DE69532532T2 - Chimerische papillomavirus-ahnliche partikel - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Papillomavirus-artige Partikel und verwandte synthetische DNA-Moleküle, Wirtszellen, Verfahren und Vakzine.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Papillomaviren infizieren die Epithelien von Menschen und einer großen Vielzahl von Tieren, wo sie im Allgemeinen eine gutartige Proliferation an der Infektionsstelle induzieren. Jedoch durchlaufen in einigen Fällen die durch bestimmte Papillomaviren induzierten Läsionen eine maligne Progression. Es gibt eine starke Assoziation zwischen der malignen Progression von menschlichen Genitalläsionen und bestimmten menschlichen Papillomavirus (HPV)-Arten wie HPV16. Von der Infektion mit einer dieser Arten wird angenommen, dass sie der wichtigste Risikofaktor in der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs, einer der häufigsten Krebsarten bei Frauen, weltweit (zur Hausen, H., Science 254: 1167 (1991); Schiffman, M. H., J. Natl. Cancer Inst. 84: 394 (1992)) ist. Die Mehrzahl der Gebärmutterkrebsarten enthält und exprimiert frühe HPV-Gene wie E6 und E7 und für diese Gene wurde gezeigt, dass sie eine starke transformierende und immortalisierende Aktivität in kultivierten Zellen aufzeigen (Werness, B. A., Munger, K. & Howley, P. M. (1991) Advances in Oncology, Eds. DeVita V. T., Hellman, S. & Rosenberg, S. A. (Lipponcott, Philadelphia), S. 3–18).
  • Papillomaviren sind nicht eingehüllte doppelsträngige DNA-Viren von ungefähr 55 nm im Durchmesser mit einem Genom in dem Nukleohistonkern von ungefähr 8 kB (Baker, et al., Biophys. J. 60: 1445 (1991)). Die Kapside bestehen aus zwei viral kodierten Proteinen, L1 und L2, die auf SDS-PAGE-Gelen bei ungefähr 55 kDa und 75 kDa wandern (Mose Larson et al., J. Virol. 61: 3596 (1987)). L1, welches das hauptsächliche Kapsinprotein ist, ist in 72 Pentameteren angeordnet, die mit T = 7 ikosahedraler Symmetrie assoziieren. Die Funktion und Position von L2 innerhalb des Virions ist unklar (Baker, et al., Biophys. J. 60: 1445 (1991)).
  • Das L1-Protein hat die Fähigkeit zum Selbstzusammenbau, so dass große Mengen an virusartigen Partikeln (VLPs, virus-like particles) durch die Expression des L1-Proteins aus einer Anzahl von Papillomavirus-Spezies in einer Reihe rekombinanter Expressionssysteme hergestellt werden können (Hagensee et al., J. Virol. 67: 315 (1993); Kirnbauer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992); Kirnbauer et al., J. Virol. 67: 6929 (1993); Rose et al., J Virol. 67: 1936 (1993)). Obwohl L2 nicht zum Zusammenbau benötigt wird, wird es in die VLPs eingebaut, wenn es mit L1 (L1/L2 VLPs) in Zellen koexprimiert wird.
  • Die Immunisierung von Kaninchen mit nativen Virionen oder L1-VLPs, nicht aber mit nicht zusammengesetztem L1, das in E. Coli exprimiert wird, induziert hohe Titer an neutralisierenden Serum-Antikörpern (Christensen, N. D. und Kreider, J. W., J. Virol. 64: 3151 (1990); Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992); Pilacinski et al., Bio/Technology 2: 356 (1984); Segre et al., Am. J. Vet. Res. 16: 517 (1955)). Die gegen native Partikel hergestellten polyklonalen und monoklonalen Antikörper erkennen Epitope konformell abhängig (Christensen, N. D. und Kreider, J. W., Virus Res. 28: 195 (1993); Christensen et al., J. Virol. 64: 5678 (1990); Christensen et al., Virology 181: 572 (1991)).
  • Gegen VLPs hergestellte neutralisierende Antikörper erkennen auch konformell abhängige Epitope. Unter Verwendung von infektiösem BPV1, welches leicht aus Rinderläsionen erhalten werden kann und mit einem quantitativen in vitro BPV1-Infektivitätsassay (Dvoretzky et al., Virology 103: 369 (1980)), zeigten Fachleuten, dass VLPs aus Rinderpapillomavirus große Mengen an neutralisierenden Antikörpern induzieren (Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992)). Die neutralisierenden Antikörper waren gegen konformell abhängige Epitope dahingehend gerichtet, dass eine Denaturierung der Partikel vor der Immunisierung die Fähigkeit der Zubereitung zunichtete machte, eine neutralisierende Aktivität zu induzieren (id.).
  • Wenn das L1-Gen eines HPV16-Isolats, das aus einer nicht-progressiven Läsion abgeleitet war, verwendet wurde, um das L1 Hauptkapsiprotein in Insektenzellen über rekombinante Baculoviren zu exprimieren, setzte sich L1 in VLPs in einer Ausbeute zusammen, die dreifach höher war, als was unter Verwendung von L1 erhalten wurde, das aus dem Prototypen HPV16 abgeleitet wurde (ursprünglich aus einer Krebsläsion isoliert) und bildete VLPs, die morphologisch zu nativen Virionen ähnlich waren (Kirnbauer et al., J. Virol. 67: 6929 (1993)). Der DNA-Sequenzvergleich identifizierte eine einzelne nicht konservierte Aminosäuresänderung als verantwortlich für den ineffizienten Zusammenbau des Prototypen L1 (id.). Von dem L1 des Zusammenbau-kompetenten Klons wird somit angenommen, dass es das Wildtyp-Gen ist und dass der Prototyp L1 des Zusammenbau-defekten Klons eine Mutante ist.
  • Unter Verwendung von HPV16-VLPs des Wildtyp L1-Proteins als Antigene wurde ein ELISA entwickelt, der Serumantikörper in Patienten nachweist, die mit HPV16 infiziert sind (Kirnbauer et al., J. Natl. Cancer Inst. 86: 494 (1994)). Im Gegensatz dazu konnten weder denaturierte HPV16-Partikel noch Zubereitungen des Prototypen L1-Proteins diese Antikörper nachweisen (id.). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Prototypen L1-Protein keine konformellen Epitope aufzeigt.
  • Von Kaninchenserum, das gegen selbst zusammengebaute Wildtyp-HPV16 L1/L2 virusartige Partikel gezüchtet wurde, wurde entdeckt, dass es die HPV16 VLP-Bindung an Zelloberflächenmoleküle verhindert (Roden et al., J. Virol, im Druck, (November, 1994)). Im Gegensatz dazu verhinderte Serum, dass gegen den Prototypenstamm von HPV16 L1/L2 gezüchtet wurde, eine solche Bindung nicht (id.). Die Daten zeigen, dass der Prototypen HPV16-Stamm keine konformellen Epitope aufweist.
  • Kaninchen, die mit intaktem Baumwollschwanz-Kaninchen-Papillomavirus (CRPV, cottontail rabbit papillomavirus) – virusartigen Partikeln immunisiert wurden, die aus L1 oder L1/L2 zusammengesetzt waren, waren vor einer anschließenden experimentellen Herausforderung durch infektiöses CRPV geschützt (Breitburd et al., 12. Internationaler Papillomavirus Workshop in Amsterdam, im Druck, (Oktober 1994)). Im Gegensatz dazu waren solche, die mit denaturierten Partikeln immunisiert worden waren, nicht geschützt (id.). Diese Ergebnisse sind mit dem Schluss konsistent, dass VLPs, die konformelle Epitope aufzeigen, in der Lage sind, eine schützende Immunität zu induzieren.
  • Aus Kapsidproteinen zusammengesetzte VLPs sind attraktive Kandidaten für prophylaktische Vakzine, um eine Papillomavirusinfektion zu verhindern. Jedoch ist es unwahrscheinlich, dass diese VLP-Vakzine therapeutische Wirkungen gegen ethablierte Papillomavirusinfektionen aufweisen. Die Kapsidproteine, anders als E6 und E7, werden in progressiven Läsionen oder in infizierten Basalepithelzellen, welche die angenommenen Ziele in der Immunprogression von Papillomaviren sind, nicht nachweisbar exprimiert.
  • Es gibt Hinweise aus experimentellen Modellen, dass Immunität gegen Papillomavirusproteine außer L1 und L2 der Kontrolle einer Papillomavirusinfektion helfen können. Da E6 und E7 selektiv während einer onkogenen Progression beibehalten werden, gibt es die Möglichkeit, dass Peptide, die aus diesen Onkoproteinen abgeleitet sind, als Ziele für zellvermittelte Immunreaktionen gegen HPV-enthaltende Tumorzellen dienen könnten. Studien in Tiermodellen schlagen vor, dass das E7-Protein von HPV16 als Tumorabstoßungsantigen wirkt (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110 (1991); Feltkemp et al., Eur. J. Immunol. 23: 2242 (1993)). Des weiteren erhöht sich die Häufigkeit einer HPV-Infektion, die Persistenz einer HPV-Infektion und das Risiko der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und anderen HPV-verwandten Krebsarten in Patienten mit einer geschwächten zellulären Immunität (Allout et al., Br. Med. J. 298: 153 (1989); Laga et al., Int. J. Cancer 50: 45 (1992)). Diese Beobachtungen deuten an, dass die zellvermittelte Immunität in der Verteidigung gegen eine HPV-Infektion und die damit assoziierte Tumorentwicklung von Bedeutung ist. Die Induktion einer solchen Immunität kann sowohl therapeutisch wie auch prophylaktisch sein.
