuje v rozmezí 10 až 30 mg/1.

Za účelem detailnější charakterizace exprimovaných proteinových produktů se gel podrobil Westernovému transferu, pak následovalo testování anti-L2 antisérem, které vzniklo imunizací ovcí fúzním proteinem L2 získaným z bakterií E. coli. Westernúv přenos umožňuje vizualizaci velkého množství pruhů s molekulovou hmotností nižší, než je molekulová hmotnost celého specie. Všechny tyto pruhy pravděpodobně • · vznikají proteolytickou degradací nebo předčasnou terminací transkripce nebo translace.

Počáteční analýza SDS-PAGE ukazuje na přítomnost proteinového pruhu obarveného Coomassieovou modří, jehož velikost odpovídá očekávané velikosti celého genového produktu L2E7. Navíc je možné vidět řadu dalších pruhů, které mohou odpovídat buď proteolytickým fragmentům L2E7 nebo artefaktům předčasné terminace.

Tato možnost se zkoumala pomocí metody westernová přenosu za použití anti-L2 nebo anti-E7 antiséra. Výsledky potvrzují, že hlavním produktem je L2E7 a naznačují, že minoritním pruhům chybí oblasti C-konce.

Další charakterizace se provedla sekvenováním proteinů, které potvrdilo, že dva hlavní pruhy obsahovaly intaktní sekvence N-konce zahrnující neštěpenou vedoucí sekvenci pelB.

Příklad 5: Transkripce a translace in vitro

Za účelem charakterizace produktů se dále analyzovaly geny v sériích spojených experimentů in vitro transkripce a translace. Tento systém se používá pro zavedení enzymu T7 polymerázy, aby z klonovaného genu v expresivním vektoru vznikl mRNA transkript, který se pak překládá in vitro za vzniku syntetického proteinového produktu. Když se do proteinového produktu začlení radioaktivní značka, jeho syntéza se může sledovat za použití analýzy SDS-PAGE.

Na základě transkripce a translace in vitro se objevil stejný patern syntézy proteinu, jako se nalezl v případě heterogenního systému v E. coli. Fúzní protein L2E7 tvoří dva hlavní pruhy s molekulovou hmotností 80 000 a 70 000, zatímco produkt Ll obsahoval dva hlavní pruhy s molekulovou hmotností 30 000 a 32 000, přičemž předpokládaná délka celého produktu je 60 000.

Analýza sekvence DNA ukázala, že v obou sekvencích Ll a L2 byly pruhy poly-T, které obsahovaly 7 až 9 T zbytků, které • · splývají s pozicemi předčasně ukončených fragmentů obou molekul Ll a L2E7. Tato skutečnost naznačuje, že uvedené oblasti způsobují předčasnou terminaci buď transkripce nebo translace, nejpravděpodobněji transkripce. Tato skutečnost se podpořila pozorováním poly-T v terminační sekvenci T7 polymerázy.

Příklad 6: Mutageneze sekvencí DNA

Za účelem eliminovat potencionální terminační artefakty se mutovaly dvě oblasti bohaté na T. Kodon TTT kóduje aminokyselinu fenylalanin (Phe), v jejímž případě existuje alternativní kodon (TTC). Proto se rozhodlo nahradit kodon TTT mutací za vzniku sekvence TTC, přičemž se uchoval čtecí rámec a přirozená proteinová sekvence. Tento způsob se vybral proto, že neovlivňuje vlastnosti produktu, jelikož proteinová sekvence imunoterapeutického činidla se nemění. Mutace by však měla zvýšit výtěžek exprimovaného proteinového produktu tím, že minimalizuje množství artefaktů, které vznikají předčasným ukončením transkripce nebo translace.

Mutace proběhla pomocí PCR přesahujícího prodloužení genu, kde přirozená sekvence DNA relevantní oblasti je nahrazena mutovanou sekvencí, za použití oligonukleotidů JCT61, JPC81, které se definují dále v textu.

