DE10055545A1 - Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen - Google Patents
Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA SequenzenInfo
- Publication number
- DE10055545A1 DE10055545A1 DE10055545A DE10055545A DE10055545A1 DE 10055545 A1 DE10055545 A1 DE 10055545A1 DE 10055545 A DE10055545 A DE 10055545A DE 10055545 A DE10055545 A DE 10055545A DE 10055545 A1 DE10055545 A1 DE 10055545A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hpv16
- expression
- dna sequences
- hpv
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 35
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 title description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 abstract description 18
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 abstract description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 13
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 101710132637 Protein C2 Proteins 0.000 description 1
- 101710132697 Protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000017111 nuclear migration Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
Beschrieben werden hinsichtlich der Codon-Verwendung optimierte DNA-Sequenzen, die ein HPV 16-Kapsidprotein L1 bzw. HPV 16-Kapsidprotein L2 kodieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen die in den Figuren 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmente oder Varianten dieser DNA-Sequenzen und erlauben die einfache rekombinante Herstellung von HPV 16-L1- bzw. L2-Kapsidproteinen oder Fragmenten davon mit hoher Ausbeute unter Vermeidung der Verwendung viraler Vektoren, vorzugsweise zur Herstellung von Vakzinen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft hinsichtlich der Codon-
Verwendung optimierte DNA-Sequenzen, die für ein HPV16-
Kapsidprotein L1 bzw. HPV16-Kapsidprotein L2 kodieren. Diese
DNA-Sequenzen umfassen die in den Fig. 5, 6 oder 7
gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmente oder Varianten dieser
DNA-Sequenzen. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen erlauben
die einfache rekombinante Herstellung von HPV16-L1- bzw. L2-
Kapsidproteinen oder Fragmenten davon mit hoher Ausbeute unter
Vermeidung der Verwendung viraler Vektoren, vorzugsweise zur
Herstellung von Vakzinen.
Ein Teil der humanen Papilloma-Virus(HPV)-Typen ist für den
Menschen relativ harmlos (z. B. HPV 1), während andere Typen
humaner Papillomaviren eng mit der Entwicklung maligner
Tumoren assoziiert sind. Besonders gut charakterisiert ist
deren Beteiligung an der Entstehung des Zervixkarzinoms und
verschiedene Befunde weisen darauf hin, daß HPVs eine kausale
Ätiologie dieses Tumors spielen. Auf der molekularen Ebene
sind in etwa 95% der Zervixkarzinom-Biopsien Sequenzen
onkogener HPV-Typen (HPV16 in etwa 50-60% und HPV18 in etwa
10-20% der Fälle) nachweisbar. Die rekombinante Gewinnung von
HPV-Kapsidproteinen, z. B. HPV16-L1 oder HPV16-L2, ist daher
für die Herstellung von entsprechenden Vakzinen im
kommerziellen Maßstab von großer Bedeutung. Allerdings ist es
seit längerer Zeit bekannt, daß die Expression von HPV-
Kapsidproteinen in höheren eukaryontischen Zellen, z. B.
Säugetierzellen, ohne Verwendung bestimmter viraler Vektoren,
wie Vakzinia Virus, Semliki Forest Virus (SFV), Adenovirus
etc. praktisch nicht möglich ist. Es ist davon auszugehen, daß
ein Grund dafür darin liegen dürfte, daß Papillomaviren
Strategien entwickelt haben, die vorzeitige Expression der
sehr immunogenen Kapsidproteine im Wirt zu vermeiden. Es
wurden zwar bisher verschiedene Mechanismen, die dieser
geringen Expression zugrunde liegen könnten diskutiert, z. B.
sogenannte negativ-regulatorische Elemente auf der mRNA,
allerdings konnte bisher keine der Hypothesen experimentell
bestätigt werden. Auch durch Einsatz von mRNA-Export-Elementen
war bisher nur eine geringe Expression von z. B. HPV16-L1
möglich. Durch die deshalb bedingte Notwendigkeit der
Verwendung viraler Expressionssysteme wurde die bisherige
Verwendungsmöglichkeit der vorstehenden HPV-Kapsidproteine für
die Vakzine-Herstellung stark eingeschränkt.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem
zugrunde, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die eine einfache und
hocheffiziente rekombinante Herstellung der HPV16-
Kapsidproteine L1 und L2 erlauben.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die
Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Ausführungsformen erzielt.
