JP2003504074A

JP2003504074A - インビトロでのＴｈ１様応答の誘導

Info

Publication number: JP2003504074A
Application number: JP2001509547A
Authority: JP
Inventors: マービンシーゲル; エヌ．ランドールシュ; リーエイ．ミッツェン
Original assignee: ストレスゲンバイオテクノロジーズコーポレイション
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2003-02-04
Also published as: US6495347B1; AU5926700A; WO2001004344A3; CN1367875A; US20050089841A1; EP1196772A2; US6657055B2; US20030050469A1; CA2378097A1; WO2001004344A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、Th1様応答をインビトロで刺激するための組成物および方法を提供する。本組成物は、熱ショック蛋白質の少なくとも一部を含む融合蛋白質および結合物を含む。Th1様応答は、未処置リンパ球を含む細胞試料を本発明の融合蛋白質または結合物とインビトロで接触させることによって誘発させることができる。Th1様応答は、細胞試料によって産生されるIFN-γを測定することによって検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願に関する相互参照本出願は、1999年7月8日に提出された米国仮特許出願第60／143,757号による
優先権を主張する。本出願の内容はその全体が参照として本明細書に組み入れら
れる。

【０００２】発明の分野本発明は、融合蛋白質、およびインビトロでのTh1様応答を刺激する方法に関
する。

【０００３】発明の背景 Tリンパ球は一般に、CD4抗原およびCD8抗原の発現に基づいて2つのクラスに分
けることができる。CD4+T細胞を介する免疫反応は、クラスII主要組織適合遺伝
子複合体（MHC）分子による制限を受ける。CD4+T細胞はヘルパーTリンパ球とし
ても知られ、リンホカインの分泌を介して機能を発揮する。CD8+T細胞を介する
免疫応答はクラスI MHC分子による制限を受ける。CD8+T細胞は細胞溶解性Tリン
パ球（CTL）としても知られ、細胞媒介性細胞傷害性を引き起こすとともに、活
性化されるといくつかのリンホカインを分泌する。

【０００４】 CD4+T細胞はさらにTh1およびTh2サブセットに細分することができる。Th1細胞
は、細胞性免疫を活性化するインターフェロン（IFN）-γおよび腫瘍壊死因子（
TNF）-βなどのリンホカインを産生することによって細胞性免疫に関与する。Th
2細胞は、B細胞を刺激するIL-4およびIL-5などのリンホカインを分泌することに
よって体液性免疫を補助する。Th1経路またはTh2経路のいずれか一方を活性化す
る抗原刺激は、他方の進展を抑制することがある。例えば、刺激されたTh1細胞
によって産生されるIFN-γはTh2細胞の形成を抑制することができ、刺激されたT
h2細胞によって産生されるIL-4はTh1細胞の形成を抑制することができる。

【０００５】癌、アレルギーおよび寄生虫感染症などのある種の疾病状態は、Th2応答が支
配的であることを特徴とする。ある種の環境では、IFN-γの産生に代表されるTh
1応答の誘導により、これらの状態が改善される可能性がある。

【０００６】発明の概要本発明は、未処置リンパ球を含む細胞試料をインビトロで刺激してTh1様応答
を示させることができるという発見に基づく。

【０００７】したがって、本発明は、融合蛋白質がTh1様応答を刺激するか否かを決定する
ための方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供
すること、（b）（i）熱ショック蛋白質（Hsp）または少なくとも8アミノ酸残基
長のその断片を、（ii）少なくとも8アミノ酸残基長の異種ポリペプチドと融合
させたものを含む融合蛋白質を提供すること、（c）細胞試料を融合蛋白質と接
触させること、および（d）融合蛋白質が細胞試料におけるTh1様応答を刺激する
か否かを決定すること、による方法を特徴とする。

【０００８】「未処置リンパ球」とは、本発明の方法に用いる前に（インビボおよびインビ
トロで）融合蛋白質に曝露されていないリンパ球のことである。「Hsp」とは、
熱ショックなどのストレスに曝された細胞でその発現が誘導または増強される蛋
白質との一致率が少なくとも40％である配列からなるポリペプチドである。「融
合蛋白質」とは、少なくとも2つの異なる蛋白質に由来する非天然型のポリペプ
チドのことである。

【０００９】本方法に用いるHspは、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71からなる群か
ら選択しうる。さらに、融合蛋白質はHsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60またはHsp71
のいずれかの完全アミノ酸配列を含むこともできる。いくつかの態様において、
融合蛋白質はHspの断片、例えば、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）のHsp65
のアミノ酸1〜200位を含む。

【００１０】異種ポリペプチドは、（i）ウイルスなどのヒト病原体の蛋白質または（ii）
腫瘍関連抗原の少なくとも8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含みうる。ウ
イルスの例には、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、
B型肝炎ウイルス（HBV）、C型ウイルス（HCV）、サイトメガロウイルス（CMV）
、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス
およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）が含まれる。異種ポリペプチドには、HPV16
E6などのHPV E6抗原、HPV16 E7などのHPV E7抗原、または少なくとも8アミノ酸
残基長のこれらの抗原のいずれかの断片が含まれうる。

【００１１】 1つの例において、融合蛋白質は、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）BCG Hs
p65およびHPV16 E7を含む。

【００１２】本発明の方法に用いる細胞試料には、脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、胸腺、
肺、気道または肛門性器粘膜に由来する細胞が含まれうる。好ましい態様におい
て、細胞は脾細胞またはリンパ節細胞である。

【００１３】 Th1様応答が刺激されたことは、細胞試料によって産生されたリンホカイン、
例えばIFN-γまたはTNF-βの存在を検出することによって決定しうる。

【００１４】 1つの態様において、本方法は、（e）未処置リンパ球を含む第2の細胞試料を
提供する段階、（f）第2の細胞試料を第2の融合蛋白質と接触させる段階、およ
び（g）第2の融合蛋白質が第2の細胞試料におけるTh1様応答を刺激するか否かを
決定する段階も含む。この例において、第1の融合蛋白質は完全長の天然型Hspの
配列を含み、第2の融合蛋白質は天然型Hspのすべてには満たないものの少なくと
も8個のアミノ酸を含む。

【００１５】もう1つの局面において、本発明は、化合物のスクリーニングの方法であって
、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i
）Hspまたは少なくとも8アミノ酸残基長のその断片を、（ii）少なくとも8アミ
ノ酸残基長の異種ポリペプチドと融合させたものを含む融合蛋白質を提供するこ
と、（c）細胞試料を化合物および融合蛋白質と接触させること、ならびに（d）
接触の段階後に細胞試料がTh1様応答を示すか否かを決定すること、による方法
を特徴とする。この方法では、化合物の存在下におけるTh1様応答が化合物の非
存在下と比較して低いことにより、化合物が細胞試料によるTh1様応答を抑制す
ることが示される。

【００１６】本発明には、化合物のスクリーニングの方法であって、（a）未処置リンパ球
をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）Hspまたは少なくとも8
アミノ酸残基長のその断片を、（ii）少なくとも8アミノ酸残基長の異種ポリペ
プチドと融合させたものを含む融合蛋白質を提供すること、（c）細胞試料を化
合物および融合蛋白質と接触させること、ならびに（d）接触の段階後に細胞試
料がTh1様応答を示すか否かを決定すること、による方法も含まれる。この方法
では、化合物の存在下におけるTh1様応答が化合物の非存在下と比較して高いこ
とにより、化合物が細胞試料によるTh1様応答を促進することが示される。

【００１７】もう1つの局面において、本発明は、ハイブリッド化合物がTh1様応答を刺激す
るか否かを決定する方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細
胞試料を提供すること、（b）（i）分子量1,500未満の非ペプチド化合物が、（i
i）少なくとも8アミノ酸長のポリペプチドと共有結合したものを含む、天然にみ
られないハイブリッド化合物であって、非ペプチド化合物をポリペプチドと共有
結合させることによって生成されるハイブリッド化合物を提供すること、（c）
細胞試料をハイブリッド化合物と接触させること、および（d）ハイブリッド化
合物が細胞試料におけるTh1様応答を刺激する示すか否かを決定すること、によ
る方法を特徴とする。1つの態様において、非ペプチド化合物の分子量は少なく
とも100である。

【００１８】もう1つの局面において、本発明は、ハイブリッド化合物がTh1様応答を刺激す
るか否かを決定する方法であって、（a）非ペプチド化合物を少なくとも8アミノ
酸長のポリペプチドと共有結合させることによってハイブリッド化合物を生成す
ること、（b）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（c
）細胞試料をハイブリッド化合物と接触させること、および（d）ハイブリッド
化合物が細胞試料におけるTh1様応答を刺激する示すか否かを決定すること、に
よる方法を特徴とする。1つの態様において、非ペプチド化合物の分子量は100と
1,500との間である。

【００１９】もう1つの局面において、本発明は、融合蛋白質がTh1様応答を刺激するか否か
を決定する方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を
提供すること、（b）（i）少なくとも8アミノ酸残基長の第1のポリペプチドを、
（ii）少なくとも8アミノ酸残基長の第2のポリペプチドと融合させたものを含む
融合蛋白質を提供すること、（c）細胞試料を融合蛋白質と接触させること、お
よび（d）接触の段階後に細胞試料が示すTh1様応答を検出すること、による方法
を特徴とする。1つの態様において、検出されるTh1様応答は、第2の細胞試料を
第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1のポリペプチドと第2のポリ
ペプチドとの混合物のいずれかに接触させた場合に未処置リンパ球を含む第2の
細胞試料が示すTh1様応答よりも強い。1つの例では、検出されるTh1様応答は、
第2の細胞試料が示すTh1様応答の少なくとも2倍である。もう1つの例では、検出
されるTh1様応答は、第2の細胞試料が示すTh1様応答の少なくとも5倍である。

【００２０】もう1つの局面において、本発明は、（i）Hsp10蛋白質または少なくとも8アミ
ノ酸残基長のその断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチ
ド、を含む融合蛋白質を提供する。融合蛋白質のHsp10蛋白質は、マイコバクテ
リア蛋白質、例えば、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のHsp10蛋白
質でありうる。異種ポリペプチドは、HPVなどのヒトウイルスの蛋白質の少なく
とも8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含みうる。1つの例において、異種ポ
リペプチドはHPV16 E7を含む。

【００２１】もう1つの局面において、本発明は、（i）Hsp40蛋白質または少なくとも8アミ
ノ酸残基長のその断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチ
ド、を含む融合蛋白質を提供する。融合蛋白質のHsp40蛋白質は、マイコバクテ
リア蛋白質、例えば、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のHsp40蛋白
質でありうる。異種ポリペプチドは、HPVなどのヒトウイルスの蛋白質の少なく
とも8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含みうる。1つの例において、異種ポ
リペプチドはHPV16 E7を含む。

【００２２】もう1つの局面において、本発明は、（i）Hsp71蛋白質または少なくとも8アミ
ノ酸残基長のその断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチ
ド、を含む融合蛋白質を提供する。融合蛋白質のHsp71蛋白質は、マイコバクテ
リア蛋白質、例えば、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のHsp71蛋白
質でありうる。異種ポリペプチドは、HPVなどのヒトウイルスの蛋白質の少なく
とも8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含みうる。1つの例において、異種ポ
リペプチドはHPV16 E7を含む。

【００２３】もう1つの局面において、本発明は、化合物がTh1様応答を刺激するか否かを決
定する方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供
すること、（b）化合物を提供すること、（c）細胞試料を化合物と接触させるこ
と、および（d）接触の段階後に細胞試料が示すTh1様応答を検出すること、によ
る方法を特徴とする。

【００２４】別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語
は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。本発
明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法お
よび材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するも
のである。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の
参考文献は、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。対立が生じ
た場合には、定義を含め、本明細書が支配的であるものとする。さらに、材料、
方法および実施例は例示のためのものであって発明の範囲の制限を意図したもの
ではない。

【００２５】本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から
明らかになると思われる。

【００２６】詳細な説明本発明は、未処置リンパ球を含む細胞試料におけるTh1様応答をインビトロで
刺激する方法に関する。これらの方法は、蛋白質、例えばHspが異種ポリペプチ
ドと結合したものを含む融合蛋白質が、Th1様応答の刺激物質として働く能力を
評価するために有用である。さらに、本方法は、Th1様応答を調節しうる化合物
を同定するために用いることもできる。本発明の方法に用いるのに適したさまざ
まな材料および手順を以下に説明する。

【００２７】ストレス蛋白質および熱ショック蛋白質（Hsp）という用語は、本明細書で同
義語として用いられる。Hspとは、ストレスに曝された細胞でその発現が誘導ま
たは増強される蛋白質との一致率が少なくとも40％である配列からなるポリペプ
チドのことである。ストレス蛋白質への転換では一般に、細胞はストレス遺伝子
または熱ショック遺伝子と一般に呼ばれる一群の遺伝子の発現を高めることによ
ってストレッサー（典型的には熱ショック処理）に応答する。熱ショック処理に
は、細胞が順応している温度よりも1℃〜数℃高い温度に細胞または生物体を曝
露させることが含まれる。ストレスに曝された細胞では、このような遺伝子の誘
導と協調して、対応するストレス蛋白質のレベルが高くなる。「熱ショック蛋白
質」または「Hsp」としても知られる、本明細書で用いる「ストレス蛋白質」は
、ストレス遺伝子によってコードされる蛋白質であり、このため、ストレッサー
の生物体への接触または曝露後に著しく産生量が高まることが一般的である。「
ストレス遺伝子」は「熱ショック遺伝子」としても知られ、本明細書では、（そ
の遺伝子を含む）生物体の、熱ショック、低酸素、グルコース欠乏、重金属塩、
エネルギー代謝および電子伝達の阻害物質、ならびに蛋白質変性剤などのストレ
ッサー、またはある種のベンゾキノン、アンサマイシンへの接触または曝露のた
めに活性化される、または別の形で検出可能なようにアップレギュレートされる
遺伝子として用いられる。ノーバー（Nover, L.）、「熱ショック応答（Heat Sh
ock Response）」、CRC Press, Inc.、Boca Raton、FL（1991）。「ストレス遺
伝子」には、Hsp70およびHsp90ストレス遺伝子ファミリーに属するある種の遺伝
子などの、既知のストレス遺伝子ファミリーに属する相同遺伝子も含まれるが、
このような相同遺伝子自体はストレッサーによって誘導されない。別に特記する
場合を除き、本明細書で用いるストレス遺伝子およびストレス蛋白質という用語
はそれぞれ他方を含みうる。

