DE60016765T2

DE60016765T2 - Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind

Info

Publication number: DE60016765T2
Application number: DE60016765T
Authority: DE
Inventors: P. Michael NEEPER; L. William MCCLEMENTS; U. Kathrin JANSEN; D. Loren SCHULTZ; Ling Chen; Xin-Min Wang
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 2000-08-21
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2020-08-22
Also published as: EP1212358B1; PT1212358E; AU772611B2; AU7063900A; ATE284898T1; CA2381991A1; ES2233437T3; WO2001014416A3; JP2003511010A; JP4799789B2; EP1212358A2; DE60016765D1; WO2001014416A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Human-Papillomavirus (HPV)-Gene, die für die Expression in einer menschlichen Zellumgebung codon-optimiert wurden, und deren Verwendung mit adenoviralen Vektoren und/oder Plasmid-Vektoren als Vakzine.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Papillomavirus-Infektionen treten in einer Vielzahl von Tieren auf, einschließlich Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Schlangen, Affen und Kühen. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im Allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind artenspezifische infektiöse Erreger; ein Human-Papillomavirus kann keine nicht-menschlichen Lebewesen infizieren.
Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, die bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (open reading frames, ORFs) des Virus werden mit E1 bis E7 und L1 sowie L2 bezeichnet, wobei "E" früh und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen Gene sind mit Funktionen wie virale Replikation und zelluläre Transformation verbunden.
Im Menschen verursachen unterschiedliche HPV-Typen verschiedene Krankheiten, die sich von gutartigen Warzen (zum Beispiel HPV-Typen 1, 2, 3) zu hoch invasiven Genital- und Analkarzinomen (HPV-Typen 16 und 18) erstrecken. Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es kein ausreichendes therapeutisches Heilverfahren für diese Krankheiten.
Immunologische Studien in Tieren zeigten, dass die Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegen Papillomavirus-Antigene einer Infektion mit dem homologen Virus vorbeugt. Jedoch wurde die Entwicklung eines Vakzins durch die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der in vitro-Kultivierung der Papillomaviren behindert.
Impfung ist eine effektive Form der Krankheitsvorbeugung und hat sich erfolgreich gegenüber mehreren Typen viraler Infektionen bewährt. Jedoch waren bis heute Versuche, ein effektives HPV-Vakzin zu entwickeln, nicht ganz erfolgreich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Oligonukleotide, die für ein Human-Papillomavirus(HPV)-Protein kodieren, welches für eine effiziente Expression in einer Wirtszelle codon-optimiert wurde; vorzugsweise sind die Oligonukleotide DNA. In einer Ausführungsform kodieren die Polynukleotide für ein Protein, das seine Wildtyp-Aminosäuresequenz behält. In einer alternativen Ausführungsform kodieren die Polynukleotide für eine mutierte Form eines HPV-Proteins, das im Vergleich zum Wildtyp Protein eine reduzierte Protein-Funktion besitzt, aber die Immunogenität beibehält.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Protein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: L1-, L2-, E1-, E2-, E4-, E5-, E6- und E7-Proteinen. Besonders bevorzugt sind L1-, L2-, E2- und E7-Proteine.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Vektor, der die Polynukleotide trägt, die für ein codon-optimiertes HPV-Protein kodieren. Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung sind Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein adenoviraler Vektor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der adonovirale Vektor ein Vakzin-Vektor, umfassend ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfasst, umfassend:

a) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, worin das Polynukleotid für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codonoptimiert ist; und
b) einen Promotor, funktionsfähig mit dem Polynukleotid verknüpft.

Ein weiterer Vektor-Typ, der durch diese Erfindung vorgesehen ist, ist ein Shuttle-Plasmid-Vektor, der einen Plasmid-Anteil und einen adenoviralen Anteil umfasst, wobei der adenovirale Anteil umfasst: ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfasst, umfassend:

Diese Erfindung ist auch auf Plasmid-Vakzin-Vektoren gerichtet, die einen Plasmid-Anteil und eine exprimierbare Kassette umfassen, umfassend:

a) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, worin die Polynukleotide für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codonoptimiert sind; und
b) ein Promotor, funktionsfähig mit dem Polynukleotid verknüpft.

