JPH10506796A - パピローマウイルス様キメラ粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、形状エピトープをもち、パピローマウイルスＬ１生成物およびパピローマウイルスＬ２融合生成物を含むという特徴を有するパピローマウイルス様粒子、関連する合成ＤＮＡ分子、宿主細胞、方法およびワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 パピローマウイルス様キメラ粒子 発明の分野 本発明は、パピローマウイルス様キメラ粒子および関連する合成ＤＮＡ分子、 宿主細胞、方法並びにワクチンに関する。 発明の背景 パピローマウイルスはヒトおよび広範囲の動物の上皮に感染し、当該上皮の感 染部位に一般に良性の増殖を誘導する。しかしながら、幾つかの事例ではある種 のパピローマウイルスによって誘導された病巣は悪性に経過する。ヒトの性器病 巣の悪性進行とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のある種の型（例えばＨＰＶ １６）との間には密接な関係が存在する。これらのウイルス型による感染は、子 宮頸癌（世界的に最も一般的な女性の癌の１つ）の進行における最も重要な危険 因子であると考えられる(H．zur Hausen，Science 254:1167(1991); M.H．Schif fman，J．Natl．Cancer Inst．84:394(1992))。子宮頸癌の大半はＨＰＶ初期遺 伝子（例えばＥ６およびＥ７）を含み、該遺伝子を発現している。さらに、これ らの遺伝子は培養細胞において強力な形質転換活性および永代化(immortalizing )活性を有することが示された(B.A．Wemess，K．Munger & P.M．Howley(1991)、 「腫瘍学の進歩」(Advances in Oncology)、V.T．DeVita，S．Hellman & S.A. R osenberg編、（Lipponcott、フィラデルフィア）pp.3-18)。 パピローマウイルスは、直径が約５５ｎｍのエンベロープを持たない二本鎖Ｄ ＮＡウイルスで、ヌクレオヒストンのコアの中に約８ｋｂのゲノムを含む(Baker ら、Biophys．J．60:1445(1991))。キャプシドは、ウイルスによってコードされ る２つの蛋白ＨＰＶ１およびＬ２で構成され、これらはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおい て、それぞれ約５５ｋＤａおよび７５ｋＤａに移動する(Mose Larsonら、J．Vir ol．61:3596(1987))。Ｌ１（これは主要キャプシド蛋白である）は、Ｔ−７の二 十面体対称と結合する７２ペンタメーターとして配列されている。Ｌ２の機能お よびビリオン内の位置は不明である(Bakerら、Biophys．J．60:1445(1991))。 Ｌ１蛋白は自己集合組立能をもち、それによって、大量のウイルス様粒子（vi rus-like particles，VLPs）が、多数のパピローマウイルス種に由来するＬ１蛋 白の種々の組換え体（リコンビナント）発現系での発現により生成できる（Hage nseeら、J．Virol．67:315(1993);Kirnbauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 89:12180(1992);Kirnbauerら、J．Virol．67:6929(1993);Roseら、J．Virol．67 :1936(1993))。集合組立には必要ではないが、Ｌ２は、細胞内でＬ１とともに同 時に発現される場合（Ｌ１／Ｌ２ＶＬＰｓ）ＶＬＰｓに取り込まれる。 天然のビリオンまたはＬ１ＶＬＰｓでウサギを免疫することによって高力価の 中和血清抗体が誘導されるが、大腸菌で発現させた集合組立されていないＬ１に よる免疫では誘導されなかった(N.D．Christensen & J.W．Kreider，J．Virol. 64:3151(1990);Kirnbauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:12180(1992);Pil acinskiら、Bio/Technology 2:356(1984);Segreら、Am．J．Vet．Res．16:517(1 955))。天然の粒子に対して作製した多クローン性および単クローン性抗体は形 状依存性エピトープを認識する(N.D．Christensen & J.W．Kreider，Virus Res. 28:195(1993); Christensenら、J．Virol．64:5678(1990); Christensenら、Vi rology 181:572(1991))。 ＶＬＰｓに対して作製した中和抗体もまた形状依存性エピトープを認識する。 感染性ＢＰＶ１（これはウシの病巣から容易に得られ、インビトロＢＰＶ１感染 性アッセーで定量できる(Dvoretzkyら、Virology 103:369(1980))を用いて、ウ シパピローマウイルスから得られたＶＬＰｓは高レベルの中和抗体を誘導するこ とが示された(Kirnbauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:12180(1992))。こ の中和抗体は形状依存性エピトープに対して誘導され、免疫の前に粒子を変性さ せると中和活性を誘導するこの調製物の能力は失われた（上掲書）。 昆虫細胞でリコンビナントバキュロウイルスによってＬ１主要キャプシド蛋白 を発現させるために非進行性病巣から得られたＨＰＶ１６分離株のＬ１遺伝子を 用いた場合、Ｌ１は、プロトタイプのＨＰＶ１６（癌病巣から最初に分離された ）に由来するＬ１を用いて得られた収量より３乗高い収量で自己集合組立を行な い、天然のビリオンと形態学的に同様なＶＬＰｓを形成した(Kirnbauerら、J．V irol．67:6929(1993))。ＤＮＡ配列の比較によって、プロトタイプＬ１の効率の 悪い自己集合組立をもたらすただ１つの非保存的アミノ酸変化が明らかにされた （上掲書）。集合組立能をもつクローンのＬ１はしたがって野性型遺伝子と考え られ、集合組立不全クローンのプロトタイプＬ１は変異体と考えられる。 野性型Ｌ１蛋白をもつＨＰＶ１６ＶＬＰｓを抗原として用いて、ＨＰＶ１６に 感染した患者における血清抗体を検出するＥＬＩＳＡを開発した(Kirnbauerら、 L．Natl．Cancer Inst．86:494(1994))。対照的に、変性ＨＰＶ１６粒子もプロ トタイプＬ１蛋白調製物もこれらの抗体を検出できなかった（上掲書）。これら の結果は、プロトタイプＬ１蛋白は形状エピトープをもたないことを明らかにし た。 自己集合組み立てさせた野性型ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２に対して作製したウサギ 血清は、ＨＰＶ１６ＶＬＰが細胞表面分子に結合するのを妨げることが分かった (Rodenら、J．Virol．(印刷中、1994年、10月))。対照的に、ＨＰＶ１６Ｌ１／ Ｌ２のプロトタイプ株に対して作製された血清はそのような結合を阻止しなかっ た（上掲書）。このデータは、プロトタイプＨＰＶ株は形状エピトープを欠いて いることを示している。 完全なワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のＬ１またはＬ１／Ｌ２ から構成されたウイルス様粒子で免疫したウサギは、その後の感染性ＣＲＰＶに よる実験的感染から防御された(Breitburdら、第12回国際パピローマウイルスワ ークショップ（於：アムステルダム）、印刷中(1994年、10月))。