  • Es wurde gezeigt, dass fremde Peptide in virale Kapsid-artige Strukturen eingebracht werden können und dass diese chimären Partikel verwendet werden können, um fremde Antigene an das Immunsystem zu präsentieren. Veröffentlichte Beispiele umfassen die Hepatitis B-Kernantigenpartikelpräsentation von menschlichen Rhinovirus Typ 2 Epitopen (Francis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2545 (1990)), gp 41 aus HIV (Borisova et al., FEBS Lett. 259: 121 (1989)) und B19 Parvoviruspartikel-Präsentation von Peptiden aus dem Herpes Simplex Virus 1 und den murinen Hepatitisvirus (Brown et al., Virology 198: 477 (1994)). Die Parvoviruschimären schützten Mäuse vor der experimentellen Herausforderung mit dem korrespondierenden Virus. In allen der oben genannten Systeme wurden fremde Sequenzen in Proteine eingefügt, die in die Kapsidstruktur integriert sind und auf weniger als 20 Aminosäuren beschränkt waren. Jedoch zeigte kürzlich eine Studie (Miyamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8507 (1994)), dass das gesamte 147 Aminosäuren Hühnereiweißlysozymprotein in B19 Parvoviruspartikel eingebaut werden kann, wenn es an das kleinere Parvovirus L1 Kapsidprotein fusioniert wird. Das Lysozym verblieb biologisch aktiv und zeigte eine Immunreaktion, wenn es in Kaninchen injiziert wurde. In gegebenenfalls weniger relevanten Studien zeigten Hepatitis B Virus Oberflächenantigenpartikel (die Lipidmembranstrukturen sind), die 84 Aminosäuren eines Glykoproteins der HIV-1 Hülle enthalten (Michel et al., J. Virol. 64: 2452 (1990)) und Hefe Ty virusartige Partikel, die einen Teil der HIV-1 V3-Schleife enthalten (Griffiths et al., J. Virol. 65: 450 (1991)), dass sie auch eine Immunreaktion auf die eingefügten Peptide produzieren, wenn sie in Tieren inokuliert wurden. Bezüglich der Papillomaviren wurde kürzlich berichtet, dass Hepatitis B Kernantigenpartikel, die HPV16 E7-Peptide (alle weniger als 20 Aminosäuren) enthalten, peptidspezifische Antikörper und T-Helferreaktionen in Mäusen induzieren (Tindle et al., Virology 200: 547 (1994)).
  • Es gab weder Berichte über chimäre Partikel, die auf selbst zusammengesetztem Papillomavirus L1 beruhen, noch wurde die Verwendung von L2 als viraler Fusionspartner für die Zwecke der Herstellung chimärer VLPs beschrieben. Die oben zitierten chimären Partikelstudien involvieren Viren, die nicht mit Papillomaviren verwandt sind und können somit die Ergebnisse von Studien mit chimären Partikeln, die Papillomaviren involvieren, nicht voraussagen. Studien, die Viren verwenden, die nicht mit Papillomaviren verwandt sind, können nicht voraussagen, ob sich ein Papillomavirus L2, das ein Fremdpeptid oder Protein enthält, mit Papillomavirus L1 in Partikel zusammensetzen können. Des weiteren können diese Studien nicht voraussagen, ob jegliche der resultierenden chimären Partikel die Fähigkeit beibehalten werden, neutralisierende Antikörper zu induzieren oder nachzuweisen oder andere immunverwandte Reaktionen.
  • Chimäre Partikel können als Plattformen für eine multivalente Antigenpräsentation fungieren. Oder sie können zur Ablieferung von Protein in Zellen zur Prozessierung in Peptide und die anschließende Präsentation dieser Peptide innerhalb des Kontext von MHC-Molekülen dienen, um eine zellvermittelte Immunreaktion auszulösen. Die chimären Partikel stellen eine kosteneffektive Art zur Herstellung eines wirksamen Papillomavirus Vakzins mit einem breiten Anwendungsspektrum dar. Alternativ dazu können die chimären Papillomavirus-artigen Partikel zur VLP- und/oder Fusionspartneraufreinigung verwendet werden. Oder die Partikel können derart funktionieren, dass sie intakte und aktive Proteine in Zellen abliefern, z. B. Enzyme oder Toxine oder Medikamente.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Papillomavirus-artiger Partikel zur Verfügung gestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er konformelle Epitope aufweist, der ein Papillomavirus L1-Protein und ein Papillomavirus L2-Fusionsprodukt umfasst, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2-Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon.
  • Das antigene Protein oder Peptid ist vorzugsweise aus Proteinen oder Peptiden infektiöser Agenzien ausgewählt.
  • Der Fusionspartner kann ein Papillomavirusprotein oder Peptid sein, vorzugsweise ein E6- oder E7-Protein oder Peptid sein.
  • Der Papillomavirus-artige Partikel der Erfindung kann zusätzlich ein Fusionsprodukt umfassen, das eine Bindungsdomäne eines kostimulatorischen Proteins oder einen akzessorischen Rezeptors oder Liganden enthält, der in die Immunreaktivität involviert ist, z. B. B7 (welcher mit CD28 auf T-Zellen wechselwirkt), ein interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), ein Lymphozyten-funktionelles-Antigen (LVA), ein vaskuläres Adhäsionsmolekül (VCAM-1) oder ein hitzestabiles Antigen (HSA).
  • Das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kann ein menschliches Papillomavirus L2 Fusionsprodukt oder ein bovines Papillomavirus L2 Fusionsprodukt sein.
  • Das menschliche Papillomavirus L2-Fusionsprodukt kann ein HPV16 L2 Fusionsprodukt und das bovine Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kann ein BPV1 L2-Fusionsprodukt sein.
  • Der Fusionspartner kann aus Peptidfragmenten oder Proteinen in Gesamtlänge bestehen, oder Kombinationen davon, die als Tandem verbunden sind.
  • Das Papillomavirus L2 Protein oder Peptid kann an seinem N-Terminus oder C-Terminus an den Fusionspartner gebunden sein.
  • Das Papillomavirus L2-Fusionsprodukt kann einen Fusionspartner aufweisen, der zwischen den Aminosäuren des L2-Proteins oder Peptids eingefügt ist.
  • Das Papillomavirus L1-Protein kann ein menschliches Papillomavirus L1 Protein oder ein bovines Papillomavirus L1 Protein sein. Das menschliche Papillomavirus L1 Protein kann ein HBV16 L1 Produkt und das bovine Papillomavirus L1 Protein kann ein BPV1 L1 Produkt sein.
  • Der Papillomavirus-artige Partikel besteht vorzugsweise aus L1-Protein und L2-Fusionsprodukt und kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus HPV16 L1 und HPV16 L2 – HPV16 E7 (Gesamtlänge), worin optional HPV16 E7 an den C-Terminus von HPV16 L2 gebunden ist; BPVL1 und BPVL2 – HPV16 E7 (Gesamtlänge), worin optional HPV16 E7 an den C-Terminus von BPVL2 gebunden ist; oder BPVL1 und BPVL2 – HPV16 E7 (Aminosäuren 1–30), worin optional HPV16 E7 an BPVL2 zwischen den L2 Aminosäuren 274 und 275 gebunden ist, besteht.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Aufreinigung eines Papillomavirus-artigen Partikels zur Verfügung, umfassend den Schritt des Aussetzens des Papillomavirus-artigen Partikels an eine Affinitätschromatographiesäule, die Antikörper umfasst, die den Fusionspartner des Papillomavirus L2 Fusionsprodukts des Papillomavirus-artigen Partikels binden, was in der Aufreinigung von besagtem Partikel resultiert.
  • Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionspartners des Papillomavirus L2 Fusionsprodukts des Papillomavirus-artigen Partikels zur Verfügung, das den Schritt der Isolierung des Papillomaviruspartikels umfasst, was in der Aufreinigung des Fusionspartners resultiert.
  • Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Abgabe eines Fusionspartners eines Papillomavirus L2 Fusionsprodukts eines Papillomavirus-artigen Partikels zur Verfügung, das den Schritt der Verabreichung des Papillomavirus-artigen Partikels an die Zelle in vitro oder ex vivo umfasst, was in der Abgabe des Fusionspartners in die Zelle resultiert.