Při mutagenezí se použily následující oligonukleotidy: JCT61 CCAACCCTCCGAAGAACACCCCCAAAC SEQ ID NO: 3 (Oligonukleotidový primer nekódujícího řetězce pro účely mutageneze HPV 6 L2 v sekvenci DNA v poziciích 159 a 162 (TTTTTT se zaměnilo za TTCTTC)).

JPC81

GATCAAATATTAAAATGGGGAAGTTTGGGGGTGTTCTTCGGAGGG SEQ ID

NO: 4 (Oligonukleotidový primer kódujícího řetězce HPV 6 L2, začleňující mutagenezí sekvence TTTTTT na TTCTTC do pozice 159 • · · a 162. Oligonukleotid kóduje restrikční místo Sspl se sekvencí AATATT.

Druhé místo se také mutovalo místně řízenou mutagenezí za použití následujícího oligonukleotidu:

JPC90 CGTATTCCCTTATTCTTCAGATGTGGCGGC SEQ ID NO:5 (Oligonukleotidový primer kódujícího řetězce HPV 6 L2 začleňující in vitro mutagenezí sekvence do pozice 1359 a 1362) .

Konečný genový produkt se pak inzeroval za vzniku konečného expresivního vektoru, který se označil jako pGW53 a testovala se exprese in vitro a in vivo.

Příklad 7: Exprese mutovaných sekvencí

Účinek následující mutageneze konstrukce L2E7 se monitoroval expresí in vitro a in vivo, pak následuje analýza SDA-PAGE a je-li to vhodné westernův přenos.

Za účelem analýzy in vitro transkripce a translace produktů obou mutovaných genů L2E7 a Lise provedly počáteční experimenty.

Exprese in vivo mutovaných genů L2E7 a Ll se testovala, jak se uvádí shora v textu. Vybraly se jednotlivé kolonie a kultivovaly se do dosažení hodnoty optické hustoty 0,6. V tento okamžik se použilo IPTG, aby se indukovala polovina kultury; tři hodiny po indukci se buňky shromáždily a připravily se alikvoty pro analýzu SDS-PAGE. Zjistilo se, že expresívní kazeta se překládá uspokojivě.

Oba experimenty jak in vivo tak in vitro potvrdily, že mutageneze poly-T oblastí vede ke sníženi výtěžku předčasně terminovaných fragmentů obou L2E7 a Ll a zvýšení výtěžku celého produktu. Výsledkem bylo snížení výtěžku při expresi produktu o molekulové hmotnosti 70 000 a ztráta fragmentu s molekulovou hmotností 30 000 až 32 000 při expresi Ll.

··

Je proto zřejmé, že mutace pcly-T oblastí vede v tomto expresivním systému k zesílení exprese celého specie. Tento výsledek nebyl dříve popsán pro expresivní systém založený na T7 polymeráze a může mít široké uplatnění v jiných oblastech exprese.

Příklad 8: Produkce proteinu a způsob čištění

Pracovní buněčné banky bakterie E. coli HMS174, které obsahují plazmid pGW53 a které se získaly zde popsaným způsobem, se nechaly usadit a uskladnily se při teplotě -80°C. Za účelem produkce se ampule z pracovní buněčné banky rozmrazí a kultivují se v médiu 2YT v objemu, který je vhodný pro inokulaci fermentoru. Objem fermencace se může pohybovat od 1,3 1 do 50 1. Objem fermentace se může dále zvyšovat. Buňky se kultivovaly do okamžiku, kdy se dosáhlo předem daného bodu (v typickém případě 0,3 g/1). V uvedeném okamžiku se kultura indukovala IPTG, o dvě hodiny později se buňky shromáždily. Za použití standardních fermentačních podmínek se získal výtěžek 24 až 50 mg L2E7 na gram suché hmotnosti buněk. Pak se uskutečnilo rozbití buněk a čistění proteinu, jak se popisuje dále v textu a na obrázku č. 3.