Es zeigte sich, daß durch einen Austausch bestimmter Codons in
der HPV16-L1 bzw. HPV16-L2 kodierenden DNA-Sequenz unter
Beibehaltung der ursprünglichen Aminosäuresequenz die
Expression in höheren eukaryontischen Zellen sehr stark
verbessert werden kann, wobei auch nicht länger der Einsatz
von viralen Vektoren erforderlich ist. In den zu der
vorliegenden Erfindung führenden Experimenten wurden die HPV
16-L1 und -L2 kodierenden DNA-Sequenzen vollständig
neusynthetisiert, wobei dazu überlappende 85mer Primer
verwendet und die entsprechenden DNA-Sequenzen (ohne Matrize)
über PCR hergestellt wurden. Es wurden für L1 kodierende neue
DNA-Sequenzen hergestellt, die für die Expression in Pflanzen
und Säugerzellen optimiert worden waren und eine für L2
kodierende neue DNA-Sequenz, die ebenfalls für die Expression
in Säugerzellen optimiert worden war. Dabei wurden mehr als
60% aller Codons verändert. Die Expression erfolgte in dem
Vektor pUF3 unter Kontrolle des humanen Cytomegalovirus
"immediate early promotors" (pCMV), wobei es sich zeigte, daß
alle Konstrukte eine wesentlich bessere Expression zeigten im
Vergleich zu den Ausgangs-DNA-Sequenzen, wobei eine Erhöhung
der Expressionsrate bis zu einem Faktor von 10000 gefunden
wurde. Desweiteren wurde gefunden, daß eine derart hohe
Expression auch erzielt wird, wenn das HPV16-L1 oder -L2 in
Fusionsproteinen, z. B. mit E7 von HPV16 oder Teilen davon,
vorliegt, wobei die DNA-Sequenzen der mit HPV16-L1 oder -L2
fusionierten Polypeptide in Wildtyp-Form vorliegen können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-
Sequenz, die für ein HPV16-Kapsidprotein L1 kodiert und die
in Fig. 5 oder 6 gezeigte DNA-Sequenz umfaßt, oder für ein
HPV16-Kapsidprotein L2 kodiert und die in Fig. 7 gezeigte
DNA-Sequenz umfaßt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine DNA-Sequenz, die
für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines
HPV-16-Kapsidproteins L1 oder eines HPV16-Kapsidproteins L2
kodiert und die ein Fragment oder eine Variante der in Fig.
5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenz ist.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff
"Fragment" umfaßt DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den
Fig. 5, 6 und 7 angegebenen DNA-Sequenzen dadurch
unterscheiden, daß sie nur einen Teil davon oder Teile davon
umfassen, die jedoch noch Polypeptide mit einer biologischen
Aktivität des von der Gesamtsequenz kodierten Proteins
kodieren, wobei sich in diesem Zusammenhang der Begriff
"biologische Aktivität" vorzugsweise auf die Wirksamkeit als
Vakzine bezieht. Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren
solche Fragmente herstellen bzw. auswählen, die noch über
diese Eigenschaft verfügen.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff
"Variante" umfaßt DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den
Fig. 5, 6 und 7 angegebenen DNA-Sequenzen dadurch
unterscheiden, daß sie nicht alle der in den Figuren
angegebenen veränderten Codons, d. h. weniger im Vergleich zu
den Ausgangs-DNA-Sequenzen veränderte Codons, also noch mehr
WT-Codons enthalten. Dabei beträgt die Rate der gegenüber den
ursprünglichen DNA-Sequenzen veränderten Codons mindestens
10-40%, vorzugsweise mindestens 50% und am meisten bevorzugt
mindestens 55%. Diese Codonveränderungen führen nicht dazu,
daß die Wirkung der davon translatierten Polypeptide als
Vakzine wesentlich beeinträchtigt wird, vorzugsweise führen
sie nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch mit weiteren
DNA-Sequenzen fusioniert sein, die die Synthese von
Fusionsproteinen bewirken, wobei diese Fusionsproteine neben
HPV16-L1 oder -L2 oder Teilen davon vorzugsweise ein weiteres
HPV16-Protein oder ein Teil davon, z. B. ein Kapsidprotein
oder ein Strukturprotein, wie E7, umfassen, was u. U. zu einer
verbesserten Vakzine führen kann. Günstig kann es sein, wenn
das HPV16-L1 oder -L2 kein Kernwanderungssignal (NLS)
aufweist, daß ein solches dann z. B. in Form jenes von SV40, im
Fusionsprotein vorliegt. Bevorzugte Fusionsproteine sind
HPV16-L1-human delta C E7 1-60, HPV16-L1 human delta C NLS-E7
(short) und HPV16-L1 human delta C NLS-E7 (long). Es wird auf
die Fig. 8-10 verwiesen.
Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der
DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken
der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY
(1989)). Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob
ein von einer so veränderten DNA-Sequenz kodiertes Protein
noch über die biologischen Eigenschaften des Ausgangsproteins
verfügt.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in einen
Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt
die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende
Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor"
bezieht sich auf ein Plasmid (pBR322, pBlueScript, pGEMEX,
pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, etc.) oder ein anderes
geeignetes Vehikel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Vektor mit regulatorischen
Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression,
vorzugsweise in höheren eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen,
beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen
Replikationsursprung und spezifische Gene, die die
phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle
erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression
in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-
Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in
Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-,
SV40-, RVS-40, MMTV- oder Metallothionein I-Promoter für die
Expression in tierischen Zellen, insbesondere Tieren. Als
Vektoren für letztere Expression eignen sich z. B. pMSXND,
pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, insbesondere pUF3. Bevorzugt liegen
die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in einem
Expressionsvektor, z. B. pUF3 (Zolotukhin et al., J. Virol.
Vol. 70, (1906), 4646-4654) unter der Kontrolle des humanen
Cytomegalovirus "immediate early" Promoters (pCMV) vor. Ferner
können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in einen AAV-
Vektor, z. B. der Serotypen AAV1-6, wobei AAV2 bevorzugt ist,
inseriert sein, wodurch z. B. eine Vakzinierung über die
Mund/Rachen-Schleimhäute ermöglicht ist, was u. U. zur
Induktion von anti-HPV16-L1 bzw. -L2 IgA Antikörper führt.
Desweiteren können auch andere Viren oder abgeschwächte bzw.
inaktivierte Bakterien als Vektor für die erfindungsgemäßen
DNA-Sequenzen verwendet werden. Solche sind z. B. Vakzinia
Viren, Herpes Simplex Viren oder Adenoviren bzw. Salmonellen
oder Listerien. Darüberhinaus zählen zu den erfindungsgemäßen
Expressionsvektoren auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren
für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise
pAcSGHisNT-A.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in pflanzlichen Zellen,
Vektoren, wie pUC-Derivate, verwendet werden, die für
pflanzliche Zellen geeignete regulatorische Elemente
enthalten. Solche Elemente umfassen z. B. Promotoren, wie den
Couliflower Mosaic Virus 35S Promotor, den Agrobacterium
tumefaciens Nopalin Synthase Promotor und den Mannopin
Synthase Promotor. Sollten aus den transfizierten pflanzlichen
Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist es günstig, wenn
ferner ein selektierbarer Marker, wie das
Neomycinphosphotransferase II-Gen aus E.coli, das Sulfonamid-
Resistenzgen oder das Hygromydin-Resistenzgen vorliegt.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur
Konstruktion von Expressionsvektoren, die die
erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete
Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen
Verfahren zählen beispielsweise in vitro-
Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in
vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in
Sambrook et al., supra, beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend
beschriebenen DNA-Sequenzen oder Vektoren enthaltende
Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen vorzugsweise
pflanzliche Zellen, insbesondere Zellen von Weizen, Gerste,
Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Brassicaceen, Leguminosen,
Tabak, Kartoffel, Pilze, Moose und Algen, sowie tierische
Zellen, insbesondere Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen
sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293T-, 911- und
WI38-Zellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch
die aus den Wirtszellen generierbaren Wirte, insbesondere
Pflanzen. Verfahren zur Transformation vorstehender
Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten
und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem
Fachgebiet bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur
Herstellung eines HPV16-Kapsidproteins L1 oder eines HPV
16-Kapsidproteins L2, das die Kultivierung der vorstehend
beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen umfaßt, die die
Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben
(vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des
Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann
sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte
Wirtszellen zu kultivieren. Geeignete Reinigungsverfahren
(beispielsweise präparative Chromatographie,
Affinitätschromatographie, beispielsweise
Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls
allgemein bekannt.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in exprimierbarer Form,
z. B. in rekombinanten AAVs, sowie mit den erfindungsgemäßen
DNA-Sequenzen rekombinant hergestellten HPV16-Kapsidproteine
erlauben die einfache und kostengünstige Herstellung eines
Vakzinierungsmittels gegen HPV16-Infektionen, das
gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen
Träger enthält. Geeignete Träger und die Formulierung
derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu
geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise
Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die
Verabreichung des Vakzinierungsmittels kann oral oder
parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale
Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle,
intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale,
intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder
intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von
dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen
Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter und dem Gewicht des
Patienten, der Art der Verabreichung etc.