  • Die Erfindung stellt auch eine immunogene Zusammensetzung, die den hierin beschriebenen Papillomavirus-artigen Partikel umfasst, zur Verfügung.
  • Die Erfindung umfasst einen Papillomavirus-artigen Partikel, wie er hierin beschrieben wird, zur Verwendung als Pharmazeutikum. Auch umfasst die Erfindung die Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels, wie er hierin beschrieben wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunreaktion in einem Wirtssäugetier.
  • Die Erfindung stellt des weiteren ein DNA-Molekül zur Verfügung, das eine Nukieinsäuresequenz umfasst, die ein Papillomavirus L1 Protein und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodiert, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2-Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon, wobei besagtes Molekül in der Lage ist, die Expression von Papillomavirus-artigen Partikeln mit konformellen Epitopen in einer transformierten Zelle zu dirigieren, und worin besagte Partikel besagtes Papillomavirus L1 Protein und Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfassen.
  • Somit stellt die Erfindung ein oder mehrere synthetische DNA-Moleküle zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einzeln oder zu zweit ein Papillomavirus L1 Produkt und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodieren, wobei das Molekül oder die Moleküle die Expression eines Papillomavirus-artigen Partikels in einer transformierten Wirtszelle dirigieren, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er konformelle Epitope aufweist, der das Papillomavirus L1 Produkt und das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfasst.
  • Die transformierte Wirtszelle kann eine Insektenzelle sein (wie die Sf9-Insektenwirtszelle) und das DNA-Molekül oder die Moleküle können zusätzlich einen Insektenzellvektor umfassen (wie einen Baculovirusvektor), oder die transformierte Wirtszelle kann eine Säugetierwirtszelle sein und das DNA-Molekül oder die Moleküle können zusätzlich einen Säugetierzellvektor umfassen (wie einen Vaccinia-Virusvektor), oder die transformierte Wirtszelle kann eine Hefewirtszelle sein und das DNA-Molekül oder die Moleküle können zusätzlich einen Hefezellvektor umfassen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Wirtszelle zur Verfügung gestellt, die mit dem DNA-Molekül oder den Molekülen der Erfindung transformiert ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der transformierten Wirtszellen werden das Papillomavirus L1 Protein und das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt auf dem gleichen DNA-Molekül kodiert. Alternativ dazu können das Papillomavirus L1 Protein und das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt auf verschiedenen DNA-Molekülen kodiert werden.
  • Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung des DNA-Moleküls oder der Moleküle der Erfindung zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte umfasst: Das zur Verfügung stellen von Bedingungen für das oben genannte Molekül oder die Moleküle, um die oben genannte Expression zu dirigieren, und optional die Rückgewinnung des Papillomavirus-artigen Partikels aus den oben genannten transformierten Zellen.
  • Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Papillomavirus-artigen Partikels zur Verfügung gestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er konformelle Epitope aufweist, umfassend ein Papillomavirus L1 Protein und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt, wobei das Verfahren den Schritt des zur Verfügung Stellens von Bedingungen für das DNA-Molekül oder die Moleküle umfasst, um die oben genannte Expression des Papillomavirus-artigen Partikels in den oben genannten transformierten Wirtszellen zu dirigieren, wobei der Partikel aus der Wirtszelle optional rückgewonnen wird.
  • Die Erfindung umfasst auch eine Zusammensetzung, umfassend ein erstes DNA-Molekül, das ein Papillomavirus L1 Protein kodiert, und ein zweites DNA-Molekül, das ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodiert, wobei besagtes Fusionsprodukt, das ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon, worin besagte Moleküle in der Lage sind, die Expression von Papillomavirus-artigen Partikeln mit konformellen Epitopen in einer transformierten Zelle zu dirigieren, und wobei besagte Partikel besagtes Papillomavirus L1 Protein und Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfassen.
  • Optional sind die DNA-Moleküle:
    • (a) in der Lage, eine Expression in einer transformierten Insektenzelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül umfasst zusätzlich einen Insektenzellvektor, oder
    • (b) in der Lage, eine Expression in einer transformierten Säugetierzelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül umfasst zusätzlich einen Säugetierzellvektor, oder
    • (c) in der Lage sind, eine Expression in einer transformierten Hefezelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül umfasst zusätzlich einen Hefezellvektor.
  • Die Erfindung umfasst die Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels, wie er hierin zuvor beschrieben wurde, als Plattform für eine multivalente Antigenpräsentation.
  • Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels, wie er hiern zuvor beschrieben wurde, zur Abgabe von Proteinen in Zellen zur Prozessierung in Peptide und anschließende Präsentation dieser Peptide im Zusammenhang mit MHC-Molekülen, um eine zellvermittelte Immunreaktion auszulösen.
  • Die Erfindung stellt zudem ein Vakzin zur Verfügung, das den oben beschriebenen Papillomavirus-artigen Partikel umfasst.
  • Die Erfindung entstammt aus dem Ergebnis, dass ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt in einen Papillomavirus L1 Protein-basierenden Papillomavirus-artigen Partikel eingebracht werden kann, der konformelle Epitope präsentiert. Dieses Ergebnis war unerwartet.
  • Ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt soll eine Kette von Aminosäuren umfassen, in der ein Teil der Kette aus einer L2-Proteinsequenz und ein Teil der Kette aus einer anderen Proteinsequenz (oder anderen Proteinsequenzen) stammt.
  • L2-Fusionsprodukte werden durch das Splicen (im Leseraster) eines offenen Leserasters für ein Protein (oder einer Reihe von Proteinen) neben oder in ein offenes Leseraster für L2 hergestellt.
  • Es wird die Proteintechnologie verwendet, um die Struktur des L2 Fusionsproduktes zu bestimmen. In einer Routineübung für Proteinchemiker generieren diese Varianten des natürlichen L2-Proteins. Die Änderungen, die diese ausführen, können geschulte Annahmen sein, die auf dem detaillierten Wissen der Struktur von L2 beruhen; alternativ dazu können Änderungen auf der Basis reinen Zufalls durchgeführt werden. Oder es kann eine Kombination struktureller Informationen mit zufälliger Mutagenese und Selektion zu dramatischen Ergebnisse führen.
  • Zum Beispiel kann die Selektion der L2-Aminosäuren, zwischen die ein Fusionspeptid oder Protein eingefügt werden soll, auf dieser Basis durchgeführt werden. Die Existenz einer Region, in der die Aminosäuresequenz und Länge zwischen Papillomaviren variiert, schlägt vor, dass diese Region eine Struktur darstellt, die nicht essentiell für die Integrität von L2 und/oder seinen Einbau in Partikel ist. Die beobachtete Fähigkeit, ein Fusionspeptid oder Protein in L2 einzufügen, impliziert, dass eine solche Region existiert.
  • Die Bestimmung einer Struktur für das L2-Fusionsprodukt wird auf der Basis der Fähigkeit des L2-Fusionsprodukt durchgeführt, in einen Papillomavirus L1-Produkt basierenden Papillomavirus-artigen Partikel eingebaut zu werden, der konformelle Änderungen präsentiert.
  • Bevorzugte Mittel zur Bestimmung einer Struktur umfassen Assays, die die Effizienz und/oder Authentizität des Einbaus eines L2-Fusionsprodukts in ein Papillomavirus L1 Produkt-basierenden Papillomavirus-artigen Partikel umfassen.
  • Die Effizienz und/oder Authentizität der Bildung von L1/L2-VLPs steht in Beziehung zur Präsentation der konformellen Epitope (supra).
  • Das Chimäre L2 wird somit in L1-basierende VLPs mit einer Effizienz und/oder Authentizität eingebaut, die ähnlich der des Einbaus von Wildtyp L2 ist.
  • Andere bevorzugte Mittel zur Bestimmung einer Struktur für das L2-Fusionsprodukt umfassen Assays, die die Induktion und/oder den Nachweis von neutralisierenden Antikörpern messen.
  • Die Induktion und/oder der Nachweis von neutralisierenden Antikörpern steht in Beziehung zur Präsentation von konformellen Epitopen, da neutralisierende Antikörper gegen konformell abhängige Epitope gerichtet sind (supra).
  • Der Einbau des Chimären L2 wird somit nicht die Induktion und/oder den Nachweis von neutralisierenden Antikörpern durch chimäre Papillomavirus-artige Partikel im Vergleich zu L1 oder L1/L2-VLPs verhindern.
  • Für die Zwecke der Erfindung ist ein chimäres L2-Fusionsprodukt in der Lage, in einen Papillomavirus L1 Produkt-basierenden Papillomavirus-artigen Partikel eingebaut zu werden, der konformelle Epitope präsentiert, der entweder durch die oben genannten Mittel oder andere Mittel, die auf dem Gebiet bekannt sind, identifiziert wird.