対照的に、変 性粒子で免疫した動物は防御されなかった（上掲書）。これらの発見は、形状エ ピトープをもつＶＬＰは防御免疫を誘導できるという結論と一致する。 キャプシド蛋白で構成されたＶＬＰは、パピローマウイルス感染を防止する予 防ワクチンとして魅力的な候補物である。しかしながら、これらＶＬＰワクチン がすでに成立したパピローマウイルス感染に対して治療的効果を有することはお そらくないであろう。Ｅ６およびＥ７と異なり、このキャプシド蛋白は進行性病 巣または基底上皮感染細胞（これらはパピローマの免疫退行の推定標的である） での発現は検出されない。 Ｌ１およびＬ２以外のパピローマウイルス蛋白に対する免疫はパピローマウイ ルス感染の制御を助けるかもしれないということが実験モデルによって証明され る。Ｅ６およびＥ７は腫瘍発生過程で選択的に維持されるので、これらの腫瘍蛋 白に由来するペプチドは、ＨＰＶ含有腫瘍細胞に対する細胞性免疫反応のための 標的として役立つ可能性がある。動物モデル実験によってＨＰＶ１６のＥ７蛋白 は腫瘍拒絶抗原として作用することが示唆された（Chenら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA，88:110(1981); Feltkempら、Eur．J．Immunol．23:2242(1993)）。の みならず、ＨＰＶ感染頻度、ＨＰＶ感染の持続、並びに子宮頸癌および他のＨＰ Ｖ関連癌のリスクは細胞性免疫の抑制をもつ患者で高まる（Alloutら、Br．Med. J．298:153(1989);Lagaら、Int．J．Cancer 50:45(1992)）。これらの観察によ って、細胞性免疫は、ＨＰＶ感染およびそれに付随する腫瘍の発達を防御するた めに重要であることが示唆される。そのような免疫の誘導は予防的であるととも に治療的であるかもしれない。 外来ペプチドがウイルスキャプシド様構造物に取り込まれ得ること、さらにこ れらキメラ粒子を用いて外来抗原を免疫系に呈示することが可能なことが明らか になった。報告された実施例には、ヒトライノウイルス２型エピトーブ(Francis ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:2545(1990))、ＨＩＶのｇｐ４１（Boriso vaら、FEBS Lett．259:121(1989)）のＢ型肝炎コア抗原粒子の表示、並びに単純 ヘルペスウイルス１型およびネズミ肝炎ウイルス由来ペプチドのＢ１９パルボウ イルス粒子の表示(Brownら、Virology 198:477(1994)）が含まれる。パルボウイ ルスキメラは、対応するウイルスによる実験的感染攻撃からマウスを防御した。 上記の系の全てで、外来配列はキャブシド構造に必須の蛋白内に挿入され、２０ アミノ酸未満に限定されていた。しかしながら、最近の実験(Miyamuraら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，91:8507(1994))は、パルボウイルスＬ１マイナーキャ プシド蛋白に融合させた場合、完全な１４７アミノ酸のニワトリ卵白リゾチーム 蛋白がＢ１９パルボウイルス粒子に取り込まれ得ることを明らかにした。このリ ゾチームは生物的活性を保持し、ウサギに注射したとき免疫反応を誘導した。別 の関連性が低い実験でも、ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白の８４アミノ酸を含む Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子（これは脂質膜構造である）(Michelら、J．Viro l．64:2452(1990))およびＨＩＶ−１Ｖ３ループの一部分を含む酵母Ｔｙウイル ス様粒子(Griffithsら、J．Virol．65:450(1991))もまた、動物に接種したとき 挿入したペプチドに対して免疫反応を起こさせることが示された。パピローマウ イルスに関しては、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（全て２０アミノ酸未満）を含むＢ 型肝炎ウイルスコア抗原粒子は、マウスでペプチド特異的抗体およびＴヘルパー 応答を誘導することが報告された（Tindleら、Virology 200:547(1994)）。 自己集合組立パピローマウイルスＬ１を基材にしたキメラ粒子はこれまで報告 がなく、またキメラＶＬＰを作製する目的でウイルス性融合パートナーとして使 用したという報告もない。上記に記載したキメラ粒子実験は、パピローマウイル スと無関係のウイルスを含み、したがってパピローマウイルスを含むキメラ粒子 実験の結果を予測することはできない。実際、カーンバウエルらによるパピロー マウイルスの研究(Kirnbauerら、J．Virol．67:6929(1993)上掲書)では、Ｌ１の ただ１つの非保存的アミノ酸変化が、ＶＬＰｓへの効果的な自己集合組立および 形状エピトープの表示（これらは臨床的に関連する免疫反応の誘導および検出に 必須であるらしい）をもたらすことが明らかにされた。したがって、パピローマ ウイルスに無関係のウイルスを用いた研究は、Ｌ１のただ１つのアミノ酸置換に よって効果的な自己集合組立が失われると仮定した場合、外来ペプチドまたは蛋 白を含むパピローマウイルスＬ２がパピローマウイルスＬ１との同時集合組立に よって粒子を形成することができるか否かを予測することは不可能である。さら にまた、これらの実験は、Ｌ１のただ１つのアミノ酸置換が形状エピトープの表 示を妨げることができると仮定した場合、生じたキメラ粒子のいずれかが中和抗 体もしくは他の免疫関連反応を誘導または検出する能力を保持しているか否かを 予測することも不可能である。 パピローマウイルス様キメラ粒子を提供することが本発明の目的である。これ らのキメラ粒子は多価抗原を表示するための土台として機能することができる。 またこれらのキメラ粒子は、蛋白を細胞内に運び、ペプチドに加工し続いてＭＨ Ｃ分子の中にこれらのペプチドを表示させて細胞性免疫反応を誘導させるために 役立てることができる。このキメラ粒子は、有効スペクトルの広い効果的なパピ ローマウイルスワクチンを作製する費用効率の良い方法を提供する。また別に、 このパピローマウイルス用キメラ粒子はＶＬＰおよび／または融合パートナーの 精製にも利用できる。またこのキメラ粒子は、活性を有する無傷の蛋白（例えば 酵素、毒素または薬剤）を細胞内に運ぶために機能することができる。 発明の要旨 本発明の特徴に従えば、形状エピトープを有するという特徴をもつパピローマ ウイルス様粒子が提供されるが、当該粒子はパピローマウイルスＬ１生成物およ びパピローマウイルスＬ２融合生成物を含む。 該パピローマウイルスＬ２融合生成物は、ヒトパピローマウイルスＬ２融合生 成物またはウシパピローマウイルスＬ２融合生成物であるという特徴を有するこ とができる。 該ヒトパピローマウイルスＬ２融合生成物は、ＨＰＶ１６Ｌ２融合生成物でも よく、さらにウシパピローマウイルスＬ２融合生成物はＢＰＶ１Ｌ２融合生成物 であってもよい。 該パピローマウイルスＬ２融合生成物は、ペプチド、完全な長さの蛋白として 特徴付けられる融合パートナーを含むことができ、また、ペプチドもしくは完全 な長さの蛋白または縦並びに連結されたその組合せを含む融合パートナーを含む ことができる。 該融合パートナーはパピローマウイルスＥ６またはＥ７生成物でもよい。 該パピローマウイルスＬ２融合生成物は、その５’または３’末端で融合パー トナーと融合されるという特徴を有することができる。 該パピローマウイルスＬ２融合生成物は、Ｌ２のアミノ酸の間に挿入された融 合パートナーをもつという特徴を有することができる。 