【００２８】抗原としては、免疫応答をそれに対して起こさせようとする任意の化合物、ペ
プチドまたは蛋白質が可能である。特に関心が持たれる抗原は、腫瘍関連抗原、
任意の由来のアレルゲン、ならびにウイルス、マイコプラズマ、細菌、真菌、原
生動物および他の寄生生物由来の蛋白質である。

【００２９】融合蛋白質本発明はHsp融合蛋白質を提供する。本明細書で用いる「融合蛋白質」とは、
一般に2つの異なる蛋白質に由来する少なくとも2つのアミノ酸配列を含む非天然
型のポリペプチドのことである。完全長融合蛋白質のアミノ酸配列は、天然にみ
られる蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一ではない。Hsp融合蛋白質は
、Hspまたは少なくとも8アミノ酸長のその断片が異種ポリペプチドと結合したも
のを含む。「Hspポリペプチド」とは、熱ショックなどのストレスに曝された細
胞でその発現が誘導または増強される蛋白質との一致率が少なくとも40％である
配列からなるポリペプチドのことを指す。「異種ポリペプチド」とは、Hsp蛋白
質またはその断片と融合したポリペプチドのことを指す。異種ポリペプチドは少
なくとも8アミノ酸長であることが好ましい。いくつかの態様において、異種ポ
リペプチドは少なくとも10、20、50、100、150、180、200または300アミノ酸長
である。異種ポリペプチドは一般に、天然にみられるHspの一部または全体では
ない。しかし、融合蛋白質は、第1のHspとそれとは異なる第2のHspとの間の融合
体、または同じHspの全体もしくは一部と融合したHspの全体もしくは一部（その
結果得られる融合体が天然にみられる蛋白質と同一でない限り）でもありうる。
Hspポリペプチドは異種ポリペプチドのN末端にもC末端にも結合させうる。融合
蛋白質は精製蛋白質であることが好ましい。

【００３０】好ましいHsp融合蛋白質は、1つのHspポリペプチドが1つの異種ポリペプチドと
結合したものを有するが、他のコンフォメーションも本発明の範囲に含まれる。
1つの態様において、融合蛋白質は、HPV16 E7などの異種ポリペプチドを少なく
とも2コピー含む。もう1つの態様において、融合蛋白質は、Hsp65などのHspポリ
ペプチドを少なくとも2コピー含む。さらに、融合蛋白質は、例えば単一の抗原
蛋白質の異なるエピトープである2つもしくはそれ以上の断片、または同じもし
くは異なる腫瘍もしくは病原体に由来する2つもしくはそれ以上の異なる抗原蛋
白質の断片などの少なくとも2つの異なる異種ポリペプチド、および／または少
なくとも2つの異なるHspポリペプチドを含みうる。

【００３１】 Hspおよび異種ポリペプチドはリンカー配列なしに直接融合させることができ
る。好ましい態様において、HspのC末端を異種ポリペプチドのN末端と直接融合
させること、または異種ポリペプチドのC末端をHspのN末端と直接融合させるこ
とができる。

【００３２】または、Hspおよび異種ポリペプチドを、ペプチドリンカー配列を介して互い
に連結することもできる。好ましいリンカー配列は、（1）柔軟な長いコンフォ
メーションをとれる必要がある、（2）Hspおよび異種ポリペプチドの機能的ドメ
インと相互作用すると考えられる秩序立った二次構造を生じる傾向を示さない必
要がある、および（3）蛋白質の機能的ドメインとの相互作用を促すと考えられ
る疎水性または荷電性が極めてわずかである必要がある。柔軟な蛋白質領域に典
型的なアミノ酸にはGly、AsnおよびSerが含まれる。Gly、AsnおよびSerを含むア
ミノ酸配列の順列は、リンカー配列に関する上記の基準を満たすと考えられる。
ThrおよびAlaなどのその他の中性または中性に近いアミノ酸もリンカー配列に用
いることができる。任意の他のアミノ酸もリンカーに用いうる。機能的な蛋白質
ドメインの適切な分離を得るためには20アミノ酸長未満のリンカー配列を用いる
ことができるが、それよりも長いリンカー配列を用いてもよい。

【００３３】 Hsp融合蛋白質をさらに、融合蛋白質の精製を容易にする別のアミノ酸配列と
融合させてもよい。有用な融合蛋白質の1つは、Hsp-異種ポリペプチド配列をGST
配列のC末端またはN末端と融合させたGST融合蛋白質である。もう1つの有用な融
合蛋白質は、Hsp-異種ポリペプチド配列をポリヒスチジン配列、例えばHis×6の
C末端またはN末端のいずれかに融合させたポリヒスチジン（His）融合蛋白質で
ある。もう1つの態様において、融合蛋白質はインテイン（intein）のキチン結
合領域を含み、それによってキチンビーズによる融合蛋白質の精製が可能となる
（Hoangら（1999）Gene 1999 237：361〜71）。もう1つの態様において、融合蛋
白質は別の蛋白質からのシグナル配列を含む。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳
動物宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用によってHsp融合蛋白質の発現お
よび／または分泌を高めることができる。例えば、バキュロウイルス外被蛋白質
のgp67分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（「分子生物学に
おける最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Ausu
belら編、John Wiley & Sons、1992）。真核生物シグナル配列のその他の例には
、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が含まれる（Stra
tagene；La Jolla、California）。原核宿主細胞による分泌を高めるために有用
な原核生物シグナル配列には、phoA分泌シグナル（「分子クローニング（Molecu
lar Cloning）」、Sambrookら、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press
、1989）およびプロテインA分泌シグナル（Pharmacia Biotech；Piscataway、Ne
w Jersey）が含まれる。

【００３４】本発明の融合蛋白質、例えば、Hsp65とHPV16 E7との融合蛋白質は、標準的な
組換え技術によって作製することができる。例えば、異なるポリペプチド配列を
コードするDNA断片を、従来の技術に従い、インフレームで任意の順序で互いに
連結する。このような技術には、連結のための平滑末端または付着末端、適切な
末端を得るための制限酵素消化、付着末端を適宜充填平滑化すること（fill-in
）、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵
素的連結が含まれる。2つの核酸の正しい連結には、連結産物がHsp部分および異
種ポリペプチド部分からなるキメラ蛋白質をコードする必要がある。もう1つの
態様において、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む従来の技術によって合成
することができる。または、2つの連続した遺伝子断片の間に相補的な突出部を
生じるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のPCR増幅を行い、その後にアニ
ーリングさせた上で再増幅を行ってキメラ遺伝子配列を作製することもできる（
例えば、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molec
ular Biology）」、Ausubelら編、John Wiley & Sons：1992を参照）。

【００３５】異種ポリペプチド、およびHspまたはHsp以外の蛋白質のいずれかを含む融合蛋
白質をコードする発現ベクターを、上記の手順によって調製することができる。
Hsp融合蛋白質の例は、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）BCG Hsp65-HPV16
E7（HspE7）融合蛋白質、ならびにHPV16 E7（E7）、ヒスチジンタグされたHPV16
E7（hE7）およびウシ結核菌（M. bovis）BCG Hsp65（Hsp65）のベクター構築、
発現および精製を記載しており、参照として本明細書に組み入れられる国際公開
公報第99／07860号に記載がある。HPV抗原などの異種ポリペプチドが選択的に連
結されたHspをコードする核酸の追加的な例は、国際公開公報第89／12455号、国
際公開公報第94／29459号、国際公開公報第98／23735号およびそれらに引用され
ている参考文献に記載されており、それらの内容は参照として本明細書に組み入
れられる。

【００３６】多岐にわたる生物からさまざまな熱ショック蛋白質の単離、クローニングおよ
び特徴決定がなされている（Mizzen、Biotherapy 10：173〜189、1998）。あら
ゆるHspまたはその断片が、本発明の融合ポリペプチドおよび結合物における使
用に適すると思われる。例えば、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）お
よびライ菌（Mycobacterium leprae）による感染に対する宿主免疫応答によって
認識される主要な決定基にはHsp70、Hsp60、Hsp20〜30およびHsp10がある。さら
に、以下の実施例の項で述べる通り、ウシ結核菌の菌株であるカルメット・ゲラ
ン杆菌（Bacille Calmette Guerin）（BCG）のHsp65は有効な刺激物質であるこ
とが明らかになった。

【００３７】本発明に用いるためのストレス遺伝子およびストレス蛋白質のファミリーは当
技術分野で周知であり、これには例えば、Hsp100〜200、Hsp100、Hsp90、Lon、H
sp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBP、シクロフィリン、Hsp20〜30、ClpP、GrpE、H
sp10、ユビキチン、カルネキシンおよび蛋白質ジスルフィドイソメラーゼが含ま
れる。例えば、マカリオ（Macario）、Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25
：59〜70、1995；パーセル（Parsell）ら、Rev. Genet. 27：437〜496、1993；
および米国特許第5,232,833号を参照されたい。好ましいHspにはHsp65、Hsp40、
Hsp10、Hsp60およびHsp71が含まれる。

【００３８】融合蛋白質のHsp部分は、完全長HspまたはHspの少なくとも8アミノ酸長の断片
のいずれかを含みうる。いくつかの態様において、Hsp断片の長さは10アミノ酸
を上回り、好ましくは少なくとも20、50、100、150、180、200または300アミノ
酸を上回る。1つの態様において、融合蛋白質のHsp部分はウシ結核菌（Mycobact
erium bovis）のHsp65のアミノ酸1〜200位からなる。Th1様応答をインビトロで
誘発させるためにHsp65の他の部分および他のHspを融合蛋白質に用いることが可
能である。その他の好ましいHspには、ヒト結核菌（M. tuberculosis）のHsp40
、ヒト結核菌のHsp10、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）Hsp65およびアス
ペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）のHsp60が含まれる。異種
ポリペプチドは、免疫応答をインビトロおよび／またはインビボで刺激するため
に有用な任意のアミノ酸配列を含みうる。好ましくは、異種ポリペプチドはMHC
結合エピトープ、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII結合エピトープを含む。
異種ポリペプチドは、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、真菌、原生動物および
その他の寄生生物などのヒト病原体によって産生される蛋白質中に認められる配
列、または腫瘍関連抗原（TAA）の蛋白質中に認められる配列を含みうる。ウイ
ルスの例には、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、B
型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、サイトメガロウイルス（CMV
）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイ
ルスおよびヒト免疫不全ウイルス（HIV）が含まれる。腫瘍関連抗原の例には、M
AGE1、MAGE2、MAGE3、BAGE、GAGE、PRAME、SSX-2、チロシナーゼ、MART-1、NY-E
SO-1、gp100、TRP-1、TRP-2、A2メラノトープ、BCR／ABL、プロテイナーゼ3／ミ
エロブラスチン、HER2／neu、CEA、P1A、HK2、PAPA、PSA、PSCA、PSMA、pg75、M
UM-1、MUC-1、E6、E7、GnT-V、β-カテニン、CDK4およびP15が含まれる。

【００３９】 HPVの任意の株に由来するPV抗原が、融合ポリペプチドにおける使用に適して
いる。HPVは6種または7種の非構造蛋白質および2種の構造蛋白質を発現する。ウ
イルスキャプシド蛋白質L1およびL2は後期構造蛋白質である。L1は主要なキャプ
シド蛋白質であり、そのアミノ酸配列は異なる種類のHPVの間で高度に保存され
ている。早期非構造蛋白質は7種ある。蛋白質E1、E2およびE4はウイルス複製に
重要な役割を果たす。蛋白質E4はウイルスの成熟にも役割を果たす。E5の役割は
あまりよくわかっていない。蛋白質E6およびE7は、ウイルス複製のため、ならび
に宿主細胞の不死化および形質転換のために極めて重要な腫瘍性蛋白質である。
本発明の融合蛋白質には、HPV蛋白質の配列全体、または少なくとも8アミノ酸の
断片などのその断片が含まれうる。1つの態様において、HPV抗原配列は、HPV16
またはHPV18 E7蛋白質などの「ハイリスク（high risk）」HPVに由来する。HPV
抗原配列は、MHC結合エピトープ、例えば、MHCクラスIおよび／またはMHCクラス
II結合エピトープを含みうる。

【００４０】 Hsp融合蛋白質に加えて、他の融合蛋白質を本明細書に記載のインビトロアッ
セイに用いることもできる。これらの非Hsp融合蛋白質は、少なくとも8アミノ酸
長の第1のポリペプチドが少なくとも8アミノ酸長の第2のポリペプチドと融合さ
れたものを含み、ここで第1および第2のポリペプチドは異なる蛋白質（好ましく
は天然の蛋白質）に由来する。融合蛋白質それ自体は天然蛋白質の配列を有して
いない。