  • Die Struktur von L2 und seinem Fusionspartner (und L1) soll ein L2-Protein in Gesamtlänge (und L1-Protein) und ein Fusionspartnerprotein in Gesamtlänge umfassen und deren Peptidfragmente, egal ob 5'-Fragmente, 3'-Fragmente oder interne Fragmente mit mindestens ungefähr 20 Aminosäureresten, vorteilhafterweise mindestens ungefähr 10 Aminosäureresten und bevorzugt mindestens ungefähr 5 Aminosäureresten. Art, Untergruppe und Stammvariationen von L2 (und L1) und menschliche Allel- und Speziesvariationen des Fusionspartnerproteins sind spezifisch dahingehend vorgesehen, dass sie in den Umfang der Erfindung fallen. Die Erfindung umfasst auch konservierte Varianten des L2-Proteins in Gesamtlänge (und L1-Proteins) und das Fusionspartnerprotein in Gesamtlänge und deren Peptidfragmente, worin konservative Aminosäuren gegen Aminosäurereste des Wildtyps L2 (und L1) und des Fusionspartnerproteins substituiert sind. Um die Degeneration des genetischen Kodes zu berücksichtigen, umfasst die Erfindung auch DNA, die für die gleichen Aminosäurereste kodieren, wie die DNA des L2- und (L1-) und Fusionspartnergens.
  • Von dem chimären Papillomavirus-artigen Partikel selbst ist vorgesehen, dass er jegliches L2-Fusionsprodukt mit jeglichem L1-Produkt aus jeglichem Papillomavirus einbaut, egal ob die Genome nah verwandt oder entfernt verwandt sind, solange der Einbau in die Partikel stattfindet. Somit kann ein L2-Fusionsprodukt, das z. B. mit einem der BPV-1, BPV-2, BPV-4, CRPV, DPV, EEPV, HPV-1, HPV-5, HPV-6, HPV-8, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31 oder HPV-33 verwandt ist, in die Partikel mit jeglichem L1-Produkt eingebaut werden, z. B. aus einem der oben genannten Viren oder einer Art, Untergruppe oder Stammvariation des Papillomavirus.
  • Da VLPs konformell abhängige Epitope präsentieren, die zur Induktion eines hohen Titers neutralisierender Serumantikörper notwendig sind, können VLP-Chimäre, die L2-Fusionsprodukte enthalten, prophylaktisch als optimierte Vakzinuntereinheiten zur Stimulation der humoralen Immunität fungieren, um eine Papillomavirusinfektion zu verhindern und dadurch die Entwicklung papillomavirusassoziierter Krebsarten oder anderer papillomavirusassoziierter Pathologien auszuschließen.
  • Da es unwahrscheinlich ist, das VLPs sich als therapeutische Vakzine wirksam zeigen werden, um eine Regression existierender Papillomavirus-proliferativer Läsionen, wie sie oben diskutiert werden, zu induzieren, können chimäre VLPs dahingehend fungieren, diesen lang anhaltenden und dementsprechend nicht befriedigten Bedarf zur Entwicklung eines therapeutischen Vakzins anzusprechen.
  • Von chimären VLPs ist zu erwarten, dass sie spezifische Zelloberflächerezeptoren binden, internalisiert werden und in das Zytoplasma freigesetzt werden und es somit wahrscheinlicher ist, dass sie die Präsentation von Peptiden in Verbindung mit Klasse I MHC-Molekülen zur Präsentation an zytotoxische T-Zellen zur Herstellung einer zellvermittelten Immunität unterstützen. Dieses steht im Gegensatz zu nicht komplexierten Proteinen, von denen nicht erwartet werden würde, dass sie spezifisch in Zellen eindringen oder die Präsentation von Peptiden im Kontext von Klasse I MHC-Molekülen unterstützen, um eine zytotoxische T-Zellreaktion auszulösen (es ist wahrscheinlicher, wenn überhaupt, dass sie die Präsentation von Peptiden, die an Klasse II MHC-Molekülen gebunden werden sollen sollen, und zu Helfer-T-Zellen präsentiert werden, unterstützen).
  • Der Einschluß von einem oder mehreren Fusionspartnern als L2-Fusionsprodukte wäre eindeutig eine kosteneffektive Weise, ein wirksames Papillomavirusvakzin mit einem breiten Nutzungsspektrum, einschließlich Therapie und verbesserter Prävention klinischer Läsionen, herzustellen.
  • Die Fusionspartner können aus der Liste ausgewählt werden, die aus solchen Fusionspartnern besteht, die ein Verfahren zur Expandierung potentieller Ziele eines VLS-basierenden Vakzins zur Verfügung stellen würden, z. B. E6 oder E7-Peptid oder E6- oder E7 in Gesamtlänge, andere Papillomaviruspeptide oder Proteine, oder Peptide oder Proteine von anderen STD oder infektiösen Mitteln, z. B. Herpes simplex, HIV, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae und Treponema pallidum.
  • Das L2-Fusionsprodukt ist nicht auf einen einzelnen Fusionspartner pro L2-Molekül eingeschränkt und kann zusätzliche Fusionspartner umfassen, z. B. zusätzliche Peptide oder Proteine in Gesamtlänge oder Kombinationen davon, die aus dem gleichen oder aus verschiedenen Proteinen abgeleitet sind und als Tandem verbunden sind. Es können auch mehr als ein L2-Fusionsprodukt zu einem einzelnen VLP zusammengesetzt werden. Z. B. kann ein L2-Fusionsprodukt oder chimäres VLP, das ein virales Zielepitop enthält, auch derart konstruiert sein, dass es eine Bindungsdomäne eines kostimulatorischen Proteins oder einen akzessorischen Rezeptor oder Liganden enthält, der in Immunaktivität involviert ist, z. B. B7 (das mit CD28 auf T-Zellen wechselwirkt), ein intrazelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), ein lymphozyten-funktionelles Antigen (LFA), ein vaskuläres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-1) und ein hitzestabiles Antigen (HSA). (Siehe Beispiel 14, um die Kostimulatoren oder Liganden auf die Oberfläche von VLPs zu richten.)
  • Es ist zu verstehen, dass die tatsächlichen bevorzugten Mengen an chimären Papillomavirus-artigen Partikeln als Vakzine zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Krankheit mit den spezifisch formulierten Zusammensetzungen, dem Modus der Anwendung, dem entsprechenden Situs und dem zu behandelnden Organismus variieren werden. Die Dosierungen für einen gegebenen Wirt können unter Verwendung konventioneller Überlegungen bestimmt werden, z. B. durch die Mittel eines geeigneten konventionellen Vakzinierungsprotokolls.
  • Alternativ dazu können chimäre VLPs in einem Verfahren zur Aufreinigung von VLPs verwendet werden. VLPs sind per se als prophylaktische Vakzine und in Immundiagnostika (supra) verwendbar. Kurz gefasst, es werden Antikörper gegen den Fusionspartner unter Verwendung von standardimmunologischen Techniken hergestellt, es wird eine Affinitätschromatographiesäule unter Verwendung der Antikörper konstruiert und die VLPs werden anschließend in einem Affinitätschromatographieschritt aufgereinigt.
  • Oder es können chimäre VLPs in einem Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionspartners verwendet werden, Z. B. können VLPs, die ein L2-E7-Fusionsprodukt enthalten, als Mittel zur Gewinnung von korrekt gefaltetem E7 nützlich sein. Es wurde berichtet, dass ein großer Prozentanteil von Gebärmutterkrebspatienten seropositiv für konformell korrektes E7 im Vergleich zu denaturiertem E7, wie es aus Bakterien isoliert wird, sind (Viscidi et al., Int. J. Cancer 55: 780 (1993)). Das in vitro Transkriptions-Translationssystem, das in diesem Bericht zur Herstellung von E7 verwendet wird, ist arbeitsaufwendig und teuer und verwendet radiomarkiertes E7. Es wäre vorteilhaft, chimäre E7 VLPs aufzureinigen und das Material in einem E7 ELISA zu verwenden. Um Komplikationen einer Seroreaktivität mit menschlichem L1 oder L2 zu vermeiden, könnten BPV-basierende Partikel verwendet werden. Es wurde die Beobachtung der E7-Seroreaktivität, welche im Gegensatz zu einer prämalignen Erkrankung mit Krebs korreliert, als nützlich vorgeschlagen, um den Kurs der Erkrankung in Gebärmutterhalskrebspatienten zu verfolgen und ein Wiederaufleben zu untersuchen (id).
  • Optional können chimäre VLPs in einem Verfahren zur Abgabe eines intakten und aktiven Proteins in Zellen verwendet werden. Dieses Protein kann z. B. ein Enzym oder Toxin oder ein Medikament sein. Die chimären VLPs werden an die Zellen entweder in vitro, in vivo, in situ oder ex vivo verabreicht und das Protein wird anschließend in die Zelle abgegeben, wo es für seinen vorgesehenen Zweck wirkt, z. B. als ein Enzym oder ein Toxin oder ein Medikament.
  • Wir haben es geschafft, chimäre Papillomavirus-artige Partikel, die E7-Protein oder Peptid, das an L2 gebunden ist, einbauen, herzustellen.