Fig. 1 Vergleich der Expression von HPV16 L1 - original
(L1ori), optimiert für Pflanzenexpression (pL1)
und Expression in humanen Zellen (hL1) nach
transienter Transfektion der entsprechenden
Expressionsplasmide in humane Zellen
Extrakte der transfizierten Zellen (293T Zellen) wurden in SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit einem monoklonalen anti-L1 Antikörper nachgewiesen. Entsprechend den Angaben über der Figur wurden von Extrakt hL1 im Vergleich zu dem Extrakt von pL1 und L1ori nur 1/10 bzw. 1/100 der Menge aufgetragen. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.
Extrakte der transfizierten Zellen (293T Zellen) wurden in SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit einem monoklonalen anti-L1 Antikörper nachgewiesen. Entsprechend den Angaben über der Figur wurden von Extrakt hL1 im Vergleich zu dem Extrakt von pL1 und L1ori nur 1/10 bzw. 1/100 der Menge aufgetragen. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.
Fig. 2 Direkte und indirekte Effekte der modifizierten
Leserahmen
Um der Frage nachzugehen, ob die Codons oder regulatorische Elemente die Expression von L1 beeinflussen, wurden bi cistronische Vektoren analysiert. (siehe bezüglich des schematischen Aufbaus der Vektoren den unteren Teil der Figur.) Hinter den jeweiligen L1-Genen befindet sich das eGFP- Gen, dessen Translation unabhängig von der L1-Translation von einer "internal ribosome binding site" (IRES) erfolgen kann. Ergebnis: Die eGFP-Expression wird vom jeweiligen vorgeschalteten L1-Gen beeinflußt. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.
Um der Frage nachzugehen, ob die Codons oder regulatorische Elemente die Expression von L1 beeinflussen, wurden bi cistronische Vektoren analysiert. (siehe bezüglich des schematischen Aufbaus der Vektoren den unteren Teil der Figur.) Hinter den jeweiligen L1-Genen befindet sich das eGFP- Gen, dessen Translation unabhängig von der L1-Translation von einer "internal ribosome binding site" (IRES) erfolgen kann. Ergebnis: Die eGFP-Expression wird vom jeweiligen vorgeschalteten L1-Gen beeinflußt. Kontrolle: mock transfizierte Zellen. L1ori: Original-Sequenz von HPV16-L1.