【００４１】本発明の融合蛋白質において、第1および第2のポリペプチドはいずれも、蛋白
質の精製または検出のために一般に用いられるアミノ酸配列、例えばGSTまたは
ポリヒスチジンではない。

【００４２】融合蛋白質の生産のためには、融合蛋白質をコードする核酸を、発現ベクター
を用いて、細菌、初代細胞または不死化細胞系などの宿主細胞に導入することが
可能である。続いて、組換え細胞を用いて融合蛋白質を産生させる。トランスフ
ェクションは一時的でも安定的でもよく、後者は時に相同組換えによって達成さ
れる。

【００４３】融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列は通常、発現のために用いようとす
る宿主細胞に基づいて選択された1つまたは複数の調節配列と機能的に結合して
いる。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の
発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）のことを指す。このような調
節配列は例えば、ゲッデル（Goeddel）（1990）「遺伝子発現技術：酵素学にお
ける方法 185（Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185）」
、Academic Press、San Diego、CAに記載されており、その内容は参照として本
明細書に組み入れられる。調節配列には、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド
配列の構成的発現を指令するもの、ある種の宿主細胞のみでヌクレオチド配列の
発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）および調節可能な様式で（
例えば、誘導物質が存在する場合のみに）発現を指令するものが含まれる。発現
ベクターの設計が、形質転換を行おうとする宿主細胞の選択、望ましい融合蛋白
質の発現レベルといった要因に依存すると思われることは当業者に理解されると
考えられる。

【００４４】組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における融合蛋白質の発現用
に設計することができる。例えば、融合蛋白質を、大腸菌などの細菌細胞、昆虫
細胞（例えば、バキュロウイルスウイルス発現系において）、酵母細胞または哺
乳動物細胞で発現させることができる。いくつかの適した宿主細胞は、ゲッデル
（Goeddel）（1990）「遺伝子発現技術：酵素学における方法 185（Gene Expres
sion Technology：Methods in Enzymology 185）」、Methods in Enzymology 18
5、Academic Press、San Diego、CAに詳細に考察されている。酵母（S. cerevis
iae）における発現用のベクターの例には、pYepSec1（Baldariら（1987）EMBO J
. 6：229〜234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz（1982）Cell 30：933〜943）
、pJRY88（Schultzら（1987）Gene 54：113〜123）およびpYES2（Invitrogen Co
rporation、San Diego、CA）が含まれる。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）に
おける融合蛋白質の発現に用いうるバキュロウイルスベクターには、pAcシリー
ズ（Smithら（1983）Mol. Cell. Biol. 3：2156〜2165）およびpVLシリーズ（Lu
cklowおよびSummers（1989）Virology 170：31〜39）が含まれる。

【００４５】哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8（Seed（1987）Nature 329：840）およ
びpMT2PC（Kaufmanら（1987）、EMBO J. 6：187〜195）が含まれる。哺乳動物細
胞で用いようとする場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス調節要素
によって提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターには、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40
に由来するものがある。

【００４６】組換え発現ベクターは、上記の調節制御配列に加えて、別のヌクレオチド配列
も含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターが取り込まれた
宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードしてもよい。さらに、宿
主細胞、特に哺乳動物宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を促進するために、発現
時に融合蛋白質がそのアミノ末端にシグナル配列を伴って発現されるように、組
換え発現ベクターは、融合蛋白質のアミノ末端に結合した形でシグナル配列をコ
ードすることもできる。このシグナル配列は融合蛋白質を細胞の分泌経路に向か
わせた後に通常は切断され、これによって成熟型融合蛋白質（すなわち、シグナ
ル配列を伴わない融合蛋白質）の宿主細胞からの放出が可能となる。哺乳動物宿
主細胞からの蛋白質またはペプチドの分泌を促進するためのシグナル配列の使用
は当技術分野で知られている。

【００４７】ベクターDNAは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原
核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」
および「トランスフェクション」という用語は、外来性核酸（例えば、DNA）を
宿主細胞に導入するための当技術分野で知られた種々の技術のことを指し、これ
にはリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム沈殿法、DEAE-デキストランを介し
たトランスフェクション法、リポフェクション法、電気穿孔法、微量注入法およ
びウイルスを介したトランスフェクション法が含まれる。宿主細胞の形質転換ま
たはトランスフェクションのための適した方法は、サムブルック（Sambrook）ら
（「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Ma
nual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））および他の
実験マニュアルに記載がある。

【００４８】外来DNAがゲノム中に組み込まれる哺乳動物細胞の割合はわずかに過ぎないこ
とが多い。これらの組み込み体（integrant）の同定および選択のために、選択
マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、融合蛋白質
をコードする遺伝子とともに宿主細胞に導入することができる。好ましい選択マ
ーカーには、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に対す
る耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、融合蛋白
質をコードするものと同じベクター上にある形で宿細胞に導入することもでき、
別々のベクター上にある形で導入することもできる。導入された核酸による安定
的なトランスフェクションを受けた細胞は、薬剤選択法によって同定することが
できる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、他の細胞は死
滅すると考えられる）。

【００４９】または、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、組換
え発現ベクターの転写および翻訳をインビトロで行わせることもできる。

【００５０】上記の組換え法に加えて、2つのポリペプチド、例えばHspおよび異種ポリペプ
チドを連結させて結合物を形成させることにより、本発明の融合蛋白質を形成さ
せることもできる。Hsp結合物を形成させる方法は、国際公開公報第89／12455号
、国際公開公報第94／29459号、国際公開公報第98／23735号および国際公開公報
第99／07860号に記載されており、それらの内容は参照として本明細書に組み入
れられる。本明細書で用いるHsp「結合物」は、カップリング剤の作用によって
異種ポリペプチドと共有結合したHspを含む。本結合物はこのため、互いに結合
した2つの別々の分子を含む。本明細書で用いる「カップリング剤」という用語
は、1つのポリペプチドを別のポリペプチドと、例えばHspを異種ポリペプチドと
結合させることができる試薬のことを指す。結合が生理的条件下でアッセイに必
要な時間（例えば、少なくとも12時間、好ましくは少なくとも72時間）にわたっ
て安定であるように構成要素を結合させることができる任意の結合が適している
。2つの構成要素の間の結合は、例えばHspが異種ポリペプチドと直接結合すると
いうように直接的でもよく、または例えばHspがバックボーンなどの中間体と結
合し、その中間体がさらに異種ポリペプチドと結合するというように間接的でも
よい。カップリング剤は、Hsp、バックボーン（存在する場合には）および異種
ポリペプチドの化学的安定性が実質的に保持される温度、pH、塩、溶媒系および
他の反応物の条件下で働く必要がある。

【００５１】カップリング剤には、結果として得られる融合蛋白質にカップリング剤が付加
されずに、Hspおよび異種ポリペプチドなどの構成要素を結合させうるものがあ
る。その他のカップリング剤では、結果として得られる融合蛋白質にカップリン
グ剤が付加される。例えば、カップリング剤は、薬剤の1つまたは複数の原子成
分が組成物中に保持されるホモ二官能性またはヘテロ二官能性の架橋剤でもよい
。架橋剤でないカップリング剤はカップリング反応後に完全に除去しうるため、
分子生成物は完全にHsp、異種ポリペプチドおよびバックボーン部分（あれば）
から構成される。

【００５２】多くのカップリング剤は、アミンおよびカルボン酸と反応してアミドを形成す
る、またはアルコールおよびカルボン酸と反応してエステルを形成する。カップ
リング剤は当技術分野で知られており、例えば、本明細書で参考文献としている
ボダンスキー（M. Bodansky）、「ペプチド合成の原理（Principles of Peptide
Synthesis）」、第2版、ならびにグリーン（T. Greene）およびワッツ（P. Wut
s）「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」
第2版、1991、John Wiley、NYを参照されたい。カップリング剤は、構成要素部
分を安定的に結合させると同時に、Hspまたは異種ポリペプチドの変性もしくは
失活がほとんどまたは全く生じさせないものである必要がある。

【００５３】本発明の結合物は、当技術分野で知られた方法を用いてHspを異種ポリペプチ
ドと結合させることによって調製することができる。架橋剤を含むさまざまなカ
ップリング剤を共有結合のために用いることができる。架橋剤の例には、N,N'-
ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC；Pierce）、N-サクシニミジル-S-アセチ
ル-チオアセテート（SATA）、N-サクシニミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピ
オネート（SPDP）、オルト-フェニレンジマレイミド（o-PDM）およびスルホサク
シニミジル 4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（ス
ルホ-SMCC）が含まれる。例えば、カルポブスキー（Karpovsky）ら（1984）J. E
xp. Med. 160：1686およびリュウ（Liu）ら（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82：8648を参照されたい。その他の方法には、パウルス（Paulus）（1985）Be
hring Ins. Mitt. 78：118〜132；ブレナン（Brennan）ら（1985）Science 229
：81〜83；およびグレニー（Glennie）ら（1987）J. Immunol. 139：2367〜2375
に記載されたものが含まれる。ペプチドおよび蛋白質用の多数のカップリング剤
が、緩衝液、溶媒および使用方法とともに、ピアスケミカル社（Pierce Chemica
l Co.）のカタログのページT-155〜T-200、1994（3747N. Meridian Rd.、Rockfo
rd IL、61105、U.S.A.；Pierce Europe B.V.、P.O. Box 1512、3260BA Oud Beij
erland、The Netherlands）に記載されており、このカタログは参照として本明
細書に組み入れられる。

【００５４】 DCCは有用なカップリング剤である（Pierce #20320；Rockford、IL）。これは
DMSO（Pierce #20684）中でのアルコールNHSのカップリングを促進し、ポリリジ
ンと架橋させることが可能な活性化エステルを形成する。DCC（N,N'-ジシクロヘ
キシルカルボジイミド）はペプチド合成におけるカップリング剤としてよく用い
られるカルボキシ反応性架橋剤であり、分子量は206.32である。もう1つの有用
な架橋剤はSPDP（Pierce #21557）であり、これは第一級アミンおよびスルフヒ
ドリル基とともに用いるためのヘテロ二官能性架橋剤である。SPDPの分子量は31
2.4、スペーサーアーム長は6.8Åであり、これはNHS-エステルおよびピリジルジ
チオ基と反応性があり、切断可能な架橋を形成してその後の反応によってこの薬
剤は除去されるため、Hspをバックボーンまたは異種ポリペプチドと直接結合さ
せることができる。その他の有用な結合剤には、二段階架橋のために保護SH基を
導入してヒドロキシルアミン-HCl（Pierce #26103）で脱保護するためのSATA（P
ierce #26102）、ならびにアミンおよびスルフヒドリルとの反応性のあるスルホ
-SMCC（Pierce #22322）がある。その他の架橋剤およびカップリング剤もピアス
ケミカル社（Pierce Chemical Co.）（Rockford、IL）から入手しうる。蛋白質
の他の蛋白質もしくは他の組成物との結合、例えばレポーター基もしくは蛋白質
の金属イオン標識用のキレート剤との結合を目的とするこのほかの化合物および
工程、特にシッフ塩基を中間体として用いるものは、欧州特許第243,929 A2号（
1987年11月4日に公開）に開示されている。

【００５５】カルボキシル基を含むポリペプチドは、あらかじめ形成された反応性エステル
（N-ヒドロキシサクシニミドエステルなど）、またはカルボジイミドを介した反
応によってインサイチューで結合したエステルにより、異種ポリペプチド中のリ
ジンε-アミノ基と結合させることができる。スルホン酸基を含むHspにも同じこ
とが適用され、これはアミノ基と反応する塩化スルホニルに変換させることがで
きる。カルボキシル基を含むHspは、インサイチューカルボジイミド法により、
ポリペプチド上のアミノ基と結合させることができる。Hspをセリンもしくはト
レオニン残基のヒドロキシル基、またはシステイン残基のスルフヒドリル基と結
合させることもできる。

【００５６】 Hspおよび異種ポリペプチドなどの2つのポリペプチドの結合物に加えて、非ペ
プチド化合物が少なくとも8アミノ酸長のポリペプチドと共有結合したものを含
むハイブリッド化合物を作製することも可能である。このハイブリッド化合物の
ポリペプチド成分は、Hsp融合蛋白質または結合物の構成要素として本明細書に
記載するいずれの異種ポリペプチドであってもよい。このハイブリッド化合物の
非ペプチド成分の例には、分子量が約5,000グラム／モル未満、好ましくは約1,5
00グラム／モル〜100グラム／モルの範囲にあるポリヌクレオチド、ポリヌクレ
オチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物または無機化合
物、ならびにこのような非ペプチド化合物の塩、エステルおよび薬学的に許容さ
れるその他の形態が含まれる。

【００５７】Th1様活性に関するインビトロアッセイ未処置リンパ球を含む細胞試料を任意の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウ
サギ、ヤギまたはヒトから調製し、1つまたは複数の組織培養プレートに適切な
密度で播く。未処置リンパ球とは、細胞をインビトロアッセイに用いる前に（イ
ンビボおよびインビトロで）融合蛋白質（または、結合して融合蛋白質を形成す
るポリペプチドのいずれか）に曝露されていないリンパ球のことである。細胞試
料は、動物のさまざまな一次もしくは二次リンパ系器官または組織、例えば、脾
臓、リンパ節、末梢血、骨髄または胸腺のいずれに由来するものでもよい。肺、
気道（咽頭、喉頭、気管、気管支など）および肛門性器粘膜などの、リンパ系細
胞を含む体内のいずれかの組織から試料を得ることもできる。細胞試料は、NK細
胞、NK T細胞、αβT細胞およびγδT細胞から選択される未処置リンパ球を含み
うる。細胞試料は未分画のものでもよく、1つまたは複数の特定の細胞種を豊富
に含むものでもよい。未処置リンパ球に加えて、細胞試料は、マクロファージ、
樹状細胞および／またはB細胞などの未処置抗原提示細胞を選択的に含むことが
できる。細胞試料は、形質転換T細胞系またはT細胞クローンなどの細胞系を選択
的に含むことができる。

【００５８】細胞試料を、本明細書に記載の融合蛋白質または結合物に対してインビトロで
曝露させる。細胞試料を融合蛋白質または結合物と一定期間、例えば6、12、24
、36、48、60、72または96時間にわたってインキュベートした後、細胞試料にお
いてTh1様応答が誘発されたか否かに関する決定を行う。Th1様応答は例えば、細
胞試料による特定のリンホカイン、例えばIFN-γまたはTNF-βの産生を測定する
ことによって検出することができる。または、SLAM（シグナル伝達性リンパ球活
性化分子）などの細胞表面マーカーの発現またはサイトカインの発現をさまざま
な技術（例えば、フローサイトメトリー）を用いてアッセイすることによってTh
1様応答を検出することもできる。

【００５９】 1つの例では、未処置リンパ球を含むプールした未分画脾細胞培養物をマウス
から調製し、組織培養プレートに播く。脾細胞の単離および培養の方法は、「免
疫学における最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）」、コリ
ガン（Coligan）ら編、John Wiley & Sons、2000に記載されている。続いて、例
えば、国際公開公報第99／07860号に記載されており、以下の実施例の項で用い
ているHspE7などの標準的な抗原-ストレス蛋白質融合蛋白質に対する測定可能な
IFN-γ応答が誘発されるのに十分な時間にわたり、脾細胞の培養物を種々の濃度
の被験蛋白質、例えば組換えHsp融合蛋白質、Hsp、抗原単独または別の抗原を含
む融合蛋白質に対して曝露させる。細胞試料を被験蛋白質に曝露させた後に、TF
N-γELISAなどの適したアッセイを用いて、細胞外培地中のIFN-γレベルを測定
する。

【００６０】以下に述べるアッセイの結果から、脾細胞またはリンパ節細胞のHsp融合蛋白
質への曝露によって誘発されるIFN-γ放出は、抗原単独、Hsp単独、抗原とHspと
の混合物、または抗原とHsp以外の蛋白質との融合物への曝露によって誘導され
るものよりもはるかに大きいことが明らかになった。

【００６１】本発明のアッセイは、Hsp融合蛋白質の標本を評価するため（例えば、品質管
理アッセイとして）、またはHsp融合蛋白質の異なる標本を比較するために用い
ることができる。本アッセイで行う測定は、特に融合蛋白質標本の特に活性のあ
るバッチを同定するため、または標準的なバッチを除外するための方法となる。
本アッセイを生産手順、貯蔵方式などを最適化するために用いることもできる。
特定の抗原に対する最大のTh1様応答が望ましい場合には、本アッセイを用いて
、抗原と異なる種類のHspまたは異なる由来のHspとの間のさまざまな融合物の試
験を行うことができる。さらに、本アッセイを用いて、Hspと融合させた際に最
も顕著なTh1様応答を引き起こす抗原を同定する目的で、さまざまな一連の抗原
候補の試験を行うこともできる。

【００６２】また、本アッセイを、Th1様応答を誘発させる主な原因であり、このため治療
薬となる可能性のある抗原配列またはHsp配列中の領域を同定するために用いる
こともできる。抗原におけるこのような活性領域を同定するためには、抗原の個
々の小領域をHspと融合させたものを含む融合物を調製し、本発明のアッセイで
検討するとよい。Hspにおける活性領域を同定するためには、Hspの個々の小領域
を抗原と融合させたものを含む融合物を調製して検討するとよい。これらの決定
により、Th1様応答を誘発させるのに十分な抗原および／またはHspの小領域を含
む短縮型の融合蛋白質を作製するための基盤が得られると考えられる。Hspの小
領域および／または抗原の小領域を含む融合物は、誘発されたTh1様応答を、既
知の活性を有する完全長融合蛋白質、例えばHspE7によって誘導されるものと比
較することによって検討することができる。

【００６３】本明細書に記載の融合蛋白質は、Th1様応答を刺激する効果に関して化合物を
スクリーニングするためのアッセイにおいて有用である。例えば、インビトロア
ッセイでIFN-γ分泌を刺激することが明らかになったHsp融合蛋白質は、同じ効
果を生じる能力に関して候補化合物の試験を行うための対照として用いることが
できる。

【００６４】インビトロでTh1様応答を刺激するための本明細書に記載のシステムは、個体
への再移植用の活性化Th1細胞をエクスビボで作製するために用いることができ
る。これは、Th2免疫応答が優勢であってTh1応答が不十分であることを特徴とす
る状態を治療するために有用と思われる。

【００６５】本アッセイを、Th1様応答を調節しうる化合物を同定するために用いることも
できる。化合物は、Hsp融合蛋白質によって誘導されるTh1様応答を阻害する能力
、Hsp融合蛋白質と同様な様式でTh1様応答を促す能力、またはHsp融合蛋白質（
または、Hsp融合蛋白質と同等な様式で作用することが明らかになった任意の他
の蛋白質）によって誘導されるTh1様応答を増強する能力に関してスクリーニン
グすることができる。阻害性化合物は、Th1応答が不適切であることを特徴とす
る状態、例えば炎症性疾患または自己免疫疾患を治療するために有用と思われる
。阻害剤（例えば、抗原-ストレス蛋白質融合蛋白質の抗原提示細胞との結合、
またはストレス蛋白質融合物によって増強される抗原プロセシングに対する）の
可能性のあるものは、以下の通りにスクリーニングすることができる。未処置リ
ンパ球を含む細胞試料を、IFN-γ分泌などのTh1様応答を誘導することが知られ
た融合蛋白質または結合物と混合する。阻害剤の可能性があるものとしてスクリ
ーニングしようとする化合物を、融合蛋白質または結合物の添加の前、後または
添加と同時に細胞培養物に添加する。IFN-γ放出などによって測定されるTh1様
応答の誘導に対する化合物の効果は、その応答を、融合蛋白質または結合物のみ
を細胞試料に添加した場合に得られるものと比較することによって決定しうる。

【００６６】同様の様式で、Th1様応答を促す能力に関して化合物をスクリーニングするこ
とができる。Th1様応答を調節する能力に関して、ペプチド性および非ペプチド
性化学物質の双方を含む、任意の化合物をスクリーニングすることができる。こ
れらの化合物には、分子量が約5,000グラム／モル未満のペプチド、ペプチド模
倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、
ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物また
は無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステルおよび薬学的に許容さ
れる他の形態が非制限的に含まれる。この場合には、未処置リンパ球を含む細胞
試料を被験化合物と接触させる。続いて、IFN-γ放出などによって測定されるTh
1様応答の誘導に対する被験化合物の効果を測定し、対照（被験試料のないもの
）またはTh1様応答を刺激することが知られたHsp融合物と比較する。このアッセ
イは、Th1様応答を刺激するために用いうる新規化合物を同定するために用いる
ことができる。化合物によって刺激されるTh1様応答は、HspE7融合蛋白質によっ
て誘導される最大応答レベルの少なくとも25％、例えば少なくとも40％、50％、
60％、70％または80％であることが好ましい。1つの態様において、化合物は好
ましくは天然にみられない化合物である。もう1つの態様において、化合物は、
天然の蛋白質の断片とは対応しないペプチドである。

【００６７】以下は、本発明の実施例である。これらはいかなる形でも本発明の範囲を制限
するものとみなされるべきではない。

【００６８】実施例実施例1：組換え蛋白質の産生のための細菌増殖および細胞溶解 pET65をBL21（DE3）pLysS（Novagen）への形質転換に用いたことを除き、すべ
ての組換え蛋白質の産生に関して、大腸菌BL21（DE3）株またはBLR（DE3）株（N
ovagen）を宿主として用いた。pET65を有するBL21（DE3）pLysS細胞は、30μg／
mlのカナマイシンおよび34μg／mlのクロラムフェニコールを含む2×YT培地（20
g／Lトリプトン；10g／L酵母抽出物、20g／L NaCl；ミリQ（Milli-Q）（登録商
標）品質の水）中で増殖させ、他のすべての形質転換体は30μg／mlのカナマイ
シンを含む2×YT培地中で増殖させた。細菌培養物はすべて2Lの振盪フラスコ中
で200〜400rpmにてOD_６００＝0.5となるまで増殖させた後、0.5mM IPTGで37℃で
3時間誘導した。続いて細胞を4℃、4,000〜8,000gでの5分間の遠心処理によって
回収した後に、300mlの溶解緩衝液（10mM TRIS-HCl、10mM 2-メルカプトエタノ
ール、pH 7.5）中に懸濁し、リゾチームを200μg／mLとなるように添加し、懸濁
液を混合して-70℃で保存した。

【００６９】組換え蛋白質を精製するために、37℃水浴を用いて細胞を解凍し、プロテイナ
ーゼ阻害剤を添加した（2μg／mlアプロチニン、2μg／mlロイペプチン、2μg／
mlペプスタチンおよび2mM PMSF）。細胞懸濁液を50mLずつの試料に分けて氷上で
保存し、超音波処理を出力レベル5〜8（Sonicator 450、Branson, Corp.）で30
秒間ずつ3〜4回行った。4℃、35,000〜60,000gでの10〜20分間の遠心処理によっ
て上清をペレットから分離した。可溶性蛋白質の場合は、上清を保存して可溶性
画分として処理した。封入体に認められる蛋白質に関しては、上清を廃棄してペ
レットを溶解緩衝液（1M尿素、1％（v／v）Triton X-100を選択的に含む）で洗
浄した。続いて、この結果得られた混合物を4℃、35,000〜60,000gで10〜20分間
遠心し、上清を廃棄した。ペレットは8M尿素を含む溶解緩衝中に溶解した。続い
てこの混合物を4℃、35,000〜60,000gで10〜20分間遠心し、ペレットを廃棄して
上清を封入体画分として-70℃で保存した。

【００７０】実施例2：組換えウシ結核菌（M. bovis）BCG Hsp65（Hsp65）の作製 Hsp65をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。以下のプライマーを
用いて、ウシ結核菌（M. bovis）BCGのHsp65をコードする配列をpRIB1300（van
Edenら（1988）Nature 331：171〜173）からPCR増幅した。順方向プライマーは、NcoI部位にATG開始コドンを1つ含む。逆方向プライマーは、TGA停止コドンの下流にNheI部位を1つ含む。PCR産物をNcoIおよびNheIで消
化し、精製した上で、NcoIおよびNheIで切断したpET28a（Novagen）に連結させ
た。プラスミドpET65は、ウシ結核菌BCGのHsp65蛋白質（Hsp65と略記）をコード
する。Hsp65（配列番号：4）の発現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：
3）は図1A〜1Bに示されている。

【００７１】 Hsp65蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET65による形質転換を受け
た大腸菌BL21（DE3）pLysS細胞から、可溶性画分を上記の通りに調製した。可溶
性画分に存在するウシ結核菌BCGのHsp65蛋白質（Hsp65）を以下のクロマトグラ
フィー工程を用いて精製した：SP-セファロース（200mlカラム、Amersham Pharm
acia）、Q-セファロース（200mlカラム、Amersham Pharmacia）、セファクリルS
-300（500mlカラム、Amersham Pharmacia）およびセラミックヒドロキシアパタ
イト（HAP；100mlカラム、Biorad）。精製したHsp65をダルベッコ変法リン酸緩
衝生理食塩水（DPBS）／15％（v／v）グリセロール中に移し、-70℃で保存した
。

【００７２】実施例3：組換えHPV16 E7（E7）の作製 HPV16 E7をコードするプラスミドは以下の通りに構築した。プライマーw280お
よびw134 を用いて、pSK／HPV16（ATCC）からHPV16 E7のコード配列をPCR増幅した。PCR産
物を制限酵素NcoIおよびEcoRIで消化し、アガロースゲルにより精製した。精製
したPCR産物を、同じ酵素であらかじめ消化したpET28aに連結させた。連結反応
を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、HPV16 E7遺伝子挿入断片を含むと推
定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択した。この最初の制限解析を
、遺伝子全体、プロモーターおよび末端領域のDNA配列解析によって確認した。
続いて、pET／E7（NH）と命名された確認済みの構築物のDNAを電気穿孔法によっ
て大腸菌BL21（DE3）に導入した。E7（配列番号：8）の発現をコードするヌクレ
オチド配列（配列番号：7）は図2に示されている。

【００７３】 HPV16 E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET／E7（NH）による形
質転換を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、可溶性画分を上記の通りに調製し
た。HPV16 E7蛋白質は以下のクロマトグラフィー工程を用いて精製した：Q-セフ
ァロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）；スーパーデックス200（26／60
カラム、Amersham Pharmacia）；およびNiキレート性セファロース（100ml、Ame
rsham Pharmacia）を2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件下
で用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗浄し、続いてHPV E7
蛋白質を含むプール画分を30mM TRIS-HCl、1M NaCl、1mM 2-メルカプトエタノー
ル、pH 7.5に対して一晩透析した。Niキレート性セファロース（75ml、Amersham
Pharmacia）を、2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件下で
用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗浄することにより、透
析した蛋白質をさらに精製した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な
画分をプールした上で、DPBS／10％（v／v）グリセロールに対して4℃で一晩透
析した。

