DE60132770T2

DE60132770T2 - Chimäre humane papillomavirus (hpv) l1 moleküle und deren verwendungen

Info

Publication number: DE60132770T2
Application number: DE60132770T
Authority: DE
Inventors: Susan Silver Spring WILSON; Wendy Germantown WHITE; JoAnn A. Washington Grove SUZICH; Brian Mt. Airy MULLIKIN
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2021-06-13
Also published as: EP1292328A1; US6908613B2; EP1292328B1; US7390487B2; ES2301551T3; WO2001097840A1; AU7545801A; AU2001275458B2; CA2411945A1; DE60132770D1; PT1292328E; CA2411945C; US20040224305A1; EP1292328A4; ATE386105T1; DK1292328T3; US20060127979A1; CY1108106T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Erzeugung von neutralisierenden Antikörperreaktionen von hohem Titer gegen HPV-18 und HPV-45 und optional von weiteren humanen Papillomaviren (HPV-Typen mit virusartigen Teilchen (VLPs), die aus einem chimären L1-Molekül zusammengesetzt sind, das neutralisierende Epitope von jedem der HPV-Typen enthält, bereit. Diese VLPs lösen neutralisierende Antikörperreaktionen aus und können daher als wirksame prophylaktische Reagenzien gegen diese Krankheitszustände im Zusammenhang mit anhaltenden Infektionen mit den HPV-Typen verwendet werden. Zelluläre Immunreaktionen gegen das chimäre HPV-L1-Molekül können günstige therapeutische Wirkungen gegen bestehende Infektionen ausüben. Diese chimären VLPs können auch bei der Diagnose einer früheren oder aktuellen Infektion mit den HPV-Typen geeignet sein oder sie können als Hilfsmittel bei der Bestimmung der Konzentration an schützenden (neutralisierenden) Antikörpern, die in einer Flüssigkeitsprobe des Körpers vorhanden sind, verwendet werden. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung derartiger VLPs zur Einkapselung von erwünschten Einheiten, z. B. diagnostischen oder therapeutischen Mitteln, und deren Verwendung als "Pseudovirionen" zur Bewertung der Wirksamkeit von mutmaßlichen Impfstoffen oder Therapeutika.
Hintergrund der Erfindung
Papillomaviren infizieren eine Vielzahl verschiedener Spezies von Tieren, einschließlich Menschen. Die Infektion ist typischerweise durch die Induktion von gutartigen epithelialen und fibroepithelialen Tumoren oder Warzen an der Infektionsstelle gekennzeichnet. Jede Spezies von Wirbeltieren wird durch einen Spezies-spezifischen Satz von Papillomaviren infiziert, wobei ein derartiger Satz jeweils mehrere verschiedene Papillomavirus-Typen umfasst. Beispielsweise wurden mehr als 60 verschiedene humane Papillomavirus(HPV)-Genotypen isoliert. Papillomaviren sind hochgradig Spezies-spezifische infektiöse Mittel. Beispielsweise können Hunde- und Kaninchen-Papillomaviren in heterologen Spezies, wie Menschen, keine Papillome induzieren. Eine neutralisierende Immunität gegen eine Infektion durch einen Papillomavirus-Typ verleiht im allgemeinen keine Immunität gegen einen anderen Typ, selbst wenn die Typen eine homologe Spezies infizieren.
Beim Menschen verursachen Papillomaviren Genitalwarzen, eine vorwiegend auf sexuellem Wege übertragene Krankheit. Die HPV-Typen 6 und 11 sind besonders häufig mit den gutartigen Genitalwarzen Condylomata acuminata assoziiert. Genitalwarzen sind sehr häufig und subklinische und unscheinbare HPV-Infektionen sind häufiger als klinische Infektionen. Obgleich die meisten HPV-induzierten Läsionen gutartig sind, können Läsionen, die aus bestimmten Papillomavirus-Typen, z. B. HPV-16 und HPV-18 entstehen, einen malignen Verlauf nehmen. Außerdem wird eine Infektion durch einen der mit Bösartigkeit assoziierten Papillomavirus-Typen als ein erheblicher Risikofaktor in Bezug auf die Entwicklung von Zervikalkarzinomen, weltweit der zweithäufigsten Krebsart bei Frauen, angesehen. Von den bei Zervikalkrebs beteiligten HPV-Genotypen ist HPV-16 besonders häufig; es wird bei etwa 50% von Zervixkarzinomen festgestellt. HPV-18 tritt bei etwa 8–31% auf, je nach der geographischen Lage. In den meisten Gebieten der Welt ist HPV-45 der dritthäufigste, onkogene HPV-Typ (F. X. Bosch et al., J. Natl. Cancer Inst., Bd. 87 (1995), S. 796–802).
In Anbetracht der erheblichen Gesundheitsrisiken, die sich allgemein durch Papillomavirus-Infektionen und speziell durch humane Papillomavirus-Infektionen ergeben, haben verschiedene Arbeitsgruppen über die Entwicklung von rekombinanten Papillomavirus-Antigenen und von deren Verwendung als diagnostische Mittel und als prophylaktische Impfstoffe berichtet. Im allgemeinen sind derartige Forschungsarbeiten auf die Erzeugung von prophylaktischen Impfstoffen abgestellt, die nur das Haupt-Capsidprotein (L1) oder dieses in Kombination mit dem untergeordneten Capsidprotein (L2) enthalten. Beispielsweise berichteten Ghim et al., Virology, Bd. 190 (1992), S. 548–552, über die Expression von HPV-1-L1-Protein unter Anwendung der Vakzinia-Expression in Cos-Zellen, die Konformationsepitope zeigten, und über deren Verwendung als Impfstoffe oder für die serologische Typisierung oder den Nachweis. Diese Arbeit stellt auch die Basis einer Patentanmeldung (US-SN 07/903 109, Anmeldetag 25. Juni 1992, fallengelassen zugunsten US-SN 08/216 506, Anmeldetag 22. März 1994) dar, an der die vorliegende Anmelderin eine Lizenz besitzt. Ferner berichten Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 11553–11557, darüber, dass die Immunisierung von Hunden mit einem rekombinanten, oralen Hunde-Papillomavirus (COPV) in einem Baculovirus/Insekten-Zellsystem die Entwicklung von viralen, mukosalen Papillomen vollständig verhinderte. Diese Ergebnisse sind aufgrund der erheblichen Ähnlichkeiten zwischen zahlreichen HPVs und COPV von Bedeutung. Beispielsweise bewirkt COPV ähnlich wie HPVs, die mit anogenitalem und genitalem Krebs assoziiert sind, Infektionen und Läsionen an Schleimhautstellen. Ferner zeigen die Ll-Sequenzen von COPV Strukturähnlichkeiten mit HPV-L1-Sequenzen. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten ist das COPV/Beagle-Modell für die Untersuchung von L1-Protein enthaltenden Impfstoffen geeignet, z. B. für die Untersuchung einer schützenden Immunreaktion, einen Schutz gegen natürliche Infektionen und eine Optimierung von Impfverfahren (Id.).
Ferner berichtete eine Forschungsgruppe der Universität Rochester über die Erzeugung von humanem Papillomavirus-Haupt-Capsid-Protein (L1) und von virusartigen Teilchen unter Verwendung eines Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystems (Rose et al., University of Rochester, WO-94/20137 , Veröffentlichungstag 15. September 1994). Insbesondere berichteten sie über die Expression des L1-Haupt-Capsidproteins von HPV-6 und HPV-11 und über die Erzeugung von HPV-6-, HPV-11-, HPV-16- und HPV-18-virusartigen Teilchen.
Ferner berichtete eine Forschergruppe der Universität von Queensland über die rekombinante Herstellung von Papillomavirus-L1- und/oder L2-Proteinen und virusartigen Teilchen sowie über deren potentielle Verwendung als Impfstoffe (Frazer et al., WO-93/02189 , Veröffentlichungstag 4. Februar 1993).
Außerdem berichtete eine staatliche US-Forschergruppe über rekombinante Papillomavirus-Capsidproteine, die angeblich sich selbständig zu Capsomerstrukturen vereinigen und virale Capside bilden, die antigene Konformationsepitope umfassen ( US-Patent 5 437 951 , Lowy et al., Ausgabetag 1. August 1995). Die Ansprüche dieses Patents sind auf eine spezifische HPV-16-DNA-Sequenz, die für ein L1-Protein kodiert, das zum selbständigen Zusammenbau befähigt ist, und auf dessen Verwendung zur Expression von rekombinanten HPV-16-Capsiden mit einem Gehalt an diesem HPV-16-L1-Protein abgestellt.
In Bezug auf HPV-Capsidprotein enthaltende Vakzine gilt es in der Fachwelt als weitgehend gesichert, dass eine notwendige Voraussetzung für einen wirksamen, auf HPV-L1-Haupt-Capsidprotein basierenden Impfstoff darin besteht, dass das L1-Protein Konformationsepitope aufweist, die durch native, humane Papillomavirus-Haupt-Capsidproteine exprimiert werden (vergl. z. B. Hines et al., Gynecologic Oncology, Bd. 53 (1994), S. 13–20; Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Ed. 92 (1995), S. 11553–11557).
Sowohl nicht-teilchenförmige als auch teilchenförmige, rekombinante HPV-L1-Proteine, die native Konformations-HPV-L1-Epitope präsentieren, werden in der Literatur beschrieben. Es ist bekannt, dass L1 in mehreren oligomeren Konfigurationen stabil ist, z. B. (i) Capsomere, die Pentamere des Li-Proteins umfassen, und (ii) Capside, die aus 72 Capsomeren in einer T=7-Eikosaederstrukur bestehen. Ferner ist es bekannt, dass das L1-Protein bei Expression in eukaryontischen Zellen allein oder in Kombination mit L2 zu einem wirksamen selbständigen Zusammenbau zu capsidartigen Strukturen, die im allgemeinen als virusartige Teilchen (VLPs) bezeichnet werden, befähigt ist.
Von VLPs wurde berichtet, dass sie in morphologischer und antigener Hinsicht authentischen Virionen ähnlich sind. Außerdem wurde berichtet, dass eine Immunisierung mit VLPs die Erzeugung von virusneutralisierenden Antikörpern auslöst. Insbesondere haben Ergebnisse mit einer Vielzahl von tierischen Papillomaviren (oraler Hunde-Papillomavirus und Rinder-Papillomavirus-4) darauf schließen lassen, dass eine Immunisierung mit VLPs zu einem Schutz gegen eine anschließende Papillomavirus-Infektion führt. Infolgedessen wurden VLPs, die aus HPV-L1-Proteinen zusammengesetzt sind, als Impfstoffe zur Verhinderung von Krankheiten in Verbindung mit humanen Papillomavirus-Infektionen vorgeschlagen.
Außerdem wurde berichtet, dass das Li-Protein zu VLPs zusammengesetzt werden kann, wenn eine Expression unter Verwendung von rekombinanten Baculovirus- und Vakzinia-Virus-Vektoren und in rekombinanter Hefe erfolgt (Hagensee et al., J. Virol., Bd. 68 (1994), S. 4503–4505; Hofmann et al., Virology, Ed. 209 (1995), S. 506–518; Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 12180–12184; Kirnbauer et al., J. Virol., Bd. 67 (1993), S. 6929–6936; Rose et al., J. Virol., Bd. 67 (1993), S. 1936–1944; Sasagawa et al., Virology, Bd. 206 (1995), S. 126–135; Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 92 (1995), S. 11553–11557; Volpers et al., Virology, Bd. 200 (1994), S. 504–512; Zhou et al., J. Virol., Bd. 68 (1994), S. 619–625).
Die meisten bisherigen rekombinanten L1-Präparate, die aus eukaryontischen Zellen isoliert wurden, führten zu einer variablen Population von VLPs mit einem Durchmesser von annähernd 55 nm, die in ihrem Erscheinungsbild intakten Virionen ähnlich sind. Jedoch zeigt der VLP-Zusammenbau eine gewisse Empfindlichkeit gegenüber dem Zelltyp. Beispielsweise wird L1 in Escherichia coli weitgehend in Form von Capsomeren oder kleineren Produkten exprimiert, wobei entweder in der Zelle oder nach der Reinigung nur wenige oder gar keine Capside auftreten (Rose et al., J. Virol., Bd. 67 (1993), S. 1936–1944; Li et al., J. Virol., Bd. 71 (1997), S. 2988–2995). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn das Polyoma-Virus-VP1-Protein in E. coli exprimiert wird (Salunke et al., Biophys. J., Bd. 56 (1989), S. 887–900).
Bisher gibt es kein wirksames Verfahren zur Auslösung von neutralisierenden Antikörperreaktionen von hohem Titer gegen zwei oder mehr HPV-Typen mit einem einzigen VLP. Tatsächlich wurde aufgrund des Mangels an authentischen, humanen Papillomavirus-Vorräten wenig über kreuzneutralisierende Antikörperreaktionen gearbeitet. Jedoch wurde die Fähigkeit von HPV-VLPs zur Bildung von Antiseren, die eine Kreuzreaktion mit anderen HPV-VLP-Typen eingehen, geprüft. Antiseren gegen individuelle HPV-VLP-Typen wurden durch ELISA auf ihre Reaktivität mit einer Vielzahl anderer HPV-VLP-Typen getestet. Im allgemeinen ist die Antikörperreaktivität gegen HPV-VLPs typspezifisch. Das Antiserum reagiert mit dem VLP, das bei der Erzeugung des Antiserums verwendet wurde, jedoch nicht mit anderen HPV-VLP-Typen. In Fällen, bei denen über eine hochgradige Kreuzreaktivität des Antiserums mit anderen VLP-Typen berichtet wurde, waren die Aminosäuresequenzen des heterologen HPV-Typs hochgradig homolog mit dem ursprünglichen Typ. Beispielsweise wurde über starke anti-VLP-Antikörper-Kreuzreaktionen zwischen HPV-6, HPV-11 und zwischen HPV-18, HPV-45 berichtet (R. C. Rose, persönliche Mitteilung; W. White et al., in Vorbereitung; L. F. Zang, Vaccine, (2000), S. 1051–1058). Die kreuzneutralisierende Aktivität von kreuzreagierenden Antigenen wurde in den wenigen Fällen festgestellt, bei denen HPV-Vorräte verfügbar sind und Infektivitätstests entwickelt worden sind. Es wurde über Tests auf in vitro-Infektivität für HPV-11, –16 und –18 berichtet (Smith et al., J. Invest. Dermatol., Bd. 105 (1995), S. 1–7; White et al., J. Virol., Bd. 72 (1998), S. 959–964; White et. al., 17^th International Papillomavirus Conference, 1999). Zusätzlich wurden neuerdings Tests auf HPV-31 und –45 entwickelt (S. Wilson, unveröffentlichte Ergebnisse). Ergebnisse mit diesen Tests haben gezeigt, dass eine starke Kreuzreaktivität ein Anzeichen für kreuzneutralisierende Aktivität darstellt (White et al., J. of Virol., Bd. 72 (1998), S. 959–964; White et. al., 17^th International Papillomavirus Conference, 1999; Wilson et al., unveröffentlichte Ergebnisse). In jedem einzelnen Fall war jedoch der kreuzneutralisierende Titer immer erheblich niedriger (10- bis 100-fach) als die Reaktivität gegen den homologen Typ. Die Konzentration an Antikörper, die zur Erzielung eines Schutzes gegen HPV-Infektionen notwendig ist, ist nicht bekannt. Jedoch gilt es als weitgehend gesichert, dass hohe Antikörpertiter zu höheren Schutzgraden führen. Somit besteht die derzeitige Beschränkung darin, dass es für eine breit gefächerte Abdeckung gegen eine Vielzahl von HPV-Typen erforderlich ist, zahlreiche VLP-Typen aufzunehmen. Jeder zusätzliche VLP-Typ erfordert aufwändige Herstellungs- und Reinigungsmaßnahmen und führt zu einer komplexeren Beschaffenheit und zu höheren Kosten des Impfstoffes. Daher wäre es von Vorteil, die Anzahl an VLP-Typen zu verringern und dennoch ein Produkt zu erzeugen, das zur Auslösung von schützenden oder therapeutischen Reaktionen gegen eine Vielzahl von HPV-Typen befähigt ist.
Steven et al. (Journal of Virology, Juli 1996, S. 4791–4794) führt aus, dass die Bindung von HPV11-spezifischen, neutralisierenden, monoklonalen Antikörpern auf HPV6-L1-virusartige Teilchen umdirigiert werden kann, indem man zwei Substitutionen von entsprechenden Aminosäureresten an HPV11-L1 vornimmt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Auslösung von neutralisierenden Antikörperreaktionen von hohem Titer oder von therapeutischen zellulären Reaktionen gegen HPV-18 und HPV-45 und optional gegen weitere HPV-Typen mit einem einzigen chimären L1-Molekül bereit. Durch Schaffung eines chimären L1-VLP, das zur Auslösung von Antikörperreaktionen oder zellulären Reaktionen befähigt ist, die mit den durch zwei oder mehr individuelle VLP-Typen induzierten Reaktionen vergleichbar sind, bewirken die erfindungsgemäßen Verfahren eine Verringerung des Bedarfs an einer großen Anzahl von VLP-Typen in Impfstoffen auf HPV-VLP-Basis.
Die erfindungsgemäßen neuen chimären HPV-L1-VLPs können für die Diagnose einer früheren oder aktuellen HPV-Infektion und auch zur Bestimmung des Grads an schützenden Antikörperreaktionen, die in Körperflüssigkeiten auftreten, herangezogen werden. Die Verwendung des chimären Moleküls verringert dabei die Anzahl der erforderlichen Tests und die Anzahl der erforderlichen Komponenten, die zur Definition dieser Parameter benötigt werden.
Die erfindungsgemäßen chimären HPV-VLPs können auch zur Einkapselung von erwünschten Resten, z. B. von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln, wie zielgerichteten Liganden, antiviralen Mitteln und Radionukliden, verwendet werden, und sie können als "Pseudovirionen" zur Abgabe von therapeutischen Mitteln an Zellen und zur Bewertung der Wirksamkeit von mutmaßlichen Impfstoffen oder Therapeutika eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Aminosäuresequenzen der L1-Proteine von HPV-18 und HPV-45 sind hochgradig homolog, wobei die Identität der Aminosäuresequenz 86% beträgt. HPV-18-L1-VLPs und HPV-45-VLPs rufen Antiseren hervor, die miteinander kreuzreagieren (White et al., in Vorbereitung; Wilson et al., 18^th International Papillomavirus Conference). Test auf in vitro-Infektivität wurden sowohl mit HPV-18-Material (White et al., in Vorbereitung) als auch mit HPV-45-Material (Wilson et al., Abstract, 18^th International Papillomavirus Conference) entwickelt, wobei jedes Material ein Produkt einer organotypischen Kultur war (Meyers et al., Abstract, 18^th International Papillomavirus Conference). Die Infektivitätstests wurden für den Nachweis verwendet, dass anti-HPV-18-VLP-Serum sowohl HPV-18-Virus als auch HPV-45-Virus neutralisiert. Ferner neutralisiert anti-HPV-45-VLP-Serum HPV-18 zusätzlich zu HPV-45. Somit liegen kreuzneutralisierende Epitope sowohl an HPV-18 als auch an HPV-45 vor. Jedoch war in beiden Fällen die Wirkungsstärke des Antiserums in Bezug auf die Neutralisation des Homotyp-Virus 100-fach größer als gegen das Heterotyp-Virus.
Als Mittel zur Erzeugung eines VLP, das starke Neutralisationstiter gegen beide Virus-Typen hervorrufen soll, wurden vier verschiedene chimäre HPV-18/45-L1-Moleküle erzeugt, indem Segmente des L1-Gens durch homologe Segmente des HPV-45-L1-Gens ausgetauscht wurden. Sämtliche vier chimären L1-Moleküle bildeten VLPs, wie durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen wurde. Jedes chimäre L1-VLP wurde durch ELISA auf die Reaktivität mit drei HPV-18-neutralisierenden, monoklonalen Antikörpern (R5, J4, 195), die verschiedene Stellen an HPV-18-L1-VLPs erkennen, getestet. Einer der chimären VLPs ging keine Bindung mit den monoklonalen Antikörpern (mAbs) J4 und 195 ein, band jedoch R5. Überraschenderweise zeigten Antiseren, die in Mäusen gegen dieses chimäre VLP erzeugt worden waren, Neutralisationstiter sowohl gegen HPV-18 als auch gegen HPV-45, die von vergleichbarer Größe mit den durch die homotypischen VLPs hervorgerufenen Titer waren. Obgleich die J4- und 195-Epitope verloren gingen, ergab die Aufrechterhaltung des R5-Epitops (und vermutlich anderer 18 Epitope) sowie der Einbau von HPV-45-neutralisierenden Epitopen in einem VLP-Format die Struktur, die zur Induktion von Neutralisationsreaktionen von hohem Titer gegen beide Virustypen erforderlich war. Somit wurde insgesamt festgestellt, dass ein chimäres HPV-L1-VLP, das aus den Aminosäuren 1-265 von HPV-18, anschließend den Aminosäuren 265–442 von HPV-45 und am Ende aus den Aminosäuren 443–507 von HPV-18 zusammengesetzt ist, Neutralisationsreaktionen von hohem Titer gegen beide Virustypen auslöst. Diese Reaktionen sind von höherer Größenordnung als die Reaktionen, die durch jeden VLP-Typ gegen das heterologe Virus ausgelöst werden. Ferner sind Antikörperreaktionen gegen die J4- und 195-Epitope nicht zur Auslösung von starken Neutralisationsreaktionen gegen HPV-18 nötig. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen sollte es möglich sein, funktionelle chimäre L1-Proteine mit anderen HPV-Kombinationen bereitzustellen, insbesondere, wenn ein hohes Maß an Homologie, d. h. mehr als etwa 75%, und eine hochgradige Kreuzreaktivität vorliegen.
Definitionen
Haupt-Capsidprotein oder Li-Protein: das Strukturprotein von Papillomavirus (PV), das den Hauptteil der PV-Capsidstruktur darstellt. Es finden sich Berichte über den Einsatz dieses Proteins bei der Herstellung von HPV-Impfstoffen und als diagnostisches Mittel.
Virusartige Teilchen oder VLPs: die capsidartigen Strukturen, die sich bei der Expression und beim Zusammenbau einer Papillomavirus-L1-DNA-Sequenz allein oder in Kombination mit einer L2-DNA-Sequenz ergeben. VLPs sind in morphologischer und antigener Hinsicht ähnlich mit authentischen Virionen. VLPs können in vivo in geeigneten Wirtszellen, z. B. Säugetier- oder Insektenwirtszellen erzeugt werden oder sie können sich spontan bei Reinigung von rekombinanten L1-Proteinen bilden. Ferner können sie unter Verwendung von L1-Fragmenten oder mutierten Formen davon hergestellt werden, z. B. unter Verwendung von L1-Proteinen, die durch Addition, Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren modifiziert worden sind. L1-Mutanten, die unter den Umfang der Erfindung fallen, sind solche, die bei VLP-Wiederaufbau mindestens ein natives PV-Konformationsepitop präsentieren. Beispielsweise umfasst dies L1-Proteine, die am letzten konservierten Glutaminrest am Carboxyterminus geschnitten worden sind. Die Spaltung dieses Glutaminrestes entfernt durchschnittlich 30 bis 40 Aminosäurereste vom L1-Protein. Geeignete Mutanten oder Fragmente lassen sich auf der Grundlage der Reaktivität dieser L1-Proteine mit neutralisierendem Antiserum oder auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Anregung von neutralisierendem Antiserum bestimmen.
Korrekt gefaltetes L1-Protein: ein L1-Protein, Fragment davon oder eine mutierte Form davon (entweder monomer in Form von kleinen Oligomeren (Dimere bis Tetramere) oder Capsomere), die bei Expression eine Konformationsstruktur annehmen, die ein oder mehr Konformations-HPV-L1-Epitope, die an nativen viralen Capsiden oder VLPs vorhanden sind, präsentiert und sich für den Zusammenbau zu VLPs eignet. Erfindungsgemäß präsentiert ein korrekt gefaltetes chimäres HPV-L1-Protein ein oder mehrere HPV-L1-Konformationsepitope von jedem der HPV-Typen, die bei der Herstellung des chimären Proteins verwendet werden.
Konformations-L1-HPV-Epitop: ein Epitop, das an der Oberfläche von korrekt gefaltetem L1-Protein exprimiert wird und auch durch ein L1-Protein oder Fragment oder eine mutierte Form davon exprimiert wird und das auch durch ein L1-Protein eines entsprechenden infektiösen Wildtyp-HPV exprimiert wird. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Präsentation von Konformationsepitopen für die Wirksamkeit (sowohl in Form von prophylaktischen als auch von diagnostischen Mitteln) von HPV-L1-Protein-Immunogenen wesentlich ist.
Neutralisierendes Konformations-L1-HPV-Epitop: ein Epitop, das auf der Oberfläche eines korrekt gefalteten L1-Proteins, eines Fragments oder einer mutierten Form davon exprimiert wird und das auch von einem L1-Protein eines entsprechenden infektiösen Wildtyp-HPV exprimiert wird, sowie neutralisierende Antikörper hervorruft. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Präsentation von neutralisierenden Konformationsepitopen für die Wirksamkeit (sowohl in Form von prophylaktischen als auch von diagnostischen Mitteln) von HPV-L1-Protein-Immunogenen wesentlich ist.