  • Ein Papillomavirus E7-Gen exprimierte ein L2-E7-Fusionsprotein, wenn es im Leseraster an das 3'-Ende des L2-Gens oder innerhalb eines Teils des L2 offenen Leserasters fusioniert wurde, das in der Gegenwart von L1-Protein in virusartige Partikel eingebaut wurde. Die Effizienz und Authentizität des Einbaus von L2-E7 in VLPs war zu der des Wildtyp L2-Proteins ähnlich. Für BPVL1/L2-E7 virusartige Partikel wurde herausgefunden, dass sie neutralisierende Antikörper genau so wirksam wie BPVL1/L2 Partikel induzieren. Von chimären Partikeln wurde beobachtet, dass sie eine humorale Immunität auslösen, die für Epitope des Fusionspartners dahingehend spezifisch ist, dass Kaninchen, die mit L2-E7 chimären Partikeln immunisiert worden waren, Antikörper herstellten, die gegen E7 gerichtet waren.
  • Die erfolgreiche Herstellung von chimären Papillomavirus-artiger Partikeln öffnet die Tür zur Fusion von fast jeglichem Protein oder Peptid mit einem L2-Produkt zur Aufnahme in chimäre Papillomavirus-artige Partikel.
  • Wir erzielten die Herstellung chimärer VLPs durch die Herstellung von L2-E7 Fusionsproteinen und das Exprimieren dieser Proteine zusammen mit L1 über rekombinante Baculoviren in Insektenzellen. Wir generierten drei chimäre VLPs: HPV16L1 + HPV16L2 – HPV16E7 (Gesamtlänge), BPVL1 + BPVL2 – HPV16E7 (Gesamtlänge) und BPVL1 + BPVL2 – HPV16E7 (AS 1–30).
  • BPVL2 wurde an seinem 3'-Ende an HPV16 E7 gebunden. HPV16L2 wurde an seinem 3'-Ende an HPV16E7 gebunden. Zusätzlich wurden die ersten 30 Kodons von HPV16E7 zwischen den Kodons 274 und 275 von BPVL2 eingefügt.
  • Sukrosegradienten-Kosedimentation und Koimmunpräzipitation von L1 und den L2-E7 Chimären zeigte den Einbau des chimären Proteins in die VLPs.
  • Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass Partikel, die das L2-E7-Fusionsprotein enthalten, mit der gleichen Effizienz zusammengebaut wurden wie L1- oder L1/L2-VLPs und dass diese morphologisch nicht unterscheidbar waren.
  • In vitro BPV1-Neutralisierungsassays zeigten, dass die BPVL1-enthaltenen chimären VLPs in der Lage waren, neutralisierende Antiseren zu induzieren. Die Titer waren mit solchen vergleichbar, die unter Verwendung von BPVL1/L2-VLPs erhalten wurden. Äquivalente neutralisierende Titer von 30.000 wurden sowohl für BPVL1/L2-VLPs wie auch BPVL1/L2-HPV16E7 (Gesamtlänge) chimäre VLPs erhalten.
  • Kaninchen, die mit L2-E7 chimären Partikeln immunisiert worden waren, erzeugten Antikörper, die gegen E7 gerichtet waren, was die Induktion einer humoralen Immunität, die für Fusionspartnerepitope spezifisch ist, durch chimäre VLPs zeigt und auch die Position der E7-Epitope außerhalb der VLPs ethablierte.
  • Wie in Beispiel 1 gezeigt, können chimäre rekombinante Baculoviren hergestellt werden. Gene für die Chimären können aus genomischen Quellen oder cDNAs, durch direkte Synthese oder jegliche Kombinationen davon gewonnen werden. L2 und seine Fusionspartnergene können durch rekombinante PCR-Techniken amplifiziert werden, z. B. mit Oligos, die Restriktionsenzymschnittstellen und Komplementaritäten enthalten, die die Fusion und Klonierung in Expressions-, Transfer- und/oder Klonierungsvektoren, z. B. Plasmide, erleichtern.
  • Fusionierte Gene können in einen Baculovirusexpressionsvektor kloniert werden. Es kann ein weiterer Baculovirusexpressionsvektor, der L1 enthält, hergestellt werden. Oder die fusionierten Gene können in einen Baculovirus-Doppelexpressionsvektor kloniert werden, der bereits L1 enthält.
  • Beispiel 2 zeigt eine typische Prozedur zur Selektion rekombinanter Baculoviren. CsCl-(oder äquivalent) aufgereinigtes rekombinantes Plasmid kann mit Baculovirus-DNA in Sf9-Insektenzellen unter Verwendung von Lipofektin (oder einem Äquivalent) kotransfiziert werden. Die rekombinanten Baculoviren können (z. B.) unter Verwendung von konventionellen Baculovirusvektor- und Insektenzellkulturverfahren Plaque-aufgereinigt werden.
  • Es kann vorteilhaft sein, zwei einzelne Expressionsbaculovirusvektoren anstatt eines Doppelexpressions-Baculovirusvektors zu verwenden. In diesem Fall können die chimären VLPs durch das Infizieren von Sf9-Zellen mit zwei rekombinanten Baculoviren hergestellt werden, einem, der ein L1-Produkt kodiert und einem anderen, der das L2-Fusionsprodukt kodiert. Die Lokalisierung der Gene auf verschiedenen Vektoren erleichtert die Manipulation der hergestellten Menge an L1-Produkt und L2-Fusionsprodukt. Dieser Ansatz ermöglicht es einem, die das Verhältniss des L2-Fusionsprodukts zum L1-Produkt in einem VLP zu verändern. Obwohl in nativen Virionen L2 im Vergleich zu L1 die geringere Komponente ist, können wir einen stärkeren Einbau von L2-Fusionsprodukt in VLPs unter Verwendung von zwei einzelnen Expressionsvektoren erreichen.
  • Wie in Beispiel 3 gezeigt wird, können chimäre Partikel durch Bandenbildung in Cesiumchlorid (oder einem äquivalenten Mittel) aufgereinigt werden. Sf9-Insektenzellen können z. B. mit einer Infektionsmultiplizität von 10 mit rekombinanten Baculoviren infiziert werden. Nach 72 Stunden (oder ähnlich) können Zellen geerntet und in phosphatgepufferter Salzlösung (oder äquivalenter) für 60 Sekunden (oder ähnlich) ultraschallbehandelt werden. Nach Klärung bei geringer Geschwindigkeit (oder äquivalenter) können die Lysate einer Zentrifugation ausgesetzt werden, z. B. bei 110.000 × g für 2,5 h durch ein 40% (Gew./Vol.) Sukrose/PBS-Kissen (SW/28 Rotor). Die resuspendierten Pellets können bis zum Gleichgewicht zentrifugiert werden, z. B. bei 141.000 × g für 20 h bei Raumtemperatur in einem 10–40%igen (Gew./Gew.) CsCl/PBS-Gradienten. Die sichtbare Bande kann geerntet werden, wiederum bis zum Gleichgewicht unter Verwendung identischer Bedingungen zentrifugiert werden, ausgiebig gegen PBS dialysiert werden und bei 4°C gelagert werden (z. B.).
  • Wie in Beispiel 4 gezeigt wird, kann die Ko-Sedimentierung chimärer Komplexe durch z. B. analytische Gradientenzentrifugation etabliert werden. Z. B. kann ein 12–45%iger Sukroseschrittgradient über Nacht bei 4°C linearisiert werden lassen, die dialysierten Proben werden oben auf geschichtet und der Gradient kann bei 41.000 Upm (288.000 × g) für 2 h in einem SW-41 Rotor zentrifugiert werden. Es können Fraktionen geerntet und auf Ko-Sedimentation analysiert werden, z. B. durch Westernblotten oder Ko-Immunpräzipitation.
  • Wie in Beispiel 5 gezeigt wird, kann eine Ko-Sedimentation z. B. durch Ko-Immunpräzipitation etabliert werden.
  • Wie in Beispiel 6 gezeigt wird, können Antiseren hergestellt werden. Dieses kann getan werden, um einen BPV1-Neutralisierungsassay (oder äquivalenten), wie er in Dvoretsky et al. Virology 103: 369 (1980) beschrieben wird, durchzuführen. Zum Beispiel können Antiseren wie folgt hergestellt werden. Kaninchen können durch subkutane Injektion von 330 μl der CsCl-Gradienten aufgereinigten Partikel in PBS bei einer Konzentration von 1 mg/ml immunisiert werden. Die Kaninchen können mit der gleichen Menge an Partikeln 2 Wochen und 4 Wochen nach der ersten Injektion geboostet werden.