該パピローマウイルスＬ１生成物は、ヒトパピローマウイルスＬ１生成物また はウシパピローマウイルスＬ１生成物という特徴を有することができる。 該ヒトパピローマウイルスＬ１生成物はＨＰＶ１６Ｌ１生成物でもよく、さら にウシパピローマウイルスＬ１生成物はＢＰＶ１Ｌ１生成物であってもよい。 本質的にはパピローマウイルス様粒子は、ＨＰＶ１６Ｌ１およびＨＰＶ１６Ｌ ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）（この場合ＨＰＶ１６Ｅ７はＨＰＶ１６Ｌ２ の３’末端に融合されている）、ＢＰＶＬ１およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７ （完全な長さ）（この場合ＨＰＶ１６Ｅ７はＢＰＶＬ２の３’末端に融合されて いる）またはＢＰＶＬ１およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０ ）（この場合ＨＰＶ１６Ｅ７はＬ２アミノ酸２７４と２７５との間でＢＰＶＬ２ に融合されている）からなることができる。 本発明の別の特徴に従えば、パピローマウイルスＬ１生成物およびパピローマ ウイルスＬ２融合生成物を１度または２度コードするという特徴を有する１つま たは２つ以上の合成ＤＮＡ分子が提供されるが、この場合、該分子は形状エピト ープを有するという特徴をもち、パピローマウイルスＬ１生成物およびパピロー マウイルスＬ２融合生成物を含むパピローマウイルス様粒子の発現を形質転換細 胞で誘導する。 該形質転換宿主細胞は昆虫宿主細胞（例えばＳｆ９昆虫宿主細胞）でもよく、 さらに該ＤＮＡ分子はさらに昆虫細胞ベクター（例えばバキュロウイルスベクタ ー）を含むことができる。また該形質転換宿主細胞は哺乳類宿主細胞でもよく、 該ＤＮＡ分子はさらに哺乳類細胞ベクター（例えばワクシニアウイルスベクター ）を含むことができ、また、該形質転換宿主細胞は酵母宿主細胞でもよく、該Ｄ ＮＡ分子はさらに酵母細胞ベクター（例えばワクシニアウイルスベクター）を含 むことができる。 本発明の別の特徴に従えば、上記のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞が提 供される。 本発明のまた別の特徴に従えば上記のＤＮＡ分子を用いる方法が提供されるが 、該方法は、上記の分子が上記の発現を誘導する条件を提供し、さらに上記の形 質転換宿主細胞からパピローマウイルス様粒子を回収する工程を含む。 本発明のさらにまた別の特徴に従えば、形状エピトープを有しパピローマウイ ルスＬ１生成物およびパピローマウイルスＬ２融合生成物を含むことを特徴とす るパピローマウイルス様粒子を製造する方法が提供されるが、該方法は、上記の ＤＮＡ分子が上記の形質転換宿主細胞でパピローマウイルス様粒子を上記のよう に発現させることができる条件を提供する工程を含む。 本発明はまた、上記のパピローマウイルス様粒子の精製方法を提供するが、該 方法は、該パピローマウイルス様粒子をアフィニティークロマトグラフィーカラ ムに曝す工程を含み、当該カラムは、パピローマウイルス様粒子のパピローマウ イルスＬ２融合生成物の融合パートナーと結合して該粒子の精製をもたらす抗体 を含んでいる。 本発明はさらに、上記のパピローマウイルス様粒子のパピローマウイルスＬ２ 融合生成物融合パートナーを精製する方法を提供するが、該方法は、上記のパピ ローマウイルス様粒子を精製して該融合パートナーを精製する工程を含む。 本発明はさらに、上記のパピローマウイルス様粒子のパピローマウイルスＬ２ 融合生成物の融合パートナーを細胞に送り込む方法を提供するが、該方法は、上 記のパピローマウイルス様粒子を細胞に投与し該融合パートナーの細胞内輸送を 達成する工程を含む。 さらにまた、本発明は上記のパピローマウイルス様粒子を含むワクチンを提供 する。 発明の詳細な説明 本発明は、パピローマウイルスＬ２融合生成物は、パピローマウイルスＬ１生 成物を基材とする、形状エピトープを表示するパピローマウイルス様粒子に取り 込まれるという結果から得られた。これらの結果は予期せぬものであった。 パピローマウイルスの研究(Kirnbauerら、J．Virol．67:6929(1993)上掲書)に おいて、Ｌ１のただ１つの非保存的アミノ酸変化がＶＬＰｓへのＬ１の効果的な 自己集合組立および形状エピトープの表示をもたらすことが示された。この形状 エピトープの表示は、臨床的に関連のある免疫反応の誘導および検出に必要なよ うに思える。したがって、Ｌ１内のただ１つのアミノ酸置換が効果的な自己集合 組立を失わせると仮定した場合、外来ペプチドまたは蛋白を含むパピローマウイ ルスＬ２がパピローマウイルスＬ１とともに集合組み立てされて粒子を形成する か否かは予測不可能であった。Ｌ１内のただ１つのアミノ酸置換が形状エピトー プの表示を妨げることができると仮定した場合、生成されるどのようなキメラ粒 子が中和抗体もしくは他の免役関連反応の誘導または検出能を保持しているかを 予測することもまた不可能であった。 パピローマウイルスＬ２融合生成物は一連のアミノ酸の鎖を意味し、この場合 該鎖の一部分はＬ２の蛋白配列に由来し、さらに該鎖の一部分は別の１つ蛋白配 列（または複数の蛋白配列）に由来する。 Ｌ２融合生成物は、１つの蛋白（または多数の蛋白）のための読み取り枠をＬ ２のための読み取り枠の隣にまたはその中に（枠内で）スプライシングすること によって製造される。 蛋白工学を用いてＬ２融合生成物の構造を決定する。蛋白工学分野の従事者に とって日常的な作業で天然蛋白Ｌ２の変種が作製される。作製されるこのような 変形はＬ２の構造を詳細に知った上での経験に基づいて予測されるものでもよく 、また完全に任意のものであってもよい。構造情報とランダム変異および選別と の組合せによってもまた劇的な結果を得ることができる。 例えば、融合ペプチドまたは蛋白がその間に挿入されるＬ２アミノ酸の選別は この基準によって実施することができる。アミノ酸の配列と長さがパピローマウ イルス間で変化する領域が存在することは、この領域がＬ２の組み込みおよび／ または粒子への取り込みに必須ではない構造を表していることを示唆する。融合 ペプチドまたは蛋白をＬ２内へ挿入するこの観察された能力は、そのような領域 が存在することを暗示させる。 Ｌ２融合生成物のための構造の決定は、形状エピトープを表示するパピローマ ウイルスＬ１生成物を基材にしたパピローマウイルス様粒子への取り込みが生じ るＬ２融合生成物の能力をもとに実施される。 構造決定の好ましい手段は、パピローマウイルスＬ１生成物を基材とするパピ ローマウイルス様粒子へのＬ２融合生成物の取り込み効率および／または純正度 を測定するアッセーを含む。 Ｌ１／Ｌ２ＶＬＰｓ形成の効率および／または純正度は形状エピトープの表示 と関連がある（上掲書）。 キメラＬ２は、したがって野性型Ｌ２の取り込みのそれと同じような効率およ び／または純正度でＬ１基材ＶＬＰｓへ取り込まれるようになるであろう。 Ｌ２融合生成物のための構造を決定する他の好ましい手段は、中和抗体の誘発 および／または検出を測定するアッセーを含む。 中和抗体は形状依存性エピトープに対して誘導される（上掲書）ので、中和抗 体の誘導および／または検出は形状エピトープの表示と関連がある。 したがって、キメラＬ２の取り込みは、Ｌ１またはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓと比較 したときパピローマウイルス様キメラ粒子による中和抗体の誘導および／または 検出を抑制しない。 本発明の目的のために、キメラＬ２融合生成物は、形状エピトープ（上記の手 段または当技術分野で既知の他のいずれかの手段で特定されたか否かにかかわら ず）を表示するパピローマウイルスＬ１生成物基材パピローマウイルス様粒子へ 取り込まれることができる能力をもつ。 