DE69933875T2

DE69933875T2 - Protein-verabreichungssystem, das dem menschlichen papillomavirus ähnliche partikel benützt.

Info

Publication number: DE69933875T2
Application number: DE69933875T
Authority: DE
Inventors: S. Robert Rahway LOWE; U. Kathrin Rahway JANSEN; G. Joseph Rahway JOYCE; L. William Rahway MCCLEMENTS; C. James Rahway COOK; Ching-Yee Jessica Rahway LING; P. Michael Rahway NEEPER
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: JP2002522056A; AU5469999A; DE69933875D1; AU753391B2; WO2000009157A1; EP1105157B1; CA2339324A1; CA2339324C; JP4563582B2; ATE344052T1; EP1105157A4; ES2275350T3; EP1105157A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abgabe eines Proteins an eine Zelle durch dessen Fusion mit einem modifizierten Papillomavirus-L2-Protein und Expression des fusionierten Proteins in einem virus-ähnlichen Partikel. Die Erfindung betrifft auch modifizierte Gene, welche für die Proteine codieren, die modifizierten virus-ähnlichen Partikel und Wirtszellen, welche die virus-ähnlichen Partikel enthalten. Das L2-Protein umfasst mindestens die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren, ist jedoch kürzer als 60% des Wildtyp-L2-Proteins.
Hintergrund der Erfindung
Humane Papillomaviren (HPVs) infizieren den Genitaltrakt und wurden mit verschiedenen Krebsarten und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Rekombinant hergestelltes L1-Protein und L1+L2-Protein können selbst assemblieren, um virus-ähnliche Partikel (VLPs) zu bilden. Diese VLPs sind immunogen und können die Basis eines Vakzins bilden.
Gegenwärtig gibt es jedoch weder ein bekanntes prophylaktisches Vakzin noch eine ideale therapeutische Behandlung einer durch HPV verursachten Erkrankung. Eine Immunreaktion auf andere HPV-Proteine, die im Rahmen von VLPs mit abgegeben werden, wie z.B. frühe Proteine oder Gene von HPV, könnte die schützende Wirkung eines Vakzins erhöhen. Kürzlich wurden in einem Artikel von Greenstone et al. VLPs beschrieben, bei denen das L2-Protein modifiziert wurde, um ein Fusionsprotein zwischen Volllängen-L2 und HPV-E2 oder -E7 zu bilden (Greenstone et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805). Die Fusionsproteine assemblierten zusammen mit L1 zu VLPs, welche morphologisch und hinsichtlich ihres Vermögens zur Hervorrufung neutralisierender Antikörper von L1-VLPs nicht unterscheidbar erschienen. Ferner wurden in Tumor-Herausforderungsmodellen Mäuse, die mit chimären L1+L2:E7-Fusions-VLPs geimpft wurden, befunden, Mäuse vor E7-exprimierenden Tumoren zu schützen.
Es gibt jedoch potentielle Probleme, die mit der Verwendung eines Volllängen-L2 als Fusionspartner verbunden sind. Zunächst hat aufgrund von Größenbeschränkungen ein vollständiges L2 als Fusionspartner eine begrenzte Kapazität, große Fusionsproteine zu akzeptieren. Beispielsweise führt die Fusion von E1 mit intaktem L2 von CRPV zu morphologisch abweichenden VLPs. Ferner wird die Expression eines Volllängen-L2 höchstwahrscheinlich die Aktivität von enzymatisch aktiven Proteinen beeinflussen und kann deshalb seine Brauchbarkeit zum Transport funktioneller Proteine in eine Zelle begrenzen. Die minimalen Sequenzanforderungen an L2, welche eine Coassemblierung mit L1 zu VLPs ermöglichen, sind unbekannt und das Vermögen zur Deletion signifikanter Abschnitte von L2 unter Erhalt der Kapazität zur Assemblierung mit L1 ist ebenfalls unbekannt.
Es wäre wünschenswert, ein minimales L2-Fusionsprotein bereitzustellen, welches immer noch die Proteinabgabefunktion eines Volllängen-L2 behält, jedoch größere und funktionell aktive Proteine abgeben kann.
Sun et al., Virology, 213, 321-327, 1995, offenbaren, dass sowohl das C-terminale mutmaßliche Kernlokalisierungssignal als auch die N-terminalen DNA-Bindungssequenzen des L2-Proteins beim gezielten Transport von Proteinen in den Kern funktionell sind.
Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abgabe eines Peptids oder Proteins in vitro an eine Zelle, umfassend die Schritte: a) Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz, die das Peptid oder Protein codiert, welches abgegeben werden soll, an ein modifiziertes Papillomavirus (PV)-L2-Gen, um ein Fusionsproteingen zu erzeugen, worin das L2-Gen weniger als die vollständige Länge aufweist und mindestens die Codierungssequenzen für die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren (As) von L2 umfasst, aber weniger als 60% des Wildtyp-L2-Proteins codiert, b) Exprimieren des Fusionsproteingens in einer Wirtszelle, um ein Fusionsprotein zu erhalten, c) in Kontakt bringen des Fusionsproteins mit einem PV-L1-Protein unter Bedingungen, bei denen das Fusionsprotein und das L1-Protein sich spontan verbinden, um ein virus-ähnliches Partikel (VLP) zu bilden, und d) Abgabe des VLP an eine Zelle.
Diese Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, codierend für ein Fusionsprotein, das ein weniger als Volllängen-L2-Protein fusioniert mit einem Gen, das für ein Peptid oder Protein von Interesse codiert, umfasst, und diese Fusionsproteine. Die L2-Fusionsproteine, welche weniger als ein Volllängen-L2 umfassen, umfassen mindestens die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren von L2, codieren jedoch für weniger als 60% des Wildtyp-L2-Proteins. Zusätzlich betrifft diese Erfindung die virus-ähnlichen Partikel (VLPs), welche das Fusionsprotein enthalten, und zelluläre Wirte, welche diese VLPs enthalten.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Assemblierung des minimalen L2-DNA-Konstrukts von nativem HPV16-L2. Die Codierungssequenz von HPV16-L2, in kleinen Kursivbuchstaben gezeigt, diente als Matrize für PCR-Amplifizierungen. Die Initiator- und Terminatorcodons sind in Großbuchstaben dargestellt. Sense-Primer, I und A, sind oberhalb der Matrize gezeigt, Anti-Sense-Primer, C und D, darunter. Neue Sequenzinformation, eingeführt mittels PCR-Amplifizierung, ist in Großbuchstaben gezeigt. Die komplementären Sequenzen in den Primern A und C sind unterstrichen.
2 ist die Aminosäuretranslation des HPV16-Minimal-L2-Gens. Aminosäureänderungen, welche aus der Einführung des Polylinkers, enthaltend nur einmal vorkommende Restriktionsstellen NotI, SacI und XhoI, resultieren, sind durch kursive Buchstaben angezeigt. Die Aminosäuren 1-69 werden vom Aminoterminus von L2 bereitgestellt. Ein Glutaminsäurerest ist an Position 70 hinzugefügt. Die Aminosäuren 71-154 werden vom Carboxyterminus von L2 bereitgestellt. An Position 72 ersetzt ein Glutaminsäurerest ein Serin, das in dem Volllängen-Wildtyp-L2 gefunden wird.
3 ist ein Westernblot von immunpräzipitierten Hefe-Lysaten, welcher die Co-Immunpräzipitation von chimären L2-E-Proteinen mit HPV16L1-VLP-spezifischem Mab H16:V5 zeigt. Das linke Feld zeigt einen mit Anti-E1 angefärbten Immunoblot der Minimal-L2:E1-Fusions (mL2:E1)-Klone E1-121 bis E1-124, die mL2:E2-Probe E2-23 und Proben ohne Lysat sind Spezifitätskontrollen. Das mittlere Feld zeigt einen mit Anti-E7 angefärbten Immunoblot der Minimal-L2:E7-Fusions (mL2:E7)-Klone E7-125 bis E7-127 und E7-31; die mL2:E2-Probe E2-23 und Proben ohne Lysat sind Spezifitätskontrollen. Das rechte Feld zeigt einen mit Anti-E2 angefärbten Immunoblot der mL2:E2-Fusionsklone E2-33a, E2-33b; die Probe E2-33b ohne H16:V5-Einfang-Antikörper als Kontrolle ist ebenfalls gezeigt und YP3#1 ohne E-Protein als Kontrolle ist als mL2-Vektor gezeigt.
4 ist eine Tabelle, welche die Beta-Galactosidase-Aktivitäten von transient transfizierten Zelllysaten aufführt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren dieser Erfindung kann mit praktisch jedem Papillomavirus-Stamm verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das HPV einer der Stämme, welcher mit Genitalwarzen und/oder Genitaltumoren assoziiert ist, und kann insbesondere aus der Gruppe ausgewählt sein, welche besteht aus: HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52 und HPV56.
Virus-ähnliche Wildtyp-Partikel sind überwiegend aus L1-Protein aufgebaut, obwohl sie eine kleinere Menge an L2-Protein enthalten. Gemäß dieser Erfindung wurden die VLPs modifiziert, so dass sie immer noch Wildtyp-L1-Protein enthalten, jedoch nunmehr ein deletiertes L2-Fusionsprotein anstelle von Wildtyp-L2 enthalten. Das L2-Segment des Fusionsproteins ist substantiell weniger als das Volllängen-L2-Protein; es enthält Peptiddomänen vom Aminoterminus und vom Carboxyterminus, welche für die Assoziation mit L1-Proteinen und Inkorporation in VLPs erforderlich sind, mindestens, für den HPV-Typ 16, die Codierungssequenzen für die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren (As) von L2. Die L2-Sequenz kann größer als dies sein, so lange sie weniger als Wildtyp ist. Die Gesamtmenge der vorhandenen L2-Aminosäuren beträgt weniger als 60% des Wildtyps, bevorzugter weniger als etwa 50% des Wildtyps und noch bevorzugter weniger als etwa 35% des Wildtyps. Dieses modifizierte L2 wird in der Beschreibung und den Ansprüchen durchgehend als "Minimal L2"-Gen und -Protein bezeichnet werden.
Praktisch jedes Protein oder Peptid kann mit dem Minimal-L2-Protein fusioniert werden, um das Fusionsprotein herzustellen. HPV-Proteine, welche normalerweise nicht Teil des VLP sind, sind bevorzugt, falls das Ziel darin besteht, ein VLP herzustellen, welches eine erhöhte Immunreaktion im Vergleich zu Wildtyp-VLP induziert. Für diese Anmeldung umfassen diese Proteine, sind jedoch nicht beschränkt auf, HPV: E1, E2, E3, E4, E5, E6 und/oder E7, HIV-TAT und/oder Beta-Lactamase. Besonders bevorzugte Proteine sind E1, E2 und E7. Diese Fusionsproteine und die dafür codierenden Nukleinsäuren bilden einen weiteren Aspekt dieser Erfindung.
Einer der Vorteile dieser Erfindung besteht darin, dass der Fusionspartner ein großes Protein sein kann. Beispielsweise kann der Fusionspartner über 50 kD, über 60 kD und sogar über 70 kD aufweisen. Diese erhöhte Größe erlaubt die Einführung der meisten bekannten Proteine und macht dieses Abgabesystem besonders nützlich nicht nur für HPV-verwandte Proteine wie oben beschrieben, sondern auch für Proteine, welche nicht mit einer Behandlung einer HPV-Erkrankung assoziiert sind.
Somit umfasst diese Erfindung Verfahren zur Verwendung eines modifizierten VLP als allgemeinen Transporter, welcher die Abgabe praktisch jedes gewünschten Proteins oder Peptids in Zellen steuert. In einer Ausführungsform werden Reporter- oder regulatorische Proteine an Zellen abgegeben als Maß für die VLP-Aufnahme durch Zellen. Ein Beispiel von Fusionskandidaten, welches keineswegs beschränkend ist, ist das regulatorische Protein von HIV, bekannt als TAT. Es wurde gezeigt, dass die Fusionen von TAT mit dem Minimal-L2 sowohl die Proteinfunktion behalten als auch VLPs mit L1 bilden. Dies ist von Nutzen bei der Etablierung von Neutralisations-Assays.
Das Fusionsprotein und L1-Protein können gleichzeitig hergestellt werden durch Transformation einer ausgewählten Wirtszelle mit Genen, welche für die Proteine codieren, unter Bedingungen, welche die Expression der beiden Gene erlauben. Allgemeine Techniken, die Gene für L1 und L2 und Verfahren zur rekombinanten Expression von L1- und L2-Proteinen sind im Stand der Technik bekannt und können angewandt werden. Bevorzugte Wirtszellen umfassen Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen und E. coli.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird Hefe mit Plasmid-DNA, enthaltend die Gene, welche L1 und die L2-Fusion codieren, unter der Kontrolle bekannter Hefe-Promotoren, wie z.B. die Hefe-Gal 1- und -Gal-10-Promotoren, transformiert. Die Expression eines jeden Genprodukts wird durch Zugabe von Galactose zu dem Wachstumsmedium induziert und die VLPs werden aus den induzierten Zelllysaten isoliert.
Alternativ kann der eine Satz von Wirtszellen zur Expression von nur L1-Protein transformiert werden und ein zweiter Satz von Wirtszellen kann zur Expression des L2-Fusionsproteins dieser Erfindung transformiert werden. Die jeweiligen Proteine werden geerntet, gegebenenfalls einem Reinigungsschritt unterworfen und in Kontakt gebracht, so dass VLPs, welche das Fusionsprotein enthalten, gebildet werden.
Die modifizierten VLPs machen noch einen weiteren Aspekt dieser Erfindung aus. Diese VLPs können als Vakzin oder als Teil eines therapeutischen Behandlungsplans verabreicht werden. Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um PV-Infektionen zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z.B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus. Allgemein werden die Zusammensetzungen im Dosierungsbereich von etwa 1 μg bis etwa 1 mg verabreicht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Routen, wie z.B. subkutan, topisch, oral, mukosal, intravenös und intramuskulär, verabreicht werden.
Die Vakzine der Erfindung umfassen DNA, RNA oder Proteine, die von der DNA codiert werden, welche die amino-terminalen und carboxy-terminalen Abschnitte von L2 enthält, welche die Inkorporation von damit fusionierten Proteinen in VLPs gestatten. Solche Vakzine sind auch sicher genug, um ohne Gefahr einer klinischen Infektion verabreicht zu werden, haben keine toxischen Nebenwirkungen, können auf einer effektiven Route verabreicht werden, sind stabil und mit Vakzin-Trägern kompatibel.
Die Vakzine können auf einer Vielfalt von Routen, wie z.B. oral, parenteral, subkutan, mukosal, intravenös oder intramuskulär, verabreicht werden. Die verabreichte Dosis kann mit dem Zustand, Geschlecht, Gewicht und Alter des Individuums, dem Verabreichungsweg und dem PV-Typ des Vakzins variieren. Das Vakzin kann in Dosierungsformen wie Kapseln, Suspensionen, Elixieren oder flüssigen Lösungen verwendet werden. Das Vakzin kann mit immunologisch akzeptablen Trägern oder Adjuvanzien oder anderen Exzipienten formuliert werden.
Die Vakzine werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d.h., in ausreichenden Mengen, um eine immunologisch schützende Antwort hervorzurufen. Die therapeutisch wirksame Menge kann entsprechend dem PV-Typ variieren. Das Vakzin kann in einzelnen oder mehreren Dosen verabreicht werden.
Die gereinigten Proteine der vorliegenden Erfindung können zur Formulierung immunogener Zusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen sind bei Einführung in einen geeigneten Wirt in der Lage, eine Immunreaktion in dem Wirt zu induzieren.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele werden zur besseren Erläuterung der Erfindung präsentiert.
BEISPIEL 1
Konstruktion des modifizierten L2-Gens
Das modifizierte HPV16-L2-Gen wurde konstruiert aus den codierenden Sequenzen für die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren (As) von HPV16-L2, welche durch einen synthetischen Polylinker, der nur einmal vorkommende NotI-, SacI- und XhoI-Restriktionsendonuklease-Restriktionsstellen einführte und zur Insertion eines Glutaminsäurerests und der Mutation eines Serinrests zu Glutaminsäure führte (1), im Leserahmen fusioniert wurden.
PCR-Primer (Midland Certified Reagents; Midland, TX) wurden konstruiert zur Amplifizierung von L2-Sequenzen von dem nativen L2-Gen, das in dem Vektor pGal110 (Hofmann, K., et al., 1995, Virology, 209:506-518) enthalten war, worin die für HPV16 L1 + –L2 codierenden Gene inseriert wurden (siehe 1).
Die Primer I (5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; SEQ-ID-Nr. 1) und C (5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; SEQ-ID-Nr. 2) amplifizierten eine 265-Basenpaar(bp)-Sequenz, codierend für die 69 amino-terminalen As und 23 bp von stromaufwärts untranslatierter Sequenz, einschließlich einer SmaI-Restriktionsenzymstelle. Der Primer C modifizierte und verlängerte die für den L2-Aminoterminus codierende Region und fügte NotI-, SacI- und XhoI-Restriktionsenzymstellen stromabwärts der L2-codierenden Sequenzen hinzu.
Die Primer A (5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; SEQ-ID-Nr. 3), C und D (5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; SEQ-ID-Nr. 4) amplifizierten eine 285-bp-Sequenz, codierend für die 84 carboxy-terminalen As von L2 plus 6 bp, welche eine BglII-Restriktionsenzymstelle hinzufügten. Der Primer A fügte auch eine 17-bp-Sequenz, enthaltend NotI-, SacI- und XhoI-Stellen, stromaufwärts der L2-codierenden Sequenz hinzu.
Die Minimal-L2-Expressionskonstruktion wurde durch komplementäre Sequenzen, durch die Primer A und C hinzugefügt, assembliert. Die isolierten DNA-Produkte der obigen I/C- und A/D-Amplifizierungsreaktionen wurden beide in einer PCR-Reaktion verwendet, welche die I- und D-Primer einschloss. Zur Erleichterung der Verknüpfung der Fragmente durch ihre komplementäre 17-bp-Sequenz wurden drei PCR-Zyklen mit der Verschmelzungstemperatur von 37°C, gefolgt von 15 Zyklen mit der Verschmelzungstemperatur von 57°C, durchgeführt. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde in pcrScript (Stratagene, LaJolla, CA) „blunt-end"-ligiert und in XL-1 Blue MRF'-Zellen (Stratagene) transformiert. Positive Klone wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer I und D identifiziert und durch Restriktionsenzymverdauungs-Analyse bestätigt. Die Konstruktion wurde dann durch automatische Sequenzanalyse (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA) verifiziert.
Plasmid-DNA aus einem geeigneten Isolat wurde dann mit SmaI und BglII verdaut; ein Fragment von etwa 0,5 Kilobasenpaaren (kb) wurde gelgereinigt und mit dem 14-kb-SmaI- und -BglII-Vektorfragment von pGAL110, worin das HPV16L1-Gen neben dem GAL 1-Promotor inseriert war, ligiert. Kompetente DH5-E. coli-Zellen (Gibco BRL, Rockville, MD) wurden mit der Ligierungsmischung transformiert und Transformanten auf LB-Ampicillinplatten (Remel, Lenexa, KS) selektioniert. Klone wurden zuerst mittels PCR gescreent, wobei die Primer D und I zur Amplifizierung von Abschnitten von L2 verwendet wurden. Eine Sequenzierung des Kandidatenklons YP3#1 verifizierte die Sequenz als die in 2 gezeigte.
YP3#1 wurde dann als das Gerüst-Konstrukt eingesetzt, in das Gene, codierend für die offenen Leserahmen von HPV16-E1, -E2, -E7 oder Tat, inseriert wurden.
BEISPIEL 2
Insertion von für HPV-E-Protein und Tat codierenden Genen
Das für HPV16-E2 codierende Gen wurde mittels PCR-Amplifizierung einer HPV16-positiven klinischen Probe erhalten, welches dann direkt in den Subklonierungsvektor pCRII (Stratagene) inseriert wurde, und die Sequenz wurde wie oben verifiziert. Die E2-Gensequenz wurde dann in folgender Weise modifiziert:

1) DNA-Sequenzen, die XhoI, NaeI, NotI im Leserahmen enthielten, wurden dem amino-terminalen Abschnitt von E2 hinzugefügt. Zusätzlich wurden NotI-, NaeI- und XhoI-enthaltende Sequenzen dem carboxy-terminalen Abschnitt von E2 hinzugefügt, um die Insertion innerhalb E2 an den NotI-, XhoI-Stellen zu erleichtern.
2) Die DNA-Sequenzen wurden mittels PCR-Mutagenese verändert, um für Alaninreste an den Resten Glutaminsäure 39 und Isoleucin 73 zu codieren. Dies wurde zur Inaktivierung der E2-Proteinfunktion vorgesehen.

Das oben beschriebene modifizierte HPV16-E2-Gen wurde mit NotI, XhoI verdaut und mit einem gleichermaßen verdauten YP3#1-Vektor ligiert. Transformanten, welche die richtig inserierten E2-Sequenzen enthielten, wurden mittels PCR selektioniert, hinsichtlich ihrer Sequenz verifiziert und als YP3-E2 bezeichnet.
Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Insertion der Gene, welche für HPV16-E1, HPV16-E7 und HIV-Tat codierten, verwendet (wobei YP3-E1, YP3-E7 bzw. YP3-Tat erzeugt wurden). Das Konstrukt, in dem Tat am Carboxyterminus von Minimal-L2 inseriert war, wurde als YP3-cTat bezeichnet. Für E1 wurde Glycin 482 zu Asparaginsäure verändert; für E7 wurden Cystein 24 und Glutaminsäure 26 beide zu Glycin verändert, um die Proteinfunktion zu inaktivieren. Die resultierenden Konstruktionen wurden dann zur Transformation von Hefe eingesetzt.
BEISPIEL 3
Identifizierung und Züchtung von Hefe, die chimäre VLPs exprimierte
Plasmid-DNA von YP3#1 und die oben beschriebenen Derivate wurden zur Transformation von Saccharomyces cerevisiae (MATα, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, cir°) nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933) eingesetzt. Transformierte Sphäroplasten wurden auf selektivem (leucin-minus) Medium (Remel, Lenexa, KS) ausplattiert. Klone wurden durch zwei Durchgänge von Einzelkolonie-Selektion isoliert. Kleine Flüssigkeitskulturen von Kandidatenklonen wurden auf eine hohe Zelldichte in Medium, das Galactose enthielt, gezüchtet. Rohextrakte wurden durch heftiges Schütteln mit Glasperlen, gefolgt von Zentrifugation, hergestellt. Die geklärten Extrakte wurden hinsichtlich der Expression von L1, der L2-Komponente und VLPs mit verschiedenen Verfahren, einschließlich SDS-PAGE, ELISA, Immunoblotting und EIA, analysiert, wobei monoklonale Antikörper oder monospezifische polyklonale Antiseren eingesetzt wurden, welche L1 oder L2 oder die Amino- oder Carboxy-Termini von L2 oder L1-VLPs erkennen oder E1 oder E2 oder E7 oder irgendein anderes Protein oder Peptid, das mit dem modifizierten L2 fusioniert ist. Klone, welche die L2-Komponente exprimierten und VLPs bildeten, wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. 1-Liter- oder 16-Liter-Kulturen ausgewählter Klone wurden in galactose-enthaltendem Medium für die großmaßstäbliche Präparation von chimären VLPs gezüchtet.
BEISPIEL 4
Reinigung von chimären HPV-Typ 16-L1/L2_mini/E2-VLPs
Zellpellets aus einer 16-Liter-Fermentation von S. cerevisiae wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Zu den eingefrorenen Zellen wurde "Aufbruchpuffer" (200 mM MOPS, pH 7,1 mM CaCl₂) zugegeben, um eine etwa 20%ige (Gew./Vol.) Aufschlämmung zu ergeben. BENZONASE^® (Nycomed Pharma) wurde bis 750 Einheiten/g Nasszellgewicht hinzu gegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 19.000 psi mittels fünf Durchgänge in einem M110-Y-Mikrofluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Das Zelllysat wurde mittels Mikrofiltration durch eine Hohlfaser-Kartusche mit 0,65 Mikron Porengröße geklärt und dann mit drei Volumina 0,25 M Natriumcitrat, 0,2 M MOPS, pH 7,0, diafiltriert. Das Permeat wurde auf ein POROS^® 50HS-Harz (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), äquilibriert in 200 mM MOPS, pH 7, 250 mM Natriumcitrat, aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 mM MOPS, 0,5 M NaCl, 5 mM Natriumphosphat, pH 7, gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0,5 bis 1,5 M NaCl im gleichen Puffer eluiert. Säulenfraktionen wurden mittels Immunoblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert.
Der 50HS-Pool wurde durch ein 0,22-mm-Filter filtriert und auf eine keramische Hydroxylapatit (HA) Typ II (Bio-Rad)-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 mM MOPS, pH 7, 1,25 M NaCl, 5 mM Natriumphosphat, gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 5 bis 200 mM Natriumphosphat, pH 7, in 1,25 M NaCl eluiert. Fraktionen wurden mittels Westernblots und SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung an L1-Protein zeigten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden steril durch eine 0,22-mm-Membran filtriert und einer Elektronenmikroskopie unterworfen.
BEISPIEL 5
Nachweis von VLPs durch Elektronenmikroskopie
Transmissionselektronenmikroskopie wurde mittels EMBS (Elkridge, MD) durchgeführt. Geeignet verdünnte Proben wurden auf ein kohlenstoff-beschichtetes 300-Mesh-Kupfergitter platziert und an der Luft trocknen gelassen. Die Gitter wurden mit Phosphorwolframsäure angefärbt. Die gesamte Mikroskopie wurde unter Verwendung eines JEOL 1200 EX-Transmissionselektronenmikroskops durchgeführt. Die hergestellten mikroskopischen Aufnahmen hatten eine Endvergrößerung von 138.000 x. Elektronenmikroskopie bestätigte die Anwesenheit intakter VLP-Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 32 nm. Diese Partikel waren morphologisch von in Hefe exprimierten L1- oder L1+L2-Partikeln nicht unterscheidbar. Die Bestätigung der Anwesenheit von L2-Fusionen innerhalb der VLPs wurde durch Immunoblot-Analyse von Verfahrensfraktionen demonstriert (siehe Beispiel 6).
BEISPIEL 6
Co-Immunpräzipitation von L2-Fusionsproteinen mit L1-spezifischen Anti-VLP-Antikörpern
Zur Demonstration, dass die L2-Fusionen eine integrale Komponente der VLPs waren, wurden VLPs mit Hilfe eines für HPV16-L1-VLP spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAb) H16:V5 (Wang, D., et al., 1997, J. General Virology, 78:2209-2215) eingefangen, ausgiebig gewaschen und die zurückgehaltenen Produkte mittels Immunoblots nachgewiesen. In Kürze, Magnetperlen, die mit Schaf-Antimaus-IgG vorbeschichtet worden waren (Dynabeads M-280; Dynal, Oslo), wurden mit TMOPS-Puffer (0,05 M MOPS, pH 7,0, 0,4 M NaCl, 0,1% Tween-80), enthaltend 5% fettfreie Trockenmilch, gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden über Nacht bei 4°C mit H16:V5-mAb in derselben Lösung inkubiert. Ungebundener mAb wurde durch Waschen mit TMOPS entfernt. Die Perlen wurden dann mit Kontrolle oder VLP-enthaltenden rohen Hefeextrakten (siehe Beispiel 3) oder partiell gereinigten VLP-Präparationen (siehe Beispiel 4) inkubiert. Extrakte, die 100-400 μg Gesamtprotein enthielten, wurden mit 0,2 MOPS, pH 7,0, 2 mM MgCl₂ verdünnt und mit Perlen 4 h lang bei 4°C inkubiert. Die Perlen wurden dann ausgiebig mit TMOPS gewaschen; gebundene Proteine wurden durch Erwärmen der Perlen bei 95°C in Laemmli-Probenpuffer gewonnen, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Immunoblots identifiziert.
Die Identifizierung des L2-Fusionsproteins erfolgte durch Antikörper, welche den L2-Anteil des Proteins erkennen, und durch Antikörper, welche das Protein von Interesse in Fusion mit L2, beispielsweise E1, E2 oder E7, erkennen. Neben dem Einschluss von Kontroll-Hefeextrakten, umfassten andere Kontrollen 1) Perlen, welche nicht mit H16:V5 inkubiert worden waren, und 2) Perlen, welche nicht mit Hefeextrakt inkubiert worden waren. 3 zeigt die Immunoblot-Ergebnisse von VLPs, welche mit dem H16:V5 Mab eingefangen und wie oben einem Immunoblot unterworfen und dann mit Anti-E1-, Anti-E7- oder Anti-E2-Antiseren angefärbt worden waren. In jedem Fall wurden für mehrere Isolate die E-Protein:L2-Fusionen bei den eingefangenen gereinigten VLPs unter Verwendung des geeigneten Antikörpers nachgewiesen, jedoch nicht in Abwesenheit von Lysat oder unter Verwendung gereinigter chimärer VLPs, welche E-Proteine enthielten, die von den Nachweis-Antikörpern verschieden waren.
Eine Copräzipitation des L2-Fusionsproteins mit L1 unter Verwendung eines für L1-VLPs spezifischen monoklonalen Antikörpers wurde als Hinweis betrachtet, dass das L2-Fusionsprotein mit den VLP assoziiert war.
BEISPIEL 7
Demonstration von Tat-Aktivität in TatiMinimal-L2-Fusionen in Säugerzellen
Zur Demonstration, dass Tat/L2-Fusionen Tat-Aktivität behielten, wurde ein Expressionsplasmid konstruiert, worin DNA, codierend für das HIV-Tat-Gen, stromabwärts des Minimal-L2-Gens inseriert wurde, so dass es mit dem Carboxyterminus von L2 in dem translatierten Produkt verknüpft sein würde. Diese DNA-Kassette wurde mit BglII verdaut und innerhalb der BglII-Stelle des Säuger-Expressionsvektors V1Jp (Montgomery, D., et al., 1993, DNA & Cell Biol. 12:777) neben dem CMV-Promotor inseriert. Die L2/Tat-Fusion wurde mittels PCR des minimalen L2 (dem ein Translationsstoppsignal fehlte) unter Verwendung der Oligomere 5'-TCC CCC GGG AGA TCT GCC ACC ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA C-3' (Primer W; SEQ-ID-Nr. 5) und 5'-GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3' (Primer X; SEQ-ID-Nr. 6) erzeugt. Die Oligomere 5'-CAG ATG TCT CTT TGG CTG CCA TGG AGC CAG TAG ATC CTA GAC-3' (Primer Y; SEQ-ID-Nr. 7) und 5'-CTC GTA AGA TCT CTA TTC CTT CGG GCC TGT C-3' (Primer Z; SEQ-ID-Nr. 8) wurden zur Amplifizierung des vollständigen offenen Tat-Leserahmens und zur Einführung von Sequenzkomplementarität mit L2 verwendet. Die Produkte aus beiden PCR-Reaktionen wurden mit einem Agarosegel isoliert und dann in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert, in der nur die Primer W und Z zugegeben wurden, welche die L2-Tat-Fusion durch Überlappung komplementärer Sequenzen erzeugten. Diese Primer fügten auch BglII-Stellen hinzu, welche verdaut wurden, um die Insertion in V1Jp zur Bildung von V1Jp-L2cTat zu erleichtern.