  • Wie in Beispiel 7 gezeigt wird, kann ein BPV1-Neutralisierungsassay (oder äquivalenter) durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob BPV-chimäre Partikel konformelle Eptiope aufzeigen. Zum Beispiel können serielle Verdünnungen der Seren, die 3 Wochen nach der zweiten Verstärkungsinjektion erhalten wurden, mit ≈ 500 fokusbildenden Einheiten BPV-Virus für 30 Minuten inkubiert werden, der Virus kann an C127-Zellen für eine Stunde adsorbiert werden und die Zellen können für 3 Wochen kultiviert werden. Die Foki können dann mit 0,5% Methylenblau/0,25% Karbolfuchsin in Methanol gefärbt werden. Es können neutralisierende Titer für chimäre VLPs und Kontroll-BPVL1-L2 VLPs erhalten werden. Äquivalente neutralisierende Titer werden eine korrekte Faltung der chimären Partikel anzeigen, die zur Präsentation konformeller Epitope wirksam ist.
  • Wie in Beispiel 8 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht werden. Zum Beispiel können aufgereinigte Partikel auf Kohlenstoff-beschichteten Netzen adsorbiert werden, mit 1% Uranylazetat gefärbt werden und mit einem Philips-Elektronenmikroskop, Modell 400T, bei einer 36.000-facher Vergrößerung untersucht werden. Die Effizienz des Einbaus und die Morphologie der chimären Partikel und L1 oder L1/L2 VLPs können verglichen und gegenübergestellt werden. Eine nicht unterscheidbare Effizienz des Einbaus und der Morphologie wird einen korrekten Selbstzusammenbau der chimären Partikel anzeigen.
  • Wie in Beispiel 9 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. auf Induktion einer humoralen Immunität, die spezifisch für Fusionspartnerepitope ist, untersucht werden. Zum Beispiel können Kaninchen mit chimären VLPs inokuliert werden. Die Seren können dann auf Antikörper analysiert werden, z. B. durch das Durchführen einer SDS-PAGE mit einer Probe des Fusionspartnerantigens und anschließendes Westernblotting. Immun- und Präimmun (Kontroll)- Seren können bei einer geeigneten Verdünnung aufgetragen werden. Der Nachweis der Fusionspartnerbande in dem Westernblot durch Serum aus dem immunisierten Kaninchen zeigt die Induktion von Antikörpern, die spezifisch für Fusionspartnerepitope sind.
  • Wie in Beispiel 10 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. auf die Induktion einer zellvermittelten Immunität, die spezifisch für Fusionspeptide ist, untersucht werden, z. B. durch das Injizieren chimärer VLPs in Mäuse und die Messung einer Antigen-spezifischen T-Zellproliferation.
  • Wie in Beispiel 11 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. auf die Induktion einer prophylaktischen Immunität gegen eine herausfordernde Infektion untersucht werden, z. B. durch das Immunisieren von Kaninchen mit chimären CRPV VLPs und nicht-chimären CRPV VLPs (Kontrolle) und anschließende Herausforderung mit infektiösem CRPV, um zu zeigen, dass L2-Fusionen eine prophylaktische Immunität nicht beenden; oder durch das Immunisieren experimenteller Tiere mit chimären VLPs, die ein STD-Mittel enthalten, anschließendes Herausfordern mit dem STD-Mittel und Messung einer erhöhten Überlebensrate gegenüber einer letalen Herausforderung oder eine verringerte Infektion nach subletaler Herausforderung.
  • Wie in Beispiel 12 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. auf die Induktion einer therapeutischen Immunität gegen bereits existierende Papillomas untersucht werden, z. B. durch das Immunisieren von Kaninchen (die pre-existierende Papillomas aufweisen) unter Verwendung chimärer CRPV VLPs und nicht-chimärer CRPV VLPs (Kontrolle) und Messung der Regression der pre-existierenden Papillomas.
  • Wie in Beispiel 13 gezeigt wird, können chimäre Partikel z. B. für eine Immuntherapie und die Immunprävention von Tumoren untersucht werden.
  • Bestimmte Aspekte der Erfindung sind leichter durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele zu verstehen, von denen vorgesehen ist, dass die Erfindung beispielhaft darstellen, ohne ihren Umfang auf die speziellen beispielhaften Ausführungsformen einzuschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Erstellung chimärer rekombinanter Baculoviren
  • Drei Chimären wurden hergestellt: HPV16L2-HPV16E7, BPVL2-HPV16E7 und BPVL2-HPV16E7 (AS 1–30). HPV16L2-HPV16E7 enthielt das HPV16E7 in Gesamtlänge, das an den C-Terminus (AS 473) von HPV16L2 gebunden wurde. BPVL2-HPV16E7 enthielt HPV16E7 in Gesamtlänge, das an den C-Terminus von BPVL2 (AS 469) gebunden worden war. BPVL2-HPV16E7 (AS 1–30) enthielt die ersten 30 Aminosäuren von HPV16E7, die in die Mitte von BPVL2 zwischen den Aminosäuren 274 und 275 eingebunden worden waren.
  • L2-E7 chimäre Gene wurden mittels rekombinanter PCR-Techniken hergestellt (Higuchi, R. (1990) in PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, Ed. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. und White, T. J. (Academic, New York), S. 177–180). Für die Chimären, die HPV16E7 in Gesamtlänge enthalten, wurde L2 mit einem 5'-Oligo amplifiziert, das eine Restriktionsenzymschnittstelle enthält und einem 3'-Oligo, das komplementär zu dem E7 5'-Oligo war. In einer unabhängigen Reaktion wurde E7 mit einem 5'-Oligo amplifiziert, das komplementär zu dem L2 3'-Oligo war und einem 3'-Oligo, das eine Restriktionsenzymschnittstelle enthielt. Die L2- und E7-Gene wurden dann in einer zweiten Primer-Verlängerungsreaktion nur unter Verwendung der äußeren (L2 5'- und E7 3') Oligos verbunden. Für die Chimären, die nur die Aminosäuren 1–30 von HPV16E7 enthalten, kodierten die „internen" Primer die ersten 30 AS von HPV16E7.
  • Die verbundenen Gene wurden dann in den Baculovirus Doppelexpressionsvektor pSynwtVI-, (welcher bereits L1 enthielt, das unter den Polyhedrinpromotor (Krinbauer et al., Virol. 67: 6929 (1993) kloniert worden war) direkt stromabwärts vom pSyn-Promotor kloniert.
  • Die BPVL2-HPV16E7-Chimären wurden als 5'-BglII bis 3'-BglII-Fragmente kloniert. Die HPV16L2-HPV16E7-Chimären wurden als 5' SstlI bis 3' SstlI-Fragment kloniert. Die für BPVL2-HPV16E7 (Gesamtlänge) verwendeten Primer waren
    BPVL2-Sense
    Figure 00240001
    und Antisense,
    Figure 00240002
    HPV16E7, Sense
    Figure 00240003
    und Antisense,
  • Figure 00240004
  • Die für BPVL2-HPV16E7 (AS 1–30) verwendeten Primer waren wie folgt:
    BPVL2, Sense: genau wie oben.
  • Innerner Primer, Antisense
    Figure 00240005
  • Innerer Primer, Sense
    Figure 00240006
  • BPVL2, Antisense
    Figure 00250001
  • Die für HPV16L2-HPV16E7-Chimäre verwendeten Primer waren die folgenden:
    HPV16L2, Sense
    Figure 00250002
    und Antisense,
    Figure 00250003
    HPV16E7, Sense
    Figure 00250004
    und Antisense,
  • Figure 00250005
  • Beispiel 2
  • Selektion rekombinanter Baculoviren
  • CsCl-aufgereinigtes rekombinantes Plasmid wurde mit Baculovirus-DNA (Baculo-Gold; PharMingen, San Diego, CA) in Sf9-Insektenzellen (ATCC, CRL 1711) unter Verwendung von Lipofektin (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) (Hartig, P. C. Biotechniques 11: 310 (1991)) kotransfiziert. Die rekombinanten Baculoviren wurden wie beschrieben Plaque-aufgereinigt (Summers, M. D. & Smith, G. E. (1987) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin (Tex. Agric. Exp. Stn., College Station, TX), Vol. 1555).
  • Beispiel 3
  • Aufreinigung von chimären Partikeln
  • Sf9-Insektenzellen wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 10 mit rekombinanten Baculoviren infiziert. Nach 72 Stunden wurden die geernteten Zellen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 60 Sekunden ultraschallbehandelt. Nach Klärung bei geringer Geschwindigkeit wurden die Lysate einer Zentrifugation bei 110.000 × g für 2,5 h durch ein 40%iges (Gew./Vol.) Sukrose/PBS-Kissen (SW 28 Rotor) ausgesetzt. Die resuspendierten Pellets wurden bis zum Gleichgewicht bei 141.000 × g für 20 h bei Raumtemperatur in einem 10–40%igen (Gew./Gew.) CsCl/PBS-Gradienten zentrifugiert. Die sichtbare Bande wurde geerntet, wiederum zum Gleichgewicht unter Verwendung der identischen Bedingungen zentrifugiert, ausgiebig gegen PBS dialysiert und bei 4°C aufbewahrt.