Otevřely se buňky a uvolnil se nerozpustný L2E7 ve formě vnitrobuněčných inkluzních tělísek (IB) . Tento krok se uskutečnil pomocí hydraulického tlaku, který způsobuje lyži buněk při průchodu buněk úzkou šrěrbinou za tlaku 35 MPa. Použitím standardních metod se dosáhne lyže s přibližně 95 % účinností a obvykle se jí dosáhne pc třech průchodech.

Centrifugoval se buněčný lyzát bakterií E. coli obsahující nerozpustný L2E7 ve formě inkluzních tělísek. Sedimentovaný pelet obsahující inkluzní tělíska a buněčný odpad se resuspendoval v pufru, který obsahuje detergen Triton X-100. Při tangenciální filtraci s příčným tokem, což je standardní ·· koncentrace suspenze velikosti pórů 0,16 metoda, která se provádí na komerčně dostupném přístroji „Filtron (™) , kapalina nebo suspenze za účelem ultrafiltrace nebo filtrace prochází ultrafiltrační nebo filtrační membránou pod vlivem transmembránového tlaku, který je dostatečně velký, aby prohnal filtrát membránou. V současném provedení vynálezu tangenciální filtrace s příčným tokem se používá ke zvýšení inkluzních tělíska proti filtru o μπι. Inkluzní tělíska jsou obsaženy v zakoncentrované v retenci a do filtrátu prošly kontaminanty. Koncentrát se pak ředí, aby se redukovala koncentrace Triton X-100 a znovu se zakoncentruje. Močovina a DTT (dithitritol) , sloučeniny rozpouštějící 12E7, se pak přidaly v množství, aby konečná koncentrace byla 8M, respektive 10 mM. Denaturovaný redukovaný protein L2E7 pak prochází filtrem o velikosti pórů 0,16 μ do filtrátu, který se sbírá.

Protein L2E7 v denaturované, redukované a filtrované formě se pak čistí za použití chromatografie s výměnou iontů. Močovina o koncentraci 8,0 M, ve které je rozpuštěný protein L2E7 se nejprve čistí chromatografií s výměnou aniontů za podmínek, které jsou uvedeny na obrázku č. 3. V typickém případě se čistí 1 až 2 g produktu na koloně o objemu 250 až 350 ml. Protein rozpuštěný v močovině se nanesl na pryskyřici, kde dochází k výměně aniontů, a slabě vázané kontaminanty se odstranily vymytím čtyřmi objemy kolony pufru močovina-DTTTris (pH 8,0), který obsahuje 50 mM NaCl. Nakonec se protein L2E7 vymyl z kolony za použití maximálně pěti objemů pufru močovina-DTT-Tris (pH 8,0), který obsahuje 350 mM sůl. Rychlost průtoku j e 5 ml x cm’²/ min.

Produkt píku chromatografie s výměnou aniontů se nanesl na měnič kationtů. V typickém případě se na koloně o objemu okolo

250 ml čistí 1 az g produktu. Produkt se nanáší na pryskyřici rychlostí 2,5 ml min cm¹, která se pak promývá obj emy 8, 0 mM pufru močovina-DTT-fosforečnan (pH 6,2) obsahující 210 mM chlorid sodný, pak následuje eluce píku L2E7

9 9

999 999 • ·

9 9

9 999

1,5 objemy kolony promývacího pufru, jenž obsahuje 500 mM chloridu sodného.

Produkt píku kationtového měniče se nanesl na matrici dělící podle velikosti molekul (jak ukazuje obrázek č. 3) za použití pufru obsahujícího 25 mM Tris pH 8,0 a 75 mM chlorid sodný. V typickém případě se na 6,5 1 matrice s výškou podloží 100 cm nanese 200 až 400 mg L2E7 obsaženého v objemu 100 ml (při rychlosti 0,2 ml x cm~²/min) . Pík odpovídá hlavnímu produktu a minoritní fragmenty, kterým chybí N-konec, se vymyly 0,46 objemy kolony.