Ｌ２およびその融合パートナー（およびＬ１）の構造は、完全な長さのＬ２蛋 白（およびＬ１蛋白）並びに完全な長さの融合パートナー蛋白およびそのフラグ メント（５’フラグメントであれ、３’フラグメントであれまたは内部フラグメ ントであれ）を含むことが意図される。前記フラグメントは、少なくとも約２０ アミノ酸残基、有利には少なくとも約１０アミノ酸残基、さらに好ましくは少な くとも約５アミノ酸残基である。Ｌ２（およびＬ１）のタイプ、サブグループお よび株間変動並びに、融合パートナー蛋白のヒト対立遺伝子および種間変動も明 らかに本発明の範囲内に含まれると解される。本発明はまた、完全な長さのＬ２ 蛋白（およびＬ１蛋白）並びに完全な長さの融合パートナー蛋白およびそのペプ チドフラグメントの保存的変種を含むが、この場合、保存的アミノ酸が野性型Ｌ ２（およびＬ１）および融合パートナー蛋白のアミノ酸残基に代わって置換され る。遺伝暗号の縮退のために、本発明はまた、Ｌ２（およびＬ１）および融合パ ートナー遺伝子のＤＮＡがコードするのと同じアミノ酸残基をコードするＤＮＡ を含む。 このパピローマウイルス様キメラ粒子自体は、どのようなパピローマウイルス に由来するどのようなＬ２融合生成物もいずれのＬ１生成物と一緒に（該ゲノム が密接に関係しようと、関係が薄かろうと粒子への取り込みが生じるかぎり）取 り込むと予想される。したがって、例えばＢＰＶ−１、ＢＰＶ−２、ＢＰＶ−４ 、ＣＲＰＶ、ＤＰＶ、ＥＥＰＶ、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ ８、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１またはＨＰＶ− ３３の何れかと関係があるＬ２融合生成物は、例えば上記のウイルスの何れか、 またはパピローマウイルスのいずれかのタイプ、サブグループもしくは株間変種 に由来する何れのＬ１生成物とも粒子内に取り込まれ得る。 ＶＬＰｓは高力価の中和血清抗体の誘導に必要な形状依存性エピトープを表示 するので、Ｌ２融合生成物を含むＶＬＰキメラは、液性免役の刺激のために最適 化されたサブユニットワクチンとして機能し、パピローマウイルス感染を予防し 、したがってパピローマウイルス関連癌およびパピローマウイルスに付随する他 の病的状態の発生を排除する。 先に考察したように、ＶＬＰｓが既に存在する増殖性病巣の退縮を誘導する治 療用ワクチンとして有効であるということはありそうもないので、キメラＶＬＰ ｓは、治療用ワクチンを開発しようと長い間熱望され、これまで果たされなかっ た要請を達成するために機能することができる。 おそらくキメラＶＬＰｓは、特異的な細胞表面レセプターに結合して内在化さ れて細胞質中に遊離され、したがって細胞性免疫を惹起させる細胞毒性Ｔ細胞に 向けて呈示されるＭＨＣクラスＩ分子と組み合わされたペプチドの表示を促進す るであろう。これは、特異的に細胞に進入したり、細胞毒性Ｔ細胞反応を誘導す るためにＭＨＣクラスＩ分子と一体となってペプチドの表示を促進することが期 待されない非複合体化蛋白と対照的な点である（この場合は、ＭＨＣクラスＩＩ 分子と結合してヘルパーＴ細胞に呈示され、ペプチドの表示が促進される可能性 の方が高い）。 Ｌ２融合生成物として１つまたは２つ以上のパートナーを包含することは、（ 臨床的病巣の治療および予防の改善を含む）広い利用スペクトルをもつ効果的な パピローマウイルスワクチンを作製するために明らかに経費効率が良い方法であ る。 融合パートナーは、ＶＬＰ基材ワクチンの潜在的標的を広げる方法を提供する ような融合パートナー（例えばＥ６もしくはＥ７ペプチドまたは完全な長さのＥ ６もしくはＥ７、他のパピローマウイルスペプチドもしくは蛋白、または他のＳ ＴＤもしくは感染性病原体（例えば単純ヘルペス、ＨＩＶ、トラコーマクラミジ ア、淋菌、梅毒トレポネーマ）のペプチドもしくは蛋白）から成る群から選択で きる。 Ｌ２融合生成物はＬ２分子につきただ１つの融合パートナーとは限らず、また 別の融合パートナー、例えば縦並びに連結したまた別のペプチドまたは完全な長 さの蛋白、または同じかもしくは異なる蛋白に由来するそれらの組合せを含むこ とができる。さらにまた、１つ以上のＬ２融合生成物をただ１つのＶＬＰ中に同 時に集合組み立てさせることができる。例えば、補助刺激蛋白の結合ドメインま たは免疫反応に必要な補助レセプターもしくはリガンドを含むように操作して、 ウイルス標的エピトープを含むＬ２融合生成物またはキメラＶＬＰをまた作製で きる。これらは、例えばＢ７（これはＴ細胞上でＣＤ２８と相互作用する）、細 胞内粘着分子（ＩＣＡＭ）、リンパ球機能抗原（ＬＦＡ）、血管細胞粘着分子（ ＶＣＡＭ−１）および熱耐性抗原（ＨＳＡ）（補助刺激物質またはリガンドをＶ ＬＰ表面に誘導するため、実施例１４参照）である。 疾患の予防および／または治療においてワクチンとして実際に好ましいパピロ ーマウイルス様キメラ粒子の量は、製剤化された具体的な組成物、適用態様、処 置される具体的な部位および器官によって変動することは理解されよう。ある宿 主の投与量は通常の方法によって、例えば適切な慣用的免疫付与プロトコルによ って決定できる。 また別にキメラＶＬＰはＶＬＰ精製方法でも用いることができる。ＶＬＰｓは それ自体予防用ワクチンとして、さらに免疫診断として有用である（上掲書）。 簡単に記せば、融合パートナーに対する抗体は標準的な免疫学的技術によって作 製され、アフィニティークロマトグラフィーカラムはこの抗体を用いて構築され る。続いてＶＬＰｓはアフィニティークロマトグラフィー工程で精製される。 また、キメラＶＬＰｓは融合パートナーの精製方法で用いることができる。例 えば、Ｌ２−Ｅ７融合生成物を含むＶＬＰｓは、正しく折り畳まれたＥ７を得る 手段として有用である。子宮頸癌患者の血清は、細菌から分離されたような変性 Ｅ７に対するよりも高い割合で形状的に正確なＥ７に対して陽性であることが報 告された(Viscidiら、Int．J．Cancer 55:780(1993))。この報告でＥ７を生成さ せるために用いられたインビトロ転写−翻訳系は困難かつ高価で、しかも放射能 標識Ｅ７を用いる。キメラＥ７ＶＬＰｓを精製し、この材料をＥ７ＥＬＩＳＡで 用いることが有利であろう。ヒトＬ１またはＬ２との血清反応性の複雑さを避け るために、ＢＶＰ基材粒子を用いることができるであろう。Ｅ７の血清反応性（ これは前癌病変とは対照的に癌と相関する）をモニターすることは、子宮頸癌患 者で疾患の進行を追跡するために、さらに再発をスクリーニングするために有用 であると提唱された（上掲書）。 場合によっては、キメラＶＬＰｓは活性を有する完全な蛋白を細胞に輸送させ る方法で用いることができる。この蛋白は、例えば酵素または毒素または薬剤で あろう。このキメラＶＬＰｓは細胞にインビトロ、インビボ、そのままの場所で または生体外のいずれかで投与され、この蛋白はその後細胞に輸送され、該細胞 でその意図された目的（例えば酵素または毒素または薬剤として）のために機能 する。 本発明者らは、Ｌ２に融合させたＥ７蛋白またはペプチドを取り込んだパピロ ーマウイルス様キメラ粒子の作製に成功した。 パピローマウイルスＥ７遺伝子は、Ｌ２遺伝子の３’末端に枠内で融合させた 場合、またはＬ２読み取り枠部分内で融合させた場合、ウイルス様粒子に取り込 んだＬ２−Ｅ７融合蛋白をＬ１蛋白の存在下で発現させた。ＶＬＰｓへのＬ２− Ｅ７の取り込み効率と純正度は野性型Ｌ２蛋白のそれと同様であった。ＢＰＶＬ １／Ｌ２−Ｅ７ウイルス様粒子は、ＢＰＶＬ１／Ｌ２粒子と同じ効率で中和抗体 を誘導させることが分かった。キメラ粒子は、Ｌ２−Ｅ７キメラ粒子で免疫した ウサギで融合パートナーエピトープに特異的な液性免疫を誘導し、Ｅ７に対する 抗体を生じることが観察された。 