  • Beispiel 4
  • Ko-Sedimentation von L1/I2-E7-Komplexen
  • Um zu bestimmen, ob das L2-E7-Fusionsprotein in Partikel aufgenommen wurde, wurde eine analytische Gradientenzentrifugation, wie sie zuvor beschrieben wurde, zur Bestimmung des Ko-Zusammenbaus von L1 und L2 durchgeführt (Kimbauer et al., Virol. 67: 6929 (1993)).
  • Kurz gefasst, es wurde ein 12 bis 45%iger Sukroseschrittgradient über Nacht bei 4°C linearisieren gelassen, die dialysierten Proben wurden obenauf geschichtet und der Gradient wurde bei 41.000 Upm (288.000 × g) für 2 hin einem SW-41 Rotor zentrifugiert. Die Fraktionen wurden geerntet. Die Fraktionen wurden durch Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE (L1) oder Westernblotting mit einem Anti-BPVL2 polyklonalen Ab oder AntiHBV16E7 polyklonalen Ab und 125I-markiertem Anti-Kaninchen-IgG analysiert.
  • Die Assoziation von chimären L2-E7 mit virusartigen Partikeln wurde durch Ko-Sedimentation etabliert.
  • Beispiel 5
  • Ko-Immunpräzipitation von L1/L2-E7-Komplexen
  • Um den Nachweis dafür zu erhalten, dass die L2-E7-Fusionsproteine stabile Komplexe mit L1 ausbilden, wurden Ko-Immunpräzipitationsexperimente durchgeführt.
  • Kurz gefasst, BPVL1/L2-HPV16E7 (Gesamtlänge) und BPVL1/L2-HPV16E7 (AS 1–30)-VLP-Zubereitungen wurden in PBS, 1% Triton® X-100 mit Anti-L1 Mab 5B6 (Roden et al., J. Virol., im Druck, (November, 1994)), einem Anti-L1 polyklonalen Ab, pre-Immunserum oder einem irrelevanten Ab (Anti-E1A Mab) und Protein A-Sepharose in PBS immunpräzipitiert und einer SDS-PAGE ausgesetzt. Die Proteine wurden immungeblottet und mit Anti-BPVL2 oder Anti-HBV16E7-Seren oder einem Anti-HPV16E7 Mab (Triton Diagnostics, Alameda, CA) untersucht.
  • Die Assoziierung des chimären L2-E7 mit den virusartigen Partikeln wurde durch Ko-Immunpräzipitation etabliert.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von Antiseren
  • Kaninchen wurden durch subkutane Injektion von 330 μl CsCl-Gradienten-aufgereinigten Partikeln in PBS bei einer Konzentration von 1 mg/ml immunisiert. Die Kaninchen wurden mit der gleichen Menge an Partikeln 2 Wochen und 4 Wochen nach der ersten Injektion verstärkt.
  • Beispiel 7
  • BPV1 Neutralisierungsassay
  • Es wurde ein fokusbildender Assay wie er beschrieben wurde durchgeführt (Kimbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992)).
  • Kurz gefasst, serielle Verdünnungen von Kaninchenseren, die drei Wochen nach der zweiten Verstärkungsinjektion erhalten wurden, wurden mit ≈ 500 Fokus-bildenden Einheiten des BPV1-Virus für 30 Minuten inkubiert, der Virus wurde auf C127-Zellen für eine Stunde adsorbiert und die Zellen wurden für 3 Wochen kultiviert (Dvoretzky et al., Virology 103: 369 (1980)). Die Foki wurden mit 0,5% Methylenblau/0,25% Carbolfuchsin in Methanol gefärbt.
  • Es wurden äquivalente neutralisierende Titer von 30.000 für die BPVL1/L2 VLPs und BPVL1/L2-HPV16E7 (Gesamtlänge) chimären VLPs erhalten.
  • Beispiel 8
  • Elektronenmikroskopie
  • Es wurde eine Transmissionselektronenmikroskopie wie sie beschrieben wurde durchgeführt (Kimbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992)).
  • Kurz gefasst, aufgereinigte Partikel wurden auf Kohlenstoff-beschichteten Gittern adsorbiert, mit 1% Uranylazetat gefärbt und mit einem Philips-Elektronenmikroskop, Modell EM 400T, bei einer 36.000-fachen Vergrößerung untersucht.
  • Es wurde herausgefunden, dass Partikel, die das L2-E7-Fusionsprotein enthalten, von L1- oder L1/L2 VLPs in Bezug auf die Morphologie und Effizienz des Einbaus nicht unterscheidbar waren.
  • Beispiel 9
  • Induktion von Antikörpern
  • Kaninchen, die mit BPVL1/L2-HPV16E7 Papillomavirus-artigen Partikeln inokuliert worden waren, produzierten Antiseren, die E7 erkannten.
  • Um die Seren auf E7-Spezifität zu analysieren, wurden 2,5 μg HPV16E7 und 2,5 μg BSA (Kontrolle) einer SDS-PAGE ausgesetzt und anschließend Western-geblottet. Immun- und Pre-Immun (Kontroll) Seren wurden bei einer Verdünnung von 1 : 10 aufgetragen.
  • Das Serum aus dem immunisierten Kaninchen detektierte spezifisch die HPV16E7-Proteinbande in dem Westernblot, was die Induktion von Antikörpern anzeigt, die spezifisch für E7-Epitope sind.
  • Beispiel 10
  • Induktion einer zellvermittelten Immunität
  • Chimäre Partikel wurden auf die Induktion einer zellvermittelten Immunität, die spezifisch für E7-Peptide ist, untersucht, z. B. durch das Injizieren von chimären VLPs in Mäuse und das Messen einer Antigen-spezifischen T-Zellproliferation.
  • Beispiel 11
  • Prophylaktische Immunität
  • Chimäre Partikel wurden auf die Induktion einer prophylaktischen Immunität gegen eine herausfordernde Infektion untersucht, z. B. durch das Immunisieren von Kaninchen mit E7 chimären CRPV VLPs und nicht-chimären CRPV VLPs (Kontrolle) und anschließende Herausforderung mit infektiösen CRPV, um zu demonstrieren, dass L2-E7-Fusionen eine prophylaktische Immunität nicht beenden; oder durch das Immunisieren experimenteller Tiere mit chimären VLPs, die ein STD-Agens enthalten, anschließendes Herausfordern mit dem STD-Agens und das Messen einer erhöhten Überlebensrate gegen eine letale Herausforderung oder eine verminderte Infektion nach subletaler Herausforderung.
  • Beispiel 12
  • Therapeutische Immunität
  • Chimäre Partikel wurden auf Induktion einer therapeutischen Immunität gegen pre-existierende Papillomas untersucht, z. B. durch das Immunisieren von Kaninchen (die pre-existierende Papillomas aufweisen) unter Verwendung von E7-chimären CRPV VLPs und nicht-chimärer CRPV VLPs (Kontrolle), und die Messung einer Regression der pre-existierender Papillomas.
  • Beispiel 13
  • Immuntherapie und Immunpräventation von Tumoren
  • Chimäre Partikel wurden auf die Fähigkeit hin untersucht, eine Tumorentwicklung zu verhindern oder existierende Tumore zu behandeln, z. B. in experimentellen Tieren wie Mäusen unter Verwendung von Tumorzellen, die z. B. E7 exprimieren. Die Tiere werden mit z. B. L2-E7 chimären VLPs immunisiert und auf Wachstum der inokulierten tumorgenen Zellen getestet, die z. B. E7 exprimieren. Von diesem Ansatz wurde gezeigt, dass er für Tiere funktioniert, die mit nicht-komplexierten E7 und einem ko-stimulatorischen Protein immunisiert worden waren (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110 (1991)).
  • Beispiel 14
  • Zielen auf die Oberfläche chimärer VLPs
  • Es mag für bestimmte Moleküle, wie Ko-Stimulatoren oder Liganden, die an Zelloberflächen binden, wünschenswert sein, auf der Oberfläche chimärer VLPs vorhanden zu sein. Roden et al., J. Virol., im Druck, (November, 1994) stellten fest, dass Regionen von L2 auf der Oberfläche von VLPs lokalisiert sind. Ein Peptid, das aus den BPVL2 Aminosäuren 44–173 besteht, induzierte, wenn es in Kaninchen inokuliert war, neutralisierende Antikörper, die bei einer 1 : 1,000 Serumverdünnung aktiv waren. Diese Ergebnisse zeigen an, dass L2-Regionen neutralisierende Epitope spezifizieren und dass diese Regionen daher für die Oberfläche nativer Virionen zugänglich sind. Konsequenterweise würde die Fusion eines Nicht-L2-Polypeptids zu einer dieser Regionen wahrscheinlich in dem Zielen dieses Polypeptids auf die Oberfläche eines chimären VLPs resultieren.
  • Während bestimmte Ausführungsformen der Erfindung im Detail beschrieben worden sind, ist es für Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich, dass diese Ausführungsformen eher beispielhaft als einschränkend sind und dass der wahre Umfang der Erfindung derjenige ist, der sich durch die beigefügten Ansprüchen definiert.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001

Claims (29)

  1. Ein Papillomavirus-artiger Partikel mit konformellen Epitopen und umfassend ein Papillomavirus L1 Protein und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder an ein antigenes Peptidfragment davon.