Konformationsantikörper: ein Antikörper, der spezifisch an ein Epitop bindet, das an einem korrekt gefalteten L1-Protein, jedoch nicht an einem denaturierten L1-Protein exprimiert wird.
Chimäres L1-Molekül: die Nucleotidsequenz von einem HPV-Typ mit einem Gehalt an verschiedenen Segmenten der analogen Nucleotidsequenz von einem oder mehreren weiteren HPV-Typen.
Chimäres VLP: ein VLP, das aus einem chimären L1-Molekül zusammengesetzt ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Schematische Darstellung der chimären 18/45-L1-Moleküle. Restriktionsendonuclease-Stellen wurden in die HPV-45-L1-Sequenz durch positionsgerichtete Mutagenese eingeführt und die verdauten DNA-Fragmente wurden als Ersatz für homologe Regionen von HPV-18-L1 verwendet. Die in Klammern angegebenen Zahlen geben die Position der HPV-45-L1-Gensequenz an, die als Ersatz des 18-L1-Gens verwendet wurde.
2A: Anti-VLP-Serum-Panel mit HPV-18-VLPs. ELISA-Platten wurden mit HPV-18-VLPs beschichtet und mit seriellen, 2-fachen Verdünnungen von Antiseren, die in Kaninchen gegen die angegebenen HPV-VLP-Typen erzeugt worden waren, umgesetzt. Nur die anti-HPV-18-Seren und in geringerem Ausmaß die anti-HPV-45-Seren zeigten eine signifikante Bindung an die HPV-18-VLPs über den geprüften Verdünnungsbereich hinweg.
2B: Anti-VLP-Serum-Panel mit HPV-45-VLPs. HPV-45-VLPs wurden schichtförmig auf ELISA-Platten aufgebracht und mit dem gleichen Panel von anti-HPV-VLP-Antiseren wie in 2A umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktivität gegen die HPV-45-VLPs weitgehend typspezifisch ist; jedoch zeigte das anti-HPV-18-Serum den höchsten Grad an Kreuzreaktivität.
3: HPV-18 wurde mit anti-HPV-11-, -16-, -18-, -33-, -35-, -39- oder -45-VLP-Seren vorinkubiert und anschließend zu HaCaT-Zellen gegeben. HPV-18E1E4-spezifische und zelluläre -actinspezifische RT-PCR-Produkte wurden mit RNA, die aus den infizierten Zellen isoliert worden war, erzeugt. Die RNA- und RT-PCR wurden im Wesentlichen gemäß den Angaben von White et. al., 1998, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass es sich beim HPV-18-spezifischen Vorwärts-Außenprimer um 5'-GACTCCAACGACGCAGAGAAAC-3' und beim reversen Außenprimer um 5'-GTCCACAATGCTGCTTCTCCG-3' handelte. Beim verschachtelten Vorwärtsprimer handelte es sich um 5'-GTATGCATGGACCTAAGGCAAC-3' und beim reversen verschachtelten Primer um 5'-TCCACAGTGTCCAGGTCGTGT-3'. Nur die anti-HPV-18- und anti-HPV-45-Seren neutralisierten das Virus.
4: Titration von anti-18 und anti-45 auf HPV-18-Neutralisationsaktivität: HPV-18 wurde mit 1:100 verdünntem Präimmun-Kaninchenserum (Bahn V), mit seriellen log 10-Verdünnungen von anti-HPV-18-VLP-Serum oder mit seriellen log 10-Verdünnungen von anti-HPV-45-VLP-Serum vor der Zugabe zu Keratinozyten vorinkubiert. Als Kontrolle wurde ein weiterer Aliquotteil von Zellen ohne Virus inkubiert (Bahn C). RT-PCR-Produkte wurden mit Gesamt-RNA und HPV-18-spezifischen PCR-Primern gemäß den Angaben zu 3 erhalten. Das anti-HPV-18-VLP-Serum verhinderte den Nachweis des E1E4-Transkripts in Verdünnungen von 1:10⁵, während das anti-HPV-45-Serum nur in Verdünnungen von 1:10³ eine Neutralisation bewirkte.
5: HPV-45 wurde mit anti-HPV-6-, -11-, -16-, -18-, -31-, -33-, -35-, -39- oder -45-VLP-Seren vorinkubiert und sodann zu HaCaT-Zellen gegeben. HPV-45-E1-E4-spezifische und zelluläre, -actinspezifische RT-PCR-Produkte wurden mit RNA erzeugt, die aus den infizierten Zellen isoliert worden war. Nur die anti-HPV-18- und anti-HPV-45-Seren neutralisierten das Virus.
6: Bindung von HPV-18- und HPV-45-reaktiven mAbs an chimäre 18/45-L1-VLPs: HPV-18-, HPV-45- oder die Chimären 18/45-L1-VLPs wurden an Mikrotiterplatten gemäß den Angaben zu Materialien und Methoden gebunden. Aszitesflüssigkeiten aus den mAb-sezernierenden Hybridom-Zelllinien wurden 1:128 000 verdünnt und auf Bindungsreaktivität gegen die verschiedenen VLPs getestet. Die MAbs R5, J4 und 195 sind HPV-18-neutralisierend. Der MAb E30 erkennt bevorzugt ein Konformationsepitop an HPV-45-VLPs; reagiert aber weniger stark mit HPV-18-VLPs. Eine spezifische Bindung der mAbs an die verschiedenen VLPs wurde durch ein biotinyliertes anti-Maus-Ig-Reagenz durch eine kolorimetrische Ablesung nachgewiesen, die durch Streptavidin-Meerrettich-peroxidase und Substrat (TMB) erzeugt worden war. Die optische Dichte wurde nach 15-minütiger Inkubation mit dem Substrat und der Zugabe eines Stoppreagenz zur Beendigung der Farbentwicklung bei 450 nm aufgezeichnet. Die Mittelwerte von zwei im Doppelversuch angesetzten Vertiefungen wurden als die endgültigen OD-Werte berechnet.
7: Reaktivität von polyklonalen, anti-chimären 18/45-L1-VLP-Seren an HPV-18- und HPV-45-VLPs: Antiseren gegen HPV-18-, -45- und die XN-, NB-, und BH-18/45-L1-VLPs wurden nicht-zuchtverwandten Swiss-Mäusen erzeugt. Fünf Mäuse wurden subkutan in den Wochen 0 und 3 mit 2 μg des angegebenen VLP bei Adsorption an Aluminiumhydroxid (1 mg/ml Al-Endkonzentration) immunisiert. Antiseren wurden in der Woche 5 (2 Wochen nach der sekundären Immunisierung) gewonnen. Vereinigte Antiseren aus jeder Gruppe wurden 1:4 000 verdünnt und durch ELISA auf ihre Reaktivität mit HPV-18- oder HPV-45-VLPs getestet. Die spezifische Bindung wurde durch ein biotinyliertes anti-Maus-Ig-Reagenz durch eine kolorimetrische Ablesung nachgewiesen, die durch ein Streptavidin-Meerrettich-peroxidase und ein Substrat (TMB) erzeugt worden war. Die optische Dichte wurde nach 15-minütiger Inkubation mit dem Substrat und nach Zugabe eines Stoppreagenz zur Beendigung der Farbentwicklung bei 450 nm abgelesen. Mittelwerte von im Doppelversuch angesetzten Vertiefungen wurden als die endgültigen OD-Werte berechnet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden chimäre HPV-L1-Proteine bereitgestellt, die zur Auslösung von Antikörperreaktionen oder zellulären Reaktionen befähigt sind, die mit den Reaktionen vergleichbar sind, die durch HPV-18 und HPV-45 und gegebenenfalls durch weitere individuelle HPV-Typen ausgelöst werden. Dies bedeutet, dass die erfindungsgemäßen chimären Proteine zur Bildung von Neutralisationstitern gegen zwei oder mehr HPV-Typen in einer Größenordnung befähigt sind, die mit dem Neutralisationstiter vergleichbar sind, der entsteht, wenn jeder einzelne von zwei oder mehr HPV-Typen getrennt verabreicht worden ist. Der Ausdruck "allgemein vergleichbar" bedeutet, dass der Neutralisationstiter des chimären L1-Proteins und des VLP gegen jeden Virustyp, der zur Herstellung des chimären Proteins verwendet worden ist, mindestens 50% des Neutralisationstiters beträgt, der gegen jedes Homotyp-Virus erzeugt worden ist. Dies stellt eine erhebliche Verbesserung gegenüber der Reaktion dar, die durch ein einzelnes, natives HPV-VLP-(nicht-chimär) erzeugt worden ist, wobei die Stärke der Kreuzneutralisationsaktivität, d. h. die Fähigkeit des Serums zur Neutralisation von HPV-Typen, die sich vom nativen Typ unterscheiden, immer erheblich geringer ist als die Kreuzreaktivität des Serums und die Fähigkeit des Serums zur Neutralisation von Heterotyp-Virus (etwa 100-fach niedriger mit nativen L1-Proteinen und nicht-chimären VLPs).
Die erfindungsgemäßen chimären HPV-L1-Proteine lassen sich unter Verwendung von Sequenzen aus HPV-18 und HPV-45 konstruieren. Weitere HPV-Typen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus HPV-11, -16, -31, -33, -35 und -39 besteht. Besonders bevorzugte Typen weisen eine hochgradige Homologie auf, d. h. mindestens 65–75% unter den nativen L1-Genen, wie es bei HPV-18, -45 und -39 der Fall ist. Insbesondere handelt es sich bei diesen HPV-Typen um HPV-16, -18, -31, -33 und -45. Das chimäre HPV-L1-Protein umfasst vorzugsweise mindestens das R5-Epitop von HPV-18.
Eine Möglichkeit zur Konstruktion von chimären L1-Proteinen besteht in der Anwendung einer "Tribrid"-Vorgehensweise, wobei drei Abschnitte von L1-Genen unterschiedlicher HPV-Typen verbunden werden oder der Mittelabschnitt von einem L1-Gen aus der entsprechenden Region eines anderen ersetzt wird. Das erfindungsgemäße chimäre "Tribrid"-Protein umfasst die Aminosäuren 1–265 von HPV-18, anschließend die Aminosäuren 265–442 von HPV-45 und am Ende die Aminosäuren 443–507 von HPV-18.
Die erfindungsgemäßen Chimären HPV-L1-Proteine können zur Herstellung virusartiger Teilchen (VLP) verwendet werden. Derartige VLPs können in Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden, die ferner pharmazeutische Träger und gegebenenfalls Adjuvantien, die dem Fachmann geläufig sind, umfassen. Die chimären VLPs können auch in therapeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Patienten mit aktuellen Papillomavirus-Infektionen verwendet werden. Die VLPs, die Impfstoffe, die therapeutischen Zusammensetzungen und die Proteine der Erfindung können alle zur Erzeugung von neutralisierendem Antiserum von hohem Titer gegen mindestens zwei HPV-Typen verwendet werden.
Eine Neutralisationsaktivität von hohem Titer bedeutet, dass das chimäre L1-Protein zur Bildung von Antiserum befähigt ist, das in einer Verdünnung von 1:1 000 und insbesondere in einer Verdünnung von 1:10 000 mindestens zwei HPV-Typen neutralisiert. Die Neutralisationsaktivität, die gegen jeden Virustyp vorliegt, kann von dem Niveau abhängen, das durch Verabreichung der nativen Homotyp-Viren erreicht wird, beträgt aber im allgemeinen mindestens etwa 50% der Neutralisationsaktivität, die durch Homotyp-Serum hervorgerufen wird. Das Verfahren kann auch zur Induktion von neutralisierenden Antikörperreaktionen oder zellvermittelten Immunreaktionen von hohem Titer gegen zahlreiche verschiedene HPV-Typen verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Anzahl der Epitope, die in einem einzelnen chimären L1-Molekül enthalten sind. Die Anzahl von HPV-Typen, gegen die Antikörperreaktionen erzeugt werden, kann ferner durch Verabreichung von VLPs, die mehr als ein chimäres L1-Molekül enthalten, erfüllt werden. Beispielsweise können Antiseren gegen mindestens drei HPV-Typen erzeugt werden, indem man ein VLP mit einem Gehalt an mindestens zwei Typen von chimären HPV-L1-Proteinen verabreicht, sofern jeder Typ des chimären Moleküls mindestens ein L1-Epitop aufweist, das aus einem anderen HPV-Typ als das andere Epitop stammt.
Die Erfindung umfasst ferner Gene, die für die hier beschriebenen chimären HPV-L1-Proteine kodieren. Das Gen, das die Kodierungssequenzen von HPV-18 umfasst, umfasst vorzugsweise mindestens die Nucleotide des nativen HPV-18-L1-Gens, die für das R5-Epitop kodieren, und insbesondere mindestens etwa die N-terminale Hälfte des nativen HPV-18-L1-Gens. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Gen umfasst das native HPV-18-L1-Gen, wobei die Nucleotide 624 bis 1327 durch die entsprechenden Nucleotide von HPV-45 ersetzt worden sind. "Entsprechend" bedeutet die Nucleotide in der gleichen Position wie die deletierten Nucleotide, wenn zwei native Gene so ausgerichtet werden, dass sich die höchstmögliche Homologie ergibt. In "Tribrid"-Virustypen können die rekombinanten Gene, die für die chimären L1-Proteine kodieren, entsprechende Segmente aufweisen, die im Bereich von etwa 100 Nucleotiden bis etwa 1200 Nucleotiden liegen.