【００７４】実施例4：組換えのヒスチジンタグされたHPV16 E7（(h)E7）の作製 (h)E7をコードするプラスミドは以下の通りに構築した。以下のプライマーを
用いて、HPV16 E7のコード配列をHPV16のゲノムDNA（pSK／HPV16）からPCR増幅
した。順方向プライマーは、ATG開始コドンの上流にNheI部位を1つ含む。逆方向プライマーは、TAA停止コドンの下流にEcoRI部位を1つ含む。PCR産物をNheIおよびEcoRIで
消化し、精製した上で、NheIおよびEcoRIで切断したpET28aに連結させた。N末端
にヒスチジンタグを含むHPV16 E7蛋白質（(h)E7と略記）をコードするpET／H／E
7を、大腸菌BL21（DE3）細胞の形質転換に用いた。(h)E7（配列番号：12）の発
現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：11）は図3に示されている。

【００７５】 (h)E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET／H／E7による形質転換
を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した。封
入体画分に存在するN末端にヒスチジンタグが付加されたHPV16 E7蛋白質（(h)E7
）を以下のクロマトグラフィー工程を用いて精製した：Niキレート性セファロー
ス（60ml、Amersham Pharmacia）を、2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗浄
による変性条件下で用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗浄
した。結合した(h)E7を樹脂上でリフォールディングさせ、50〜500mMのイミダゾ
ール勾配によって溶出させた。精製した(h)E7をDPBS／25％（v／v）グリセロー
ルに対して透析した。

【００７６】実施例5：組換えHPV16 E7-ウシ結核菌BCG 65融合蛋白質（HspE7）の作製 HspE7をコードするプラスミドは以下の通りに構築した。pET65の場合と同じ順
方向プライマー（w046）を用いて、pRIB1300からウシ結核菌BCG Hsp65のコード
配列をPCR増幅した。逆方向プライマーは、TGA停止コドンの上流にNdeI部位を1つ、下流にNheI部位を1つ含む。PCR産物
をNcoIおよびNheIで消化し、精製した上で、NcoIおよびNheIで切断したpET28aに
連結させた。

【００７７】 HPV16 E7のコード配列は、以下のプライマーを用いて、HPV16のゲノムDNA（pS
K／HPV16）からPCR増幅した。順方向プライマーは、NdeI部位にATG開始コドンを1つ含む。逆方向プライマーは、TAA停止コドンの下流にEcoRI部位を1つ含む。PCR産物をNdeIおよびEcoRIで
消化して精製した上で、NdeIおよびEcoRIで切断したpET65Cに連結させ、この結
果得られたプラスミド（pET65C／E7-1N）を大腸菌BL21（DE3）細胞の形質転換に
用いた。pET65C／E7-1Nは、Hsp65がそのC末端でHPV16 E7と連結したものからな
る融合蛋白質（HspE7と略記）をコードする。HspE7（配列番号：17）の発現をコ
ードするヌクレオチド配列（配列番号：16）は図4A〜4Bに示されている。

【００７８】 HspE7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET65C／E7-1Nによる形質転
換を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、可溶性画分を上記の通りに調製した。
可溶性画分に存在するHsp65-HPV16 E7融合蛋白質（HspE7）を、以下のクロマト
グラフィー工程を用いて精製した：0〜15％硫酸アンモニウム沈殿、Niキレート
性セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）およびQ-セファロース（1
00mlカラム、Amersham Pharmacia）。6Mグアニジン-HCl（Gu-HCl）の存在下でNi
キレート性セファロースカラムを1％（v／v）Triton X-100で十分に洗浄するこ
とによって内毒素を除去した。精製したHspE7をDPBS／15％（v／v）グリセロー
ルに移し、-70℃で保存した。

【００７９】実施例6：組換えヒト結核菌（M. tuberculosis）Hsp40-HPV16 E7融合蛋白質（MT 40-E7）の作製 pETMT40E7は、ヒト結核菌（H37RV株-ATCC 27294）Hsp40蛋白質のC末端にhu HP
V16（ATCC 45113）のE7蛋白質が結合したものから構成されるキメラ型組換え蛋
白質をコードするプラスミドである。このプラスミドを蛋白質の産生および精製
のために大腸菌 BL21（DE3）細胞の形質転換に用いた。MT40-E7（配列番号：19
）の発現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：18）は図5A〜5Bに示されて
いる。

【００８０】 MT40-E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpETMT40E7による形質転換
を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した。MT4
0-E7蛋白質を以下のクロマトグラフィー工程を用いて精製した：Q-セファロース
（100mlカラム、Amersham Pharmacia）、Niキレート性セファロース（70ml、Ame
rsham Pharmacia）を2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件下
で用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗浄した。蛋白質の純
度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分をプールした上で、DPBS／10％（v／v）
グリセロールに対して4℃で一晩透析した。

【００８１】実施例7：卵白アルブミン（OVA）卵白アルブミン（ロット番号37H7010）をシグマケミカルズ（Sigma Chemicals
）社から購入し、20mLのCon Aセファロース（Amersham-Pharmacia）を用いるク
ロマトグラフィーによって精製した。精製産物を含む画分をプールし、DPBSに対
して一晩透析した。

【００８２】実施例8：組換えウシ結核菌BCG Hsp65-卵白アルブミン融合蛋白質（HspOva）の
作製 HspOvaをコードするプラスミドを以下の通りに構築した。完全長ニワトリ卵白
アルブミンのコード配列をNheIおよびEcoRI消化によってpET／OVAから切り出し
、アガロースゲルによって精製した。OVAの発現をコードする配列は図6に示され
ている。精製産物を、同じ酵素であらかじめ消化したpET65Hに連結させた。連結
反応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、ニワトリ卵白アルブミン遺伝子
挿入断片を含むと推定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択した。こ
の最初の制限解析を、融合遺伝子全体、プロモーターおよび末端領域のDNA配列
解析によって確認した。pET65H／OVAと命名された確認済みの構築物のDNAを大腸
菌BL21株（DE3）の形質転換に用いた。HspOVA（配列番号：21）の発現をコード
するヌクレオチド配列（配列番号：20）は図7A〜7Cに示されている。

【００８３】 HspOva蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET65H／OVAによる形質転
換を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した。
封入体画分に存在するHspOva融合蛋白質を以下のクロマトグラフィー工程を用い
て精製した：Q-セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）およびNiキ
レート性セファロース（60ml、Amersham Pharmacia）を2％（v／v）Triton X-10
0を含む連続洗浄による変性条件下で用いた後に残存するTriton X-100を除去す
るために連続洗浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分をプ
ールした上で、DPBS／15％（v／v）グリセロールに対して4℃で一晩透析し、続
いてDPBS／2.5％（w／v）スクロースに対して透析した。

【００８４】実施例9：組換えグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）の作製 Gstをコードするプラスミドを以下の通りに構築した。カナマイシン耐性コー
ド配列をAlwNIおよびXhoI消化によってpET28a DNAから切り出し、アガロースゲ
ルによって精製した。精製産物を同じ酵素であらかじめ消化したpGEX-4T-2に連
結させた。連結反応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、カナマイシン耐
性遺伝子挿入断片を含むと推定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択
した。この最初の制限解析を、挿入断片のコード配列全体、プロモーターおよび
末端領域のDNA配列解析によって確認した。pGEX／Kと確認済みの構築物のDNAを
大腸菌BL21株（DE3）の形質転換に用いた。GST（配列番号：23）の発現をコード
するヌクレオチド配列（配列番号：22）は図8に示されている。

【００８５】 GST蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpGEX／Kによる形質転換を受け
た大腸菌BL21（DE3）細胞から、可溶性画分を上記の通りに調製した。可溶性画
分に存在するGST蛋白質をグルタチオン-アガロースクロマトグラフィーによって
以下の通りに精製した。約20mLのグルタチオン-アガロース（Sigma-Aldrich；カ
タログ番号：G4510）をDPBSで平衡化して混合し、試料とともに振盪機にて室温
で一晩インキュベートした。その翌朝に樹脂をカラムに充填し、DPBSで連続洗浄
した。2％（v／v）Triton X-100による洗浄後に残存するTriton X-100を除去す
るための連続洗浄を行うことによって内毒素を除去した。最後に、10mMグルタチ
オン（還元型）、50mM TRIS-HCl、pH 8.0を用いて蛋白質を溶出させた。

【００８６】実施例10：組換えグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-HPV16 E7融合蛋白質（GS T-E7）の作製 GST-E7をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。HPV16 E7のコード配
列をBamHIおよびEcoRI消化によってpETOVA／E7から切り出し、アガロースゲルに
よって精製した。精製産物を、同じ酵素であらかじめ消化したpGEX／Kに連結さ
せた。連結反応を用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、HPV16-E7遺伝子挿入断
片を含むと推定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択した。この最初
の制限解析を、融合遺伝子全体、プロモーターおよび末端領域のDNA配列解析に
よって確認した。 pGEX／K／E7と命名された確認済みの構築物のDNAを大腸菌BL2
1株（DE3）の形質転換に用いた。GST-E7（配列番号：25）の発現をコードするヌ
クレオチド配列（配列番号：24）は図9に示されている。

【００８７】 GST-E7蛋白質は以下の通りに精製した。発現ベクターpGEX／K／E7を含む細菌
を増殖させ、本質的にはGSTに関して上に述べた通りのアフィニティークロマト
グラフィー手順を用いて蛋白質を精製した。

【００８８】実施例11：組換えHPV16 E7-リンカー-ウシ結核菌BCG Hsp65融合蛋白質（E7-L-BC G65）の作製 E7-L-BCG65をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。プライマーw280
およびw396 を用いて、pSK／HPV16（ATCC）からHPV16 E7のコード配列をPCR増幅した。PCR産
物を制限酵素NcoIおよびSpeIで消化し、アガロースゲルによって精製した。精製
したPCR産物を、同じ酵素であらかじめ消化したpET5'65（pET5'65は、ウシ結核
菌BCGのhsp65配列の5'末端にポリグリシンリンカー配列が挿入されたpET65であ
る）に連結させた。連結反応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、HPV16 E
7遺伝子挿入断片を含むと推定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択
した。この最初の制限解析を、融合遺伝子全体、プロモーターおよび末端領域の
DNA配列解析によって確認した。pET／E7／5'65と命名された確認済みの構築物の
DNAを大腸菌BLR株（DE3）の形質転換に用いた。E7-L-BCG65（配列番号：29）の
発現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：28）は図10A〜10Bに示されてい
る。

【００８９】 E7-L-BCG65蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET／E7／5'65による
形質転換を受けた大腸菌BLR（DE3）細胞から、可溶性画分を上記の通りに調製し
た。可溶性画分に存在するE7-L-BCG65融合蛋白質を、以下のクロマトグラフィー
工程を用いて精製した：ブチルセファロース（100ml、Amersham-Pharmacia）、Q
-セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）、スーパーデックス200に
よるゲル濾過（26／60カラム、Amersham Pharmacia）およびNiキレート性セファ
ロースによる高速クロマトグラフィー（60ml、Amersham Pharmacia）を2％（v／
v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件下で用いた後に残存するTriton
X-100を除去するために連続洗浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、
適切な画分をプールした上で、DPBSに対して4℃で一晩透析した。試料に含まれ
る内毒素の量を減らすため、あらかじめ充填されたデトキシゲル（DetoxiGel）
（登録商標）の1mlカラム（Pierce、Rockford、IL、USA）を製造者の指示に従っ
て用いて、これをさらに精製した。

【００９０】実施例12：組換えHPV16 E7-ウシ結核菌BCG Hsp65断片の融合蛋白質（BCG65(F1)- E7）の作製 BCG65(F1)-E7をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。プライマーw0
46およびw293 を用いて、ウシ結核菌BCG hsp65遺伝子のアミノ末端側の最初の600塩基対をpET6
5C／E7-1NからPCR増幅した。PCR産物を制限酵素NcoIおよびNdeIで消化し、アガ
ロースゲルにより精製した。精製したPCR産物を、同じ酵素であらかじめ消化し
たpET65C／E7-1Nに連結させた。連結反応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行
い、切断型BCG65遺伝子を含むと推定されるクローンを診断的制限消化に基づい
て選択した。この最初の制限解析を、融合遺伝子全体、プロモーターおよび末端
領域のDNA配列解析によって確認した。pET65F1／E7と命名された確認済みのプラ
スミド構築物を大腸菌BLR株（DE3）の形質転換に用いた。BCG65(F1)-E7（配列番
号：33）の発現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：32）は図11に示され
ている。

【００９１】 BCG65(F1)-E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET65F1／E7による
形質転換を受けた大腸菌BLR（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製し
た。封入体画分に存在するBCG65(F1)-E7融合蛋白質を、以下のクロマトグラフィ
ー工程を用いて精製した：ソース（Source）15Qセファロース（Amersham-Phanna
cia）およびNiキレート性セファロース（60ml、Amersham Pharmacia）を2％（v
／v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件下で用いた後に残存するTrito
n X-100を除去するために連続洗浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ
、適切な画分をプールした上で、DPBSに対して4℃で一晩透析した。

【００９２】実施例13：組換えヒト結核菌Hsp10-HPV16 E7融合蛋白質（TB10-E7）の作製発現プラスミドpETESE7は、ヒト結核菌H37RV株（ATCC 27294）groES（Hsp10）
コード配列の3'末端をHPV16（ATCC 45113）E7コード配列と融合させたものから
構成されるキメラ遺伝子を含む。蛋白質の産生および精製のために、このキメラ
遺伝子を発現ベクターpET28a中にクローニングし、大腸菌BL21（DE3）細胞への
形質転換に用いた。TB10-E7（配列番号：35）の発現をコードするヌクレオチド
配列（配列番号：34）は図12に示されている。

【００９３】 TB10-E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpETESE7による形質転換を
受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した。封入
体画分に存在するTB10-E7融合蛋白質を以下のクロマトグラフィー工程を用いて
精製した：DEAEセファロース（100mlカラム、Amersham Phannacia）、ソース15Q
セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）およびNiキレート性セファ
ロース（60ml、Amersham Pharmacia）を2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗
浄による変性条件下で用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗
浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分をプールした上で、
DPBS／10％（v／v）グリセロールに対して4℃で一晩透析した。

【００９４】実施例14：組換えHPV16 E7-ヒト結核菌Hsp71融合蛋白質（E7-TB71）の作製 E7-TB71をコードするプラスミドは以下の通りに調製した。プライマーw048お
よびw079 を用いて、ヒト結核菌hsp71遺伝子をクローンpY3111／8（MehlertおよびYoung（
1989）Mol. Microbiol. 3：125〜130）からPCR増幅した。PCR産物をNcoIおよびN
heIで消化してゲル精製し、同じ酵素で消化したpET28aに連結してpET／71を作製
した。

【００９５】 HPV16 E7のコード配列は、プライマーw280およびw344 を用いて、pSK／HPV16（ATCC）からPCR増幅した。PCR産物を制限酵素NcoIで消化
し、アガロースゲルにより精製した。精製したPCR産物を、5'リン酸を除去する
ためにあらかじめNcoIおよびCIAPで消化したpET／71 DNAに連結させた。連結反
応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、HPV16 E7遺伝子挿入断片を含むと
推定されるクローンを診断的制限消化に基づいて選択した。この最初の制限解析
を、融合遺伝子全体、プロモーターおよび末端領域のDNA配列解析によって確認
した。pET／E7／71と命名された確認済みの構築物を大腸菌BL21株（DE3）の形質
転換に用いた。E7-TB71（配列番号：41）の発現をコードするヌクレオチド配列
（配列番号：40）は図13A〜13Bに示されている。hsp71遺伝子の3'末端からの配
列を含むKpnI〜NheI断片を、プライマーw391およびw392 を用いてpY3111／8から増幅してKpnIおよびNheIで消化したPCR断片で置換するこ
とにより、この結果得られた構築物であるpET／E7／71をさらに改変した（hsp71
遺伝子の3'末端の配列を完成させるため）。この結果得られた最終的なプラスミ
ドであるpET／E7／71'は、HPV16 E7が完全長Hsp71蛋白質のアミノ末端に融合し
たものを発現するが、これを大腸菌BL21株（DE3）の形質転換に用いた。pET／E7
／71'の融合蛋白質（配列番号：45）の発現をコードするヌクレオチド配列（配
列番号：44）は図14A〜14Bに示されている。

【００９６】 E7-TB71蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET／E7／71'による形質
転換を受けた大腸菌 BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した
。封入体画分に存在するE7-TB71融合蛋白質を以下のクロマトグラフィー工程を
用いて精製した：Q-セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）およびN
iキレート性セファロース（80ml、Amersham Pharmacia）を2％（v／v）Triton X
-100を含む連続洗浄による変性条件下で用いた後に残存するTriton X-100を除去
するために連続洗浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分を
プールした上で、DPBS／10％（v／v）グリセロールに対して4℃で一晩透析した
。

【００９７】実施例15：組換え肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）HSP65(2)-HPV16 E7融
合蛋白質（SP65(2)-E7）の作製 SP65(2)-E7をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。プライマーw384
およびw385 を用いて、肺炎球菌hsp65遺伝子をプラスミドpETP60-2（国際公開公報第99／357
20号）からPCR増幅した。PCR産物をNcoIおよびEcoRIで消化してゲル精製し、同
じ酵素で消化したpET28aに連結してpET／SP65-2Cを作製した。

【００９８】 HPV16 E7のコード配列は、プライマーw133およびw134 を用いて、pSK／HPV16（ATCC）からPCR増幅した。PCR産物を制限酵素NheIおよび
EcoRIで消化し、アガロースゲルにより精製した。続いて、精製したPCR産物を、
あらかじめNheIおよびEcoRIで消化したpET／SP65-2Cに連結させた。連結反応を
用いて大腸菌DH5α株の形質転換を行い、HPV16 E7挿入断片を含むと推定される
クローンを診断的制限消化に基づいて選択した。この最初の制限解析を、融合遺
伝子全体、プロモーターおよび末端領域のDNA配列解析によって確認した。pET／
SP65c-E7と命名された確認済みの構築物のDNAを大腸菌BLR株（DE3）の形質転換
に用いた。SP65(2)-E7（配列番号：51）の発現をコードするヌクレオチド配列（
配列番号：50）は図15A〜15Bに示されている。

【００９９】 SP65(2)-E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpET／SP65c-E7による
形質転換を受けた大腸菌BLR（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製し
た。封入体画分に存在するSP65(2)-E7融合蛋白質を以下のクロマトグラフィー工
程を用いて精製した：Q-セファロース（100mlカラム、Amersham Pharmacia）お
よびNiキレート性（60ml、Amersham Pharmacia）を、2％（v／v）Triton X-100
を含む連続洗浄による変性条件下で用いた後に残存するTriton X-100を除去する
ために連続洗浄した。蛋白質の純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分をプー
ルした上で、DPBSに対して4℃で一晩透析した。

【０１００】実施例16：アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Hsp60-HPV 16 E7融合蛋白質（AF60-E7）の組換え作製 pETAF60E7は、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）（AT
CC 26933）Hsp60蛋白質（リーダー配列を伴わないもの）（PCT／CA99／01152号
における記載の通りに入手）をそのC末端でHPV16（ATCC 45113）E7蛋白質配列と
融合させたものから構成される組換え蛋白質AF60-E7をコードするプラスミドで
ある。蛋白質の産生および精製のために、プラスミドpETAF60E7を大腸菌BL21（D
E3）細胞の形質転換に用いた。AF60-E7（配列番号：53）の発現をコードするヌ
クレオチド配列（配列番号：52）は図16A〜16Bに示されている。

【０１０１】 AF60-E7蛋白質は以下の通りに精製した。プラスミドpETAF60E7による形質転換
を受けた大腸菌BL21（DE3）細胞から、封入体画分を上記の通りに調製した。AF6
0-E7蛋白質を以下のクロマトグラフィー工程を用いて精製した：ソース15Qセフ
ァロース（Amersham-Pharmacia）およびNiキレート性セファロース（60ml、Amer
sham Pharmacia）を、2％（v／v）Triton X-100を含む連続洗浄による変性条件
下で用いた後に残存するTriton X-100を除去するために連続洗浄した。蛋白質の
純度をSDS-PAGEによって調べ、適切な画分をプールした上で、DPBSに対して4℃
で一晩透析した。

【０１０２】実施例17：Hsp65-HPVE7（HspE7）融合蛋白質によるIFN-γ放出の刺激 2つの異なる供給源（Charles River LaboratoryおよびJackson Laboratory）
から入手した未処理の未処置C57BL／6マウスからプール未分画脾細胞を調製し、
完全培地（完全RPMI）中にて6×10^５細胞／ウェルの密度で平底96穴組織培養プ
レートに播いた。同型培養物（5件）を、濃度0.05〜1.4nmol／mLの組換えウシ結
核菌BCG Hsp6S（Hsp65）、HPV16 E7（E7）もしくはヒスチジンタグされたE7（(h
)E7）、ウシ結核菌BCG Hsp65とHPV16 E7との混合物（Hsp65＋E7）、またはウシ
結核菌BCG Hsp65-HPV16 E7融合蛋白質（HspE7）とともに72時間インキュベート
した。インキュベート後に細胞をペレット化し、上清をIFN-γ捕捉用ELISAプレ
ートに移した。

【０１０３】インキュベート後に同型試料を回収してエッペンドルフチューブに集め、ベ
ックマン（Beckman）GS-6R遠心機により1200rpm（300×g）で7分間遠心処理を行
ってペレット化した。上清をクリオバイアルに移し、分析時まで-70℃で保存し
た。

【０１０４】マキシソープ（Maxisorp）ELISAプレート（Nuncカタログ番号442404A）を、1
μg／mLの精製ラット抗マウスIFN-γ（PharMingenカタログ番号18181D）（0.1M
NaHCO_３緩衝液、pH 8.2中）により4℃で一晩コーティングした。プレートを0.05
％Tween 20（PBS中）で洗浄した後、3％BSA（アルブミン画分V：Amershamカタロ
グ番号10857）（DPBS中）（ブロッキング緩衝液）で2時間ブロックした。プレー
トを洗浄した後、組換えマウスIFN-γ（8000、4000、2000、1000、500、250、12
5、62.5pg／mL、完全RMPI中）を各ELISAプレートに3通りずつ播いた。試料上清
を-70℃から採取して37℃で急速解凍し、希釈せずにELISAプレートに2通りずつ
加えた。続いて試料を7回にわたり完全RPMIで3倍連続希釈した後、4℃で一晩イ
ンキュベートした。ELISAのバックグラウンド値は、標的抗原を除くすべての試
薬を含む8つのウェルを測定することによって確認した。

【０１０５】結合型マウスIFN-γの検出は、ブロッキング緩衝液中にある1μg／mLのラット
抗マウス IFN-γビオチン結合物（PharMingenカタログ番号18112D）を用いて行
った。洗浄した後に、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合物（Cal
tagカタログ番号SA1008）の1：1000希釈物を用いて結合型のビオチン結合抗体を
検出した。プレートを前と同じように洗浄した後、色素結合基質p-ニトロフェニ
ルリン酸（pNPP；Sigmaカタログ番号N-2765）（ジエタノールアミン緩衝液、pH
9.5中）を1mg／mLとなるように添加した。30分間インキュベートした後に、50μ
Lの100mM EDTA、pH 8.0を用いて呈色反応を停止させた。バイオリンクス（Bioli
nx）2.0ソフトウエアを備えたダイナテック（Dynatech）MR5000 ELISAプレート
リーダーを用いて410nmの吸光度を測定した。各ELISAプレートに関して作成した
標準曲線から、被験試料で検出されるIFN-γレベルを外挿した。データは、放出
されたIFN-γ（pg／mL±SD）として表した。

【０１０６】アッセイの結果を図17A〜17Bに示す。5通りの同型物による平均を標準偏差と
ともに示している。脾細胞の0.05、0.15、0.46および1.4nmol／mLのHspE7に対す
る曝露により、IFNγのかなりの分泌が誘発された。Hsp65単独、E7単独、hE7単
独、およびHsp65とE7との混合物は事実上、IFN-γの放出を刺激することができ
なかった。チャールズリバー研究所（Charles River Laboratory）（図17A）お
よびジャクソン研究所（Jackson Laboratory）（図17B）から入手したマウスか
ら調製した脾細胞で同様の結果が得られた。

【０１０７】実施例18：異なる遺伝的背景を有するマウス由来の脾細胞培養物におけるHspE7
融合蛋白質によるIFN-γ放出の刺激実施例17に示したものと同様の実験を行った。C57BL／6（H-2^ｂ）；Balb／c（
H-2^ｄ）およびC3HeB／FeJ（H-2^ｋ）という3種の異なるハプロタイプのマウス（J
ackson Laboratoryからのもの）からの脾細胞を用いて行った。異なる脾細胞調
製物に対する融合蛋白質の相対的効果は同程度であったが、放出されたIFN-γの
絶対量には差があり、観測値はBalb／c（最も高い；図18A）、C57BL／6（中間；
図18B）およびC3HeB／FeJ（最も低い；図18C）の順であった。実施例17の場合と
同じく、IFN-γ放出のかなりの増加がHspE7によって誘導されたが、E7単独、Hsp
65単独、およびE7とHsp65との混合物によっては誘導されなかった。

【０１０８】実施例19：融合蛋白質によるIFN-γ放出の刺激は、結合させた抗原の性質には依存しないが、結合させたストレス蛋白質部分を必要とするこれまでの実施例で考察した通りに実験を行った。(h)E7またはHsp65（ウシ結
核菌BCG）による未処置脾細胞の刺激によって生じるIFN-γ放出は無視しうる程
度であるが、E7とHsp65（ウシ結核菌BCG）またはHsp40（ヒト結核菌）を含む融
合蛋白質はIFN-γ放出をかなり増強させることが観察された（図19）。E7および
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合蛋白質では、IFN-γの放
出は事実上全く誘導されなかった。卵白アルブミン断片およびHsp（ウシ結核菌B
CG Hsp65）を含む融合蛋白質を試験した際には、高レベルのIFN-γ放出が検出さ
れた。HspOVA融合蛋白質によって媒介されるIFN-γ放出は、OVAを単独で細胞培
養物に添加して得られる程度を上回った。これらの結果は、IFN-γ放出の誘導が
融合蛋白質におけるE7抗原の存在には依存せず、Hspと融合させた他の抗原もIFN
-γ産生を同様に増強させうることを示している。

【０１０９】実施例20：異なるストレス蛋白質部分を有するE7融合蛋白質によるIFN-γ放出の刺激これまでの実施例で考察した通りに実験を行った。HPV16 E7をさまざまなHsp
、すなわちヒト結核菌Hsp10（TB10-E7）、ウシ結核菌BCG Hsp65（HspE7）、肺炎
球菌HSP65(2)（SP65(2)-E7）およびアスペルギルス・フミガーツスHsp60（AF60-
E7）と融合させた。さらに、2つの場合（E7-L-BCG65およびE7-TB71）には、他の
融合物でのアミノ末端の代わりに、E7抗原のカルボキシ末端にHsp（それぞれウ
シ結核菌BCG Hsp65およびヒト結核菌Hsp71）を付加した。

【０１１０】さらに、完全なHspではなく、ウシ結核菌BCG Hsp65配列（BCG65(F1)-E7）のア
ミノ末端側の3分の1（残基1〜200位）にE7抗原を結合させた1つの構築物での検
討も行った。応答の強度には差が認められたものの、脾細胞をすべての異なる融
合蛋白質に曝露させた際にIFN-γ放出の刺激は起こることが観察された（図20A
〜20B）。すなわち、異なる生物体に由来するHsp65ならびに異なる種類のHspを
含む、種々のHspを含む融合物が、IFNγ放出の増強を誘発することが可能であっ
た。さらに、E7抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれにストレス蛋白
質を含む融合物にも活性があった。その上、ウシ結核菌BCG Hsp65のアミノ酸1〜
200位を含むBCG65(F1)-E7も、完全長Hsp65配列（HspE7）と同様の様式でIFNγ分
泌を誘導した。

【０１１１】実施例21：リンパ節細胞培養物におけるHspE7融合蛋白質によるIFN-γ放出の刺
激 IFN-γ放出の誘導能を検討するために、種々の濃度のHspE7蛋白質（10％ウシ
胎仔血清を加えたRPMI 1640と定義される完全培地中に望ましい開始濃度に希釈
したもの）を、同型試料（3〜5通りの同型物）として平底96穴組織培養プレート
に播いた。アッセイの細胞成分に関しては、3個の鼠径リンパ節を未処理C57BL／
6マウスから無菌的に摘出し、5％ウシ胎仔血清を加えたハンクス平衡塩類溶液（
培地）5ml中に入れた。これを0.22μm滅菌ナイロンメッシュに移した後、滅菌シ
リンジのプランジャーを用いて細胞をメッシュ全体に分散させた。培地を用いて
細胞をすすぎ洗いし、プールされた未分画単細胞懸濁液を得た。細胞を1回洗浄
して完全培地中に再懸濁し、ウェルに6×10^５個／ウェルを添加して最終容積を0
.2mlとした。培地中にあるHspE7蛋白質または培地のみに対して、培養物を37℃
の5％CO_２大気下で72時間曝露させた。インキュベート後に同型培養物をプール
し、遠心処理によって細胞をペレット化した上で、上清を実施例17に記載した手
順に従うELISAによってIFN-γ含有量に関して測定するか、または以降の分析の
ために直ちに-70℃で凍結した。

【０１１２】図21は、リンパ節細胞および脾細胞によるIFN-γ放出の誘導を比較した上記の
実験の結果を示している。融合蛋白質はいずれの種類の細胞でもIFN-γの放出を
誘発することが明らかになった。融合蛋白質によって誘発されたIFN-γ放出は、
Hsp65のみによって誘導された程度を大きく上回った。

【０１１３】実施例22：Hsp融合蛋白質の投与によって誘導される、あらかじめ確立された（p re-established）腫瘍のインビボでの退縮ヒト乳頭腫ウイルス16型（HPV16）は、子宮頸癌およびその前駆的な前癌状態
である子宮頸部上皮内腫瘍の誘導と関連のある感染因子である。以下の実験では
、HPV16 E7を発現する宿主細胞を消失させる戦略の一部として免疫認識のターゲ
ティングを行うために、本発明のHsp-HPV16 E7融合蛋白質を用いた。

【０１１４】 H-2^ｂマウス上皮細胞に由来する腫瘍細胞系であるTC-1（HPV16 E6およびE7な
らびに活性化ヒトHa-rasの同時形質転換による）を、ジョンス・ホプキンス大学
（Johns Hopkins University）（Baltimore、MD）のウー氏（T.C. Wu）から入手
した。本明細書で用いるものと類似したアッセイにおけるTC-1細胞の使用は、国
際公開公報第99／07860号に記載されている。TC-1は、10％FBS（Hyclone、カタ
ログ番号SH30071）を加えたRPMI 1640（ICN、カタログ番号1260354）；2mM L-グ
ルタミン（ICN、カタログ番号16-801-49）；10mM HEPES（ICN、カタログ番号16-
884-49）；0.1mM MEM非必須アミノ酸溶液（Gibco BRL、カタログ番号11140-050
）；1mM MEMピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL、カタログ番号11360-070）；50
μM 2-メルカプトエタノール（Sigma、カタログ番号M-7522）；および50mcg／mL
硫酸ゲンタマイシン（Gibco BRL、カタログ番号15750-011）からなる完全培地中
で維持した。培地にはG418（0.4mg／mL活性型、Gibco BRL、カタログ番号11811-
023）およびハイグロマイシンB（0.2mg／mL活性型、Calbiochem、カタログ番号4
00051）も加えた。

【０１１５】 TC-1細胞系はC57BL／6マウスに由来するため、これらの実験ではこのマウス系
統を宿主として用いた。約8〜10週齢の雌性C57BL／6マウスをチャールズリバー
・カナダ（Charles River Canada）社（St-Constant、Quebec、Canada）から購
入し、フィルタートップケージを用いて飼育した（1ケージ当たりマウス4匹の割
合）。

【０１１６】移植用のTC-1細胞は以下の通りに調製した。TC-1細胞を2〜5×10^４個／mLの密
度で播き、集密度が70〜90％となるまで2〜4日間インキュベートした。0.25％ト
リプシン（10倍原液、Gibcoカタログ番号1505-065をDPBSで1倍へと希釈）に30秒
間曝露させることによって細胞をトリプシン処理した後に完全培地を加えた。ト
リプシン処理後に、TC-1細胞を4℃、1000rpm（250×g）で4分間遠心してペレッ
ト化し、上清を吸引除去した上で30mLの冷DPBSを添加した。続いて細胞を4℃、7
00rpm（100×g）で4分間遠心し、上清を吸引除去した上で微量（約5mL）の冷DPB
Sを添加した。注入用の最終的な細胞密度は、トリパンブルー色素排除法による
測定で生細胞6.5×10^５個／mLに調整した。TC-1接種に用いた細胞の少なくとも9
0％は生存していた。細胞は直ちにマウスに注入するために氷上で保存した。

【０１１７】 TC-1細胞の移植は以下の通りに行った。移植の24〜72時間前に、各マウスの腓
腹後部を剃毛した。TC-1細胞を上記の通りに調製し、注入するまで氷上に置いた
。注入はすべて細胞のトリプシン処理から2時間以内に行った。細胞を遠心管内
でゆっくりとかき混ぜ、針を装着せずに1mLシリンジ（Becton-Dickinson、カタ
ログ番号309602）に吸引した。続いて25ゲージ針（Becton-Dickinson、カタログ
番号305122）を装着し、気泡を排出させた。剃毛した皮膚をゆっくりと持ち上げ
、針の斜面を上にして皮膚の真下に挿入した。すべての試験で細胞（1.3×10^５
個）を容量0.2mLとして注入した。5回注入する毎に新しいシリンジおよび針を用
いた。

【０１１８】融合蛋白質は以下の通りに注入した。投与日に、融合蛋白質HspE7、SP65(2)-E
7、AF60-E7、E7-TB71（図23Aおよび23BではE7-MT71と表記）、MT40-E7およびTB1
0-E7（上記の通りに調製した）を-70℃の保存物から回収し、37℃水浴中で解凍
した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（4℃）を添加して、注入用に
望ましい蛋白質濃度にした。希釈した融合蛋白質は、30ゲージ針（Becton-Dicki
nson、カタログ番号3095106）を装着した1mLシリンジ（BectonDickinson、カタ
ログ番号309602）で吸引するまで氷上に保った。同じ用量群の各マウスには同じ
シリンジを用いて0.2mLの融合蛋白質を注入し、5回注入する毎にシリンジに新し
い針を付け替えた。マウスには頸部のできるだけ高い位置の項部に皮下注射した
。

【０１１９】腫瘍発生率（TI）は以下の通りに測定した。TIの記録は一般に腫瘍移植8日後
から開始し、週3回の割合で8週間続けた。腫瘍注入部位の触診および肉眼観察に
よってマウスの皮下腫瘍の有無を評価した。

【０１２０】腫瘍体積は以下の通りに測定した。触知可能な皮下腫瘍結節の体積の測定は移
植後第8日から開始した。コンピュータによるデータ収集を行えるファウラー・
シルバック（Fowler Sylvac）のウルトラ-カル・マークIII（Ultra-Cal Mark II
I）デジタル式キャリパーを用いて、直交する最も長い2つの寸法を測定した。各
データポイントをマイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）のスプレッド
シートの形式で表にした。V＝W^２×L×0.5という式（式中、Vは体積を表し、Wは
幅、Lは長さを表す）を用いて腫瘍結節の測定値をmm^３単位に外挿し、平均腫瘍
体積±平均の標準誤差として提示した。各群における腫瘍体積の平均値の差の有
意性（p＜0.05）を検証すためには、エクセルのスチューデントのt検定関数（両
側、独立標本、等分散）を用いた。

【０１２１】さまざまなhspと結合させた7種類の異なるHPV16 E7融合蛋白質を、腫瘍をイン
ビボで退縮させる能力に関して検討した。

【０１２２】第1の実験では、C57BL／6マウス（各群18匹）の右腓腹後部に1.3×10^５個のTC
-1細胞を皮下注射した（第0日）。7日後に、マウスの群に0.2mLのDPBS（生理食
塩水）、115ugのHspE7、100ugのSP65(2)-E7または100ugのAF60-E7のいずれかを
投与した。後者の2つの蛋白質の投与量は、HspE7中に含まれるE7と同じモル当量
となることに基づいて選択した。マウスを腫瘍の有無のほか、腫瘍体積に関して
観測した。データは、各群当たりの腫瘍発生率（TI）（図22A）、および平均腫
瘍体積±平均の標準誤差として表現した腫瘍体積（図22B）として表した。

【０１２３】図22Aに示されている通り、大半のマウスでは移植後第8日までに検出可能な腫
瘍が生じ、第13日までにはマウスの94〜100％で腫瘍が明らかに認められるよう
になった。DPBS投与動物の場合には、この時点の後にすべてのマウスのTIが第25
日まで低下し、以降の観察期間を通じて発生率は約50％に安定化した。これに対
して、融合蛋白質を投与したマウスでは第28日まで比較的鋭敏なTIの低下が認め
られ、その時点で検出可能な腫瘍を有する動物はいなくなった。この腫瘍の完全
な消失は、これらの動物のほとんどについて残りの観察期間の間に観察された。
融合蛋白質を投与したマウスにおける腫瘍の完全退縮は、腫瘍体積による測定で
も明らかに認められた。図22Bは、融合蛋白質を投与したマウスの平均腫瘍体積
が第28日までに検出できなくなったことを示している。これに比べて、DPBSを投
与したマウスの平均腫瘍体積は第25日以降に定常的に増加している。

【０１２４】第2の実験では、C57BL／6マウス（各群18匹）の右腓腹後部に1.3×10^５個のTC
-1細胞を皮下注射した（第0日）。7日後に、マウスの群に0.2mLのDPBS（生理食
塩水）、10ugのHspE7、100ugのMT40-E7、100ugのE7-TB71（図23Aおよび23BではE
7-MT71と表記）または100ugのTB10-E7のいずれかを投与した。マウスを腫瘍の有
無のほか、腫瘍体積に関しても観測した。データは、各群当たりの腫瘍発生率（
TI）（図23A）、および平均腫瘍体積±平均の標準誤差として表現した腫瘍体積
（図23B）として表した。

【０１２５】図22Aの場合と同じく、マウスの大半（約95％）には腫瘍移植後第8日までに肉
眼で認められる触知可能な腫瘍が生じた（図23A）。第19日までにはTIの低下が
認められるようになった。融合蛋白質を投与したすべてのマウスでは、この時点
の後にTIの急激な低下が認められ、第33日までには事実上すべてのマウスで腫瘍
が消失した。これに対して、DPBSを投与したマウスのTIは約75％で安定化した。
図23Bは、各々の融合蛋白質を投与したマウスの平均腫瘍体積を示している。TI
の低下は腫瘍体積の著明な減少に反映されていた。いずれかの融合蛋白質を投与
したマウスの平均腫瘍体積は第30日までに本質的には測定不能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ〜1Ｂ】 Hsp65の発現をコードするプラスミドpET65の配列を示し
ている。

【図２】 E7の発現をコードするプラスミドpET／E7（NH）の配列を示して
いる。

【図３】 (h)E7の発現をコードするプラスミドpET／H／E7の配列を示して
いる。

【図４Ａ〜４Ｂ】 HspE7の発現をコードするプラスミドpET65C／E7-1Nの配
列を示している。

【図５Ａ〜５Ｂ】 MT40-E7の発現をコードするプラスミドpETMT40E7の配列
を示している。

【図６】卵白アルブミン（OVA）の発現をコードするプラスミドpET／OVA
の配列を示している。

【図７Ａ〜７Ｃ】 HspOVAの発現をコードするプラスミドpET65H／OVAの配
列を示している。

【図８】 GSTの発現をコードするプラスミドpGEX／Kの配列を示している。

【図９】 GST-E7の発現をコードするプラスミドpGEX／K／E7の配列を示し
ている。

【図１０Ａ〜１０Ｂ】 E7-L-BCG65の発現をコードするプラスミドpET／E7
／5'65の配列を示している。

【図１１】 BCG65(F1)-E7の発現をコードするプラスミドpET65F1／E7の配
列を示している。

【図１２】 TB10-E7の発現をコードするプラスミドpETESE7の配列を示して
いる。

【図１３Ａ〜１３Ｂ】 E7-TB71の発現をコードするプラスミドpET／E7／71
の配列を示している。

【図１４Ａ〜１４Ｂ】融合蛋白質の発現をコードするプラスミドpET／E7
／71'の配列を示している。

【図１５Ａ〜１５Ｂ】 SP65(2)-E7の発現をコードするプラスミドpET／SP6
5c-E7の配列を示している。

【図１６Ａ〜１６Ｂ】 AF60-E7の発現をコードするプラスミドpETAF60E7の
配列を示している。

【図１７Ａ〜１７Ｂ】チャールズリバー研究所（Charles River Laborato
ry）（図17A）およびジャクソン研究所（Jackson Laboratory）（図17B）から入
手したC57BL／6マウスからの脾細胞によるIFN-γ放出がHspE7曝露後に増強する
ことを示している。

【図１８Ａ〜１８Ｃ】 Balb／c（図18A）、C57BL／6（図18B）およびC3HeB
／FeJ（図18C）マウスからの脾細胞によるIFN-γ放出がHspE7曝露後に増強する
ことを示している。

【図１９】脾細胞によるIFN-γ放出が、抗原およびストレス蛋白質を含む
融合蛋白質への曝露後には増強するが、抗原およびストレス蛋白質以外の蛋白質
を含む融合蛋白質への曝露後には増強されないことを示している。

【図２０Ａ〜２０Ｂ】脾細胞によるIFN-γ放出が、さまざまな種類のスト
レス蛋白質、さまざまな生物体に由来するストレス蛋白質、またはストレス蛋白
質の断片を含む融合蛋白質への曝露後に増強することを示している。

【図２１】リンパ節細胞および脾細胞によるIFN-γ放出が、抗原およびス
トレス蛋白質を含む融合蛋白質への曝露後に増強することを示している。

【図２２Ａ〜２２Ｂ】 TC-1腫瘍細胞の注射後に生理食塩水、HspE7、SP65(
2)-E7またはAF60-E7を注射したマウスにおける腫瘍発生率（図22A）および腫瘍
体積（図22B）の経時的推移を示している。

【図２３Ａ〜２３Ｂ】 TC-1腫瘍細胞の注射後に生理食塩水、HspE7、MT40-
E7、E7-MT71またはTB10-E7を注射したマウスにおける腫瘍発生率（図23A）およ
び腫瘍体積（図23B）の経時的推移を示している。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月８日（２００１．２．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８２】実施例8：組換えウシ結核菌BCG Hsp65-卵白アルブミン融合蛋白質（HspOva）の
作製 HspOvaをコードするプラスミドを以下の通りに構築した。完全長ニワトリ卵白
アルブミンのコード配列をNheIおよびEcoRI消化によってpET／OVAから切り出し
、アガロースゲルによって精製した。OVA（配列番号：55）の発現をコードする
配列（配列番号：54）は図6に示されている。精製産物を、同じ酵素であらかじ
め消化したpET65Hに連結させた。連結反応を用いて大腸菌DH5α株の形質転換を
行い、ニワトリ卵白アルブミン遺伝子挿入断片を含むと推定されるクローンを診
断的制限消化に基づいて選択した。この最初の制限解析を、融合遺伝子全体、プ
ロモーターおよび末端領域のDNA配列解析によって確認した。pET65H／OVAと命名
された確認済みの構築物のDNAを大腸菌BL21株（DE3）の形質転換に用いた。HspO
VA（配列番号：21）の発現をコードするヌクレオチド配列（配列番号：20）は図
7A〜7Cに示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｐ 37/02 // Ａ６１Ｋ 38/00 43/00 １０５Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １０５Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミッツェンリーエイ．カナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリアカミシャンストリート 1936 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 4B024 AA11 CA02 GA11 HA03 4B063 QA05 QQ79 QR77 QS35 4C084 AA07 BA01 BA08 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA50 CA01 CA03 CA17 NA20 ZB071 ZC801 4H045 AA10 AA30 BA42 CA01 CA11 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】融合蛋白質がTh1様応答を刺激するか否かを決定するための
方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）熱ショック蛋白質（Hsp）または少なくとも8アミノ酸残基長のその断
片を、（ii）少なくとも8アミノ酸残基長の異種ポリペプチドと融合させたもの
を含む融合蛋白質を提供すること、（c）細胞試料を融合蛋白質と接触させること、および（d）融合蛋白質が細胞試料におけるTh1様応答を刺激するか否かを決定すること
を含む方法。
【請求項２】 Hspが、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71からなる群
から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】融合蛋白質が、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71か
らなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】融合蛋白質が、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）のHsp65
のアミノ酸1〜200位を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】異種ポリペプチドが、（i）ヒト病原体の蛋白質または（ii
）腫瘍関連抗原の少なくとも8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含む、請求
項1記載の方法。
【請求項６】異種ポリペプチドが、ヒトウイルスの蛋白質の少なくとも8
個の連続したアミノ酸と同一な配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】ウイルスが、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、単純ヘルペスウ
イルス（HSV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、サイトメ
ガロウイルス（CMV）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、インフルエンザウ
イルス、麻疹ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（HIV）からなる群から選択
される、請求項6記載の方法。
【請求項８】異種ポリペプチドがHPV E6を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】異種ポリペプチドがHPV E7を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１０】異種ポリペプチドが、HPV16 E7または少なくとも8アミノ
酸残基長のその断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】異種ポリペプチドが、HPV16 E6または少なくとも8アミノ
酸残基長のその断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】融合蛋白質が、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）Hsp65
およびHPV16 E7を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】細胞試料が、脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、胸腺、肺、
気道または肛門性器粘膜に由来する細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】細胞試料が脾細胞またはリンパ節細胞を含む、請求項1記
載の方法。
【請求項１５】検出の段階が、細胞試料によって産生されたIFN-γを検出
することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】（e）未処置リンパ球を含む第2の細胞試料を提供する段階
、（f）第2の細胞試料を第2の融合蛋白質と接触させる段階、および（g）第2の融合蛋白質が第2の細胞試料におけるTh1様応答を刺激するか否かを決
定する段階をさらに含み、第1の融合蛋白質が完全長の天然型Hspの配列を含み、第2の融合蛋白質が天然
型Hspの配列のすべてには満たないものの少なくとも8個のアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】化合物のスクリーニングの方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）Hspまたは少なくとも8アミノ酸残基長のその断片を、（ii）少なくと
も8アミノ酸残基長の異種ポリペプチドと融合させたものを含む融合蛋白質を提
供すること、（c）細胞試料を化合物および融合蛋白質と接触させること、ならびに（d）接触の段階後に細胞試料がTh1様応答を示すか否かを決定することを含み、化合物の存在下におけるTh1様応答が化合物の非存在下と比較して低いことに
より、化合物が細胞試料によるTh1様応答を抑制することが示されるような方法
。
【請求項１８】決定の段階が、細胞試料によって産生されたIFN-γを検出
することを含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】細胞試料が、脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、胸腺、肺、
気道または肛門性器粘膜に由来する細胞を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】細胞試料が脾細胞またはリンパ節細胞を含む、請求項17記
載の方法。
【請求項２１】 Hspが、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71からなる
群から選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】融合蛋白質が、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】異種ポリペプチドがHPV E6を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２４】異種ポリペプチドがHPV E7を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２５】融合蛋白質が、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）Hsp65
およびHPV16 E7を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】化合物のスクリーニングの方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）Hspまたは少なくとも8アミノ酸残基長のその断片を、（ii）少なくと
も8アミノ酸残基長の異種ポリペプチドと融合させたものを含む融合蛋白質を提
供すること、（c）細胞試料を化合物および融合蛋白質と接触させること、ならびに（d）接触の段階後に細胞試料がTh1様応答を示すか否かを決定することを含み、化合物の存在下におけるTh1様応答が化合物の非存在下と比較して高いことに
より、化合物が細胞試料によるTh1様応答を促進することが示されるような方法
。
【請求項２７】決定の段階が、細胞試料によって産生されたIFN-γを検出
することを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】細胞試料が、脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、胸腺、肺、
気道または肛門性器粘膜に由来する細胞を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】細胞試料が脾細胞またはリンパ節細胞を含む、請求項26記
載の方法。
【請求項３０】 Hspが、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71からなる
群から選択される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】融合蛋白質が、Hsp65、Hsp40、Hsp10、Hsp60およびHsp71
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】異種ポリペプチドがHPV E6を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３３】異種ポリペプチドがHPV E7を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３４】融合蛋白質が、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis） BCG
のHsp65およびHPV16 E7を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】ハイブリッド化合物がTh1様応答を刺激するか否かを決定
する方法であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）分子量1,500未満の非ペプチド化合物が、（ii）少なくとも8アミノ酸
長のポリペプチドと共有結合したものを含む、天然にみられないハイブリッド化
合物であって、非ペプチド化合物をポリペプチドと共有結合させることによって
生成されるハイブリッド化合物を提供すること、（c）細胞試料をハイブリッド化合物と接触させること、および（d）ハイブリッド化合物が細胞試料におけるTh1様応答を刺激する示すか否かを
決定することを含む方法。
【請求項３６】非ペプチド化合物の分子量が少なくとも100である、請求
項35記載の方法。
【請求項３７】ハイブリッド化合物がTh1様応答を刺激するか否かを決定
する方法であって、（a）非ペプチド化合物を少なくとも8アミノ酸長のポリペプチドと共有結合させ
ることによってハイブリッド化合物を生成すること、（b）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（c）細胞試料をハイブリッド化合物と接触させること、および（d）ハイブリッド化合物が細胞試料におけるTh1様応答を刺激する示すか否かを
決定することを含む方法。
【請求項３８】非ペプチド化合物の分子量が100と1,500との間である、請
求項37記載の方法。
【請求項３９】融合蛋白質がTh1様応答を刺激するか否かを決定する方法
であって、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）（i）少なくとも8アミノ酸残基長の第1のポリペプチドを、（ii）少なくと
も8アミノ酸残基長の第2のポリペプチドと融合させたものを含む融合蛋白質を提
供すること、（c）細胞試料を融合蛋白質と接触させること、および（d）接触の段階後に細胞試料が示すTh1様応答を検出することを含む方法。
【請求項４０】検出されるTh1様応答が、第2の細胞試料を第1のポリペプ
チド、第2のポリペプチド、または第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの
混合物のいずれかに接触させた場合に未処置リンパ球を含む第2の細胞試料が示
すTh1様応答よりも強い、請求項39記載の方法。
【請求項４１】検出されるTh1様応答が、第2の細胞試料が示すTh1様応答
の少なくとも2倍である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】検出されるTh1様応答が、第2の細胞試料が示すTh1様応答
の少なくとも5倍である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】（i）Hsp10蛋白質または少なくとも8アミノ酸残基長のそ
の断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチド、を含む融合
蛋白質。
【請求項４４】 Hsp10蛋白質を含む、請求項43記載の融合蛋白質。
【請求項４５】 Hsp10蛋白質がマイコバクテリア蛋白質である、請求項44
記載の融合蛋白質。
【請求項４６】ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）Hsp10蛋白質
を含む、請求項45記載の融合蛋白質。
【請求項４７】異種ポリペプチドが、ヒトウイルスの蛋白質の少なくとも
8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含む、請求項43記載の融合蛋白質。
【請求項４８】ヒトウイルスがHPVである、請求項47記載の融合蛋白質。
【請求項４９】異種ポリペプチドがHPV16 E7を含む、請求項48記載の融合
蛋白質。
【請求項５０】（i）Hsp40蛋白質または少なくとも8アミノ酸残基長のそ
の断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチド、を含む融合
蛋白質。
【請求項５１】 Hsp40蛋白質を含む、請求項50記載の融合蛋白質。
【請求項５２】 Hsp40蛋白質がマイコバクテリア蛋白質である、請求項51
記載の融合蛋白質。
【請求項５３】ヒト結核菌Hsp40蛋白質を含む、請求項52記載の融合蛋白
質。
【請求項５４】異種ポリペプチドが、ヒトウイルスの蛋白質の少なくとも
8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含む、請求項50記載の融合蛋白質。
【請求項５５】ヒトウイルスがHPVである、請求項54記載の融合蛋白質。
【請求項５６】異種ポリペプチドがHPV16 E7を含む、請求項55記載の融合
蛋白質。
【請求項５７】（i）Hsp71蛋白質または少なくとも8アミノ酸残基長のそ
の断片、および（ii）少なくとも8アミノ酸長の異種ポリペプチド、を含む融合
蛋白質。
【請求項５８】 Hsp71蛋白質を含む、請求項57記載の融合蛋白質。
【請求項５９】 Hsp71蛋白質がマイコバクテリア蛋白質である、請求項58
記載の融合蛋白質。
【請求項６０】ヒト結核菌Hsp71蛋白質を含む、請求項59記載の融合蛋白
質。
【請求項６１】異種ポリペプチドが、ヒトウイルスの蛋白質の少なくとも
8個の連続したアミノ酸と同一な配列を含む、請求項57記載の融合蛋白質。
【請求項６２】ヒトウイルスがHPVである、請求項61記載の融合蛋白質。
【請求項６３】異種ポリペプチドがHPV16 E7を含む、請求項62記載の融合
蛋白質。
【請求項６４】化合物がTh1様応答を刺激するか否かを決定する方法であ
って、（a）未処置リンパ球をインビトロに含む細胞試料を提供すること、（b）化合物を提供すること、（c）細胞試料を化合物と接触させること、および（d）接触の段階後に細胞試料が示すTh1様応答を検出することを含む方法。