  2. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in Anspruch 1 beansprucht wird, worin das antigene Protein oder Peptid aus Proteinen oder Peptiden von infektiösen Agenzien ausgewählt ist.
  3. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in Anspruch 2 beansprucht wird, worin besagter Fusionspartner ein Papillomavirus-Protein oder Peptid, vorzugsweise ein E6- oder ein E7-Protein oder Peptid ist.
  4. Ein Papillomavirus-artiker Partikel, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, der zusätzlich ein Fusionsprodukt umfasst, das eine Bindungsdomäne eines kostimulatorischen Proteins oder eines akzessorischen Rezeptors oder Liganden enthält, der in Immunreaktivität involviert ist, z. B. B7 (welcher mit CD28 auf T-Zellen wechselwirkt), ein interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), ein Lymphozyten – funktionelles – Antigen (LFA), ein vaskuläres Zelladhäsionsmolekül (VCAM-1) oder ein hitzestabiles Antigen (HSA) enthält.
  5. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin besagtes Papillomavirus L2 Fusionsprodukt ein menschliches Papillomavirus L2 Fusionsprodukt oder ein bovines Papillomavirus L2 Fusionsprodukt ist.
  6. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in Anspruch 5 beansprucht wird, worin besagtes menschliches Papillomavirus L2 Fusionsprodukt ein HPV16L2 Fusionsprodukt und besagtes bovines Papillomavirus L2 Fusionsprodukt ein BPV1 L2 Fusionsprodukt ist.
  7. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin besagter Fusionspartner aus Peptidfragmenten oder Proteinen in Gesamtlänge oder Kombinationen davon besteht, die als Tandem verbunden sind.
  8. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der vorangegangen Ansprüche beansprucht wird, worin besagtes Papillomavirus L2 Protein oder Peptid an seinem N-Terminus oder C-Terminus an den Fusionspartner fusioniert ist.
  9. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht wird, worin besagtes Papillomavirus L2 Fusionsprodukt einen Fusionspartner aufweist, der zwischen den Aminosäuren des L2 Proteins oder Peptids eingefügt ist.
  10. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin besagtes Papillomavirus L1 Protein ein menschliches Papillomavirus L1 Protein oder ein bovines Papillomavirus L1 Protein ist.
  11. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in Anspruch 10 beansprucht wird, worin das besagte menschliche Papillomavirus L1 Protein ein HPV16L1 Protein und besagtes bovines Papillomavirus L1 Protein ein BPV1 L1 Protein ist.
  12. Ein Papillomavirus-artiger Partikel, wie er in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht wird, worin der Partikel aus L1 Protein und L2 Fusionsprodukt besteht und aus der Gruppe, bestehend aus: (1) HPV16L1 und HPV16L2-HPV16E7 (Gesamtlänge), worin optional HPV16E7 an den C-Terminus von HPV16L2 fusioniert ist; (2) BPVL1 und BPVL2-HPV16E7 (Gesamtlänge), worin optional HPV16E7 an den C-Terminus von BPVL2 fusioniert ist; und (3) BPVL1 und BPVL2-HPV16E7 (Aminosäuren 1–30), worin optional die Aminosäuren 1–30 von HPV16E7 an BPVL2 zwischen den Aminosäuren 274 und 275 fusioniert sind; ausgewählt ist.
  13. Ein Verfahren zur Aufreinigung eines Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend den Schritt des Aussetzens des Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12 an eine Affinitätschromatographiesäule, die Antikörper umfasst, die den Fusionspartner des Papillomavirus L2 Fusionsprodukts des Papillomavirus-artigen Partikels binden, was in der Aufreinigung von besagtem Partikel resultiert.
  14. Ein Verfahren zur Aufreinigung des Fusionspartners des Papillomavirus L2 Fusionsprodukts des Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12, das den Schritt der Isolierung des Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst, was in der Aufreinigung von besagtem Fusionspartner resultiert.
  15. Ein Verfahren zur Abgabe des Fusionspartners des Papillomavirus L2 Fusionsprodukts in eine Zelle als Teil des Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12, das den Schritt der Verabreichung des Papillomavirus-artigen Partikels an besagte Zelle in vitro oder ex vivo umfasst, was in der Abgabe des Fusionspartners in besagte Zelle resultiert.
  16. Eine immunogene Zusammensetzung, die den Papillomavirus-artigen Partikel von einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
  17. Ein Papillomavirus-artiger Partikel von einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung als Pharmazeutikum.
  18. Die Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunreaktion in einem Wirtssäugetier.
  19. Ein DNA-Molekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Papillomavirus L1 Protein und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodiert, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon, wobei besagtes Molekül in der Lage ist, die Expression von Papillomavirus-artigen Partikeln mit konformellen Epitopen in einer transformierten Zelle zu dirigieren, und worin besagte Partikel besagtes Papillomavirus L1 Protein und Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfassen.
  20. Ein DNA-Molekül, wie es in Anspruch 19 beansprucht wird, wobei das DNA-Molekül in der Lage ist, eine Expression in einer transformierten Insektenzelle zu dirigieren und die DNA zusätzlich einen Insektenzellvektor umfasst, oder wobei das DNA-Molekül in der Lage ist, eine Expression in einer transformierten Säugetierzelle zu dirigieren und die DNA zusätzlich einen Säugetierzellvektor umfasst, oder wobei das DNA-Molekül in der Lage ist, eine Expression in einer transformierten Hefezelle zu dirigieren und die DNA zusätzlich einen Hefezellvektor umfasst.
  21. Eine Wirtszelle, die mit einem oder mehreren DNA-Molekülen transformiert ist, welche zusammen ein Papillomavirus L1 Protein und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodieren, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder an ein antigenes Peptidfragment davon, wobei besagte(s) Molekül(e) die Expression von Papillomavirus-artigen Partikeln mit konformellen Epitopen dirigier(en), und wobei besagte Partikel besagtes Papillomavirus L1 Protein und Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfassen.
  22. Eine Wirtszelle, wie sie in Anspruch 21 beansprucht wird, worin das Papillomavirus L1 Protein und das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt auf dem gleichen DNA-Molekül kodiert werden.
  23. Eine Wirtszelle, wie sie in Anspruch 21 beansprucht wird, worin das Papillomavirus L1 Protein und das Papillomavirus L2 Fusionsprodukt auf verschiedenen DNA-Molekülen kodiert werden.
  24. Ein Verfahren zur Herstellung eines Papillomavirus-artigen Partikels mit konformellen Epitopen, der ein Papillomavirus L1 und ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfasst, wobei besagtes Fusionsprodukt ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, das nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon, wobei das Verfahren das zur Verfügung stellen von Bedingungen für die Wirtszelle von einem der Ansprüche 21 bis 23 umfasst, um dadurch besagte DNA zu exprimieren, wodurch besagter Partikel hergestellt wird.
  25. Ein Verfahren, wie es in Anspruch 24 beansprucht wird, dass des weiteren die Gewinnung von besagtem Partikel aus besagter Wirtszelle umfasst.
  26. Eine Zusammensetzung, umfassend ein erstes DNA-Molekül, das ein Papillomavirus L1 Protein kodiert, und ein zweites DNA-Molekül, das ein Papillomavirus L2 Fusionsprodukt kodiert, wobei besagtes Fusionsprodukt, das ein L2 Protein oder Peptidfragment davon umfasst, an einen Fusionspartner gebunden ist, der ein antigenes Protein ist, dass nicht L2 ist, oder ein antigenes Peptidfragment davon, worin besagte Moleküle in der Lage sind, die Expression von Papillomavirus-artigen Partikeln mit konformellen Epitopen in einer transformierten Zelle zu dirigieren und worin besagte Partikel besagtes Papillomavirus L1 Protein und Papillomavirus L2 Fusionsprodukt umfassen.
  27. Eine Zusammensetzung, wie sie in Anspruch 26 beansprucht wird, worin die DNA-Moleküle in der Lage sind, eine Expression in einer transformierten Insektenzelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül zusätzlich einen Insektenzellvektor umfasst, oder worin die DNA-Moleküle in der Lage sind, eine Expressionen in einer transformierten Säugetierzelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül zusätzlich einen Säugetierzellvektor umfasst, oder worin die DNA-Moleküle in der Lage sind, eine Expression in einer transformierten Hefezelle zu dirigieren und die DNA von jedem besagten Molekül zusätzlich einen Hefezellvektor umfasst.
  28. Die in vitro- oder ex vivo-Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12 als Plattform zur multivalenten Antigenpräsentation.
  29. Die in vitro- oder ex vivo-Verwendung eines Papillomavirus-artigen Partikels von einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Abgabe von Proteinen in Zellen zur Prozessierung in Peptide und anschließenden Präsentation dieser Peptide im Zusammenhang mit MHC-Molekülen, um eine zellvermittelte Immunreaktion auszulösen.
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