Die Aktivität der L2/Tat-Fusion wurde durch Transfektion von V1Jp-L2cTat in P4R5-Zellen unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionskits (erhältlich von Gibco BRL, Rockville, MD), die wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt wurde, bestimmt. P4R5-Zellen enthalten eine integrierte Kopie des Gens, welches für Beta-Galactosidase codiert, unter der Kontrolle des HIV-LTR. Falls das eingeführte Tat-Gen für funktionell aktives Tat codiert, wird das exprimierte Tat-Protein den LTR binden und zur Expression von Beta-Galactosidase führen. Lysate wurden aus Kulturen 48 h nach der Transfektion hergestellt und die Beta-Galactosidase-Aktivität wurde unter Verwendung von Galactostar^®-Reagenzien (Tropix, Bedford, MS) ermittelt. Die Ergebnisse sind in 4 zusammengefasst, welche zeigt, dass ähnliche Mengen an Beta-Galactosidase in Zellen produziert wurden, die mit V1Jp-L2cTat transfiziert worden waren, wie mit der unfusionierten positiven Kontrolle pD5-Tat-Plasmid (235 gegenüber 175). Die DNA-Kontrolle ohne Tat hatte einen Wert von 0,462. Somit scheint eine volle Tat-Aktivität in der L2/Tat-Fusion erhalten geblieben zu sein.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Ein Verfahren zur Abgabe eines Peptides oder Proteins in vitro an eine Zelle, umfassend: a) Fusionieren einer ersten Nukleinsäure, die das Peptid oder Protein codiert, an eine zweite Nukleinsäure, welche einen modifizierten humanen Papillomavirus (HPV) L2 codiert, um ein Fusionsproteingen zu erzeugen, worin der L2-Teilbereich des Fusionsproteingens weniger als ein L2-Gen in voller Länge ist und mindestens die Codierungssequenzen für die 69 amino-terminalen Aminosäuren und für die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren umfasst, aber weniger als 60% des Wildtyp-L2-Proteins codiert, b) Exprimieren des Fusionsproteingens in einer Wirtszelle, um das Fusionsprotein zu erhalten, c) in Kontakt bringen des Fusionsproteins mit einem HPV-L1-Protein unter Bedingungen, bei denen das Fusionsprotein und das L1-Protein sich spontan verbinden, um ein virus-ähnliches Partikel (VLP) zu bilden, d) Abgabe des VLP an die Zelle.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin der HPV ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52 und HPV56.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, worin das L2-Gen weniger als etwa 50% des Wildtyp-L2-Proteins codiert.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, worin das abzugebende Peptid oder Protein ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus HPV E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, HIV Tat und beta-Lactamase.
Eine für ein Fusionspeptid oder -protein codierende Nukleinsäure umfassend: einen ersten Abschnitt, der eine Nukleinsäure umfasst, die einen Teilbereich eines HPV-L2-Proteins codiert, welcher weniger als die Sequenz in voller Länge ist und welcher mindestens die Codierungssequenzen für die 69 amino-terminalen Aminosäuren und für die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren umfasst, aber weniger als 60% des Wildtyp-L2-Proteins codiert, und einen zweiten Abschnitt, der eine Nukleinsäure umfasst, welche ein Peptid oder Protein codiert.
Eine Nukleinsäure nach Anspruch 5, worin der erste Abschnitt von einem HPV ist, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52 und HPV56.
Eine Nukleinsäure nach Anspruch 6, worin der zweite Abschnitt ein Protein codiert, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, HIV Tat und beta-Lactamase.
Ein HPV-virus-ähnliches Partikel (VLP), umfassend HPV-L1-Protein und ein Fusionsprotein, worin das Fusionsprotein ein erstes Protein, welches ein HPV-L2-Protein ist, welches weniger als etwa 50 des Wildtyps ist und mindestens die 69 amino-terminalen Aminosäuren und die 84 carboxy-terminalen Aminosäuren umfasst, und ein zweites Protein oder Peptid umfasst.
Ein VLP nach Anspruch 8, worin der HPV ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52 und HPV56.
Wirtszelle, umfassend das VLP nach Anspruch 8.
Impfstoff, umfassend ein virus-ähnliches Partikel nach Anspruch 10.
Nukleinsäure, welche ein VLP nach Anspruch 9 codiert.