Die Erfindung umfasst auch Vektoren, die die Gene umfassen, die für die Chimären HPV-L1-Proteine kodieren, und zwar in funktioneller Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren, die deren Expression steuern. HPV-L1-Sequenzen können in beliebigen Wirtszellen exprimiert werden, die für die Expression von gewinnbaren Ausbeuten an HPV-VLPs sorgen. Geeignete Wirtssysteme zur Expression von rekombinanten Proteinen sind bekannt und umfassen beispielsweise Bakterien, Säugetierzellen, Hefen und Insektenzellen. Ein bevorzugtes Expressionssystem umfasst das Baculovirus/Insektenzellen-System, das in den Beispielen verwendet wird, da dieses System für hohe Proteinausbeuten sorgt. Jedoch können HPV-L1- und -L2-Proteine auch in anderen Systemen, insbesondere in Bakterien und Hefen, erzeugt werden.
Geeignete Vektoren zur Klonierung der Expression der vorliegenden, für HPV-L1 kodierenden DNA-Sequenzen sind dem Fachmann geläufig und im Handel erhältlich. Ferner sind geeignete regulatorische Sequenzen zur Erzielung der Klonierung und Expression, z. B. Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer und selektierbare Marker, bekannt. Die Auswahl entsprechender Sequenzen zur Bildung von gewinnbaren Proteinausbeuten stellt für den Fachmann eine routinemäßige Maßnahme dar.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zum Impfen eines Subjekts gegen mindestens zwei Typen von HPV, wobei das Verfahren die Verabreichung einer Impfstoffzusammensetzung umfasst, die mindestens ein chimäres HPV-L1-Protein umfasst, wobei dieses mindestens eine chimäre HPV-L1-Protein neutralisierende Epitope mindestens für HPV-18 und HPV-45 umfasst. Weitere HPV-Typen werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus HPV-11, -16, -31, -33, -35 und -39 besteht, wobei es sich aber auch um einen beliebigen HPV-Typ handeln kann.
Das erfindungsgemäße chimäre HPV-Ll-Protein umfasst die Aminosäuren 1–265 von HPV-18, anschließend die Aminosäuren 265–442 von HPV-45 und am Ende die Aminosäuren 443–507 von HPV-18. Die Impfstoffzusammensetzungen können entweder freie Chimäre L1-Proteine oder VLPs mit einem Gehalt an chimären L1-Proteinen enthalten.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können zelluläre Immunreaktionen sowie die Bildung von neutralisierenden Antiserum-Titern auslösen. Die Zusammensetzungen können Adjuvantien oder zusätzliche Bestandteile zur Förderung von zellulären Immunreaktionen zusätzlich zu chimären Proteinen oder VLPs enthalten, d. h. Cytokine oder T-Zellrezeptorliganden. Derartige Bestandteile können der Zusammensetzung zugemischt werden. Alternativ kann die Zusammensetzung so aufgebaut sein, dass diese Bestandteile dem VLP-Capsid einverleibt werden. Dies kann in vivo durch Einverleibung der Reste in VLPs während ihres Zusammenbaus im Innern der Zelle erfolgen. Alternativ kann dies vorgenommen werden, indem man Reduktionsmittel verwendet, um den Abbau und die Entfernung des Reagenz zu beeinflussen, damit das VLP neu zusammengesetzt wird. Diesbezüglich beschreibt US-SN 08/923 997 ein Verfahren zum Abbau und erneuten Zusammenbau von HPV-VLPs, um abzugebende Mittel einzuverleiben oder VLPs zielgerichtet an Zellen abzugeben. Der Inhalt dieser Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe enthalten eine ausreichende Menge der vorliegenden HPV-VLPs, um die Bildung von neutralisierenden Antikörpern im Wirt auszulösen, wobei die HPV-VLPs in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten sind. Die Verabreichung der vorliegenden, VLP enthaltenden Impfstoffe kann durch beliebige, pharmazeutisch verträgliche Maßnahmen erfolgen, z. B. durch parenterale, lokale oder systemische Verabreichung, einschließlich beispielsweise eine orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre und topische Verabreichung. Die Verabreichungsart hängt von verschiedenen Faktoren ab, wozu der natürliche Infektionsweg gehört. Die verabreichte Dosierung hängt von verschiedenen Faktoren ab, unter Einschluss des Alters, der Gesundheit, des Gewichts, der Art einer gegebenenfalls vorgenommenen gleichzeitigen Behandlung und der Natur und dem Typ des speziellen humanen Papillomavirus. Der Impfstoff kann in Dosierungsformen, wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren, für die orale Verabreichung, oder in Form von sterilen flüssigen Zubereitungen, wie Lösungen oder Suspensionen, für die parenterale oder intranasale Verwendung eingesetzt werden. Ein inerter, immunologisch verträglicher Träger wird vorzugsweise verwendet, z. B. Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
Die Impfstoffe werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d. h. in Mengen, die zur Erzielung einer schützenden immunologischen Reaktion ausreichen. Im Allgemeinen werden die Impfstoffe in Dosierungen von etwa 0,1 mg Protein bis etwa 20 mg Protein und vorzugsweise von etwa 0,001 mg bis etwa 100 mg Protein verabreicht. Es können Einfach- oder Mehrfachdosierungen verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Herstellung von chimären HPV-Impfstoffen zur Verhinderung bestimmter Typen von Papillomavirus-Infektionen. Beispielsweise können die Impfstoffe, wenn mehr als ein PV-Typ mit den PV-Infektionen in Verbindung steht, stabile chimäre HPV-VLPs umfassen, die sich von mehr als einem PV-Typ ableiten.
Es ist bekannt, dass verschiedene Neoplasien mit PV-Infektionen assoziiert sind. Beispielsweise wurden die HPVs 3a und 10 mit flachen Warzen in Verbindung gebracht. Von einer Anzahl von HPV-Typen wurde berichtet, dass sie mit Epidermodysplasia verruciformis (EV) assoziiert sind, einschließlich die HPVs 3a, 5, 8, 9, 10 und 12. Von den HPVs 1, 2, 4 und 7 wurde berichtet, dass sie mit Hautwarzen assoziiert sind, und von den HPVs 6b, 11a, 13 und 16 wurde berichtet, dass sie mit Läsionen der Schleimhautmembranen assoziiert sind (vergl. z. B. Kremsdorf et al., J. Virol., Bd. 52 (1984), S. 1013–1018; Beaudenon et al., Nature, Bd. 321 (1986), S. 246–249; Heilman et al., J. Virol., Bd. 36 (1980), S. 395–407; und DeVilliers et al., J. Virol., Bd. 40 (1981), S. 932–935). Somit können die vorliegenden Impfstoffzubereitungen chimäre VLPs umfassen, die sich je nach dem gewünschten Schutz von verschiedenen HPV-Typen ableiten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Behandlung von Papillomavirus-Infektionen, die durch mehr als einen HPV-Typ charakterisiert sind, wobei die Verfahren die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung umfassen, die HPV-VLPs, die mindestens ein chimäres L1-Protein aufweisen, enthalten. Ferner umfasst werden Verfahren zur Behandlung einer Papillomavirus-Infektion, die durch einen ersten HPV-Typ verursacht worden ist, gleichzeitig mit einer prophylaktischen Behandlung mindestens eines anderen Typs einer HPV-Infektion, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung umfasst, die HPV-VLPs, die mindestens ein chimäres L1-Protein aufweisen, enthalten.
Die therapeutischen Verfahren der vorliegenden Erfindung sorgen ferner für die Einführung erwünschter Einheiten, z. B. DNAs, Proteine, Peptide, Hormone, Radionuclide, Mittel gegen Krebs und antivirale Mittel, in VLPs während des Wiederaufbaus. Dies ist vorteilhaft, da derartige VLPs als Abgabeträger (zur Einführung erwünschter Einheiten in Zellen) und als "Pseudovirionen" zur Bewertung der prophylaktischen Wirksamkeit von Papillomavirus-Impfstoffen verwendet werden können.
Beispielsweise umfassen die Einheiten, die in die VLPs eingekapselt werden können, therapeutische und diagnostische Einheiten, z. B. Nucleinsäuresequenzen, Radionuclide, Hormone, Peptide, antivirale Mittel, Antitumormittel, Mittel zur Modulation des Zellwachstums, Inhibitoren des Zellwachstums, Cytokine, Antigene, Toxine und dergl. Die vorliegenden VLPs, die einen darin eingekapselten erwünschten Rest enthalten, sollen bei Verabreichung an einen gewünschten Wirt, vorzugsweise einen Menschen, von Zellen, die normalerweise durch das spezielle Papillomavirus infiziert werden, z. B. Epithelzellen, Keratinozyten und dergl., aufgenommen werden, wobei für die potentielle Aufnahme der eingekapselten Einheit in die Zellen gesorgt wird. Dies kann die Verwendung der vorliegenden VLPs für therapeutische Zwecke (im Gegensatz zur Prophylaxe) erleichtern, da dadurch die Abgabe eines therapeutischen Mittels an eine angestrebte Zellstelle, z. B. an die Stelle eines Zervikalkarzinoms, erleichtert wird. Angesichts der im allgemeinen lästigen Eigenschaften von PVs kann dies eine hochgradig selektive Maßnahme zur Abgabe erwünschter Einheiten an Zielzellen darstellen. Beispielsweise kann dies eine Maßnahme zur Abgabe von Nucleinsäuresequenzen, z. B. DNA, die für ein therapeutisches Polypeptid kodiert, oder einer antisense-Sequenz sorgen.
Die eingekapselten Einheiten sollten selbstverständlich den Zusammenbau und/oder die Stabilität von VLP nicht nachteilig beeinflussen. Dies kann festgestellt werden, indem man VLPs herstellt, die die gewünschte Einheit enthalten, und deren etwaige Wirkungen auf den Zusammenbau und/oder die Stabilität von VLPs ermittelt.
Im Fall von DNAs oder RNAs kann die eingekapselte Nucleinsäuresequenz bis zu 8 Kilobasen, d. h. die Größe des PV-Genoms, ausmachen. Jedoch sind die eingekapselten Sequenzen typischerweise kleiner, z. B. in der Größenordnung von 1-2 Kilobasen. Typischerweise kodieren diese DNAs für ein erwünschtes Polypeptid, z. B. ein therapeutisches Polypeptid, wie ein Enzym, ein Hormon, einen Wachstumsfaktor und dergl. Diese Sequenz wird ferner funktionell mit Sequenzen verknüpft, die die Expression der Sequenz in Zielwirtszellen erleichtern.
Eine weitere Anwendung von chimären VLPs, die eingekapselte DNAs enthalten, stellen "Pseudovirionen" dar. Diesbezüglich ist festzustellen, dass zahlreiche Papillomaviren, einschließlich solche, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, selten sind, sich nicht leicht in vitro vermehren lassen und sich nicht leicht aus humanen Zellquellen in solchen Mengen reinigen lassen, dass sie leicht in Antikörper-Neutralisationstests eingesetzt werden können. Dies stellt insofern ein Problem dar, als dadurch die Bewertung der Eignung von Impfstoffen oder von therapeutischen Mitteln für einen Schutz gegen diese spezifischen HPV-Viren verhindert oder erschwert wird. Die vorliegende Erfindung sollte derartige Probleme beseitigen oder zumindest verringern.
Im Wesentlichen werden chimäre "Pseudovirionen" konstruiert, die VLPs umfassen, die aus einem chimären L1 oder einer Kombination aus chimären L1- und L2-Proteinen des speziellen PV gebildet sind, wobei ferner darin ein Teil des Genoms des Papillomavirus oder einer DNA, die für einen selektierbaren Marker kodiert, eingekapselt ist. Dieses Pseudovirion wird in einem in vitro-Zellinfektiositätstest verwendet, um die Wirksamkeit von entsprechenden VLP-Impfstoffen zu bewerten. Im Wesentlichen wird dies durchgeführt, indem man Zellen mit derartigen Pseudovirionen in Kontakt bringt. Diese Pseudovirionen sollten derartige Zellen binden und für die Einführung der DNA sorgen. Anschließend kann die Einführung der DNA durch bekannte Verfahren, z. B. PCR-Hybridisierungsverfahren, oder auf der Grundlage der Expression des selektierbaren Markers, z. B. β-Galactosidase, bewertet werden.
Dies wird sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Antikörpern vorgenommen, die gegen L1- oder L2-Proteine erzeugt worden sind, die spezifisch für das spezielle HPV, das zur Herstellung des chimären VLP verwendet worden ist, sind. Wenn die Insertion gehemmt wird, wie es beispielsweise auf der Grundlage einer verringerten Expression des selektierbaren Markers festgestellt wird, stellt dies einen Hinweis dafür dar, dass das L1- oder L2-Protein die Erzeugung von virusneutralisierenden Antikörpern ausgelöst hat.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes oder einer therapeutischen Zusammensetzung vom Mehrfach-HPV-Typ, das folgendes umfasst:

(a) die Ligation von Bereichen, die mindestens die Aminosäuren 1 bis 265 von HPV-18, die Aminosäuren 265-442 von HPV-45 und die Aminosäuren 443–507 von HPV-18 der nativen L1-Gene, die für verschiedene Epitope kodieren, umfassen;
(b) die Klonierung der ligierten Genbereiche in einen Expressionsvektor; und
(c) die Expression des Vektors in einer Zelllinie, die die Bildung von VLPs ermöglicht, wobei die VLPs mindestens ein L1-neutralisierendes Epitop von mindestens zwei verschiedenen HPV-Typen aufweisen.

Zur Erzeugung von kompatiblen Überständen an den Enden der L1-Genbereiche kann eine PCR herangezogen werden, um eine Ligation von Genbereichen nach Restriktionsendonuclease-Verdau zu ermöglichen. Alternativ können Restriktionsstellen, die in den nativen Sequenzen von HPV-L1-Proteinen vorliegen, zur Verbindung von Ll-Bereichen verschiedener HPV-Typen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Diagnose einer früheren oder aktuellen Papillomavirus-Infektion, die folgendes umfassen:

(a) die Isolierung von Serum eines Patienten, bei dem ein Verdacht auf eine frühere oder aktuelle Papillomavirus-Infektion besteht;
(b) die Exposition dieses Serums mit einem immobilisierten, Chimären HPV-L1-Protein gemäß der vorstehenden Definition, um eine Bindungswechselwirkung zwischen den HPV-L1-Epitopen und dem Antiserum zu ermöglichen, wobei gleichzeitig und getrennt davon die Exposition eines irrelevanten Antiserums oder Antikörpers mit dem identischen Chimären HPV-L1-Protein erfolgt;
(c) das Waschen des immobilisierten chimären HPV-L1, so dass ungebundene Komponenten abgetrennt werden;
(d) die Exposition eines markierten Reagenz, das spezifisch an Immunoglobuline des Patienten bindet, mit dem gewaschenen chimären HPV-L1-Protein; und
(e) das Vergleichen der Menge der Markierung, die an jede Chimäre HPV-L1-Probe gebunden ist.

Die chimären HPV-L1-Proteine können in VLPs eingebaut werden und die chimären Proteine oder die VLPs können an Perlen, der Oberfläche von Gewebekulturschalen oder Zellen durch eine Bindungswechselwirkung mit L1- oder VLP-spezifischen Antikörpern immobilisiert werden. Die an die Zellen gebundene Markierung kann durch Fließzytometrie oder beliebige andere routinemäßige Maßnahmen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, gemessen werden. Alternativ können Serumkomponenten gebunden und anschließend chimären VLPs ausgesetzt werden, wobei deren Bindung anschließend mit L1-Antikörpern nachgewiesen wird, die spezifisch für die L1s der Virustypen sind, die für die Herstellung des chimären Proteins verwendet worden sind. Das Verfahren ermöglicht ein gleichzeitiges Screening von Antikörpern für mindestens zwei verschiedene HPV-Typen, indem man zwei verschiedene markierte Reagenzien verwendet.
Bei der Verwendung für die Diagnose oder die Serotypisierung können erfindungsgemäße chimäre VLPs unter Verwendung einer Vielzahl von Markierungen und Markierungsverfahren markiert werden. Zu Beispielen für Typen von Markierungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Enzymmarkierungen, Radioisotopmarkierungen, nicht-radioaktive Isotopmarkierungen, fluoreszierende Markierungen, Toxinmarkierungen und chemilumineszierende Markierungen.
Zu Beispielen für geeignete Enzymmarkierungen gehören Malathydrogenase, Staphylokokken-Nuclease, delta-5-Steroid-isomerase, Hefe-Alkohol-dehydrogenase, alpha-Glycerinphosphat-dehydrogenase, Triosephosphat-isomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucose-oxidase, beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase und dergl.
Zu Beispielen für geeignete Radioisotopmarkierungen gehören ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc und ¹⁰⁹Pd.
Zu Beispielen für geeignete fluoreszierende Markierungen gehören eine ¹⁵²Eu-Markierung, eine Fluoresceinmarkierung, eine Isothiocyanatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung, eine o-Phthalaldehydmarkierung, eine Fluorescaminmarkierung und dergl.
Zu Beispielen für geeignete Toxinmarkierungen gehören Diphtherietoxin, Ricin und Choleratoxin. Zu Beispielen für chemilumineszierende Markierungen gehören eine Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine Markierung mit einem aromatischen Acridiniumester, eine Imidazolmarkierung und eine Acridiniumsalzmarkierung, eine Oxalatestermarkierung, eine Luciferinmarkierung, eine Luciferasemarkierung, eine Aequorinmarkierung und dergl.
Dem Fachmann sind weitere geeignete Markierungen geläufig, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Markierungen an VLPs kann unter Anwendung üblicher Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, vorgenommen werden. Typische Techniken werden von Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, Bd. 70 (1976), S. 1–31, und von Schurs et al., Clin. Chim. Acta, Bd. 81 (1977), S. 1–40, beschrieben. Bei den in der letztgenannten Druckschrift beschriebenen Kupplungstechniken handelt es sich um das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleinimid-Verfahren, das m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren, wobei alle diese Verfahren durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden.
Der Nachweis von anti-HPV-Antikörpern unter Verwendung der vorliegenden chimären VLPs kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Zu bekannten Trägern gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Art des Trägers kann so beschaffen sein, dass er für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder in gewissem Umfang löslich oder unlöslich ist. Der Fachmann kennt zahlreiche andere Träger, die sich zur Bindung von Proteinen eignen, oder er kann diese unter Einsatz routinemäßiger experimenteller Arbeiten ermitteln.
Im Anschluss an die vorstehende allgemeine Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Materialien, Methoden und Beispiele zu Erläuterungszwecken vorgelegt, was aber mit keiner Einschränkung des Schutzumfangs verbunden ist, sofern nichts anderes angegeben wird.
Materialien und Methoden
ELISA zum Nachweis von Mäuse-anti-HPV-VLP-Antikörpern:
HPV-18-L1- und HPV-45-L1-VLPs wurden heterolog in Trichoplusia ni (High Five^®)-Zellen exprimiert, die mit rekombinantem Baculovirus infiziert waren, das für die vollständige L1-Sequenz strangabwärts von Polyhedrin-Promotor kodiert (vergl. Ghim et al., Hrsg. M. A. Stanley, Immunology of human papillomaviruses, Plenum, New York (1993), S. 147–153). Zellen wurden etwa 72 Stunden nach der Infektion geerntet, durch Zentrifugation pelletisiert und eingefroren. Alternativ wurden VLPs aus frischer Zellpaste, die nicht eingefroren war, isoliert. Zum Isolieren der VLPs wurde die Zellpaste in Homogenisierungspuffer (20 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH-Wert 7,4, mit einem Gehalt an Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin und 50 μM Pefablock^® resuspendiert und in einem Microfluidizer-Gerät (Microfluidics Modell HC8000/3A)) lysiert. Das homogenisierte Lysat wurde sodann 90 Minuten mit 100 000 × g zentrifugiert und das Pellet, das die HPV-18- oder HPV-45-VLPs enthielt, wurde in PBS mit einem Gehalt an CsCl (405 g/Liter) resuspendiert. Das geklärte Lysat wurde sodann über Nacht mit 83 000 × g zentrifugiert und die VLP-Bande wurde gewonnen. Die VLPs wurden in PBS-0,5 M NaCl verdünnt und schichtförmig auf einen Zweikomponenten-Stufengradienten, der aus 30% und 65% Saccharose bestand, aufgebracht. Die Gradienten wurden 3 Stunden mit 167 000 × g zentrifugiert und anschließend wurde die gereinigte VLP-Bande an der Grenzfläche zwischen den beiden Saccharoselösungen gewonnen. Die VLPs wurden sodann in PBS-0,5 M NaCl dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde durch den Bradford-Test (Bradford et al., Anal. Biochem., Bd. 72 (1976), S. 248–254) unter Verwendung von BSA als Referenzprotein bestimmt und der L1-Gehalt wurde gemäß den Angaben von (Suzich et. al., PNAS, Bd. 92 (1995), S. 11553–11557, bestimmt. Gereinigte VLPs wurden in Aliquotanteile aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
VLPs (entweder HPV-18 oder HPV-45) wurden in PBS auf 800 ng/ml verdünnt und 100 μl-Aliquotanteile wurden auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (NUNC Maxisorp, Nalge Nunc International, Dänemark) verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 2–8°C inkubiert und anschließend mit PBS mit einem Gehalt an 0,1% Tween 20 gewaschen. Sämtliche anschließenden Stufen wurden bei 20°C durchgeführt. Die Platten wurden 1 Stunde mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBS blockiert. Nach dem Waschen wurden serielle Zweifachverdünnungen von anti-VLP-Seren oder Aszites-Flüssigkeit mit einem Gehalt an anti-HPV-18- oder HPV-45-monoklonalen Antikörpern (mAbs) in 1% fettfreier Trockenmilch in die Vertiefungen in doppelten Ansätzen gegeben. Normale Serumproben oder Aszites-Flüssigkeit mit einem Gehalt an einem irrelevanten mAb wurden als negative Kontrollen verwendet. Nach 2-ständiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und eine 1:3 000-Verdünnung von biotinyliertem Schafanti-Maus-Ig (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in 1% BSA wurde den Platten zugesetzt. Die Platten wurden 1 Stunde inkubiert, gewaschen und eine 1:2 000-Verdünnung von Streptavidin-biotinylierter Meerrettich-peroxidase in 1% BSA wurde in jede Vertiefung gegeben. Nach 1-ständiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und mit TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), das 1:2 in 0,1 M Natriumcitrat, 0,1 M Essigsäure, pH-Wert 5,8, verdünnt war, entwickelt. Nach 15-minütiger Inkubation wurde die enzymatische Reaktion mit 0,2 M H₂SO₄ gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm abgelesen. Mittelwerte von im Doppelversuch angesetzten Vertiefungen wurden als die endgültigen OD-Werte berechnet.
ELISA zum Nachweis von Kaninchen-anti-HPV-VLP-Antikörpern:
Ein Panel von Antiseren gegen HPV-11-, -16-, -18-, -31-, -33-, -35-, -39- und -45-VLPs wurden in Kaninchen gemäß Literaturangaben (White et al., J. Virol., Bd. 72 (1998), S. 959–964) erzeugt. HPV-18- oder HPV-45-VLPs wurden gemäß den vorstehenden Angaben auf Mikrotiterplatten schichtförmig aufgetragen. Auf die gleiche Weise wie beim ELISA-Test für die Mäuseantikörper wurden die Platten gewaschen und blockiert und die primären Antiseren verdünnt. Die Kaninchen-VLP-spezifischen Antikörper wurden mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (für schwere und leichte Ketten spezifisch, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), das 1:8 000 in 1% Milch in PBS verdünnt war, nachgewiesen. Nach 1-ständiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und die spezifische Bindung wurde mit ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die optische Dichte bei 405 nm wurde am Endpunkt nach 30 Minuten abgelesen. Mittelwerte von im Doppelversuch angesetzten Vertiefungen wurden als die endgültigen OD-Werte berechnet.
An HPV-18-L1-VLPs bindender monoklonaler Antikörper: Oberflächen-Plasmon-Resonanz BIACORE):
Sämtliche Stufen wurden bei 25°C durchgeführt. CM5-Sensorchips (BIACORE, Inc. Pistataway, NJ) wurden mit N-Hydroxysuccinimid/1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid gemäß den Angaben des Herstellers aktiviert. Eine 400 nM-Lösung von gereinigten 114K-HPV-16-VLPs in 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 5, wurden über ein aktiviertes Chip injiziert (R. Karlsson und A. Fält, J. Immunol. Methods, Bd. 200 (1997), S. 121–133). Nicht-umgesetzte Estergruppen wurden sodann mit 1 M Ethanolamin blockiert. Bindungsstudien wurden mit Aszites von den R5-, J4- und 195-Hybridom-Zelllinien bei Verdünnung mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4, durchgeführt. Etwa 100 μl verdünnte Aszites-Flüssigkeit wurde auf den VLP-gekuppelten Sensorchip mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl/min injiziert. Die Bindung wurde als Veränderung der Resonanzeinheiten auf dem Chip angezeigt. Ein anti-HPV-16 mAb wurde als Kontrolle für die unspezifische Bindung verwendet. Für paarweise, kompetitive Bindungsstudien wurde eine Sättigungsmenge von einem mAb über den VLP-gekuppelten Sensorchip geleitet, wonach sich eine Injektion des gleichen oder eines verschiedenen mAb anschloss. Nach jedem Bindungszyklus wurde die VLP-gekuppelte Oberfläche mit 3 M MgCl₂ regeneriert.
Elektronenmikroskopie:
Man ließ Proteinproben an mit Formvar und Kohlenstoff beschichteten Gittern (Electron Microscopy Sciences) absetzen. Anschließend wurde eine Trocknung durch Abtupfen und eine Färbung mit frisch filtrierter 2%iger Phosphowolframsäure, pH-Wert 6,8, durchgeführt. Die Gitter wurden mit dem Transmissionselektronenmikroskop JEOL Modell 1005 bei einer Beschleunigungsspannung von 100 KV geprüft und mit nominalen Vergrößerungen von 15–25 000 x photographiert.
Konstruktion eines Baculovirus-Transfervektors mit einem Gehalt an HPV-18-L1 und HPV-45-L1:
Das HPV-18-L1-Gen wurde durch PCR amplifiziert, wobei eine BglII-Stelle vor das Initiationscodon und eine HindIII-Stelle distal zum Stoppcodon angebracht wurden. Das PCR-Produkt wurde in pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und die Sequenz wurde durch automatisierte DNA-Sequenzierung bestätigt. Eine ähnliche Strategie wurde zur Klonierung des HPV-45-L1-Gens in pCR2.1 herangezogen. Zur Herstellung eines Baculovirus-Transfervektors wurde das 1,5 kb-18-L1-Gen aus dem pCR-18-L1-Plasmid unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen BglII und HindIII ausgeschnitten, durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in pFastBac (LifeTechnologies), das mit BamHI und HindIII verdaut worden war, ligiert. Dieser Klon erhielt die Bezeichnung pFB-18L1. Eine identische Strategie wurde zur Subklonierung des HPV-45-L1-Gens in pFastBac herangezogen. Dieser Klon erhielt die Bezeichnung pFB-45-L1.
Konstruktion von chimären HPV-18/45-L1-Genen:
Insgesamt vier rekombinante Baculoviren mit einem Gehalt an chimären HPV-18/45-L1-Serien wurden konstruiert. Drei rekombinante Baculoviren mit einem Gehalt an chimären HPV-18/45-L1-Genen wurden unter Anwendung der positionsgerichteten Mutagenese konstruiert, um Restriktionsstellen in das HPV-45-L1-Gen einzuführen, um eine Anpassung an spezifische Stellen, die im HPV-18-L1-Gen auftreten, vorzunehmen. Das vierte chimäre VLP bediente sich einer Restriktionsstelle, die in beiden Sequenzen auftrat. In Tabelle 1 sind die Sequenzen der Oligonucleotide aufgeführt, die dazu verwendet wurden, die Restriktionsendonuclease-Stellen in die HPV-45-L1-Kodierungssequenz einzuführen. Restriktionsfragmente wurden als Ersatz von homologen Regionen in der HPV-18-L1-Kodierungssequenz verwendet, um chimäre L1-Gene zu erzeugen.
Tabelle 1 Zur Konstruktion von Chimären HPV-18/45-L1-Genen verwendete Primer
Zur Erzeugung des Gens mit der Bezeichnung 18/45-BX wurden Oligonucleotide, die homolog zu HPV-45-L1 waren, synthetisiert, um eine BglII-Stelle proximal zum Initiationscodon im Vorwärtsprimer zu platzieren, und eine Xbal-Stelle wurde erzeugt, indem das C in der Nucleotidposition 120 gegen ein T und das C in der Nucleotidposition 121 gegen ein A im reversen Primer ausgetauscht wurden. Diese Primer wurden zur Amplifikation eines Fragments mit 125 Basenpaaren unter Verwendung des HPV-45-L1-Gens als Matritze verwendet. Das erhaltene Amplicon wurde mit BglII und XbaI verdaut und als Ersatz für das homologe Fragment des HPV-18-L1-Gens verwendet. Der pCR-18-L1-Klon wurde mit XbaI und HindIII verdaut und das 1,4 kb-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Eine Dreiwegligation wurde sodann unter Verwendung des Baculovirus-Transfervektors pFastBac (Life Technologies), der mit BamHI und HindIII verdaut worden war, des HPV-45-Amplicons, das mit BglII und XbaI verdaut worden war, und des HPV-18-L1-Fragments, das mit XbaI und HindIII verdaut worden war, durchgeführt. Das erhaltene chimäre Gen bestand aus den ersten 122 Nucleotiden von HPV-45, gefolgt von 1403 Nucleotiden des HPV-18-L1-Gens, das für drei Aminosäure-Abänderungen gegenüber der parentalen HPV-18-L1-Sequenz kodiert.
Zur Erzeugung des Gens mit der Bezeichnung 18/45 XN wurde ein PCR-Vorwärtsprimer konstruiert, um ein XbaI in das HPV-45-L1-Gen durch Veränderung des C in Position 120 in T und des C in Position 121 in A zu platzieren. Der Rückwärtsprimer war so konstruiert, dass eine NcoI-Stelle in das HPV-45-L1-Gen platziert wurde, indem man das A in der Nucleotidposition 624 gegen ein C austauschte. Ein Fragment mit 502 Basenpaaren wurde unter Verwendung dieser Primer und von HPV-45-L1 als Matritze durch PCR amplifiziert. Das erhaltene Amplicon wurde mit NcoI und XbaI verdaut. Das pFB-18-L1-Plasmid wurde mit XbaI und HindIII verdaut und das 5,8 kb-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das 5,8 kb-Fragment wurde mit dem 502 bp-PCR-Produkt, das mit XbaI und NcoI verdaut worden war, ligiert. Der erhaltene Klon bestand aus dem HPV-18-L1-Gen, wobei die Nucleotide 120 bis 623 durch HPV-45-L1 ersetzt waren.
Zur Erzeugung des Gens mit der Bezeichnung 18/45-NB wurde ein PCR-Vorwärtsprimer konstruiert, um eine NcoI-Stelle in das HPV-45-L1-Gen unter Ersatz eines C in Position 624 zu platzieren. Der Rückwärtsprimer benötigte keine Basenänderungen, da das Wildtyp-HPV-45-L1-Gen eine BamHI-Stelle enthielt. Daher wurde der Rückwärtsprimer, der zur Erzeugung des HPV-45-L1-Gens von voller Länge verwendet wurde, mit dem NcoI-Vorwärtsprimer verwendet, um ein Fragment mit 900 Basenpaaren durch PCR zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und BamHI verdaut und das Fragment mit 702 Basenpaaren wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und mit dem 5,6 kb-Fragment des pFB-18-L1-Plasmids, das mit NcoI und BamHI verdaut worden war, ligiert. Der erhaltene Klon enthielt das HPV-18-L1-Gen, wobei die Nucleotide 624–1327 durch das HPV-45-L1-Gen ersetzt waren.
Zur Erzeugung des Gens mit der Bezeichnung 18/45-BH wurde das pFB-18-L1-Plasmid mit BamHI und HindIII verdaut und das 6 kb-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das pFB-45-L1-Plasmid wurde ebenfalls mit BamHI und HindIII verdaut und das 0,2 kb-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Die 6 kb- und 0,2 kb-Fragmente wurden ligiert, um das Plasmid mit einem Gehalt an dem HPV-18-L1-Gen zu erhalten, wobei die Nucleotide 1328 bis 1524 durch das HPV-45-L1-Gen ersetzt waren.
Rekombinante Baculoviren, die für die verschiedenen L1-Gene kodierten, wurden unter Verwendung des Bac-to-Bac-Systems (Life Technologies, Rockville, MD) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erzeugt.
HPV-18- und HPV-45-Neutralisationstests:
Antiseren gegen HPV-18-VLPs, HPV-45-VLPs und chimäre HPV-18/45-VLPs wurden in Swiss Webster-Mäusen erzeugt. Die Mäuse (5 Tiere pro Gruppe) erhielten eine subkutane Injektion von 2 g VLPs, die an Aluminiumhydroxid-Adjuvans adsorbiert waren (Alhydrogel^®, E. M. Sergeant Pulp and Chemical Co., Inc., Clifton, NJ), in den Wochen 0 und 3 und Serumproben wurden in der Woche 5 gewonnen. Um festzustellen, ob die in den Mäusen erzeugten Antiseren zur Neutralisation von HPV-18- und HPV-45-Virus befähigt waren, wurde die Fähigkeit der Antiseren zum Blockieren der Expression einer spezifischen HPV-18- oder HPV-45-gespleißten mRNA in einer humanen Zelllinie (HaCaT) getestet.
HaCaT, eine immortalisierte humane Keratinozytenzelllinie (Boukamp et al, J. Cell Biol., Bd. 106 (1988), S. 761–771) wurde von Dr. Norbert Fusenig bereitgestellt. Zellen wurden in DMEM (LifeTechnologies), das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) ergänzt war, in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. HPV-18- oder HPV-45-Virusmaterial (bereitgestellt von Craig Meyers, Abstract, 18^th International Papillomavirus Conference) wurde 30 Sekunden auf Eis mit Ultraschall behandelt. Die Materialien wurden sodann im Verhältnis von 1:800 für HPV-18 oder 1:500 für HPV-45 in Medium verdünnt und mit Antiseren, die seriell 10-fach in Medium auf ein Endvolumen von 0,5 ml verdünnt worden waren, vermischt. Das Virus/Antiserum-Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Medium wurde von den HaCaT-Zellen abgesaugt und das Virus/Antiserum-Gemisch wurde in die Vertiefung gegeben. Als Kontrolle wurde eine Vertiefung mit Zellen auf jeder Platte mit 0,5 ml Medium ohne Virus versetzt. Die Zellen wurden einer 48-ständigen gemeinsamen Züchtung bei 37°C mit den Virus/Antiserum-Gemischen unterzogen, wonach mRNA aus den Zellen unter Verwendung des mRNA-Abfangkits (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) gereinigt wurden. Das Medium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen wurden 2-mal mit 0,5 ml eiskaltem 1 × PBS gewaschen. Die letzte Waschflüssigkeit wurde von den Zellen abgesaugt und 0,25 ml Lysispuffer wurde in jede Vertiefung gegeben. Sodann wurde das Zelllysat in ein RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die Zelllysate wurden einer 2-minütigen Ultraschallbehandlung in einem Cup-Horn-Ultraschallgerät auf Eis unterzogen, um die Viskosität des Lysats zu verringern. Biotinyliertes oligo-dT wurde 1:4 mit Nuclease-freiem H₂O verdünnt und 1 μl wurde zu jedem Lysat gegeben. Die Proben wurden 10 Minuten bei 42°C inkubiert, um eine Anlagerung des oligo-dT an die mRNA zu ermöglichen. Ein 50 μl-Aliquotanteil des Lysats wurde auf ein mit Streptavidin beschichtetes PCR-Röhrchen übertragen und 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Lysate wurden von den PCR-Röhrchen entfernt und verworfen. Die in den Röhrchen abgefangene RNA wurde 3-mal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen. Überschüssiger Waschpuffer wurde aus den Röhrchen mit Mikropipettenspitzen entfernt. Die Fähigkeit der Antiseren zur Blockade der Expression von HPV-18- und HPV-45-spezifischer, gespleißter mRNA wurde durch reverse Transcriptase(RT)-PCR bestimmt. RT-Reaktionen wurden unter Verwendung der Reagenzien des First Strand cDNA-Kits (Roche Molecular Biochemicals) durchgeführt. Ein Mastergemisch wurde so hergestellt, dass jedes Reaktionsgemisch 5 μl 10 × Puffer, 5 μl dNTPs, 10 μl MgCl₂, 1 μl Gelatine, 2 μl RNase-Inhibitor, 2 μl AMV-RT in einem Gesamtvolumen von 50 μl enthielt. 50 μl-Aliquotanteile des Mastergemisches wurden auf die PCR-Röhrchen, die die abgefangene mRNA enthielten, übertragen. Proben wurden in einen Thermozykler gegeben und 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Das cDNA-Reaktionsgemisch wurde aus dem PCR-Röhrchen entfernt und verworfen. Die in den PCR-Röhrchen abgefangene cDNA wurde mit 200 μl Waschpuffer gewaschen. Eine verschachtelte PCR war zum Nachweis der HPV-E1-E4-cDNA erforderlich. Die erste Amplifikationsrunde wurde durch Zugabe eines PCR-Gemisches zur abgefangenen cDNA durchgeführt, wobei 5'-GTTGTGTATGTGTTGTAAGTGTGA-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 786–810 im HPV-18-Genom) als Vorwärtsprimer und 5'-GTCCACAATGCTGCTTCTCCG-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 3580–3600 im HPV-18-Genom) als Rückwärtsprimer für 40 PCR-Zyklen verwendet wurden. 10% des PCR-Gemisches der ersten Runde wurden für verschachtelte Reaktionen mit 5'-GAATTGAGCTAGTAGAAAGCT-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 816–840 im HPV-18-Genom) als verschachteltem Vorwärtsprimer und von 5'-TCCACAGTGTCCAGGTCGTGT-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 3666–3575 im HPV-18-Genom) als verschachteltem Rückwärtsprimer für 40 PCR-Zyklen verwendet. Ein ähnlicher Satz von verschachtelten PCRs wurde zum Nachweis der HPV-45-E1-E4-gespeißten Message verwendet. 40 PCR-Zyklen wurden an der cDNA, die aus mit HPV-45 infizierten HaCaT-Zellen synthetisiert worden war, unter Verwendung von 5'-GAGCTTACAGTAGAGAGCTCG-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 806–826 im HPV-45-Genom) als Vorwärtsprimer und von 5'-TGTTACCACTACACACTTTCCTTC-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 3613–3636 im HPV-45-Genom) als Rückwärtsprimer durchgeführt. Die verschachtelte Amplifikation wurde unter Verwendung von 10% des ersten PCR-Gemisches als Matritze und unter Verwendung von 5'-GCAGAGGACCTTAGAACACTA-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 827–847 im HPV-45-Genom) als verschachteltem Vorwärtsprimer und von 5'-GAACACAGGAGCGGGTTGTGC-3' (positioniert an den Nucleotidpositionen 3572–3592 im HPV-45-Genom) als verschachteltem Rückwärtsprimer für 40 Zyklen durchgeführt. Als Kontrolle zum Nachweis, dass der Test zum Erfassen von aus HaCaT-Zellen extrahierter mRNA befähigt war, wurde ein zusätzlicher Satz von Primern, die spezifisch für zelluläres -Actin waren, in das PCR-Gemisch aufgenommen. Bei dem im ersten Reaktionsgemisch enthaltenen Vorwärtsprimer handelte es sich um 5'-GAACCCCAAGGCCAACCGCGA-3' und beim Rückwärtsprimer um 5'-CCACACAGAGTACTTGCGCTCAGG-3'. Beim Vorwärtsprimer im verschachtelten Reaktionsgemisch handelte es sich um 5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3' und beim Rückwärtsprimer um 5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'. Sämtliche PCR-Reaktionsgemische enthielten 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 125 ng jeweils an Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer und 2,5 Einheiten Tag-Polymerase (PE-Biosystems) in einem Endvolumen von 50 μl. Das Temperaturprofil für sämtliche Reaktionen war: 2 min bei 95°C, gefolgt von 40 Zyklen für 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 60°C, 30 Sekunden bei 72°C und einer endgültigen 10-minütigen Erweiterung bei 72°C.
Sämtliche PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an ein 2 Agarosegel in 1 × TBE getrennt und durch Ethidiumbromid-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
Beispiel 1
Chimäre HPV-18/45-VLPs, denen die J4- und 195-Epitope fehlen, lösen starke neutralisierende Antikörperreaktionen gegen beide virale Typen aus.
HPV-18- und HPV-45-L1-VLPs wurden in Insektenzellen unter Verwendung von rekombinanten Baculoviren exprimiert. Die VLPs wurden durch CsCl- und Saccharose-Gradienten gereinigt und als Beschichtungsantigene in einem ELISA-Test verwendet. In Kaninchen gegen ein Panel von HPV-VLP-Typen erzeugte Antiseren wurden auf ihre Reaktivität mit den HPV-18- und HPV-45-VLPs getestet. Wie früher berichtet (White et al., 17^th International Papillomavirus Conference), zeigt anti-HPV-45-Serum eine starke Kreuzreaktion mit HPV-18-VLPs, während Antiseren gegen verschiedene andere HPV-VLP-Typen (-11, -16, -18, -33, -35, -39) eine geringe oder gar keine Kreuzreaktivität zeigen (2A). Ferner reagierte, wie in 2B gezeigt, anti-HPV-18-Serum besonders stark mit HPV-45-VLPs, verglichen mit den Antiseren gegen andere VLP-Typen. Jedoch war die Fähigkeit des anti-HPV-18-VLP-Serums zur Kreuzreaktion mit den HPV-45-VLPs weniger ausgeprägt als die Bindung des anti-HPV-45-VLP-Serums an die HPV-18-VLPs.
Von Antiserum gegen HPV-45 wurde gezeigt (White et al., 17^th International Papillomavirus Conference), dass es in vitro HPV-18 neutralisiert, während Antiseren gegen eine Vielzahl von anderen HPV-Typen eine HPV-18-Infektion nicht hemmten (3). Diese Ergebnisse korrelieren mit der Bindungsreaktivität der Antiseren, wie aus 2A ersichtlich ist. Eine Titration der relativen Neutralisationsaktivität der beiden Antiseren wurde durchgeführt. Wie in 4 gezeigt, war das anti-HPV-45-Serum 100-fach weniger wirksam in seiner Fähigkeit zur Neutralisation von HPV-18, als das homotypische Antiserum. Zum Testen der Fähigkeit verschiedener anti-HPV-VLP-Seren zur Neutralisation von HPV-45 wurde ein in vitro-HPV-45 Infektiositätstest entwickelt, der ein virusspezifisches Transkript nachweist (5). Die Ergebnisse zeigten, dass nur anti-HPV-45 und HPV-18 eine HPV-45-in vitro-Infektion hemmten. Somit liegen kreuzneutralisierende Epitope sowohl gegenüber HPV-18 als auch gegenüber HPV-45 an den beiden L1-Molekülen vor.
Zur Untersuchung der typspezifischen und kreuzneutralisierenden Aktivitäten sowohl gegen HPV-18 als auch gegen HPV-45 wurden vier verschiedene chimäre HPV-18/45-L1-Moleküle durch Ersatz von Segmenten des HPV-18-Moleküls durch analoge Regionen des HPV-45-L1-Gens erzeugt. Die chimären L1-Moleküle wurden aus rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Insektenzellen durch CsCl- und Saccharose-Gradientenzentrifugation gereinigt. Eine Analyse der verschiedenen gereinigten chimären L1-Proteine durch Elektronenmikroskopie ergab, dass alle neuen L1-Moleküle VLPs bildeten (Daten nicht aufgeführt).
Die Bindung verschiedener anti-HPV-18 neutralisierender mAbs und eines anti-HPV-45 an die verschiedenen chimären HPV-18/45-VLPs wurde getestet (7). Unter Verwendung von HPV-18 neutralisierenden mAbs wiesen wir nach, dass es mindestens drei neutralisierende Epitope an HPV-18-VLPs gibt (R5, J4 und 195). Die R5- und J4-Epitope unterschieden sich voneinander, während das 195-Epitop teilweise sowohl mit der R5- als auch mit der J4-Bindungsstelle überlappt (Tabelle 2). In diesem Experiment banden wir HPV-18-VLPs an aktivierte CM5(BIACORE)-Sensorchips. Die Bindung von mAb an die immobilisierten VLPs wurde als eine Massezunahme gemessen (Resonanzeinheiten (RU)). Man ließ einen ersten mAb an die VLPs binden, bis eine Sättigungsmenge gebunden war. Anschließend wurde der zweite mAb auf den Chip gebracht. Eine unabhängige Wechselwirkung der beiden mAbs zeigte sich durch eine starke Zunahme der RU. Im Gegensatz dazu wurde ein zweiter mAb, der an eine gleiche Stelle wie der erste mAb band, an der Bindung gehindert, woraus sich eine geringe oder gar keine Zunahme der RU ergab. Wenn beispielsweise der erste und der zweite mAb gleich waren, ist die Bindungsstelle identisch und eine weitere Bindung durch den zweiten Antikörper wurde signifikant verringert oder nicht nachgewiesen. Dieser Typ von Experiment, bei dem der erste und der zweite Antikörper identisch waren, ist in den Spalten A, B und C dargestellt, wo eine wiederholte Einführung von mAbs 195, J4 und R5 auf den Chip zu einer Zunahme von 0%, 5,5% bzw. 21% führte. Im Gegensatz dazu erhöhte in Gegenwart von J4 der mAb R5 die RU-Einheiten auf ähnliche Weise wie in dem Fall, bei dem ein Kontrollantikörper als erster Antikörper verwendet wurde (Spalte D). Somit zeigen diese Daten, dass die mAbs R5 und J4 an verschiedene Stellen binden. Das Epitop für mAb 195 überlappt sich partiell mit den Epitopen, die von den mAbs R5 und J4 erkannt werden.
Dies wird durch die partielle Hemmung (54% bzw. 61% für J4 und R5) der mAb-195-Bindung in Gegenwart einer J4- oder R5-Bindung gezeigt (Spalten E und F). Tabelle 2 Kompetitive Bindungsstudien mit HPV-18-neutralisierenden mAbs unter Durchführung von Biosensor-Technologie

A B C D E F

Erster Antikörper^a 195 J4 R5 J4 J4 R5

Zweiter Antikörper 195 J4 R5 R5 195 195

% maximale Bindung des zweiten Antikörpers^b 0% 5,5% 21% 91,3% 54% 61,1%

^aDer erste Antikörper wird dem VLP-gekuppelten Chip zugeführt, bis die Sättigungsmenge gebunden ist. Anschließend lässt man den zweiten Antikörper an den Chip binden.
^bDie prozentuale Bindung an den zweiten Antikörper wird als prozentualer Anteil der gesamten Bindung (RU) angegeben, wenn ein Kontrollantikörper (V5-anti-HPV-I6-VLP) als erster Antikörper verwendet wurde.

Wie in 7 dargestellt, erkennen zwei der drei HPV-18-neutralisierenden mAbs HPV-45 nicht, während der mAb R5 mit dem heterotypischen VLP eine geringe Kreuzreaktion eingeht. Überraschenderweise behielten drei der vier chimären HPV-18/45-VLPs, einschließlich des XN-Chimären, bei dem die Aminosäuren 53–194 ausgetauscht sind, die Bindungsaktivität mit sämtlichen drei HPV-18-neutralisierenden mAbs. Im Gegensatz dazu konnte die NB-Chimäre, bei der die Aminosäuren 267–442 ausgetauscht sind, J4 und 195 nicht binden, behielt aber die R5-Bindungsstelle.
Ein HPV-45-neutralisierender mAb wurde bisher nicht identifiziert. Jedoch erkennt der E30-mAb ein Konformationsepitop (persönliche Mitteilung, Neil Christensen). Der mAb E30 erkennt bevorzugt HPV-45-VLPs, bindet aber an HPV-18-VLPs (7). Der E30-mAb band an die chimären VLPs, reagierte aber stärker mit den HPV-45-VLPs.
Gruppen von Swiss-Mäusen (5 Mäuse/Gruppe) wurden mit drei der vier verschiedenen chimären VLPs sowie mit HPV-18- und HPV-45-VLPs, die an Aluminiumhydroxid adsorbiert waren, immunisiert. Vereinigte Serumproben, die nach der zweiten Immunisierung gewonnen worden waren, wurden durch ELISA auf die Aktivität mit HPV-18- und HPV-45-VLPs einem Screening unterzogen. Wie in 8 dargestellt, lösten sowohl die XN als auch die NB-Chimäre, bei denen die Aminosäuren 53–194 bzw. 267–442 von HPV-18-L1 durch die analogen Regionen von HPV-45-L1 die Bildung von Antiseren aus, die stark sowohl mit HPV-18- als auch mit HPV-45-VLPs reagierten. Im Gegensatz dazu reagierten Antiseren gegen die BH-Chimäre, bei der das C-terminale Ende (Aminosäuren 449–506) von HPV-18-L1 durch die analoge Region von HPV-45-L1 ersetzt war, nur schlecht mit HPV-45-VLPs. Zusätzlich bestand eine Bevorzugung des anti-HPV-18-VLP-Serums für das Homotyp-VLP, während das anti-45-Antiserum gleichmäßiger mit den beiden parentalen L1-Sequenzen reagierte.

Die vereinigten Serumproben nach der zweiten Immunisierung entweder mit HPV-18-, HPV-45- oder den drei chimären VLPs wurden auf ihre Neutralisationsaktivität sowohl beim HPV-18- als auch beim HPV-45 in vitro-Infektiositätstest getestet (Tabelle 3). HPV-18 und HPV-45 wurden mit Mäuseserum vorinkubiert, das mit seriellen log 10-Verdünnungen von anti-HPV-18-VLP-Serum, anti-HPV-45-VLP-Serum und antichimärem VLP-Serum verdünnt war und zwar vor der Zugabe zu Keratinozyten. HPV-18- und HPV-45-E1-E4-spezifische und zelluläre actinspezifische RT-PCR-Produkte wurden mit RNA erzeugt, die aus den infizierten Zellen isoliert worden war. Der Neutralisationstiter wird als die höchste Serumverdünnung angegeben, die den Nachweis der virusspezifischen Botschaft hemmte. Die Fähigkeit des HPV-45-Antiserums zur Neutralisation des Virus vom heterologen Typ waren 1 log geringer als die des homologen Virustyps. Der Unterschied ist für anti-HPV-18-Antiseren noch größer, die HPV-45 für den GU1-Stamm nur mit 1:100 neutralisierten, gegenüber einem Neutralisationstiter von 1:10 000 beim homologen Virustyp. Die Fähigkeit des anti-18/45-Serums zur Neutralisation von HPV-18 und HPV-45 ist gleichwertig. Tabelle 3 Neutralisation von HPV-18 und HPV-45 durch antichimäre VLP-Seren

Antiserum	HPV-18-Neutralisationstiter	HPV-45-Neutralisationstiter
18-L1-GU1	10^–4	10^–2
18-L1-GU2	10^–4	< 10^–2
45-L1	10^–3	10^–4
18/45 XN	10^–2	10^–3
18/45 NB	10^–4	10^–4
18/45 BH	> 10^–4	< 10^–2

Die Ergebnisse zeigen, dass zwar die anti-HPV-18-VLP-Seren die HPV-18-Infektion in hohen Verdünnungen (1:10 000) neutralisierten, dass aber der Neutralisationstiter gegen HPV-45 bei einem Experiment unter der Nachweisgrenze lag und bei einem zweiten Experiment nur 1:100 betrug. Im Gegensatz dazu neutralisierte das anti-HPV-45-VLP-Serum in starkem Maße (Titer 1:10 000) den HPV-45-Virus und wies auch eine signifikante Neutralisationsaktivität (Titer 1:1 000) gegen eine in vitro-HPV-18-Infektion auf. Das Chimäre XN-18/45-L1-VLP löste relativ niedrige (1:100) HPV-18-Neutralisationstiter aus, verglichen mit HPV-18-VLP oder den chimären NB- und BH-L1-VLPs, die jeweils HPV-18-Neutralisationstiter von 1:10 000 auslösten. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Aminosäuren 53–194 (XN-Region) für die Bildung von HPV-18- Neutralisationsepitopen wichtig sind oder eine Rolle bei der richtigen Faltung der Epitope in anderen Regionen des HPV-18-L1-Moleküls spielen. Sämtliche drei HPV-18-Neutralisations-mAbs (R5, J5 und 195) banden an die chimären XN-18/45-L1-VLPs. Jedoch war die Reaktivität der R5- und J4-mAbs gegen dieses chimäre VLP relativ zum Bindungsgrad, der bei chimären BH-VLP oder beim nativen 18-VLP auftritt, verringert. Bisher wurde noch nicht festgestellt, ob die Verringerung der Bindung dieser beiden mAbs an das chimäre XN-VLP zur Verringerung der HPV-18-Neutralisationsaktivität betrug, oder ob andere, derzeit nicht identifizierte Neutralisationsstellen für HPV-18 im chimären Molekül verloren gegangen waren. Das XN-Chimäre war jedoch ebenfalls zur Auslösung von Neutralisationstitern (1:1 000) gegen HPV-45 in der Lage.
Im Gegensatz zu den chimären XN-18/45-L1-VLPs reagierten die chimären BH-VLPs stark mit sämtlichen drei HPV-18-neutralisierenden mAbs. Das chimäre anti-BH-VLP-Antiserum neutralisierte in starkem Maße (> 1:10 000) die HPV-18-in vitro-Infektion, zeigte aber keine nachweisbare Aktivität gegen eine HPV-45-Infektion. Somit löste dieses chimäre VLP, in dem nur der C-Terminus (Aminosäuren 449–506) von HPV-18-L1 durch die analoge Sequenz von HPV-45-L1 ersetzt war, die Bildung eines Antiserums mit ähnlichen Eigenschaften wie die der intakten HPV-18-L1-Sequenz aus.
Überraschenderweise handelte es sich beim chimären 18/45-L1-VLP, das ein Antiserum von hohem Titer sowohl gegen HPV-18 als auch gegen HPV-45 auslöste, um das chimäre NB-VLP. Bei diesen VLPs fehlt sowohl die 195-als auch die J4-Bindungsstelle, während das R5-Epitop erhalten ist. Ein Screening des chimären anti-NB-Antiserums sowohl beim HPV-18-als auch beim HPV-45-Neutralisationstest zeigte, dass das einzelne Antiserum beide Virustypen in hohen Verdünnungen von 1:10 000 neutralisierte. Diese Ergebnisse belegen erneut die Bedeutung der Aufrechterhaltung der N-terminalen Hälfte (Aminosäuren 1–194) von HPV-18-L1 in intaktem Zustand, um eine starke anti-HPV-18-Neutralisationsaktivität zu erreichen, und lassen darauf schließen, dass sich entweder die Neutralisationsepitope für HPV-45 in der C-terminalen Hälfte des L1-Moleküls befinden oder dass das chimäre L1-Molekül neue Neutralisationsepitope bildet, die zur Neutralisation beider Viren befähigt sind.
Die vorstehend vorgelegten Ergebnisse beweisen erstmals, dass es möglich ist, ein einzelnes chimäres L1-Molekül zu erzeugen, das Neutralisationsreaktionen von hohem Titer gegen zwei oder mehr HPV-Typen auslöst. Ein derartiges chimäres Konstrukt würde in erheblichem Umfang die Kosten für die Herstellung eines HPV-Impfstoffes mit breiter Schutzwirkung gegen eine Vielzahl von HPV-Typen verringern. Ferner können die chimären VLPs Serum-Screeningtests, die den Nachweis von Antikörpern gegen spezifische HPV-Typen anstreben, erleichtern.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimäres HPV-L1-Protein, das zur Auslösung von Antikörperreaktionen oder zellulären Reaktionen befähigt ist, die allgemein mit den Reaktionen vergleichbar sind, die durch zwei oder mehr individuelle HPV-Typen induziert werden, wobei das Protein mindestens drei Segmente umfasst, wobei die Segmente 1 und 2 benachbart sind und sich von verschiedenen HPV-Typen ableiten und die Segmente 2 und 3 benachbart sind und sich von verschiedenen HPV-Typen ableiten, wobei das Segment 1 die Aminosäuren 1-265 von HPV-18 enthält, das Segment 2 die Aminosäuren 265–442 von HPV-45 enthält und das Segment 3 die Aminosäuren 443–507 von HPV-18 enthält.
VLP, umfassend das chimäre HPV-L1-Protein von Anspruch 1.
Impfstoffzusammensetzung, umfassend das chimäre HPV-L1-Protein von Anspruch 1.
Gen, kodierend für das chimäre HPV-L1-Protein von Anspruch 1.
Gen nach Anspruch 4, umfassend das native HPV-18-L1-Gen, wobei die Nucleotide 624 bis 1327 durch die entsprechenden Nucleotide von HPV-45 ersetzt sind.
Baculovirus-Vektor, umfassend das Gen von Anspruch 4.
VLP von Anspruch 2, wobei das VLP zur Auslösung der Bildung von Antiserum befähigt ist, das mindestens zwei HPV-Typen in einer Verdünnung von 1:1000 neutralisiert.
VLP nach Anspruch 7, wobei das VLP zur Auslösung der Bildung von Antiserum befähigt ist, das mindestens zwei HPV-Typen in einer Verdünnung von 1:10000 neutralisiert.
Verwendung eines einzelnen Typs von chimärem HPV-L1-Protein nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion einer neutralisierenden Antikörperreaktion oder einer zellvermittelten Immunreaktion von hohem Titer gegen mindestens zwei HEV-Typen.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das durch die pharmazeutische Zusammensetzung erzeugte Antiserum mindestens zwei HPV-Typen in einer Verdünnung von mindestens 1:1000 neutralisiert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das durch die pharmazeutische Zusammensetzung erzeugte Antiserum mindestens zwei HPV-Typen in einer Verdünnung von mindestens 1:10000 neutralisiert.
Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, die mindestens ein korrekt gefaltetes, chimäres HPV-L1-Protein umfasst, wobei das mindestens eine chimäre HPV-L1-Protein neutralisierende Epitope für mindestens zwei HPV-Typen umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Impfen eines Subjekts gegen mindestens zwei Typen von HPV.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine chimäre Li-Protein auf der Oberfläche eines VLP exprimiert wird.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung, die HPV-VLPs umfasst, die mindestens ein chimäres Li-Protein nach Anspruch 1 aufweisen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Papillomavirus-Infektion, die durch mehr als einen HPV-Typ charakterisiert ist.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung, umfassend HPV-VLPs, die mindestens ein chimäres Li-Protein nach Anspruch 1 aufweisen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Papillomavirus-Infektion, die durch einen ersten HPV-Typ verursacht ist, gleichzeitig mit einer prophylaktischen Behandlung von mindestens einem weiteren Typ einer HPV-Infektion.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes oder einer therapeutischen Zusammensetzung vom Mehrfach-HPV-Typ, umfassend: (a) die Ligation von Bereichen der nativen L1-Gene, die für verschiedene Epitope kodieren, miteinander; (b) die Klonierung der ligierten Genbereiche in einen Expressionsvektor; und (c) die Expression des Vektors in einer Zelllinie, die die Bildung von VLPs nach Anspruch 2 ermöglicht, wobei die VLPs mindestens ein L1-neutralisierendes Epitop von mindestens zwei verschiedenen HPV-Typen gemäß der Definition in Anspruch 2 aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei eine PCR herangezogen wird, um kompatible überstehende Bereiche an den Enden von L1-Genbereichen zu erzeugen, um eine Ligation von Genbereichen im Anschluss an einen Restriktionsendonuclease-Verdau zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 16, ferner umfassend das Zerlegen und das Zusammensetzen des VLP, um den Einbau eines therapeutischen Mittels oder eines diagnostischen Mittels zu ermöglichen.
Verfahren zur Diagnose einer früheren oder aktuellen Papillomavirus-Infektion, umfassend (a) die Verwendung von Serum, das von einem Patienten mit einem Verdacht an einer früheren oder aktuellen Papillomavirus-Infektion isoliert worden ist; (b) die Exposition dieses Serums mit einem immobilisierten, chimären HPV-L1-Protein nach Anspruch 1, um eine Bindungswechselwirkung zwischen den HPV-L1-Epitopen und dem Antiserum zu ermöglichen, wobei gleichzeitig und getrennt davon die Exposition eines irrelevanten Antikörpers mit dem identischen chimären HPV-L1-Protein erfolgt; (c) das Waschen des immobilisierten chimären HPV-L1, so dass ungebundene Komponenten abgetrennt werden; (d) die Exposition eines markierten Reagenz, das spezifisch an Immunoglobuline des Patienten bindet, mit dem chimären HPV-L1-Protein; und (e) das Vergleichen der Menge der Markierung, die an jede Chimäre HPV-L1-Probe gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die chimären HPV-L1-Proteine an VLPs immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die chimären VLPs an Perlen, an der Oberfläche einer Gewebekulturschale oder an Zellen immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Anwesenheit von Antikörpern, die für mindestens zwei verschiedene HPV-Typen spezifisch sind, einem Screening unterzogen wird, wobei gleichzeitig zwei verschiedene markierte Reagenzien verwendet werden.