Pík chromatografie dělící na základě velikosti je v tomto stádiu postupu ředěn na přibližnou koncentraci 0,25 až 0,5 mg/ml. Produkt (1 až 2 1) se koncentroval tím, že se nanesl na matrici měniče aniontů o malém objemu (přibližně 75 ml) . Rychlost průtoku je 0,5 ml x cm’²/min) . Produkt se eluoval za použití pufru močovina-DTT-fosforečnan (pH 8,0), který obsahuje 1,0 M chlorid sodný. Objem píku je 1 až 2 objemy kolony.

Pík koncentrované aniontové náplně Q se dostal do konečného pufru formulace, který obsahuje 48,9 mM Tris pH 8,0 a 5mM DTT. Matrice kolony je sefarozové medium G25 o objemu přibližně 2,5 litrů. Pufr obsahující 8 M močovinu ve stejném objemu, jako je objem produktu, se nanesl znovu na kolonu. Produkt se pak nanáší v dávkách přibližně 100 až 150 ml. Pík odpovídající produktu po výměně ve formulačním pufru se v typickém případě eluuje 0,5 objemy kolony, přičemž rychlost průtoku je 0,06 ml x cm‘²/mín) . Zásoba konečného produktu se pak uschovala při teplotě -80°C.

Roztok nebo disperze produktu proteinu L2E7, který je možno získat tímto způsobem v agregované (re-agregované) formě, prochází sterilizačním filtrem, například filtrem s rozmezím velikosti pórů 0,16 až 0,22 mikrony, například 0,2 mikrony.

Příklad 9: Klonování a exprese genů HPV-6 v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae.

Za účelem testování schopnosti jiných heterogenních systémů silně exprimovat geny HPV-6 se geny vhodné pro fúzní konstrukci L2E7 a Ll klonovaly do obecně dostupného samostatně se replikujícího expresivního vektoru S. cerevisiae. Tento vektor založený na elementech 2 μ plazmidu umožňuje expresi heterogenních genů v rámci. Expresi řídí promotor GAL7. Vektor také obsahuje markér LEU-2d vhodný pro selekci zvýšeného počtu kopií v buňkách kvasinek a nese gen rezistence na kanamycin, který umožňuje selekci v bakterii E. coli. Hostitelský kmen Saccharomyces, který se používá při expresi, je S150-2B (genotyp: a, leu2-3, 112, Ahis3, trpl-289, ura3-52).

Kvasinky se za účelem represe transkripce z promotoru GAL7 transformovaly konstrukcí HPV-6L2-E7 a kultivovaly se v médiu, které obsahuje jako jediný zdroj uhlíku 2 % glukózu. Exprese genu se indukovala v médiu v přítomnosti 2% galaktozy, která slouží jako jediný zdroj uhlíku.

Buněčné extrakty vznikly rozbitím buněčných membrán skleněnými kuličkami. Extrakční pufr je založen na Tris a obsahuje řadu inhibitorů proteáz; PMSF, pepstatin, leupeptin, antipain a chymostatin. Buněčné extrakty se analyzovaly SDSPAGE a rozpuštěné proteiny se podrobily westernově přenosu za použití polyklonálního antiséra proti HPV-6 L2 a HPV-6 E7, které vzniklo u ovcí. V určitém provedení vynálezu se výtěžky fúzního proteinu HPV-6 L2-E7 produkovaného kvasinkami Saccharomyces cerevisiae uvedeným způsobem odhadly na hodnotu 10 μρ/l kultury.

Příklad 10: Klonování a exprese genů HPV-6 v kvasinkách Pichia pastoris.

Fúzní molekula L2E7 se vytvořila (jak se popisuje v příkladu 3 shora v textu) jako fragment restrikčních enzymů BamHI - Not I a klonovala se do vhodného expresivního vektoru, • ftft ·» · • · · · · · · • · · · · · • · ftft · ftftftft • · · · « • ft · ftftftft ftft · jako je expresivní vektor pPIC3K kvasinek Pichia (získaná na základě licence od Phillips Petroleum). Gen se může umístit tak, že jeho expresi řídí promotor alkoholové oxidázy, AOXI, čímž se umožní silná exprese fúzniho proteinu. Následuje linearizace expresivní konstrukce. DNA se pak transfekuje do buněk kvasinek sferoplastovou fúzí.