Fig. 3 HPV16-L2-Expression durch Modifikation des
Leserahmens
Die "Humanisierung" der Codons von L2 ermöglicht die Expression in Säugetierzellen (293T) nach transienter Transfektion. Die Figur. zeigt die Ergebnisse eines Western- Blot mit Verwendung eines polyklonalen anti-L2-Antiserums. Kontrolle: mock transfizierte Zellen Fig. 4 Partikelbildung nach Expression von HPV16-L1 in 911-Zellen
Die Figur zeigt die Bildung von Virus-artigen Partikeln (VLPs) nach transienter Expression von hL1 in humanen Zellen (911- Zellen). Die Zellen wurden 2 Tage nach der DNA-Transfektion fixiert, geschnitten und gefärbt. Die Abbildung zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der VPLs im Zellkern einer transfizierten Zelle. A: Übersicht; B: stärker vergrößerter Bereich
Die "Humanisierung" der Codons von L2 ermöglicht die Expression in Säugetierzellen (293T) nach transienter Transfektion. Die Figur. zeigt die Ergebnisse eines Western- Blot mit Verwendung eines polyklonalen anti-L2-Antiserums. Kontrolle: mock transfizierte Zellen Fig. 4 Partikelbildung nach Expression von HPV16-L1 in 911-Zellen
Die Figur zeigt die Bildung von Virus-artigen Partikeln (VLPs) nach transienter Expression von hL1 in humanen Zellen (911- Zellen). Die Zellen wurden 2 Tage nach der DNA-Transfektion fixiert, geschnitten und gefärbt. Die Abbildung zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der VPLs im Zellkern einer transfizierten Zelle. A: Übersicht; B: stärker vergrößerter Bereich
Fig. 5 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von pL1
Fig. 6 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hL1
Fig. 7 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hL2
Fig. 8 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von
HPV-16-L1 human delta C E7 1-60 (AS 1-474 von HPV16-L1 und
AS 1-60 von HPY16-E7)
Fig. 9 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von
HPV-16-L1 human delta C NLS-E7 (short) (AS 1-474 von
HPV16-L1, AS 1 und 2 von HPV16-E7, 7 AS von SV40 NLS und AS
11-60 von HPY16-E7)
Fig. 10 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von
HPV16-L1 human delta C NLS-E7 (long) (AS 1-474 von HPV16-
L1, AS 1 und 2 von HPY16-E7, 7 AS von SV40 NLS und AS
1-60 von HPV16-E7)
Fig. 11 Immunisierung von Tieren mittels erfindungsgemäßer DNA-
Sequenzen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Zur Herstellung der optimierten Sequenzen wurde ein PCR
Verfahren nach Kim et al., Gene 199, (1997), 293-301
verwendet. Hierzu wurden 85mer Oligonukleotide (jeweils 25
Primer für pL1 und hL1, 24 Primer für hL2) synthetisiert, die
das HPV16-L1- bzw. -L2-Gen umfassen. Die Oligonukleotide
überlappen in 20-23 Basenpaaren und sind alternierend vom
kodierenden bzw. nicht kodierenden DNA Strang abgeleitet (z. B.
1: kodierend, 2: nicht kodierend, 3: kodierend, 4: nicht
kodierend). Das hat zur Folge, daß die 5'-3' Richtung
geradzahliger Oligonukleotide entgegen der 5'-3' Richtung
ungeradzahliger Oligonukleotide verläuft. Für die PCR Synthese
wurden zunächst jeweils Gruppen aus 4 Oligonukleotiden
verwendet (1, 2, 3, 4 und 3, 4, 5, 6 und 5, 6, 7, 8 etc). Das molare
Verhältnis der innenliegenden Oligonukleotide (z. B. 2 und 3)
zu den aussenliegenden Oligonukleotiden (z. B. 1 und 4) wurden
auf 1 : 100 eingestellt. Durch anschließende PCR wurden
doppelsträngige DNA Produkte erhalten, die die Bereiche der
eingesetzten Primer enthielten (z. B. Produkt a: 1-4, Produkt
b: 3-6 etc.). In einem zweiten Amplifikationszyklus wurden
dann durch Verwendung der Produkte aus Runde 1 längere
doppelsträngige DNA Bereiche hergestellt. Dazu wurden
beispielsweise Primer 1 und 6 mit den Produkten a und b der
ersten Runde eingesetzt. Auf diese Weise wurden größere
Bereiche der optimierten Gene hergestellt. Beim Design der
rekombinanten Gene wurden die Erkennungssequenzen bestimmter
Restriktionsendonukleasen eingeführt, ohne allerdings die
Sequenz der kodierten HPV16-L1- bzw. -L2-Gene zu verändern.
Diese Schnittstellen wurden bei der Synthese verwendet, um PCR
Zwischenprodukte zu klonieren und deren Korrektheit mittels
pNA Sequenzierung zu prüfen. Nach Zusammensetzen der Gene aus
diesen Fragmenten wurde die Sequenz nochmals durch DNA-
Sequenzierung überprüft (Tabelle 1: Codonstatistik für
HPV16-L1 and -L2).
Die in Beispiel 1 synthetisierten DNA-Sequenzen wurden in den
Vektor pUF3 (Zolotukhin et al., supra) unter der Kontrolle des
Cytomegalovirus "immediate early" Promotors (pCMV) inseriert.