Diese Erfindung bezieht sich auch auf Vakzin-Zusammensetzungen die einen Vektor umfassen, der die Oligonukleotide zu einem menschlichen Wirt transportiert und die Expression des kodierten Proteins erlaubt. Das Protein wird in einer Menge exprimiert, die ausreicht, eine Immunantwort zu induzieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Plasmid-Vektor oder ein adenoviraler Vektor.
Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung eines HPV-Proteins, umfassend die Expression eines synthetischen Polynukleotids, kodierend für ein Human-Papillomavirus(HPV)-Protein oder eine mutierte Form eines HPV-Proteins, das verglichen mit dem Wildtyp-Protein reduzierte Proteinfunktion besitzt, aber welches die Immunogenität beibehält, in einer Wirtszelle, wobei die Polynukleotid-Sequenz Codons umfasst, die für die Expression in einem menschlichen Wirt optimiert sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV16 L1-Gens (SEQ-ID-NR.1).
2 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV16 E1-Gens (SEQ-ID-NR.2) In dieser besonderen Sequenz gibt es weitere Mutationen, welche die Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins verändern - der Glycin-Rest an Position 428 wurde zu Asparaginsäure umgewandelt und der Tryptophan-Rest an Position 439 ist jetzt Arginin.
3 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV16 E2-Gens (SEQ-ID-NR.3) In dieser besonderen Sequenz wurde der Glutaminsäure-Rest an Position 39 gegen Alanin ausgetauscht und der Isoleucin-Rest an Position 73 wurde ebenfalls gegen Alanin ausgetauscht.
4 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV16 E7-Gens. (SEQ-ID-NR.4) In dieser besonderen Sequenz wurde der Cystein-Rest an Position 24 gegen Glycin ausgetauscht und der Glutaminsäure-Rest an Position 26 wurde gegen Glycin ausgetauscht.
5 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV6a E7-Gens (SEQ-ID-NR.5).
6 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV18 E7-Gens (SEQ-ID-NR.6).
7 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV6a E2-Gens (SEQ-ID-NR.7).
8 ist die Nukleotid-Sequenz eines codon-optimierten HPV18 E2-Gens (SEQ-ID-NR.8).
9 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit natürlichen (Spuren d, e, f) oder synthetischen (a, b, c) HPV16 L1-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns.
10 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit natürlichen oder synthetischen HPV16 E1-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Die Spuren a und d enthalten natürliche HPV16 E1-Sequenzen; Spuren b und e enthalten synthetisches HPV16 E1 und Spur c ist eine pseudotransfizierte Kontrolle.
11 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit natürlichen oder synthetischen HPV16 E2-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Spur a ist pseudoinfiziert; Spur b ist eine lacZ-Kontrolle; Spur c enthält ein synthetisches HPV16 E2-Isolat #6; Spur d enthält ein synthetisches HPV16 E2-Isolat #11 und Spur e weist natürliches HPV16 E2 auf.
12 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit natürlichen oder synthetischen HPV16 E7 Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Spur a ist pseudoinfiziert; Spur b ist eine lacZ-Kontrolle; Spur c enthält ein synthetisches HPV16 E7-Isolat #2; Spur d ist synthetisches HPV16 E7-Isolat 4 und Spur e ist natürliches HPV16 E7.
13 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit natürlichen oder synthetischen HPV6a E7-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Die Spuren b und c enthalten synthetische HPV6a E7-Sequenzen; Spur d enthält eine lacZ-Kontrolle und Spur a ist eine pseudotransfizierte Kontrolle.
14 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit synthetischen HPV18 E7-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Die Spuren b, c, d und e enthalten synthetische HPV18 E7-Sequenzen; Spur f enthält synthetisches HPV16 E7 als eine Antikörperkontrolle und Spur a ist eine pseudotransfizierte Kontrolle.
15 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit synthetischen HPV6a E2-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Spur a und b enthalten synthetische E2-Sequenzen; Spur c ist eine Beta-gal-Kontrolle und Spur d ist pseudotransfiziert.
16 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit synthetischen HPV18 E2-Sequenzen im Expressionsvektor V1Jns. Spur a ist eine Beta-gal-Kontrolle; Spur b ist pseudotransfiziert; und Spuren c und d weisen synthetische Sequenzen auf.
17 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.9–32), die verwendet werden, um synthetisches HPV16 L1 zu generieren.
18 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.33–64), die verwendet werden, um synthetisches HPV16 E1 zu generieren.
19 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.65–84), die verwendet werden, um synthetisches HPV16 E2 zu generieren.
20 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.85–90), die verwendet werden, um synthetisches HPV16 E7 zu generieren.
21 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.91–96), die verwendet werden, um synthetisches HPV6a E7 zu generieren.
22 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.97–102), die verwendet werden, um synthetisches HPV18 E7 zu generieren.
23 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.103–126), die verwendet werden, um synthetisches HPV6a E2 zu generieren.
24 ist eine Tabelle von Oligonukleotiden (SEQ-ID-NRN.127–150), die verwendet werden, um synthetisches HPV18 E2 zu generieren.
25 ist ein Westernblot aus JCL-031-Zelllysat. Das Zelllysat wurde hergestellt aus JCL-031-Zellen, die in einem Auswahlmedium gewachsen sind, das 400 μg/ml G418 enthält. Der Immunoblot wurde mit anti-HPV16 E2 (Ziege 248)-Antiseren entwickelt. Positionen mit Molekulargewichtsmarkern sind angezeigt.
26 zeigt einen Schutz vor einem mit JCL-031-Zellen induzierten Tumorauswuchses. Mit E2-DNA – oder Kontroll-DNA – immunisierte Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 5 × 10⁵ JCL-031-Zellen in die linke Leistengegend herausgefordert. Frühestens fünf Tage nach dieser Herausforderung wurden alle Mäuse in zwei- oder dreitägigen Intervallen bis vier Wochen nach der Inokulation beobachtet. Tumore wurden durch visuelle Kontrolle, Austastung der Leistengegend und Messung des Tumordurchmessers mit einem Tasterzirkel, erfasst und überwacht.
Die Bezeichnung "Promotor", die hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Erkennungsregion auf einem DNA-Strang, an welche die RNA- Polymerase bindet. Der Promotor bildet einen Initiationskomplex mit RNA-Polymerase, um transkriptorische Aktivität zu initiieren und voranzutreiben. Der Komplex kann durch aktivierende Sequenzen, bezeichnet als "Enhancer", oder inhibierende Sequenzen, bezeichnet als "Silencer", modifiziert werden.
Die Bezeichnung "Kassette" bezieht sich auf die Sequenz der vorliegenden Erfindung, welche die Nucleinsäuresequenz enthält, die exprimiert werden soll. Die Kassette ist vom Konzept einer Tonbandkassette ähnlich; jede Kassette hat ihre eigene Sequenz. Somit wird beim Austausch der Kassette der Vektor eine andersartige Sequenz exprimieren. Wegen der Restriktionsstellen am 5'- und 3'-Ende kann die Kassette einfach eingeschoben, entfernt oder durch eine andere Kassette ersetzt werden.
Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf irgendwelche Mittel, durch die DNA-Fragmente in einen Wirtsorganismus oder ein Wirtsgewebe eingebracht werden können. Es gibt viele Arten von Vektoren, einschließlich Plasmid, Virus (einschließlich Adenovirus), Bakteriophagen und Cosmide.
Die Bezeichnung "effektive Menge" bedeutet, dass ausreichend Vakzinzusammensetzung eingebracht wird, um den entsprechende Menge an Polypeptid zu produzieren, so dass eine Immunantwort resultiert. Ein Fachmann erkennt, dass diese Menge variieren kann.
"Synthetisch" bedeutet, dass das HPV-Gen so modifiziert wurde, dass es Codons enthält, die für eine menschliche Expression bevorzugt sind. In vielen Fällen bleiben die durch das Gen kodierten Aminosäuren gleich. In einigen Ausführungsformen kann das synthetische Gen für ein modifiziertes Protein kodieren.
Die Bezeichnung "natürlich" bedeutet, dass das Gen DNA-Sequenzen enthält, wie sie in natürlichen Vorkommen gefunden werden. Es handelt sich um Wildtyp-Sequenzen viralen Ursprungs.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Synthetische DNA-Moleküle, kodierend für verschiedene HPV-Proteine, werden bereitgestellt. Die Codons der synthetischen Moleküle sind so entworfen, dass die Codons, die von der geplanten Wirtszelle bevorzugt wer den, verwendet werden, deren bevorzugte Ausführungsform eine menschliche Zelle ist. Die synthetischen Moleküle können als Polynukleotid-Vakzin, das durch neutralisierende Antikörper- und zellvermittelte Immunität eine effektive Immunprophylaxe gegen Papillomavirus-Infektionen bereitstellt, verwendet werden. Die synthetischen Moleküle können als immunogene Zusammensetzung verwendet werden. Diese Erfindung stellt Polynukleotide bereit, die, wenn direkt in einen Vertebraten, einschließlich Säuger wie Primaten und Menschen, in vivo eingebracht werden, eine Expression von kodierten Proteinen im Tier auslösen.
Das Gen, das für L1, E1, E2 und/oder E7 von irgendeinem Serotyp-HPV kodiert, kann in Übereinstimmung mit dieser Erfindung modifiziert werden. Es ist bevorzugt, dass das ausgewählte HPV dafür bekannt ist, im Menschen pathologische Zustände hervorzurufen. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, dass das HPV-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: HPV6a, HPV6b, HPV 11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV68, oder Varianten davon. Die Vakzin-Zusammensetzung dieser Erfindung kann eine Mischung von HPV-Typ Protein-Genen (zum Beispiel Gene von HPV6, 11, 16 und 18) enthalten und/oder es kann auch eine Mischung von Protein-Genen (d.h. L1, E1, E2 und/oder E7) enthalten.
CODON-OPTIMIERUNG
Die Wildtyp-Sequenzen vieler HPV-Gene sind bekannt. In Übereinstimmung mit dieser Erfindung wurden HPV-Gensegmente in Sequenzen umgewandelt, die identisch translatierte Sequenzen haben, aber mit einem alternativen Codongebrauch, wie definiert von Lathe, 1985 "Synthetic Oligonukleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations" J. Molec. Biol. 183:1–12, das hiermit durch Inbezugnahme enthalten ist. Die Methodik kann folgendermaßen zusammengefasst werden:

1. Identifiziere die Platzierung der Codons für einen exakten offenen Leserahmen.
2. Vergleiche das Wildtyp-Codon mit der beobachteten Verwendungshäufigkeit durch menschliche Gene.
3. Ist das Codon nicht das am meisten zum Einsatz kommende, ersetze es mit einem optimalen Codon für hohe Expression in menschlichen Zellen.
4. Wiederhole diesen Vorgang, bis das gesamte Gensegment ersetzt wurde.
5. Überprüfe die neue Gensequenz auf unerwünschte Sequenzen, die durch diese Codon-Austausche erzeugt wurden (z.B. "ATTTA" Sequenzen, versehentliche Bildung von Intron-Splice-Erkennungsstellen, unerwünschte Restriktionsenzym-Stellen, usw.) und ersetze sie durch Codons, die diese Sequenzen eliminieren.
6. Baue die synthetischen Gensegmente zusammen und teste auf eine verbesserte Expression.