パピローマウイルス様キメラ粒子を作製することが可能になったことによって 、実際上どのような蛋白またはペプチドもＬ２生成物に融合させ、パピローマウ イルス様キメラ粒子に取り込ませることが可能になる。 本発明者らは、Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を作製し、これらの蛋白を昆虫細胞でリコ ンビナントバキュロウイルスを介してＬ１とともに発現させることによってキメ ラＶＬＰｓを製造することに成功した。我々は３つのキメラＶＬＰｓを作製した ：ＨＰＶ１６Ｌ１＋ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）、ＢＰＶＬ １＋ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）およびＢＰＶＬ１＋ＢＰＶＬ２ −ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）。ＢＰＶＬ２はＨＰＶ１６Ｅ７にその３ ’末端で融合させた。ＨＰＶ１６Ｌ２はＨＰＶ１６Ｅ７にその３’末端で融合さ せた。さらにＨＰＶ１６Ｅ７の最初の３０コドンはＢＰＶＬ２のコドン２７４と ２７５との間に挿入させた。 Ｌ１およびＬ２−Ｅ７の蔗糖濃度勾配による同時沈降並びに免疫沈澱によって 、キメラ蛋白がＶＬＰｓに取り込まれていることが示された。 透過型電子顕微鏡によって、Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を含む粒子はＬ１またはＬ１ ／Ｌ２ＶＬＰｓと同じ効率で集合組立が行なわれ、形態学的に区別できないこと が明らかになった。 インビトロＢＰＶ１中和アッセーによって、ＢＰＶＬ１含有キメラＶＬＰｓは 中和抗血清を誘導できることが示された。力価はＢＰＶＬ１／Ｌ２を用いて得ら れるものに匹敵した。３００００に匹敵する中和力価がＢＰＶＬ１／Ｌ２ＶＬＰ ｓおよびＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）キメラＶＬＰｓの両 方に対して得られた。 Ｌ２−Ｅ７キメラ粒子で免疫したウサギはＥ７に対する抗体を生じたが、この ことは、キメラＶＬＰｓによる融合パートナーエピトープに対して特異的な液性 免疫が誘導されることを示し、さらにＥ７の存在部位がＶＬＰｓの外部であるこ とを確認させた。 実施例１で説明するように、キメラリコンビナントバキュロウイルスを作製す ることができる。キメラの遺伝子は、ゲノム源またはｃＤＮＡから直接的合成ま たはそのいずれかの組合せによって得ることができる。Ｌ２およびその融合パー トナー遺伝子はリコンビナントＰＣＲ技術によって増幅できる。このＰＣＲ技術 は、例えば融合を促進し、さらに発現、移転および／またはクローニングのため のベクター（例えばプラスミド）へのクローニングを促進する制限酵素部位を含 むオリゴヌクレオチドを用いる。 融合遺伝子はバキュロウイルス発現ベクターでクローニングできる。Ｌ１を含 む別のバキュロウイルス発現ベクターを作製できる。または、融合遺伝子は、既 にＬ１を含むバキュロウイルス二重発現ベクターでクローニングできる。 実施例２では、リコンビナントバキュロウイルス選別の典型的な方法が説明さ れる。ＣｓＣｌ精製（またはそれに匹敵する）リコンビナントプラスミドをバキ ュロウイルスＤＮＡとＳｆ９昆虫細胞にリポフェクチン（またはそれと同等なも の）を用いて同時トランスフェクションさせることができる。続いて、通常のバ キュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養方法を用いて、リコンビナントバキ ュロウイルスを（例えば）プラーク精製することができる。 二重発現バキュロウイルスベクターの代わりに２種の単一発現バキュロウイル スを用いる方が有利であるかもしれない。この場合には、キメラＶＬＰｓはＳｆ ９細胞を２つのリコンビナントバキュロウイルス（１つはＬ１生成物を他方はＬ ２融合生成物をコードする）で感染させることによって生成できる。該遺伝子を 異なるベクターに配置することによって、産生されるＬ１生成物およびＬ２融合 生成物量を操作することができる。このアプローチは、ＶＬＰにおけるＬ２融合 生成物のＬ１生成物に対する比を変化させることを可能にする。天然のビリオン ではＬ２はＬ１に比べて少ない成分であるが、２種の単一発現ベクターを用いて ＶＬＰへのＬ２融合生成物のより大量の取り込みを達成することができる。 実施例３で説明するように、キメラ粒子は塩化セシウム（または同等物）中で のバンド形成によって精製することができる。Ｓｆ９昆虫細胞にバキュロウイル スを例えば感染価１０で感染させることができる。７２時間後（またはその辺り で）、細胞を採取し燐酸緩衝食塩水中で６０秒（またはその辺りで）音波破砕で きる。低速（または同等な処理）で清澄にした後、溶解物を４０％（重量／容積 ）の蔗糖／ＰＢＳクッション中で例えば１１００００×ｇ、２５時間遠心する（ ＳＷ−２８ローター）。再懸濁させた沈殿物を、例えば１０−４０％（重量／重 量）のＣｓＣｌ／ＰＢＳ勾配中で室温で２０時間１４１０００×ｇで平衡に達す るまで遠心する。目に見えるバンドを採取し、同一条件を用いて再び平衡となる まで遠心し、ＰＢＳに対して十分に透析して（例えば）４℃で保存する。 実施例４に説明するように、キメラ複合体の同時沈降を、例えば分析用濃度勾 配遠心で実施できる。例えば、１２から４５％蔗糖の段階勾配は４℃で一晩で直 線化して透析したサンプルを最上部に重層し、この濃度勾配を４１０００ｒｐｍ （２８８０００×ｇ）で２時間ＳＷ−４１ローターで遠心する。分画を採集し、 同時沈降について例えばウェスタンブロット分析または同時免疫沈澱によって分 析する。 実施例５で説明するように、同時沈降は例えば免疫沈澱によって達成される。 実施例６で説明するように抗血清を作製できる。これは、文献に記載されたよ うに(Dvoretskyら、Virology 103:369(1980))、ＢＰＶ１中和アッセー（または 同等なもの）を実施するために行なわれる。抗血清は例えば以下のように作製さ れる。ＰＢＳ中のＣｓＣｌ勾配精製粒子３３０μｌ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を皮下 注射してウサギを免疫する。続いて、最初の注射から２週間後および４週間後に 同じ量の粒子でウサギを追加免疫する。 実施例７で説明するようにＢＰＶ１中和アッセー（または同等なもの）を実施 し、ＢＰＶキメラ粒子が形状エピトープを表示しているか否かを調べる。例えば ２回目の追加免疫注射後３週間して得られた血清の段階希釈を＝５００フォーカ ス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと３０分保温し、このウイルスをＣ１２７細胞に １時間吸着させ、この細胞を３週間培養する。続いてフォーカスをメタノール中 の０．５％メチレンブルー／０．２５％石炭酸フクシンで染色する。キメラＶＬ ＰｓおよびコントロールＢＰＶＬ１−Ｌ２ＶＬＰｓについて中和力価を得る。匹 敵する中和力価は、キメラ粒子が適切に折り畳まれて有効に形状エピトープが表 示されていることを示す。 実施例８に説明するように、キメラ粒子は例えば透過型電子顕微鏡で調べるこ とができる。例えば、精製粒子を炭素被覆グリッドに吸着させ、１％酢酸ウラニ ルで染色し、フィリップス電子顕微鏡モデルＥＭ４００Ｔで３６０００倍で調べ る。キメラ粒子およびＬ１またはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓの取り込み効率並びに形態 を比較する。取り込みおよび形態が区別不可能であるということは、キメラ粒子 の適切な自己集合組立を示唆する。 実施例９で説明するように、キメラ粒子は、例えば融合パートナーエピトープ に対して特異的な液性免疫誘導について調べられる。例えば、ウサギにキメラＶ ＬＰｓを接種する。例えば融合パートナー抗原サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに、 続いてウェスタンブロッテイング分析に付してこの血清を抗体について調べる。 免疫血清および免疫前血清（コントロール）を適切に希釈して用いることができ る。免疫ウサギから得た血清によってウェスタンブロットで融合パートナーのバ ンドが検出されれば、融合パートナーエピトープに対して特異的な抗体が誘導さ れたことが示唆される。 実施例１０で説明するように、例えばキメラＶＬＰｓをマウスに注射し抗原特 異的Ｔ細胞増殖を測定することによって、融合ペプチドについて特異的な細胞性 免疫の誘導についてキメラ粒子を調べる。 実施例１１で説明するように、Ｌ２融合は予防免疫を失わせないことを明らか にするために、例えばウサギをキメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶ ＶＬＰｓ（コントロール）で免疫し、続いて感染性ＣＲＰＶで試験感染させるこ とによって、または、ＳＴＤ病原体を含むキメラＶＬＰｓで実験動物を免疫し、 続いてＳＴＤで試験感染させてから致死的感染に対する生存の向上もしくは致死 量以下の試験感染後の感染の減少を測定することによって、キメラ粒子を試験感 染に対する予防免疫の誘導について調べることができる。 実施例１２で説明するように、例えばキメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラ ＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）を用いて（既にパピローマをもつ）ウサギを 免疫し、存在するパピローマの退縮を測定することによって、既に存在するパピ ローマに対する治療的免疫誘導についてキメラ粒子を調べることができる。 実施例１３で説明するように、例えば腫瘍の免疫療法および免疫的予防につい てキメラ粒子を調べることができる。 本発明の具体的な特徴は、特定の実施形態に本発明の範囲を限定することなく 本発明の例示を目的とする以下の実施例を参考にいっそう容易に理解されよう。 実施例１ キメラリコンビナントバキュロウイルスの作製 ３種のキメラを作製した：ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７、ＢＰＶＬ２−Ｈ ＰＶ１６Ｅ７およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）。ＨＰＶ １６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７は、ＨＰＶ１６Ｌ２のＣ−末端（アミノ酸４７３）に 融合させた完全な長さのＨＰＶ１６Ｅ７を含んでいた。ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６ Ｅ７は、ＢＰＶＬ２のＣ−末端（アミノ酸４６９）に融合した完全な長さのＨＰ Ｖ１６Ｅ７を含んでいた。ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）は 、アミノ酸２７４と２７５の間でＢＰＶＬ２の中央に融合させたＨＰＶ１６Ｅ７ の最初の３０アミノ酸を含んでいた。 Ｌ２−Ｅ７キメラ遺伝子はリコンビナントＰＣＲ技術（R．Higuchi(1990)、「 ＰＣＲプロトコル：方法と応用の手引」(PCR Protocols: A Guide toMethods an d Applications)より、M.A．Innis，D.H．Gelfand，J.J．Sninsky & T.J．Whit e編、(Academic，NY)，pp.177-180))によって作製した。完全な長さのＨＰＶ１ ６Ｅ７を含むキメラについては、制限酵素部位を含む５’オリゴおよび、Ｅ７の ５’オリゴと相補的な３’オリゴを用いてＬ２を増幅させた。それぞれ別個の反 応で、Ｌ２の３’オリゴと相補的な５’オリゴ、および制限酵素部位を含む３’ オリゴを用いてＥ７を増幅させた。続いて、外側（Ｌ２の５’およびＥ７の３’ ）オリゴのみを用いて、Ｌ２およびＥ７遺伝子を第二のプライマー伸長反応で融 合させた。ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸１〜３０のみを含むキメラについては、“ 内部”プライマーはＨＰＶ１６Ｅ７の最初の３０アミノ酸をコードした。 続いて、融合遺伝子をバキュロウイルス二重発現ベクターｐＳｙｎｗｔＶ１− （これはポリヘドロンプロモーター下でクローニングされたＬ１を既に含む(Kir nbauerら、Virol．67:6929(1993))でｐＳｙｎプロモーターの直ぐ下流でクロー ニングした。 ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラは５’ＢｇＩＩＩから３’ＢｇＩＩＩフラ グメントとしてクローニングした。ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラは５ ’ＳｓｔＩＩから３’ＳｓｔＩＩフラグメントとしてクローニングした。ＢＰＶ Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）のために用いたプライマーは以下の通りで あった： ＢＰＶＬ２のセンス（鎖）は、 アンチセンス（鎖）は、 ＨＰＶ１６Ｅ７、センスは、 およびアンチセンスは ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）のために用いたプライマーは 以下の通りであった：ＢＰＶＬ２、センスは上記と同じで、 内部プライマーのアンチセンスは 内部プライマーのセンスは ＢＰＶＬ２、アンチセンスは ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７キメラのために用いたプライマーは以下の通り であった： ＨＰＶ１６Ｌ２、センスは およびアンチセンスは ＨＰＶ１６Ｅ７、センスは およびアンチセンスは 実施例２ リコンビナントバキュロウイルスの選別 リポフェクチン(GIBCO/BRL製、ガイザースバーグ、メリーランド）を用いて、 ＣｓＣｌ精製リコンビナントプラスミドをＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ１ ７１１）にバキュロウイルスＤＮＡ（Baculo-Gold;PharMingen製、サンディエゴ 、カリフォルニア）と同時トランスフェクションさせた（P.C．Harting，Biotec hniques 11:310(1991)）。リコンビナントバキュロウイルスは、記載（M.D．Sum mers & G.E．Smith(1987)、「バキュロウイルスベクターと昆虫細胞培養手順の 手引」(A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cultu re Procedures)、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin(Tex．Agri c．Exp．Stn.，College Station，TX)、1555巻）にしたがってプラーク精製した 。 実施例３ キメラ粒子の精製 Ｓｆ９昆虫細胞は、感染価１０でリコンビナントバキュロウイルスで感染させ られた。７２時間後、採取細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で６０秒間音波で 破砕した。