Hierzu wurden die Gene pL1, hL1 und hL2 zunächst über XbaI und
HindIII (auf jeweils dem ersten bzw. letzten Primer) in
pBluescript KS kloniert (pBKSpL1, pBKShL1, pBKShL2). Die
erhaltenen Klone wurden bei der DMSZ (Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen als E.coli #713; 16L1 plant
Blspt (pL1) unter DSM 13745, als E.coli #835; 16L1 human Blspt
(hL1) unter DSM 13746 bzw. als E.coli #886; 16L2 human Blspt
(hL2) unter DSM 13747 am 28. Sept. 2000 hinterlegt.
Desweiteren wurden die Gene pL1, hL1 und hL2 mit Xba1 und
Hindill aus den Vektoren ausgeschnitten und in pBKCMV über
XbaI, HindIII kloniert. Aus den erhaltenen Vektoren wurden die
Gene wiederum über NotI, SalI ausgeschnitten und in NotI, SalI
gespaltenen pUF3 kloniert. Es wurden die Expressionsvektoren
pUF3-pL1, pUF3-hL1 und pUF3-hL2 erhalten.
- a) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten
Tranfektion mit den in Beispiel 2 hergestellten
Expressionsvektoren pUF3-pL1, pUF3-hL1 und pUF3-hL2
unterzogen. Nach drei Tagen wurden aus den Zellen
Extrakte gewonnen, einer SDS-PAGE unterzogen und in
einem Westernblot mittels eines käuflichen monoklonalen
anti-L1-Antikörpers nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L1 erreicht wird (Fig. 1). - b) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten
Tranfektion mit einem bi-cistronischen
Expressionsvektor unterzogen, der neben dem HPV16-L1-
Gen auch ein dahinter liegendes eGFP-Gen enthält,
dessen Translation von einer "internal ribosome binding
site (IRES) erfolgt. Nach einem Tag wurde von einem
Teil der Zellen eine FACS-Analyse durchgeführt. Von den
restlichen Zellen wurden Extrakte gewonnen, einer SDS-
PAGE unterzogen und in einem Westernblot mittels eines
käuflichen monoklonalen anti-L1-Antikörpers
nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L1 erreicht wird, die genutzt werden kann, um eine weitere in cis vorliegende DNA-Sequenz ebenfalls hoch zu exprimieren (Fig. 2). - c) Humane 293 T Zellen wurden einer transienten
Transfektion mit dem erfindungsgemäßen
Expressionsvektor pUF3-hL2 unterzogen. Nach drei Tagen
wurden aus den Zellen Extrakte gewonnen, einer SDS-PAGE
unterzogen und in einem Westernblot mittels eines
polyklonalen anti-L2-Serums nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß durch die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen eine stark erhöhte Expression von HPV16-L2 erreicht wird (Fig. 3).
911-Zellen wurden transient mit pUF3-hL1 DNA transfiziert.
Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und
Ultradünnschnitte angefertigt, die einer
elektronenmikroskopischen Analyse unterzogen wurden.
Es zeigte sich, daß sich aus den erfindungsgemäßen DNA-
Sequenzen HPV16-L1-Kapside bilden.
Um zu testen, ob eine erfindungsgemäße HPV16-L1-DNA-Sequenz
eine humorale Immunantwort auslösen kann, wurden Mäuse mit
pUF3-hL1 immunisiert. Die Mäuse wurden zweimal, im Abstand von
vier Wochen mit je 100 Mikrogramm pUF3-hL1 intra-muskulär
immunisiert. Vier Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde
Serum entnommen. Um Anti-HPV16-L1 spezifische Antikörper im
Serum der Mäuse nachzuweisen, wurden ELISA-Platten mit
gereinigtem HPV16-L1-Virus-artigen Partikeln (2,5
Mikrogramm/Vertiefung) beschichtet. Die Seren wurde in
unterschiedlichen Verdünnungen (1 : 10-1 : 12800) getestet. Als
Negativkontrolle dienten ELISA-Platten, die nur mit PBS
beschichtet waren. An die Platten gebundene HPV16-L1
spezifische Antikörper wurden durch einen Sekundär-Antikörper
(Ziege-Anti-Maus-Peroxidase) und entsprechender Peroxidase
vermittelter Farbreaktion nachgewiesen.