In diesem Zusammenhang, offenbaren Zhon et al., 1999, Journal of Virology, Vol. 73(6):4972–4982 synthetische Versionen von BPV-1 L1- und L2-Genen, wobei Codons in den L1- und L2-Genen, die in Säugergenen weniger häufig verwendet werden, durch Codons ersetzt werden, die bevorzugt in Säugersystemen verwendet werden, und exprimieren die genannten Gene in COS-1-Zellen.
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung wurde gefunden, dass die Verwendung alternativer Codons, die für dieselbe Proteinsequenz kodieren, die Einschränkungen bei der Expression von HPV-Proteinen in menschlichen Zellen beseitigen können.
Diese Methoden wurden zur Erzeugung der folgenden synthetischen Gensegmente für verschiedene Papillomavirus-Gene zur Erzeugung eines Gens verwendet, das ausschließlich Codons umfasst, die für eine hochgradige Expression optimiert sind. Während die oben genannte Vorgehensweise eine Zusammenfassung unserer Methodik zum Design Codon-optimierter Gene für DNA-Vakzine bereitstellt, ist es für einen Fachmann verständlich, dass ähnliche Vakzin-Wirksamkeiten oder gesteigerte Expression von Genen auch durch geringe Variationen in der Vorgehensweise oder durch geringe Variationen in der Sequenz erreicht werden können.
In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung wurden Änderungen gemacht (besonders in den natürlichen Proteinsequenzen des E-Proteins), um die Proteinfunktion zu reduzieren oder zu eliminieren, während die Immunogenität aufrechterhalten wird. Mutationen, welche die Enzymfunktion herabsetzen, sind bekannt. Bestimmte Änderungen wurden zum Zweck der Erweiterung des Sicherheitsbereichs und/oder der Verbesserung der Expressionsausbeute gemacht. Diese Modifikationen werden erreicht durch einen Austausch des ausgewählten Codons durch eines, das in Säugetierzellen höher exprimiert wird. Im Fall von HPV16 E1 wurden zum Beispiel zwei Mutationen eingeführt: an Aminosäurenummer 482 wurde Glycin durch Umwandlung von GGC in GAC gegen Asparaginsäure ausgetauscht; und Tryptophan wurde an Position 439 durch Umwandlung von TGG in CGC gegen Arginin ausgetauscht.
Für HPV16 E2, Umwandlung von Glutaminsäure an Position 39 in Alanin und Isoleucin an Position 73 in Alanin durch Umwandlung der beiden Codons in GCC.
Für HPV16 E7, Umwandlung von Cystein an Position 24 in Glycin und Glutaminsäure an Position 26 in Glycin wurde ermöglicht durch Abänderung von TGC bzw. GAG jeweils in GGC.
Die codon-optimierten Gene werden dann in eine Expressionskassette eingebaut, welche Sequenzen umfasst, die zur Bereitstellung einer effizienten Expression des Proteins in einer menschlichen Zelle konstruiert sind. Die Kassette enthält bevorzugt das codon-optimierte Gen mit funktionsfähig damit verknüpften zugehörigen Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, wie z.B. einen Promotor, und Terminierungssequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der Cytomegalovirus-Promotor mit der Intron A-Sequenz (CMV-intA), wenngleich der Fachmann erkennen wird, dass jeder der Vielzahl anderer bekannter Promotoren, wie z.B. der starke Immunglobulin-Promotor oder andere eukaryotische Genpromotoren, verwendet werden kann. Ein bevorzugter Transkriptionsterminator ist der Rinder-Wachstumshormonterminator, obwohl andere bekannte Transkriptionsterminatoren auch verwendet werden können. Die Kombination des CMVintA-BGH Terminators ist besonders bevorzugt.
Beispiele bevorzugter Gensequenzen sind in SEQ-ID-NRN.1–8 gegeben.
VEKTOREN
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung wird die Expressionskassette, die für mindestens 1 HPV Protein kodiert, dann in einen Vektor eingefügt. Der Vektor ist bevorzugt ein Plasmid oder ein adenoviraler Vektor, obwohl lineare DNA, verknüpft mit einem Promotor, oder andere Vektoren, wie z.B. ein adeno-assoziierter Virus oder ein modifizierter Vakzin-Virus-Vektor, auch verwendet werden können.
Ist der gewählte Vektor ein Adenovirus, ist es bevorzugt, dass der Vektor ein so genannter "First-Generation" adenoviraler Vektor ist. Diese adenoviralen Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine nichtfunktionelle E1-Genregion besitzen, bevorzugt eine deletierte adenovirale E1-Genregion. In einigen Ausführungsformen ist die Expressionskassette an der Stelle eingefügt, wo gewöhnlich das adenovirale E1-Gen lokalisiert ist. Zusätzlich haben diese Vektoren gegebenenfalls eine nicht funktionale oder deletierte E3-Region. Die Adenoviren können in bekannten Zelllinien, die das virale E1-Gen exprimieren, vervielfältigt werden, wie z.B. in 293-Zellen oder PerC.6-Zellen.
Für eine einfache Manipulation des adenoviralen Vektors kann der Adenovirus in einer Shuttle-Plasmidform vorliegen. Diese Erfindung ist ebenso auf einen Shuttle-Plasmidvektor gerichtet, welcher einen Plasmidanteil und einen adenoviralen Anteil enthält, wobei der adenovirale Anteil ein adenoviraler Genom enthält, das eine deletierte E1- und gegebenenfalls eine E3-Deletion besitzt und eine eingeschobene Expressionskassette besitzt, die mindestens ein codon-optimiertes HPV-Gen enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es eine Restriktionsstelle, angrenzend an den adenoviralen Anteil des Plasmids, so dass der adenovirale Vektor leicht entfernt werden kann. Das Shuttle-Plasmid kann in prokaryotischen Zellen oder in eukaryotischen Zellen repliziert werden.
Standardtechniken der Molekularbiologie zur Herstellung und Reinigung der DNA-Konstrukte ermöglichen die Herstellung der Adenoviren, Shuttle-Plasmide und DNA-Immunogene dieser Erfindung.
Ist der gewählte Vektor eine Plasmid-DNA, ist es bevorzugt, dass der Vektor ein oder mehrere Promotoren enthält, die von Säugetier- oder Insektenzellen erkannt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das Plasmid einen starken Promotor beinhalten wie z.B., aber nicht limitiert darauf, den CMV-Promotor. Das Gen, das exprimiert werden soll, wäre mit einem derartigen Promotor verknüpft. Ein Beispiel eines solchen Plasmids wäre das bereits beschriebene Säuger-Expressionsplasmid V1Jns (J.Shiver et al., 1996, in DNA Vaccines, eds., M. Liu et al., N.Y., Acad. Sci., N.Y. 772:198–208, welches hier durch Inbezugnahme enthalten ist).
In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung können sowohl das Vakzin-Plasmid als auch die adenoviralen Vektoren, einem Vertebraten verabreicht werden, um eine Immunantwort zu induzieren. In diesem Fall werden die zwei Vektoren in einem "prime and boost"-Verfahren verabreicht. Zum Beispiel wird der erste Vektor-Typ verabreicht, dann wird nach einer vorgegebenen Zeit, z.B. 1 Monat, 2 Monate, 6 Monate oder einem anderen passenden Intervall, ein zweiter Vektor-Typ verabreicht. Bevorzugt tragen die Vektoren Expressionskassetten, die für dasselbe Polynukleotid oder eine Kombination von Polynukleotiden kodieren.
Somit ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen das Human-Papillomavirus in einem Vertebraten, umfassend:

A) Einführen eines ersten Vektors in den Vertebraten, umfassend ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, worin das Polynukleotid für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codonoptimiert ist;
B) eine vorbestimmte Menge an Zeit verstreichen lassen; und
C) Einführen eines zweiten Vektors in den Vertebraten, umfassend einen adenoviralen Vakzin-Vektor, der ein adenoviralen Genom mit einer

Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region umfasst, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfasst, umfassend

i) ein Polynukleotid, kodierend für HPV Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, worin das Polynukleotid für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codon-optimiert ist; und
ii) einen Promotor, funktionsfähig mit dem Polynukleotid verknüpft.

Im Allgemeinen ist bevorzugt, dass der erste Vektor ein Plasmid-Vakzin-Vektor und der zweite Vektor ein adenoviraler Vektor ist. Somit ist diese Erfindung auf ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Vertebraten gerichtet, umfassend:

A) Einführen eines Plasmid-Vakzins in den Vertebraten, wobei das Plasmid-vakzin einen Plasmidanteil und einen Expressionskassettenanteil umfasst, der Expressionskassettenanteil umfassend:
i) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codon-optimiert ist; und
ii) einen Promotor, funktionsfähig mit dem Polynukleotid verknüpft;
B) eine vorbestimmte Menge an Zeit verstreichen lassen; und
C) Einführen eines adenoviralen Vakzin-Vektors in den Vertebraten, umfassend ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfasst, umfassend:
i) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen oder mutierten Formen davon, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer menschlichen Wirtszelle codon-optimiert ist; und
ii) einen Promotor, funktionsfähig mit dem Polynukleotid verknüpft.

In einer noch weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können die codon-optimierten Gene durch ein Plasmid oder einen adenoviralen Vektor in einem ersten Schritt ("prime") in einem Empfänger eingeführt werden, wonach ein Verstärkungsschritt ("boost") durch Einführen eines Polypeptids oder Proteins in den Empfänger, das im wesentlichen das selbe ist wie das, das durch die codon-optimierten Gene kodiert wird, durchgeführt wird. Fragmente eines vollständigen Proteins können ersatzweise verwendet werden, besonders solche, die immunogen sind und/oder ein Epitop enthalten.
Die Menge an exprimierbarer DNA oder transkribierter RNA, die in einen Vakzinempfänger eingebracht werden soll, wird teilweise von der Stärke des verwendeten Transkriptions- und Translationspromotors und von der Immunogenität des exprimierten Genprodukts abhängen. Im Allgemeinen wird eine immunologisch oder prophylaktisch effektive Dosis von ungefähr 1 ng bis 100 mg, und bevorzugt ungefähr 10 μg bis 300 μg eines Plasmid-Vakzin-Vektors direkt in das Muskelgewebe verabreicht. Eine effektive Dosis für rekombinate Adenoviren sind in etwa 10⁶ – 10¹² Partikel und bevorzugt ungefähr 10⁷ – 10¹¹ Partikel. Subkutane Injektion, intradermale Einbringung, Eindrücken durch die Haut und andere Arten der Verabreichung, wie z.B. intraperitoneale, intravenöse, oder inhalative Zuführung werden ebenso in Erwägung gezogen. Es wird ebenfalls erwägt, Verstärkungsimpfungen bereitzustellen. Parenterale Verabreichung, wie z.B. intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder andere Formen der Verabreichung mit Hilfsstoffen wie z.B. Interleukin-12-Proteinen, gleichzeitig mit oder anschließend zur parenteralen Einführung des Vakzins dieser Erfindung, ist auch vorteilhaft.
Der Vakzin-Vektor dieser Erfindung kann nackt sein, d.h. nicht assoziiert sein mit irgendwelchen Proteinen, Hilfsstoffen oder anderen Mitteln, die auf das Immunsystem des Empfängers einwirken. In diesem Fall ist es wünschenswert für den Vakzin-Vektor, dass er in einer physiologisch akzeptablen Lösung vorliegt, wie z.B., aber nicht darauf limitiert, in steriler Salzlösung oder steriler gepufferter Salzlösung, oder die DNA kann mit einem Hilfsstoff verbunden sein, für den bekannt ist, dass er eine Immunantwort verstärkt, wie z.B. ein Protein oder andere Träger. Mittel, welche die zelluläre Aufnahme von DNA unterstützen, wie z.B. Calciumionen, aber nicht darauf limitiert, können auch zum Vorteil eingesetzt werden. Diese Mittel werden hier im Allgemeinen als transfektions-erleichternde Mittel und pharmazeutisch akzeptable Träger bezeichnet. Techniken zur Beschichtung von Mikroprojektilen, die mit Polynukleotiden beschichtet sind, sind fachlich bekannt und sind ebenso nützlich in Verbindung mit dieser Erfindung.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration und sind nicht dazu bestimmt, die Erfindung in irgendeiner Weise zu limitieren.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Aufbau eines synthetischen Gens
Synthetische Gensequenzen für Human-Papillomavirus-Proteine L1, E1, E2 und E7 wurden durch reverse Translation von Aminosäuresequenzen unter Verwendung der am häufigsten verwendeten Codons erzeugt, die in hoch exprimierten Säugergenen gefunden wurden. (R. Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183:1–12, was hiermit durch Inbezugnahme enthalten ist). Einige Anpassungen dieser codon-optimierten Sequenzen wurden vorgenommen, um Restriktionsstellen einzufügen oder zu entfernen. Oligonukleotide, die auf diesen Sequenzen basieren, wurden chemisch synthetisiert (Midland Certified Reagents; Midland, TX) und durch PCR-Amplifizierung aufgebaut. (J. Haas et al., 1996, Current Biology 6:315–324; und PCR Protocols, M. Innis et al., eds., Academic Press, 1990, beide sind hiermit durch Inbezugnahme enthalten).
Vollständige Sequenzen wurden in den Säugetierexpressionsvektor V1Jns kloniert (J. Shiver et al., 1996, in DNA Vaccines, eds., M. Liu et al., N.Y. Acad. Sci., N.Y., 772:198–208, was hiermit durch Inbezugnahme enthalten ist) und mit Standardmethoden sequenziert. In Fällen, wo die aktuelle Sequenz sich von der erwarteten unterscheidet und in einer Aminosäuresubstitution resultierte, wurde diese Sequenz durch die vorher beschriebene PCR-Mutagenese korrigiert (PCR Protocols, M. Innis et al., eds., Academic Press, 1990, pg 177–180).
Die Proteinexpression wurde durch transiente Transfektion von gleichen Mengen von Plasmid-DNA in 293-Zellen (transformierte embryonale menschliche Nierenzellen) bewertet, die 48 Stunden nach der DNA-Zugabe geerntet wurden. Die Zelllysate wurden normiert um gleiche Proteinbeladung bereitzustellen. Die Analyse erfolgte durch indirekte Immunofluoreszenz- oder Immunoblot(Western)-Analyse unter Verwendung von Seren, die für jedes der HPV-Proteine hergestellt wurden. (Current Protocols in Molecular Biology, eds., F. Ausabel et al., John Wiley and Sons, 1998, was hiermit durch Inbezugnahme enthalten ist).
BEISPIEL 2
Synthese von HPV 16 L1
Die Gene, die für HPV 16 L1 kodieren, wurden durch Verbinden und Verlängern der 14 Oligomere hergestellt, die in 17 aufgelistet sind. Fünf separate Verlängerungsreaktionen wurden, um Fragmente der Gene zu erzeugen, welche als L1A, L1B, L1C, L1D und L1E bezeichnet werden, mit PCR unter Bedingungen durchgeführt, ähnlich denen, die in den nachfolgenden BEISPIELEN 3 und 4 beschrieben sind.
L1A wurde aufgebaut unter Verwendung der Oligomersequenzen MN4A1 (SEQ-ID-NR.9), MN4A2 (SEQ-ID-NR.16) und MN4A3 (SEQ-ID-NR.10), die unter Verwendung der Oligomere MN604 (SEQ-ID-NR.32) und MN596 (SEQ-ID-NR.24) amplifiziert wurden.
L1B wurde aufgebaut unter Verwendung der Oligomersequenzen MN4A4 (SEQ-ID-NR.17) MN4A5 (SEQ-ID-NR.11) und MN4A6 (SEQ-ID-NR.18) und wurden unter Verwendung der Oligomere MN595 (SEQ-ID-NR.23) und MN598 (SEQ-ID-NR.26) amplifiziert.
L1C wurde erzeugt unter Verwendung der Oligomersequenzen MN4A7 (SEQ-ID-NR.12) und MN4A8 (SEQ-ID-NR.19) und wurden unter Verwendung der Oligomere MN597 (SEQ-ID-NR.25) und MN602 (SEQ-ID-NR.30) amplifiziert.
L1D wurde erzeugt unter Verwendung der Oligomersequenzen MN4A9 (SEQ-ID-NR.13) MN4A10 (SEQ-ID-NR.20) und MN4A11 (SEQ-ID-NR.14), die unter Verwendung der Oligomere MN597 (SEQ-ID-NR.25) und MN602 (SEQ-ID-NR.30) amplifiziert wurden.
L1E wurde erzeugt unter Verwendung der Oligomersequenzen MN4A12 (SEQ-ID-NR.21), MN4A13 (SEQ-ID-NR.15) und MN4A14 (SEQ-ID-NR.22), die unter Verwendung der Oligomere MN601 (SEQ-ID-NR.29) und MN603 (SEQ-ID-NR.31) amplifiziert wurden.
Die Fragmente L1A, L1B, L1C, L1D und L1E, resultierend aus den PCR-Reaktionen, wurden auf niedrig schmelzender Agarose gelgetrennt, wobei die Produkte entsprechend der Größe unter Verwendung des Agarase^TM – Verfahrens (Boehringer Mannheim Biochemicals) herausgeschnitten und gereinigt wurden, wie vom Hersteller empfohlen. Die Fragmente L1A, L1B und L1C wurden in einer nachfolgenden PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligomere MN604 (SEQ-ID-NR.32) MN600 (SEQ-ID-NR.28) zum Aufbau von L1A-B-C kombiniert; die Fragmente L1D und L1E wurden durch nachfolgende PCR mit den Oligomeren MN599 (SEQ-ID-NR.27) und MN603 (SEQ-ID-NR.31) zu L1D-E aufgebaut. Das vollständige Gen wurde dann durch zusätzliche PCR Reaktionen aufgebaut, wobei die Fragmente L1A-B-C und L1D-E mit den Oligomeren MN604 (SEQ-ID-NR.32) und MN603 (SEQ-ID-NR.31) in einer abschließenden Serie von PCR Reaktionen kombiniert wurden. Das resultierende 1,5 kb Produkt wurde gelisoliert, mit Bgl II geschnitten und in den V1Jns subkloniert und sequenziert. In Fällen, bei denen Mutationen beobachtet wurden, wurden diese durch PCR-Mutagenese, wie in BEISPIEL 1 beschrieben, korrigiert. DNA wurde von einem Klon mit der korrekten HPV16 L1-DNA-Sequenz und korrekter Orientierung im V1Jns isoliert zur Verwendung in transienten Transfektionsassays, wie in BEISPIEL 1 beschrieben.
Transfektionsresultate (HPV16 L1)
9 zeigt die HPV16 L1-Immunoblotresultate von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit dem V1Jns-Plasmid, das entweder das natürliche oder das codon-optimierte synthetische HPV16 L1 enthält. Spuren a, b und c zeigen die Expressionsgrade, die unter Verwendung des synthetischen HPV16 L1-Expressionskonstrukts erreicht wurden. Ein hohes Ausmaß an immunreaktivem Material ist in jeder dieser Spuren ersichtlich, mit einer dominierenden Bande bei ca. 55 kDa, übereinstimmend mit dem erwarteten Molekulargewicht für ein komplettes HPV16 L1. Im Gegensatz dazu ist so gut wie kein immunreaktives Material in den Spuren ersichtlich, die Lysate enthalten, die mit natürlichem HPV16 L1/V1Jns-Plasmid transfiziert sind (Spuren d, e und f). Da alle Zelllysat-Beladungen normiert wurden und äquivalente DNA-Mengen in den Transfektionen eingesetzt wurden, zeigen diese Befunde, dass die synthetische Gensequenz das Ausmaß der HPV16 L2-Proteinakkumulation im Verhältnis zur natürlichen Gensequenz außerordentlich steigert.
BEISPIEL 3
Synthese von HPV16 E1
Das Gen, das für die modifizierte Form von HPV16 E1 kodiert, wurde aufgebaut aus einer Serie von Fragmenten: E1A, E1B, E1C, E1D, E1E und E1F, unter Verwendung der Oligomere, die in 18 aufgelistet sind. E1A wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN605 (SEQ-ID-NR.33), MN606 (SEQ-ID-NR.34) und MN607 SEQ-ID-NR.35) und unter Verwendung der Oligomere MN636 (SEQ-ID-NR.64) und MN624(SEQ-ID-NR.52) amplifiziert.
E1B wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN608 (SEQ-ID-NR.36), MN609 (SEQ-ID-NR.37) und MN610 (SEQ-ID-NR.38), die mit den Oligomeren MN623 (SEQ-ID-NR.51) und MN626 (SEQ-ID-NR.54) amplifiziert wurden.
E1C wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN611 (SEQ-ID-NR.39) und MN612 (SEQ-ID-NR.40), welche mit den Oligomeren MN625 (SEQ-ID-NR.53) und MN628 (SEQ-ID-NR.56) amplifiziert wurden.
E1D wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN613 (SEQ-ID-NR.41), MN614 (SEQ-ID-NR.42) und MN615 SEQ-ID-NR.43) die mit den Oligomeren MN627 (SEQ-TD-NR.55) und MN630 (SEQ-ID-NR.58) amplifiziert wurden.
E1E wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN616 (SEQ-ID-NR.44) MN617 (SEQ-ID-NR.45) und MN618 (SEQ-ID-NR.46) die mit den Oligomeren MN629 (SEQ-ID-NR.57) und MN632 (SEQ-ID-NR.60) amplifiziert wurden.
E1F wurde erzeugt durch Aufbau aus den Oligomeren MN619 (SEQ-ID-NR.47) MN620 (SEQ-ID-NR.48) und MN621 (SEQ-ID-NR.49), die mit den Oligomeren MN631 (SEQ-ID-NR.59) und MN635 (SEQ-ID-NR.63) amplifiziert wurden.
Produkte dieser PCR-Reaktionen wurden gelisoliert und in nachfolgenden PCR-Durchläufen unter Verwendung von Methoden, die oben beschrieben wurden, kombiniert, um ein 2 kb Genfragment zu erzeugen, das für ein HPV16 E1 kodiert. Das resultierende HPV16 E1 wurde wie oben in den V1Jns-Expressionsvektor eingefügt und in transienten Transfektionstudien, wie in BEISPIEL 1 beschrieben, verwendet.
Transfektionsresultate (HPV16 E1)
10 zeigt die HPV16 E1-Immunoblotresultate von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit dem V1Jns-Plasmid, das entweder natürliches oder codon-optimiertes synthetisches HPV16 E1 enthält. Spuren b und e zeigen die Expressionsgrade, die unter Verwendung des codonoptimierten HPV16 E1-Expressionskonstrukts erreicht wurden. Ein hohes Ausmaß an HPV16 E1-spezifischen Immunfärbungen ist ersichtlich, mit einer dominierenden Bande in Spuren b und e bei 72 kDa, übereinstimmend mit der erwarteten Größe für vollständiges HPV16 E1. Zusätzlich gibt es eine Anzahl kleinerer immunreaktiver Produkte, die anscheinend E1-spezifisch sind, da sie in der pseudotransfizierten Kontrolle Spur c) nicht beobachtet werden.
Ein völlig unterschiedliches Expressionsprofil wird indessen beobachtet in Lysaten von Zellen, transfiziert mit dem natürlichen HPV16 E1/V1Jns-Konstrukt. Wie in Spuren a und d gezeigt, können nur kleine Mengen von immunreaktivem Material visualisiert werden, das in der pseudo-transfizierten Kontrolle nicht anwesend ist. Da alle Zelllysatbeladungen normiert wurden und äquivalente DNA-Mengen in den Transfektionen benutzt wurden, zeigen diese Befunde, dass die syntheti sche Gensequenz das Ausmaß der HPV16 E1-Proteinakkumulation im Verhältnis zur natürlichen Gensequenz außerordentlich erhöht.
BEISPIEL 4
Synthese von HPV16 E2
Fragment AD. Eine 50 μl Reaktion, enthaltend die Oligonukleotide 13856-307-2A (SEQ-ID-NR.65), 13856-307-2B (SEQ-ID-NR.71), 13856-307-2C (SEQ-ID-NR.66) und 13856-307-2D (SEQ-ID-NR.72), jeweils 150 nM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer (Stratagen; La Jolla, CA) und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase (Stratagen), wurde in einem GeneAmp 9700 Thermocycler (Perkin Elmer Applied Biosystems; Foster City, CA) unter folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min. Zu der Reaktion wurden Primer 13856-307-2PA (SEQ-ID-NR.78) und 13856-307-2PD (SEQ-ID-NR.82) bis zu einer Endkonzentration von jeweils 400 nM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugefügt. Die Mischung wurde 2 min bei 95°C und dann 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min inkubiert. Das gelisolierte vollständige Fragment AD wurde über 20 Zyklen unter den gleichen Bedingungen unter Verwendung der Primer 13856-307-2PA (SEQ-ID-NR.78) und 13856-307-2PD (SEQ-ID-NR.82) amplifiziert.
Fragment EH. Eine 50 μl Reaktion, enthaltend die Oligonukleotide 13856-307-2E (SEQ-ID-NR.67), 13856-307-2F (SEQ-ID-NR.73), 13856-307-2G (SEQ-ID-NR.68) und 13856-307-2H (SEQ-ID-NR.74), jeweils 150 nM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase, wurde unter folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 2 min; 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min. Zu der Reaktion wurden die Primer 13856-307-2PE (SEQ.ID.NR. 80) und 13856-307-2PH (SEQ.ID.NR. 83) bis zu einer Endkonzentration von je 400 nM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugefügt. Die Mischung wurde bei 95°C, 2 min dann 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min inkubiert.
Fragment IL. Eine 50 μl Reaktion, enthaltend die Oligonukleotide 13856-307-2I (SEQ-ID-NR.69), 13856-307-2J (SEQ-ID-NR.75), 13856-307-2K (SEQ-ID-NR.70) und 13856-307-2L (SEQ-ID-NR.76), jeweils 150 nM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase, wurde unter folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 2 min; 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min. Zu der Reaktion wurden die Primer 13856-307-2PI (SEQ-ID-NR.81) und 13856-307-2PL (SEQ-ID-NR.84) bis zu einer Endkonzentration von 400 nM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugegeben. Die Mischung wurde bei 95°C, 2 min; dann 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 2,5 min inkubiert.
Fragment AH. Ein 50 μl Reaktion, enthaltend je 1,5 μl von AD- und EH-PCR-Produkten, dNTPs je 0,5 mM, nativen Puffer und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase, wurde untern folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 3,5 min. Zu der Reaktion wurden die Primer 13856-307-2PA (SEQ-ID-NR.78) und 13856-307-2PH (SEQ-ID-NR.83) bis zu einer Endkonzentration von je 400 nM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugegeben. Die Mischung wurde bei 95°C, 2 min; dann 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s und 72°C, 3,5 min inkubiert.
Fragment IM. Eine 50 μl Reaktion, enthaltend 1 μl des IL PCR-Produkts, die Oligonukleotide 13856-307-2M (SEQ-ID-NR.77) und 13856-307-2PI (SEQ-ID-NR.81), jeweils mit einer Endkonzentration von 400 nM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase, wurde unter folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 4 min.
Aufbau von AM, vollständiges HPV16 E2. Eine 50 μl Reaktion, enthaltend je 1,5 μl der Fragmente AH und IM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase, wurde unter folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s; und 72°C, 4 min. Zu der Reaktion wurden die Primer 13856-307-2PA (SEQ-ID-NR.78) und 13856-307-2PM (SEQ-ID-NR.79) mit einer Endkonzentration vom 400 μM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugegeben. Die Mischung wurde bei 95°C, 2 min; dann 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s und 72°C, 4 min inkubiert. Das resultierende vollständige Fragment wurde durch Elektrophorese über ein 1,2 % Agarosegel isoliert, die DNA wurde mit einer QIAquick-Säule gewonnen (Qiagen; Santa Clarita, CA) und zur Beurteilung in den Expressionsvektor V1Jns subkloniert.
Transfektionsresultate (HPV16 E2)
11 zeigt die HPV16 E2-Immunoblotresultate von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit dem V1Jns-Plasmid, das entweder natürliches oder synthetisches HPV16 E2 enthält. Spuren c und d zeigen die Expressionsgrade, die unter Verwendung des codon-optimierten HPV16 E2-Expressionskonstruktes erreicht wurden. Ein hohes Ausmaß an von HPV16 E2-spezifischen Immunfärbungen, die scheinbar E2-spezifisch sind, ist sichtbar, da dieses nicht in der pseudotransfizierten Kontrolle (Spur c) beobachtet wird.
Ein völlig anderes Expressionsprofil wird indessen in Lysaten von Zellen beobachtet, die mit dem nativen HPV16 E2/V1Jns-Konstrukt transfiziert sind. Wie in Spur e gezeigt ist, kann kein immunreaktives Material visualisiert werden. Da alle Zelllysatbeladungen normiert wurden und äquivalente DNA-Mengen für die Transfektion benutzt wurden, zeigen diese Befunde, dass die synthetische Gensequenz das Ausmaß der HPV16 E2-Proteinakkumulation im Verhältnis zu den natürlichen Gensequenzen außerordentlich erhöht hat.
BEISPIEL 5
Synthese von HPV16 E7
Das Gen, kodierend für HPV16 E7, wurde aufgebaut aus einer Serie von Fragmenten unter Verwendung von Oligomeren, die in 20 aufgelistet sind.
Eine 50 μl Reaktion, enthaltend die Oligonukleotide 13856-307-7A (SEQ-ID-NR.85), 13856-307-7B (SEQ-ID-NR.87), 13856-307-7C (SEQ-ID-NR.86) und 13856-307-7D (SEQ-ID-NR.88) jeweils 150 nM, dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer (Stratagen; La Jolla, CA) und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase (Stratagen), wurde in einem GeneAmp 9700 Thermocycler (Perkin Elmer Applied Biosystems; Foster City, CA) unter den folgenden Bedingungen inkubiert: 95°C, 2 min; 20 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s und 72°C, 2,5 min. Zu der Reaktion wurden Primer 13856-307-7PA (SEQ-ID-NR.89) und 13856-307-7PD (SEQ-ID-NR.90) bis zu einer Endkonzentration von 400 nM und 1 μl native Pfu-DNA-Polymerase zugegeben. Die Mischung wurde für 25 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s und 72°C, 2,5 min inkubiert.
Die resultierenden vollständigen Fragmente wurden durch Elektrophorese über ein 1,2 % Agarosegel in TBE (Current Protocols in Molecular Biology, eds., F. Ausabel et al., das hiermit durch Inbezugnahme enthalten ist) isoliert, mit Ethidiumbromid angefärbt, vom Gel ausgeschnitten, über eine GenElute-Säule (Supleco; Bellefonte, PA) gewonnen und in 20 μl Wasser resuspendiert. Die Sequenz wurde in einer 51 μl Reaktion, enthaltend 2 μl des Fragments, je 0,5 μM der Oligonukleotide 13856-307-7PA (SEQ-ID-NR.89) und 13856-307-7PD (SEQ.ID.NR.90), dNTPs jeweils 0,5 mM, nativen Puffer und native Pfu-DNA-Polymerase weiter amplifiziert. Die Reaktion wurde 20 Zyklen bei 95°C, 45 s; 55°C, 45 s und 72°C, 2,5 min unterworfen. Das amplifizierte Endprodukt wurde durch Elektrophorese wie oben beschrieben isoliert; die DNA wurde mit einer QIAquick-Säule (Qiagen; Santa Clarita, CA) gewonnen und in einen V1Jns subkloniert.
Transfektionsresultate (HPV16 E7)
12 zeigt die HPV16 E7-Immunoblotresultate von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit dem V1Jns-Plasmid, das entweder natürliches (Spur e) oder synthetisches HPV16 E7 (Spur c und d) enthält. Ein hohes Ausmaß an HPV16 E7-spezifischen Immunfärbungen ist in den synthetischen HPV16 E7-Gen-Zelllysatspuren sichtbar, die erheblich stärker in Erscheinung treten, als die der natürlichen HPV16 E7-Gen-Zelllysate (Spur e). Spuren a und b sind negative Transfektionskontrollen, die zeigen, dass die Antikörperfärbung spezifisch für HPV16 E7-Sequenzen ist. Da alle Zelllysatbeladungen normiert wurden und äquivalente DNA-Mengen in den Transfektionen verwendet wurden, zeigen diese Resultate, dass die synthetische Gensequenz das Ausmaß der HPV16 E2-Proteinakkumulation im Verhältnis zu der natürlichen Gensequenzen außerordentlich erhöht.
BEISPIEL 6
Synthese der E7- und E2-kodierenden Gene von HPV6a und HPV18:
Die Gene, die für HPV6a E7 und HPV18 E7 kodieren wurden unter Verwendung ähnlicher Methoden aufgebaut, wie in BEISPIEL 4 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass die Oligomere, die für die Herstellung von HPV6a E7- und HPV18 E7-Genen verwendet wurden, die Sequenzen, die in 21 bzw. 22 aufgelistet sind, enthalten. Die Konstruktion der synthetischen Gene, die für HPV6a E2 und HPV18 E2 kodieren, wurde in einer ähnlichen Weise durchgeführt, wie in BETSPIEL 5 aufgeführt ist, unter Verwendung der Oligomersequenzen, die in 23 bzw. 24 aufgelistet sind.
Transfektionsresultate: HPV6a E7 und HPV18 E7
13 zeigt die HPV6a E7-Immunoblotresultate von Lysaten aus 293-Zellen, transient transfiziert mit dem V1Jns-Plasmid, welches synthetisches HPV6a E7 enthält (Spuren b und c). Ein hohes Ausmaß an HPV6a E7-spezifischen Immunfärbungen ist in der Region sichtbar, in der das vollständige HPV6a E7 erwartet wurde. Ein ähnliches Profil wird in 14 bei HPV18 E7-Immunoblotanalyse von Lysaten aus 293-Zellen gefunden, die transient mit den V1Jns-Plasmid, das synthetisches HPV6aE7 (Spuren b, c, d und e) enthält, transfiziert waren. Ein hohes Ausmaß an HPV18 E7-spezifischen Immunfärbungen ist sichtbar, wo vollständiges HPV18 E7 sein sollte, wie durch die Lage der gereinigten HPV18 Proteinkontrolle (Spur f) angezeigt wird. Es scheint keinerlei gefärbtes Material in der negativen Kontrollspur a zu sein, was anzeigt, dass die Färbung in den anderen Spuren HPV18 E7-spezifisch ist.
Die Expression des synthetischen Gens, das für HPV6a E2 in V1Jns kodiert, wurde durch Immunoblotanalyse von transfizierten 293-Zellen bewertet, wie in 15 dargestellt ist. Spuren a und b sind Zelllysate der synthetischen HPV6a E2-Transfektanten; Spuren c und d sind negative Kontrollen. Das analoge Experiment wird für eine HPV18 E2-Expression in 16 gezeigt. Spuren c und d sind Zelllysate von Transfektionen, die synthetische HPV18 E2-Gene erhalten; Spuren a und b sind negative Kontrollen. Beide Figuren zeigen ein messbares Ausmaß an E2-Produktakkumulation, wenn das codon-optimierte synthetische Gen in Säugerzellen exprimiert wird.
Diese Resultate zeigen, dass der Umbau zum synthetischen Gen nicht auf HPV16-Gene limitiert ist. Vielmehr erlaubt die Codon-Optimierung von anderen HPV-Typen ein signifikantes Ausmaß an E7- und E2-Produktakkumulation in Säugerzellen.
BEISPIEL 7
Konstruktion eines replikationsgestörten FG-Ad, das HPV-Antigen exprimiert
Startvektoren
Der Shuttle-Vektor pHCMVIBGHpA1 enthält Ad5 Sequenzen von bp1 bis bp341 und bp 3534 bis bp 5798 mit einer Expressionskassette, enthaltend Human-Cytomegalovirus(HCMV)-Promotoren plus Intron A sowie das Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal.
Der adenovirale Backbone-Vektor pAdE1-E3- (auch als pHVad1 bezeichnet) enthält alle Ad5-Sequenzen ausgenommen solche Nukleotide, die die E1- und E3-Region umfassen.
Konstruktion von Ad5. HPV16 E2

1. Konstruktion eines adenoviralen Shuttle-Plasmids pA1-CMVI-HPV16 E2, das HPV16 E2 enthält, unter der Kontrolle eines Human-CMV-Promotors und Intron A. Die HPV16 E2-Insertion wurde aus pV1JNS-HPV16 E2 durch die Restriktionsenzyme Bgl II und EcoRI ausgeschnitten und dann in den mit Bgl II und EcoRI geschnittenen Shuttlevektor pHCMVBGHpA1 kloniert.
2. Homologe Rekombination zur Erzeugung einer Plasmidform des rekombinanten adenoviralen Vektors pAd-CMVI-HPV16 E2, der eine HPV16 E2-Expressionskassette enthält. Das Shuttle-Plasmid pAl-CMVI-HPV16 E2 wurde mit den Restriktionsenzymen BstZ17 und SgrA1 geschnitten und dann in den E.coli-Stamm BJ5183 mit linearisiertem (d.h. mit ClaI geschnittenem) adenoviralen Backbone- Plasmid pAdE1-E3- co-transformiert. Eine Kolonie wurde durch PCR-Analyse nachgewiesen. Der Vektor wurde zu kompetentem E.coli HB101 zur Produktion großer Mengen des Plasmids transformiert.
3. Erzeugung des rekombinanten Adenovirus Ad.CMVI-HPV16 E2 in 293-Zellen. Das pAd-Plasmid wurde durch das Restriktionsenzym PacI linearisiert und unter Verwendung der CaPO₄-Methode (Invitrogen-Kit) zu 293-Zellen transfiziert. 10 Tage später wurden 10 Plaques herausgegriffen und in 293-Zellen in 35 mm Schalen aufgezogen. PCR Analyse der adenoviralen DNA zeigte Viren, die HPV16 E2-positiv waren.
4. Auswertung einer großen Menge des rekombinanten Adenovirus Ad.CMVI-HPV16 E2. Ein ausgewählter Klon wurde durch mehrfache Amplifizierungsrunden in 293-Zellen zu großen Mengen herangezüchtet. Die Expression von HPV16 E2 wurden ebenfalls durch ELISA- und Western Blot-Analyse der 293- oder COS-Zellen, die mit dem rekombinanten Adenovirus infiziert waren, ausgewertet. Der rekombinante Adenovirus wurde für. eine Bewertung in Mäusen und Rhesus-Affen verwendet.

Behandlungsmethode
Einer Person mit dem Bedarf an einer therapeutischen oder prophylaktischen Immunisierung gegen eine Infektion mit dem Human-Papillomavirus wird HPV-DNA, die für alle, oder Teile von HPV-L1, -E1, -E2, -E4 oder -E7 und Kombinationen davon kodiert, gespritzt. Die Injektion kann i.p., subcutan, intramuskulär oder intradermal erfolgen. Die HPV-DNA kann als Primer für die Immunantwort oder als Booster für die Immunantwort verwendet werden. Die Injektion der DNA kann einer Injektion einer Person mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend HPV-virusähnliche Partikel (nur L1-Protein enthaltend oder sowohl L1- als auch L2-Proteine enthaltend, oder Mutantenformen von einem oder mehreren Proteinen enthaltend), Kapsomere, inaktiviertes HPV, abgeschwächtes HPV, Zusammensetzungen, die von HPV abgeleitete Proteine enthalten, oder Kombinationen davon, vorausgehen, zusammenfallen oder nachfolgen.
BEISPIEL 8
Die Verwendung eines synthetisch exprimierten HPV-E-Proteins als Tumor-Antigen-Modell
Erzeugung einer Tumorzelllinie, die HPV16 E2 exprimiert.
Ein Not I/Hind III-Restriktions-Fragment, das die synthetische kodierende Sequenz für HPV16 E2 (siehe oben) enthält, wurde mit einem mit Not I und Hind III geschnittenen Expressionsvektor pBJ/neo/CCR2B verbunden, der einen Neomycin-Resistenzmarker hat und die Expression des Transgens mit dem direkten frühren HCMV-Promotor voran treibt. Das resultierende Plasmid pBJ-16E2 wurde durch Restriktion, Sequenzanalyse der Klonierungsverbindungen und der Fähigkeit zur Induktion von E2-Proteinexpression in transient transfizierten A293- oder CT26-Zellen charakterisiert. Eine stabile Zelllinie wurde durch Transfektion von CT26-Zellen unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BRL) erzeugt. CT26-Zellen, eine vollständig transformierte Zelllinie, die aus einem BALB/c-Maus-Kolonkarzinom erhalten wurde, werden weithin verwendet, um Tumorantigenmodelle zu präsentieren. (Brattain et al., 1980 Cancer Research 40:2142–2146; Fearon, E. et al., 1988 Cancer Research, 48:2975–2980; beide sind hiermit durch Inbezugnahme enthalten).
Nach 48 Stunden wurden die Zellen trypsiniert, 1:10, 1:100, 1:1000 oder 1:10000 in ein Medium verdünnt und in 100 mm² Schalen plattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen das Auswahlmedium, das 400 μg/ml G418 enthält, ausgetauscht. Nach 2 bis 3 Wochen wurden gut isolierte Zellkolonien unter Verwendung von Klonringen gewonnen und auf Platten mit 48 Vertiefungen überführt. Ein Klon war nach Immunoblot-Analyse positiv auf E2-Expression und wurde zwei weiteren Klonierungsrunden mit limitierender Verdünnung unterworfen. Ein G418-resistentes, E2-positives klonales Isolat wurde zum Aufbau der Zelllinie JCL-031 (25) verwendet.
Wenn JCL-031 Zellen in (genidentische) BALB/c-Mäuse durch subkutane Injektion geimpft wurden, induzierten Tumore mit Kinetiken vergleichbar mit denen der CT26-Mutterzelllinie. Zellkulturen von gewonnenen Tumoren waren gegen G418 resistent und exprimierten E2.
Induktion einer Immunität in Mäusen durch Immunisierung mit V1Jns:E2-DNA.
BALB/c-Mäuse wurden mehrere Male durch intramuskuläre Injektion mit der DNA V1Jns:16E2 immunisiert. Die Milz-Organe von zwei zufällig ausgewählten Mäusen in jeder Dosisgruppe wurden gemischt, Splenozyten wurden präpariert und in einem Maus-gamma-Interferon-Elispot-Assay geprüft. (Lalvani et al., 1997, J. Exp. Med. 186:859–865; Forsthuber, T. et al., 1996 Science 271:1728–1730; Chu, R. et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1623-1631, die alle durch Inbezugnahme enthalten sind). Splenozyten-Kulturen wurden bei 37°C für 24 Stunden in der Gegenwart eine Pools aus 36 überlappenden Peptiden mit 20 Aminosäureresten (Endkonzentration jeweils 4 μg/ml), die volle Länge von HPV16 E2 abfragend, inkubiert. Gamma-Interferon wurde auf dem Substrat durch monoklonale Antikörper (mAb) R4-6A2 (Pharmagin) eingefangen und mit biotinyliertem mAb XMG1.2 (Pharmagin) und einem Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Pharmagin) detektiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle A gezeigt. Die immunisierten Mäuse entwickeln eine CD4⁺-Immunantwort auf HPV (Tabelle A, unten).
Eine Immunisierung mit E2-DNA induzierte keine erkennbare Anti-E2-Antikörperantwort.
Schutz vor einer Herausforderung ("Challange") mit JCL-031-Zellen.
BALB/c-Mäuse, immunisiert mit V1Jns:E2-DNA oder Kontroll-DNA, wurden durch subkutane Injektion von 5 × 10⁵ JCL-031 Zellen in die linke Leistengegend herausgefordert. Das Tumorwachstum wurde durch Abtasten oder durch Tasterzirkelmessung über einen Zeitraum von 4 Wochen überwacht. 26 zeigt den Anteil jeder Dosisgruppe, die tumorfrei blieb. Die Gruppe, die mit einem E2-exprimierenden Plasmid immunisiert wurde, war verglichen mit der Kontrollgruppe signifikant vor einem Tumorwachstum geschützt.
Sequenz-Auflistung