Transformanti se izolovaly na základě jejich schopnosti růstu v minimálním médiu, aniž je přítomen histidin. Buňky, které nejsou transfekované vyžadují v růstovém médiu přítomnost histidinu. Druhé kolo testování na základě pomalého růstu na metanolovém substrátu může proběhnout za účelem selekce uvedených klonů, které obsahují gen L2E7 začleněný ve správném lokusu.

Příklad 11: Klonování a exprese genů HPV-6 v bakulovirech

Za účelem zkoumání exprese fúzniho genu L2E7 v bakulovirech se vytvořily dvě konstrukce. Každá konstrukce kóduje fúzní protein HPV-6 L2E7 buď s HisTag koncem nebo bez něj. Ačkoli konstrukce neobsahuje vedoucí sekvenci testovala se síla intracelulární exprese.

Dvě konstrukce se klonovaly PCR amplifikací, která zavádí do vektoru pGEM-T terminální restrikční místa BglII. Geny L2E7 se pak izolovaly jako BglII - Bgl II fragmenty a subklónovaly se do klonovacího místa BamHI pendlujícího vektoru pBacPAKl (Clontech). Orientace inzertů se pak stanovila analýzou PCR a z klonů se správnou orientací se připravila DNA.

DNA z pendlujícího vektoru pBacPAK, která obsahuje konstrukci L2E7, se transfekovala společně s virovou DNA PBacPAKl (Clontech) štěpenou Bsu361 za použití standardního postupu zprostředkovaného lipofektinem do buněk Spodoptera frugíperda (typ Sf9). Dochází k homologní rekombinací in vivo mezi plazmidem a virovou DNA a cílový gen se přenese do virového genomu.

·* *· • · • · · · • ···· • · · ·

4 ···· · e · · • t · • · · · ··· ···

Infekcí čerstvých buněk se amplifikovalo potomstvo virů, které se vytvořilo po transfekci v supernatantu.

Shromáždila se frakce infikovaných buněk a připravila se genomová DNA. Amplifikace PCR za použití shora uvedených primerů ukazuje, že v buňkách je přítomen rekombinantní virus.

Jednou pasážovaný virus se použil pro další infekci buněk při vysoké multiplícitě infekce, za účelem charakterizace exprese genu stanovením časového průběhu produkce proteinu: Konfluentní buňky Sf9 na plotnách se 6 prohlubněmi se infikovaly při vysoké multiplícitě infekce. 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin po infekci se shromáždily buňky a supernatant. Za účelem detekce syntézy proteinu se provedla analýza SDS-PAGE a westernův přenos.

Rekombinantní protein nebylo možno prokázat na SDS/PAGE gelu obarveném podle Coomassie, ale v malém množství se detekoval westernovým přenosem. Jak se očekávalo, k sekreci proteinu nedošlo, protože chyběla vedoucí sekvence. Sekvenovala se celá délka amplifikovaných genů a subklónovaly se do plazmidových vektorů. Genové sekvence se použily ke konstrukci fúzí genů za účelem silné exprese proteinů HPV-6 v prokaryontních a eukaryontních systémech.

Příklad 12: Imunogenicita L2E7 u myší

Imunogenicita agregátu L2E7 se testovala u myší. Zjistilo se, že když se agregát L2E7 adsorbovaný na hydroxidu hlinitém („alum) aplikuje injekcí myším B6CBA, vyvolá se specifická imunita k L2E7. Uvedená specifická imunita k L2E7 zahrnuje sérové protilátky třídy imunoglobinu G (IgG) a podtřídy imunoglobinu G1 (IgGl). Také se zjistila specifická opožděná hypersenzitivní a lymfoproliferační odpověď in vitro.