低速で清澄にした後、溶解物を４０％（重量／容積）の蔗糖／ＰＢＳ クッション中で１１００００×ｇ、２５時間遠心した（ＳＷ−２８ローター）。 再懸濁させた沈殿物を、１０〜４０％（重量／重量）のＣｓＣｌ／ＰＢＳ勾配中 で室温で２０時間１４１０００×ｇで平衡に達するまで遠心した。目に見えるバ ンドを採取し、同一条件を用いて再び平衡となるまで遠心し、ＰＢＳに対して十 分に透析して４℃で保存した。 実施例４ Ｌ１／Ｌ２−Ｅ７複合体の同時沈降 Ｌ２−Ｅ７融合蛋白が粒子内に取り込まれているか否かを決定するために、分 析用濃度勾配遠心を、Ｌ１およびＬ２の同時集合組立について調べるために先に 報告されたように実施した(Kirnbauerら、Virol．67:6929(1993))。 簡単に記せば、１２から４５％の蔗糖段階濃度勾配を４℃で一晩直線化させて 透析サンプルを最上部に重層し、この濃度勾配をＳＷ−４１ローターで４１００ ０ｒｐｍ（２８８０００×ｇ）で２時間遠心した。分画を採取し、これら分画を クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌ１）またはウェスタンブロット分析（抗Ｂ ＰＶＬ２ポリクローナル抗体または抗ＨＰＶ１６Ｅ７ポリクローナル抗体および¹²⁵ Ｉ標識抗ウサギＩｇＧを用いる）で調べた。 キメラＬ２−Ｅ７とウイルス様粒子との結合は同時沈降分析によって確認され た。 実施例５ Ｌ１／Ｌ２−Ｅ７複合体の同時免疫沈澱 Ｌ２−Ｅ７融合蛋白はＬ１と安定な複合体を形成するという証拠を得るために 、同時免疫沈澱実験を実施した。 簡単に記せば、ＢＰＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）およびＢＰ ＶＬ１／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）ＶＬＰ調製物を、ＰＢＳ、 irol．印刷中(1994年11月))、抗Ｌ１ポリクローナル抗体、免疫前血清または無 関係抗体（抗Ｅ１Ａモノクローナル抗体）および蛋白Ａセファロースを用いて免 疫沈澱させ、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。蛋白を免疫ブロッティングに付 し、抗ＢＰＶＬ２もしくは抗ＨＰＶ１６Ｅ７血清または抗ＨＰＶ１６Ｅ７モノク ローナル抗体（Triton Diagnostics製、アラメダ、カリフォルニア）をプローブ として調べた。 キメラＬ２−Ｅ７とウイルス様粒子との結合は同時免疫沈澱によって確認され た。 実施例６ 抗血清の作製 ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌの濃度の３３０μｌのＣｓＣｌ濃度勾配精製粒子を皮 下注射してウサギを免疫した。最初の注射から２週間および４週間後で同じ量の 粒子でウサギを追加免疫した。 実施例７ ＢＰＶ１中和アッセー 報告(Kirnbauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:12180(1992))にしたが ってフォーカス形成アッセーを実施した。 簡単に記せば、２回目の追加免疫注射の３週間後に得たウサギの血清の段階希 釈を、＝５００フォーカス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと３０分保温し、このウ イルスをＣ１２７細胞に１時間吸着させ、さらにこの細胞を３週間培養した(Dvo retzkyら、Virology 103:369(1990))。フォーカスをメタノール中の０．５％メ チレンブルー／０．２５％石炭酸フクシンで染色した。 ３００００に匹敵する中和力価がＢＰＶＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓおよびＢＰＶＬ１ ／Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）キメラＶＬＰｓについて得られた。 実施例８ 電子顕微鏡 透過型電子顕微鏡観察を報告(Kirnbauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89 ：12180(1992))にしたがって実施した。 簡単に記せば、精製粒子を炭素被覆グリッドに吸着させ、１％酢酸ウラニルで 染色し、フィリップス電子顕微鏡モデルＥＭ４００Ｔで３６０００倍で調べた。 Ｌ２−Ｅ７融合蛋白を含む粒子は、形態および取り込み効率に関してＬ１ＶＬ ＰｓまたはＬ１／Ｌ２ＶＬＰｓと区別できないことが分かった。 実施例９ 抗体の誘導 ＢＰＶＬ１／Ｌ１−ＨＰＶ１６Ｅ７パピローマウイルス様粒子を接種したウサ ギはＥ７を認識する抗血清を産生した。 Ｅ７特異性について血清を調べるために、２．５μｇのＨＰＶ１６Ｅ７および ２．５μｇのＢＳＡ（コントロール）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、続いてウェス タンブロッティングで調べた。免疫血清および免疫前血清（コントロール）を１ ：１０の希釈で用いた。 免疫ウサギから得た血清はウェスタンブロットでＨＰＶ１６Ｅ７蛋白バンドを 特異的に検出し、Ｅ７エピトープに特異的な抗体の誘導を示唆した。 実施例１０ 細胞性免疫の誘導 Ｅ７ペプチドに特異的な細胞性免疫の誘導について、例えばキメラＶＬＰｓを マウスに注射し、抗原特異的Ｔ細胞増殖を測定することによって、キメラ粒子を 調べた。 実施例１１ 予防的免疫 キメラ粒子を、試験感染に対する予防的免疫の誘導について調べる。例えばＥ ７キメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよび非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）で ウサギを免疫し、続いて感染性ＣＲＰＶで試験感染させて、Ｌ２−Ｅ７融合が予 防的免疫を失わせないことを示すか、またはＳＴＤ病原体を含むキメラＶＬＰｓ で実験動物を免疫し、続いてＳＴＤ病原体で試験感染させ、致死的感染に対する 生存度の向上または致死量以下の試験感染後の感染の減少を測定する。 実施例１２ 治療的免疫 例えば、ウサギ（既にパピローマをもつ）をＥ７キメラＣＲＰＶＶＬＰｓおよ び非キメラＣＲＰＶＶＬＰｓ（コントロール）で免疫し、既に存在するパピロー マの退縮を測定することによって、既に存在するパピローマに対する治療的免疫 の誘導についてキメラ粒子を調べる。 実施例１３ 腫瘍の免疫療法および免疫予防 例えば、実験動物（例えばマウス）で既に存在する腫瘍を治療する能力、また は腫瘍の発達を予防する能力について、例えばＥ７を発現している腫瘍細胞を用 いてキメラ粒子を調べる。動物を、例えばＬ２−Ｅ７キメラＶＬＰｓで免疫し、 例えばＥ７を発現している接種腫瘍原性細胞の増殖について調べる。このアプロ ーチは、非複合Ｅ７および補助刺激蛋白で免疫した動物で機能することが示され た(Chenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:110(1991))。 実施例１４ キメラＶＬＰｓの表面への誘導 細胞表面に結合する例えば補助刺激物質またはリガンドのようなある種の分子 は、キメラＶＬＰｓの表面に存在することが望ましいかもしれない。ローデンら (Rodenら、J．Virol．印刷中(1994年、11月))は、Ｌ２の領域はＶＬＰｓの表面 存在することを見出した。ＢＰＶＬ２アミノ酸４４〜１７３を含むペプチドは、 ウサギに接種されたとき、１：１０００の血清希釈で活性を有する中和抗体を誘 導した。これらの結果は，Ｌ２の領域は中和エピトープを明示し、さらにこれら の領域は天然のビリオン表面に接近できることを示唆している。したがって、非 Ｌ２ポリペプチドをこれらの領域の１つに融合させることによって、おそらくこ のペプチドをキメラＶＬＰ表面に誘導することができるであろう。 本発明の特定の実施形態を詳細に記載したが、当業者には、これらの実施形態 は制限的ではなく例示であって、本発明の真正の範囲は添付の請求の範囲に限定 されることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ローウィ、ダグラス アール. アメリカ合衆国 20814 メリーランド州 ベセスダ サウス チェルシー レーン 4709 (72)発明者 シラー、ジョン ティー. アメリカ合衆国 20902 メリーランド州 シルバースプリング メイプル ビュー ドライブ 11306 (72)発明者 グリーンストーン、ヘザー アメリカ合衆国 20910 メリーランド州 シルバースプリング ストラットン ロ ード 1901

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． パピローマウイルスＬ１生成物およびパピローマウイルスＬ２融合生成 物を含むパピローマウイルス様粒子であって、当該融合生成物が一連のアミノ酸 を含み、当該一連のアミノ酸の一部分がＬ２蛋白配列に由来し、さらに当該一連 のアミノ酸の別の部分が当該Ｌ２蛋白配列以外の蛋白配列に由来し、さらに当該 粒子が形状エピトープを表示する上記パピローマウイルス様粒子。 ２． 当該パピローマウイルスＬ２融合生成物が、ヒトパピローマウイルスＬ ２融合生成物またはウシパピローマウイルスＬ２融合生成物である請求の範囲第 １項のパピローマウイルス様粒子。 ３． 当該パピローマウイルスＬ２融合生成物が、ヒトパピローマウイルス１ ６（ＨＰＶ１６）Ｌ２融合生成物またはウシパピローマウイルス１（ＢＰＶ１） Ｌ２融合生成物である請求の範囲第２項のパピローマウイルス様粒子。 ４． 当該パピローマウイルスＬ２融合生成物が、ペプチド、完全な長さの蛋 白、または縦並びに連結されたこれらの組合せである融合パートナーを含む請求 の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 ５． 当該融合パートナーがパピローマウイルスＥ６またはＥ７生成物である 請求の範囲第４項のパピローマウイルス様粒子。 ６． 当該パピローマウイルスＬ２融合生成物が、その５’または３’末端で 融合パートナーと融合されているパピローマウイルスＬ２生成物をコードするＤ ＮＡの発現によって製造される請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 ７． 当該Ｌ２蛋白配列以外の蛋白配列に由来する当該鎖の部分が、Ｌ２アミ ノ酸の間に挿入されている請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 ８． 当該パピローマウイルスＬ１生成物が、ヒトパピローマウイルスＬ１生 成物またはウシパピローマウイルスＬ１生成物である請求の範囲第１項のパピロ ーマウイルス様粒子。 ９． 当該パピローマウイルスＬ１生成物が、ＨＰＶ１６Ｌ１生成物またはＢ ＰＶ１Ｌ１生成物である請求の範囲第８項のパピローマウイルス様粒子。 １０． ＨＰＶ１６Ｌ１およびＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ ）から本質的になる請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 １１． ＨＰＶ１６Ｌ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）が、ＨＰＶ１６Ｌ２ をコードするＤＮＡの３’末端に融合されているＨＰＶ１６Ｅ７をコードするＤ ＮＡの発現によって製造される請求の範囲第１０項のパピローマウイルス様粒子 。 １２． ＢＰＶＬ１およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）から本 質的になる請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 １３． ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（完全な長さ）が、ＢＰＶＬ２をコード するＤＮＡの３’末端に融合されているＨＰＶ１６Ｅ７をコードするＤＮＡの発 現によって製造される請求の範囲第１２項のパピローマウイルス様粒子。 １４． ＢＰＶＬ１およびＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０） から本質的になる請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。 １５． ＢＰＶＬ２−ＨＰＶ１６Ｅ７（アミノ酸１〜３０）が、Ｌ２アミノ酸 ２７４と２７５との間でＢＰＶＬ２をコードするＤＮＡと融合されているＨＰＶ １６Ｅ７をコードするＤＮＡの発現によって製造される請求の範囲第１４項のパ ピローマウイルス様粒子。 １６． パピローマウイルスＬ１生成物およびパピローマウイルスＬ２融合生 成物をただ１度コードするかまたは２重にコードする１つまたは２つ以上の合成 ＤＮＡ分子であって、当該分子が、形状エピトープを有するパピローマウイルス 様粒子の形質転換宿主細胞での発現を誘導し、当該ウイルス様粒子が当該パピロ ーマウイルスＬ１生成物および当該パピローマウイルスＬ２融合生成物を含み、 当該融合生成物が一連のアミノ酸を含み、その場合当該一連のアミノ酸の一部分 がＬ２蛋白配列に由来し、該一連のアミノ酸の別の部分がＬ２蛋白配列以外の蛋 白配列に由来する上記合成ＤＮＡ分子。 １７． 当該形質転換宿主細胞が昆虫宿主細胞であって当該ＤＮＡ分子がさら に昆虫細胞ベクターを含むか、当該形質転換宿主細胞が哺乳類宿主細胞であって 当該ＤＮＡ分子がさらに哺乳類細胞ベクターを含むか、または当該形質転換宿主 細胞が酵母宿主細胞であって当該ＤＮＡ分子がさらに酵母細胞ベクターを含む請 求の範囲第１６項の１つまたは２つ以上のＤＮＡ分子。 １８． 請求の範囲第１６項の１つまたは２つ以上のＤＮＡ分子で形質転換さ れた宿主細胞。 １９． （ａ）請求の範囲第１８項にしたがって形質転換された宿主細胞の培 養を得る工程、（ｂ）当該形質転換宿主細胞から当該１つまたは２つ以上のＤＮ Ａ分子の発現を誘導する工程、及び（ｃ）当該形質転換宿主細胞から当該パピロ ーマウイルス様粒子を回収する工程を含む、パピローマウイルス様粒子を得る方 法。 ２０． 請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子をアフィニティークロ マトグラフィーカラムに曝す工程を含むパピローマウイルス様粒子の精製方法で あって、当該カラムがパピローマウイルスＬ２融合生成物の融合パートナーと結 合する抗体を含み当該粒子の精製をもたらす、上記パピローマウイルス様粒子の 精製方法。 ２１． 請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子を細胞に投与し、その 結果当該融合パートナーを当該細胞へ輸送させる工程を含む、パピローマウイル ス様粒子のパピローマウイルスＬ２融合生成物の融合パートナーを細胞に輸送さ せる方法。 ２２． 請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子を含むワクチン。 ２３． 多価抗原の表示用土台として使用する請求の範囲第１項のパピローマ ウイルス様粒子。 ２４． 蛋白をペプチドに加工し、続いてＭＨＣ分子組織体の中でこれらのペ プチドを表示させるために細胞内に蛋白を輸送して細胞性免疫反応を誘導する場 合に使用する請求の範囲第１項のパピローマウイルス様粒子。