Claims

Synthetisches Polynukleotid, umfassend eine Sequenz, welche für ein Human-Papillomavirus (HPV)-Protein kodiert, wobei die Polynukleotidsequenz Codons umfaßt, die für die Expression in einem humanen Wirt optimiert sind.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Protein aus der Gruppe, bestehend aus L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 und E7, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei das Protein aus der Gruppe, bestehend aus L1, E1, E2 und E7, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 2, welches DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Protein L1 ist und von einem HPV stammt, das aus der Gruppe, bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 und HPV68, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei das Protein ein HPV16-L1-Protein ist.
Polynukleotid nach Anspruch 6, welches das Polynukleotid von SEQ-ID-Nr. 1 umfaßt.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Protein ein E1-Protein ist und von einem HPV stammt, das aus der Gruppe, bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 und HPV68, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 8, wobei es ein HPV16-E1-Protein ist.
Polynukleotid nach Anspruch 9, welches das Polynukleotid von SEQ-ID-Nr. 2 umfaßt.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Protein ein E2-Protein ist und von einem HPV stammt, das aus der Gruppe, bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 und HPV68, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 11, welches das Polynukleotid von SEQ-ID-Nr. 3 umfaßt.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Protein E7 ist und von einem HPV stammt, das aus der Gruppe, bestehend aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 und HPV68, ausgewählt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 13, wobei das Protein ein HPV6a-Protein ist.
Polynukleotid nach Anspruch 14, welches das Polynukleotid von SEQ-ID-Nr. 4 umfaßt.
Adenovirus-Vakzin-Vektor, umfassend ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfaßt, umfassend A) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer humanen Wirtszelle codon-optimiert ist, und B) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Vektor nach Anspruch 16, wobei das adenovirale Genom auch eine deletierte E3-Region enthält.
Shuttle-Plasmidvektor, umfassend einen Plasmidanteil und einen adenoviralen Anteil, wobei der adenovirale Anteil ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region umfaßt, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfaßt, umfassend A) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer humanen Wirtszelle codon-optimiert ist, und B) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Vakzin-Plasmid, umfassend einen Plasmidanteil und einen Expressionskassettenanteil, wobei der Expressionskassettenanteil umfaßt A) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer humanen Wirtszelle codon-optimiert ist, und B) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Plasmid nach Anspruch 19, wobei der Plasmidanteil V1Js ist.
Vakzin, welches zwischen 1 ng und 100 mg des Polynukleotids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Vakzin, welches zwischen 10¹¹ – 10¹² Partikel eines adenoviralen Vektors, der das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 trägt, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Vakzin, das für die Verabreichung zu zwei Zeitpunkten adaptiert ist, welches umfaßt: einen ersten Teil A) umfassend einen ersten Vektor, der ein Polynukleotid umfaßt, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer humanen Wirtszelle codon-optimiert ist, und einen zweiten Teil B) umfassend einen zweiten Vektor, der einen adenoviralen Vakzin-Vektor umfaßt, welcher ein adenovirales Genom mit einer Deletion in der E1-Region und einer Insertion in der E1-Region umfaßt, wobei die Insertion eine Expressionskassette umfaßt, umfassend i) ein Polynukleotid, kodierend für ein HPV-Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus L1-, E1-, E2- und E7-Proteinen, ausgewählt ist, wobei das Polynukleotid für die Expression in einer humanen Wirtszelle codon-optimiert ist, und ii) einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem Polynukleotid.
Verfahren zur Herstellung eines HPV-Proteins, umfassend das Exprimieren eines synthetischen Polynukleotids, das für ein Human-Papillomavirus (HPV)-Protein kodiert, in einer Wirtszelle, wobei die Polynukleotidsequenz Codons umfaßt, die für die Expression in einem humanen Wirt optimiert sind.