Es zeigte sich, daß Mäuse, die mit erfindungsgemäßem pUF3-hL1
immunisiert wurden, große Mengen von HPV16-L1 spezifischen
Antikörpern produzieren. Im Gegensatz dazu ist die Menge der
HPV16-L1 spezifischen Antikörper sehr gering, wenn Original-
Sequenzen von HPV16-L1 verwendet werden.
Claims (11)
1. DNA-Sequenz, die für ein HPV16-L1 mit der in Fig. 5
oder 6 gezeigten DNA-Sequenz oder für ein HPV16-L2 mit
der in Fig. 7 gezeigten DNA-Sequenz kodiert.
2. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen
Eigenschaften eines HPV16-L1 oder eines HPV16-L2
kodiert und die ein Fragment oder eine Variante der in
Fig. 5, 6 oder 7 gezeigten DNA-Sequenz ist.
3. DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem
HPV16-L1 und einem HPV16-E7 kodiert und die in Fig. 8,
9 oder 10 gezeigte DNA-Sequenz aufweist.
4. Expressionsvektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach
einem der Ansprüche 1-3.
5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei die DNA-
Sequenz mit einem pCMV-Promotor funktionell verknüpft
ist.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 4, nämlich pL1 (DSM
13745), hL1 (DSM 13746) bzw. hL2 (DMS 13747).
7. Wirtszelle, transfiziert mit einer DNA-Sequenz nach
einem der Ansprüche 1-3 oder einem Expressionsvektor
nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
8. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine
tierische Zelle ist.
9. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine
pflanzliche Zelle ist.
10. Vakzinierungsmittel, enthaltend den Expressionsvektor
nach einem der Ansprüche 4-6 oder ein durch diesen
kodiertes Protein.
11. Verfahren zur Herstellung eines HPV16-L1 oder eines HPV
16-L2, das die Züchtung der Wirtszelle nach einem der
Ansprüche 7-9 unter geeigneten Bedingungen und die
Gewinnung des Proteins aus der Zelle oder dem
Zuchtmedium umfaßt.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10055545A DE10055545A1 (de) | 2000-11-09 | 2000-11-09 | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen |
AU2002213806A AU2002213806A1 (en) | 2000-11-09 | 2001-09-19 | Dna sequences, which code for optimised eukaryotic hpv 16-l1 and hpv 16-l2 |
PCT/DE2001/003618 WO2002038769A2 (de) | 2000-11-09 | 2001-09-19 | Für expression in eukaryonten optimierte hpv 16-l1 und hpv 16-l2 kodierende dna-sequenzen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10055545A DE10055545A1 (de) | 2000-11-09 | 2000-11-09 | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10055545A1 true DE10055545A1 (de) | 2002-07-25 |
Family
ID=7662695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10055545A Withdrawn DE10055545A1 (de) | 2000-11-09 | 2000-11-09 | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU2002213806A1 (de) |
DE (1) | DE10055545A1 (de) |
WO (1) | WO2002038769A2 (de) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AP2004003021A0 (en) * | 2001-08-31 | 2004-06-30 | Univ Cape Town | Vectors, constructs and transgenic plants for HPV-11 and HPV-16 L1 capsid protein. |
KR20060003903A (ko) * | 2003-05-05 | 2006-01-11 | 이스티투토 디 리세르쉐 디 비올로지아 몰레콜라레 피. 안젤레티에스.피.에이. | 사람 암배아 항원을 암호화하는 합성 유전자 및 이의 용도 |
EP1716173B8 (de) | 2004-02-11 | 2012-06-27 | Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.R.L. | Fusionsproteine des karzinomembryonalen antigens und deren verwendungen |
US8101342B2 (en) | 2006-08-28 | 2012-01-24 | Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration | DNA vaccine for treating or preventing cervical cancer comprising a gene encoding HPV protein |
MY182347A (en) * | 2007-11-23 | 2021-01-20 | Shanghai Zerun Biotechnology Co Ltd | Genes encoding major capsid protein l1 of human papilloma virus and use of the same |
BR102019025802A2 (pt) | 2019-12-05 | 2022-01-18 | Instituto Butantan | Processo de produção de uma composição imunológica de dna profilática e terapêutica contra hpv e cânceres associados ao vírus, proteína híbrida, vetor de expressão, composição imunológica e seus usos |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994012632A1 (en) * | 1992-11-27 | 1994-06-09 | University College London | Improvements in nucleic acid synthesis by pcr |