Imunogenicita L2E7 adsorbovaného na alum se testovala na myších B6CBA. Myším se ve 14 denním intervalu aplikovaly dvě podkožní injekce se 180 μρ L2E7/Alum.

• · · • ·

Sérum se odebíralo 7, 14 a 56 dní po druhé injekci L2E7/Alum. Množství anti-L2E7 protilátek se stanovilo v testu ELISA s L2E7. Sérová anti-L2E7 odpověď dosáhla vrcholu 14 dní po druhé injekci L2E7 (střední hodnota titru je 4,572 loglO) a přetrvala 56 dní (střední hodnota titru je 4,127 loglO).

Opožděný typ hypersenzitivní odpovědi (DTH) na L2E7 se měřil ve druhé skupině myší imunizovaných způsobem, který se popisuje shora v textu. 7 dní po druhé injekci L2E7/Alum dostaly myši do pravého ucha dávku 1,8 μς L2E7 a stejný objem pufru do levého ucha. Nárůst tloušťky ucha, který je specifický pro L2E7, se měřil mikrometrem po 24, 48 a 72 hodinách po každé injekci do ucha. Myši imunizované L2E7/Alum vykazují in vivo DTH odpověď.

Lymfoproliferační odpověď in vitro se měřila následujícím způsobem. Ze třetí skupiny myší se sedm dní po třetí injekci s L2E7/alum získaly buňky lymfatických uzlin (buňky lymfatických uzlin v podpaždí). Připravila se suspenze buněk lymfatických uzlin a 2xl0⁵ vitálních lymfocytů/ml se naneslo na plotny s médiem ( Iscovevo modifikované Dulbeccovo médium) doplněným 1% normálním myším sérem, glutaminem, beta-merkaptoetanolem a antibiotiky. L2E7 se titroval do kultur (od 91 gg/ml) a proliferace buněk se stanovila inkorporací tritiovaného tymidinu posledních 24 hodin ze 72 hodin kultivace. Buňky lymfatických uzlin z myší se imunizovaly L2E7/Alum, množily se in vitro a vyvolala se odpověď na 12E7 42 000 cpm, index stimulace 50).

Příklad 13: Imunitní odpověď u lidí

Zjistilo se, že shora popsaná vakcína, gelový komplex hydroxidu hlinitého 12E7 připravený stejným způsobem, jak se uvádí shora v textu, indukuje u dobrovolníků zdravých mužů iminutní odpověď závislou na dávce. Buňky ze všech 36 vakcinovaných dobrovolníků vykazují L2E7 specifickou lymfoproliferační odpověď in vitro (CD4+T buňky), což indikuje imunitní odpověď na produkt. Dobrovolníkům se produkt aplikoval intramuskulární injekcí ve třech dávkách 3, 30 nebo 300 μς. Počáteční dávka se aplikovala v den 0 a dále v den 7 a v den 28 (zrychlený režim vakcinace). (Při alternativním pomalejším režimu vakcinace se dávky podávají v den 0, 28 a 56, ale zjistilo se, že tento způsob je méně výhodný). Lymfoproliferační odpověď se pozorovala od 7. dne při dávkách, které zahrnují nejnižší dávku 3 μς. 29 z 32 vzorků dobrovolníků vykazuje specifickou protilátkovou odpověď (tři dobrovolníci, kteří v testu na protilátky vykazují negativní reakci, dostaly nejnižší dávku). Dále se pozorovalo, že zesílení produkce IL-5 in vitro souvisí s produkcí protilátek. Dvě vyšší dávky vyvolávají proliferaci T-buněk dříve než nejnižší dávka. Nejvyšší dávka odpovídající 300 μρ stimuluje ve srovnání s nižšími dávkami větší produkci IFN-gamma. Pozorování rychlé proliferace T-buněk a spojená produkce IFN-gamma souvisí s vhodným použitím produktu jako terapeutické vakciny v případě genitálních bradavic.

U recipientů produktu v dávce 3 μρ se pozorovala regrese bradavic na chodidle, jejichž výskyt se spojuje s infekcí lidskými papilomaviry. Buňky těchto jedinců vykazovaly lymfoproliferační odpověď. Regrese se pozorovala v den 7 a v den 14 bradavice zmizely.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu obsahující antigenní determinantu papilomavirového proteinu v amorfní agregované formě, který v případě, že je v roztoku nebo v disperzi může projít sterílizačním filtrem.
2. 2. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu podle nároku 1 obsahující antigenní determinanty nejméně dvou papilomavirových proteinů, například L2 a jiný nebo E7 a jiný.
3. 3. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 obsahující alespoň jednu antigenní determinantu papilomavirového proteinu L2 a alespoň jednu antigenní determinantu papilomavirového proteinu El, E2, E4, E6 nebo E7.
4. 4. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu podle nároku 1,

   2 nebo 3 obsahující antigenní determinanty proteinů HPV L2 a E7, například zahrnuje fragment sekvence tvořící 50 % celé sekvence každého proteinu L2 a proteinu E7, např. zahrnuje v podstatě celou sekvenci L2 a E7; dále může zahrnovat sekvenci proteinu LI.
5. 5. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu podle libovolného z předchozích nároků, kde antigenní determinanta je z papilomavirového proteinu HPV typu 6, 11, 16, 18 nebo ze zvířecích papilomavirů.
6. 6. Polypeptid nebo kompozice polypeptidu podle libovolného z předchozích nároků, který je ve formě ·· ·· denaturováného, redukovaného a re-agregovaného přípravku.

   polypeptidů podle nároků získatelného nebo kompozice z předcházejících

   Polypeptid libovolného denaturací nebo denaturací s redukcí a následnou reagregací polypeptidů exprimovaného ve formě inkluzních tělísek v rekombinantí hostitelské buňce.
7. 8. Polypeptid nebo kompozice polypeptidů podle nároku 7, jehož molekulová hmotnost na agregát je v rozmezí přibližně 100 000 až přibližně 10 000 000.
8. 9. Polypeptid nebo kompozice polypeptidů podle nároku 7 obsahující seskupené partikule s průměry zjištěnými elektronovou mikroskopií v rozmezí okolo 4 až 50 nm, například okolo 10 až 15 nm.
9. 10. Polypeptid nebo kompozice polypeptidů podle nároku 7 obsahující seskupené partikule, které mají v agregátu 2 až 200, např. 5 až 50 polypeptidových řetězců.
10. 11. Polypeptid nebo kompozice polypeptidů podle nároku 1 obsahující fúzní polypepcid, který zahrnuje (a) alespoň antigenní determinantu papilomavirového proteinu L2 a (b) alespoň antigenní determinantu vybranou ze skupiny zahrnující papilomavirové proteiny El, E2, E4, E5, E6 a E7 a papilomavirové proteiny L2 typu papilomavirů odlišného od uvedených v odstavci (a); nebo obsahující antigenní determinanty z alespoň dvou papilomavirových proteinů vybraných ze skupiny papilomavirových proteinů zahrnující El, E2, E4, E5, E6 a E7 například, kde uvedené proteiny jsou z odlišných typů papilomavirů.
11. 12. Polypeptid nebo kompozice polypeptidů podle nároku 11 zahrnující fúzní polypeptid obsahující antigenní determinantu proteinu L2 a antigenní determinantu alespoň jednoho z proteinů Ξ1, E2, E4, E6 a E7.
12. 13. Imunogenní kompozice, vyznačující se tím, ž e je vhodná pro aplikaci injekcí a obsahuje společně s imunogenním adjuvans polypeptid podle libovolného z předcházejících nároků.
13. 14. Imunogenní kompozice podle nároku 13, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje hydroxid hlinitý a/nebo monofosforyllipid A.
14. 15. Použití polypeptidů nebo imunogenní kompozice podle libovolného z předcházejících nároků jako imunogenu, například jako vakciny pro profylaxi nebo terapii stavu spojovaného s papilomaviry.