US6114148C1 (en) * | 1996-09-20 | 2012-05-01 | Gen Hospital Corp | High level expression of proteins |
CA2296067C (en) * | 1997-07-09 | 2008-10-07 | The University Of Queensland | Nucleic acid sequence and method for selectively expressing a protein in a target cell or tissue |
US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
CA2229955C (en) * | 1998-02-20 | 2003-12-09 | Medigene Gmbh | Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use |
DK1108035T3 (da) * | 1998-09-04 | 2007-09-24 | Sanofi Pasteur Ltd | Behandling af cervixcancer |
PT1212358E (pt) * | 1999-08-25 | 2005-04-29 | Merck & Co Inc | Genes sinteticos de papilomavirus humano |
-
2000
- 2000-11-09 DE DE10055545A patent/DE10055545A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-09-19 AU AU2002213806A patent/AU2002213806A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-19 WO PCT/DE2001/003618 patent/WO2002038769A2/de active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Internet-Recherche am 21.08.01: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST Accession Number: NC001526 Humanpapillomavirus type 16, complete genome * |
Internet-Recherche am 21.08.01: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST PubMed Abstr. SEEDORF, K., KRAMMER, G., DURST, M., [u.a.]: Human papilloma- virus type 16 DNA sequence. In: Virology. 1985, Vol. 145, S. 181-185 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002213806A1 (en) | 2002-05-21 |
WO2002038769A3 (de) | 2003-01-09 |
WO2002038769A2 (de) | 2002-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69534995T2 (de) | Varianten von antigenen des menschlichen papillomvirus | |
DE69835294T2 (de) | Methode zur in vitro auseinander- und wiederzusammensetzung von papillomavirus virusähnlichen teilchen (vlps) | |
DE69518910T4 (de) | Verfahren zur herstellung von viralen vektoren von mindestens 20kb durch intermolekulare homologe rekombination in einer prokaryotischen zelle | |
DE69826661T2 (de) | Antitumorale zusammenstellung von immunogene polypetiden mit veränderter zellokalisierung | |
DE60132770T2 (de) | Chimäre humane papillomavirus (hpv) l1 moleküle und deren verwendungen | |
DE60016765T2 (de) | Synthetische papillomavirus gene, welche für expression in menschlichen zellen optimiert sind | |
EP2102345B1 (de) | Rsv f-protein und seine verwendung | |
DE69034075T2 (de) | Rekombinantes poxvirus und streptokokken enthaltend ein m-protein | |
EP0809700A1 (de) | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung | |
DE60302356T2 (de) | Fusionsprotein regulatorischer/akzessorischer hiv-proteine | |
DE69728914T2 (de) | Pharmazeutische Zusammensetzung gegen durch Papillomaviren verursachte Tumoren und Infektionen | |
DE60126737T2 (de) | Modifizierte HPV E6- und E7-Gene und -Proteine als Impfstoff | |
DE69631586T2 (de) | Für menschliches papillomavirus stamm 18 kodierende dns | |
DE10055545A1 (de) | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen | |
EP0564532A1 (de) | Von proteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide und deren verwendung | |
EP0354440A1 (de) | Humaner Papillomvirus Typ 57, seine DNA und die davon kodierten Proteine | |
DE3722968A1 (de) | Humaner papillomvirus typ 41, seine dna und die dafuer kodierenden proteine | |
EP0941336A2 (de) | Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen | |
WO1999009177A2 (de) | Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen | |
WO1998042847A2 (de) | Papillomvirus-hauptcapsid-proteins und deren verwendung in diagnose, therapie und vakzinierung | |
DE19631357A1 (de) | Vektor zur Aktivierung des Immunsystems gegen mit Papillomviren bzw. Sequenzen davon assoziierten Zellen | |
DE19905883C2 (de) | Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV | |
DE69834813T2 (de) | Parvovirus-Vektoren und deren Verwendung | |
DD297997A5 (de) | Proteine, vakzine und nukleinsaeuren | |
EP1149171A1 (de) | Foamy-virus-vektoren zur expression von fremdgenen in säugern und deren verwendung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |