BR102019025802A2 - Processo de produção de uma composição imunológica de dna profilática e terapêutica contra hpv e cânceres associados ao vírus, proteína híbrida, vetor de expressão, composição imunológica e seus usos - Google Patents

Abstract

processo de produção de uma composição imunológica de dna profilática e terapêutica contra hpv e cânceres associados ao vírus, proteína híbrida, vetor de expressão, composição imunológica e seus usos. a presente invenção se refere à vacina profilática e terapêutica contra hpv e cânceres associados ao vírus, destinada a pessoas que buscam a prevenção ou àquelas já infectadas por hpv que desenvolveram câncer. refere-se também a vetores de expressão de dna que podem produzir eficientemente a proteína l2 do capsídeo do vírus hpv16, além da oncoproteína viral e6 associada a tumores do papilomavírus humano. em particular, esta invenção referese à obtenção de proteínas recombinantes de fusão ou híbridas, através da clonagem gênica em vetores de expressão, produzidas pela tradução genética de genes fundidos, formados pela combinação de sequências reguladoras de ácidos nucleicos de um ou mais genes, com as sequências codificadoras de proteína de um ou mais genes, empregadas para gerar dois tipos distintos de respostas: resposta imune humoral duradoura, capaz de estimular a produção de anticorpos específicos anti-l2 e anti-e6 contra hpv (ação profilática), assim como ativar a resposta imune celular, para combater as células tumorais e induzindo a expressão de citocinas tnf (tumor necrosis factor) ou fator de necrose tumoral (ação terapêutica).

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA DE DNA PROFILÁTICA E TERAPÊUTICA CONTRA HPV E CÂNCERES ASSOCIADOS AO VÍRUS, PROTEÍNA HÍBRIDA, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA E SEUS USOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere à vacina profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus, destinada a qualquer pessoa que tenha interesse na prevenção da doença, assim como para pessoas infectadas por HPV que desenvolveram câncer. Refere-se também a vetores de expressão de DNA que podem produzir eficientemente a proteína L2 do capsídeo do vírus HPV16, além da oncoproteína viral E6 associada ao desenvolvimento de tumores causados por Papilomavírus humano. Em particular, esta invenção refere-se à obtenção de proteínas recombinantes de fusão ou híbridas, através da clonagem gênica em vetores de expressão, produzidas pela tradução genética de genes fundidos, formados pela combinação de sequências reguladoras de ácidos nucleicos de um ou mais genes, com as sequências codificadoras de proteína de um ou mais genes, empregadas para gerar dois tipos distintos de respostas: resposta imune humoral duradoura, capaz de estimular a produção de anticorpos específicos anti-L2 e anti-E6 contra HPV (ação profilática), assim como ativar a resposta imune celular, para combater as células tumorais já estabelecidas e induzir a expressão de citocinas TNF (Tumor Necrosis Factor) ou Fator de Necrose Tumoral (ação terapêutica).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer de colo do útero ou câncer cervical é o terceiro tipo de câncer mais comum em mulheres de todo o mundo, sendo a segunda principal causa de morte em mulheres por câncer. Os dois tipos virais mais prevalentes na população são HPV16 e HPV18, detectados nos cânceres mais invasivos. São causados principalmente pela infecção persistente por HPV (Papilomavírus humano) de alto risco (GUAN P, HOWELL-JONESR, L] N, et al. Human papillomavirus types in 115,789 HPV-positive women: a meta-analysis from cervical infection to cancer. Int J. Cancer, v. 131, p. 2349-2359, 2012).

[003] Apesar da disponibilidade de vacinas profiláticas, as infecções por HPV permanecem extremamente comuns em todo o mundo. Estima-se que atualmente o câncer cervical atinja mais de 1,4 milhões de mulheres no mundo, levando a morte mais de 300 mil mulheres por ano, afetando principalmente os países em desenvolvimento (WHO. Strategic Advisory Group of Experts (SAGE) on immunization. WHO. World Health Organization, 2017; DE SANJOSÉ S, DIAZ M, CASTELLSAGUÉ, et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis, v. 7, p 453-459, 2007).

[004] Entre os fatores responsáveis por essa elevada mortalidade, o custo elevado e exigência de refrigeração das vacinas são os que mais restringem a implantação da imunização preventiva em larga escala nos países em desenvolvimento, onde ocorrem aproximadamente 87% das mortes por câncer cervical (GLOBOCANE. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012, v 1.0 [internet, 2012). O preço da vacina bivalente contra o HPV é de, aproximadamente, R$ 200 por dose e o da tetravalente é de, aproximadamente, R$ 300 por dose, em clínicas particulares, sendo necessárias 2 a 3 doses com reforço a cada 5 a 8 anos (Cianciarullo AM. Profilaxia contra o papilomavirus humano. Rev. Sodebras, v. 9, n. 100, p. 8-15, 2014. Disponível em: http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf).

[005] Hoje, a principal forma de prevenção do câncer cervical é a realização de exames citológicos periódicos, teste de Papanicolaou e a vacinação profilática de meninas e meninos pré-adolescentes. No Brasil, a vacina profilática Gardasil® quadrivalente foi disponibilizada recentemente pelo Ministério da Saúde, gratuitamente através do SUS (Sistema Único de Saúde) para meninos e meninas de 9 a 14 anos, assim como para homens e mulheres de 9 a 26 anos vivendo com HIV ou AIDS, pacientes que receberam transplante de órgãos, de medula óssea e pessoas em tratamento contra o câncer (Cianciarullo AM. Profilaxia contra o papilomavirus humano. Rev. Sodebras, v. 9, n. 100, p. 8-15, 2014. Disponível em: http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf; INCA. 2017. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br).

[006] A vacina também pode ser utilizada por pessoas com idades superiores, entretanto, são apenas disponibilizadas em clínicas de vacinação particulares. Ela está indicada para meninas e mulheres entre 9 e 45 anos de idade, se for a vacina quadrivalente, ou qualquer idade acima dos 9 anos, se for a vacina bivalente; meninos e homens entre 9 e 26 anos de idade, com a vacina quadrivalente. Ainda, a vacina pode ser utilizada por pessoas que fazem tratamento ou já tiveram infecção por HPV, pois ela pode proteger contra outros tipos de vírus HPV, e prevenir a formação de novas verrugas genitais e risco de câncer (ver Cianciarullo AM. Profilaxia contra o papilomavirus humano. Sodebras, v. 9, n. 100, p. 8-15, 2014.Disponível em: http://www.sodebras.com.br/edicoes/N100.pdf; INCA. 2017. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br).

[007] Entretanto, tais ações visam à prevenção da infecção por HPV, pois não há um tratamento específico contra as infecções e lesões já estabelecidas. Dentre as proteínas expressas por HPV, destacamos a L2 e E6 que são os alvos deste trabalho. A proteína L2 está presente no capsídeo viral e é bem conservada entre diversos tipos de HPV, enquanto que E6 é uma proteína oncogênica capaz de induzir a transformação maligna das células infectadas. O genoma viral completo é requerido para a malignidade se estabelecer (Herrero R., González P, Markowitz LE. Present status of human papillomavirus vaccine development and implementation. Lancet Oncol, v. 16, p. e206-216, 2015; Wang D, Li Z, Xiao J, et al. Identification of broadgenotype HPV L2 neutralization site for Pan-HPV vaccine development by a cross-neutralizing antibody. PLOS One, v. 10, p. e0123944, 2015; Vande Pol SB, Klingelhutza J. Papillomavirus E6 oncoproteins. Virology, v. 445, p. 115- 137, 2013; Kims, Chungh, Kongh, et al. Identification of novel immunogenic human papillomavirus type 16 E7 specific epitopes restricted to HLA-A*b33;03 for cervical cancer immunotherapy. Yonsei Med J, v. 58, p. 43-50, 2017).

[008] A vacina de DNA é mais vantajosa do que as tradicionais devido à simplicidade e baixo custo de produção, por ser termoestável dispensando refrigeração, permite repetidas doses devido à ausência de resposta imune contra o vetor, possui potencial para elicitar imunidade humoral e celular, e por ser altamente tolerável em humanos [Hancock G, Hellner K, Darrell L. Therapeutic HPV vaccines. Best Practice & Res Clin Obstet Gynecol, 2017. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.bpobgyn.2017.09.008).

[009] Em 2006, a primeira vacina profilática contra o HPV foi aprovada e liberada para comercialização nos Estados Unidos, pelo FDA (Food and Drug Administration).

[0010] Atualmente, as três vacinas contra o HPV disponíveis no mercado e liberadas pelo FDA e pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) são apenas de ação profilática. Ambas baseadas na imunogenicidade conferida à proteina L1 quando estruturada em VLPs (viruslike particles).

[0011] A primeira vacina foi licenciada em 2006, ela é quadrivalente e denominada Gardasil®, produzida pela Merck Sharp Dohme, onde as proteínas L1 de HPV 6, 11, 16 e 18 são expressas em células de levedura, Saccharomyces cerevisae.

[0012] A segunda vacina foi licenciada em 2008, ela é bivalente e denominada Cervarix®, produzida pela Glaxo Smith Kline, constituída pelas proteínas L1 de HPV 16 e 18 que compõem a vacina e são expressas em culturas de células de inseto, da linhagem SF9.

[0013] A terceira vacina foi licenciada em 2014, ela é nonavalente e denominada Gardasil-9®, do mesmo fabricante da vacina homônima, porém formulada com partículas de L1 de 9 diferentes tipos de HPV: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 e 58 (CDC - Centers for Disease Control and Prevention, disponfvel em http://vwvw.cdc.gov/vaccines/he p/vis/vis-stateme nts/h pvgardasil-9.html).

[0014] As vacinas disponíveis atualmente apresentam alta eficiência na indução da produção de anticorpos específicos, ou seja, têm caráter apenas profilático, e somente contra os tipos virais contidos nas formulações vacinais. Alguns estudos demonstraram que tais anticorpos são capazes de induzir uma pequena proteção cruzada contra infecções por outros tipos de HPV, porém ainda incapaz de combater a ampla gama de diferentes tipos de HPV causadores de verrugas genitais e neoplasias.

[0015] A Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/ Instituto Butantan/IPT, publicada em 2009 em nome de Bruna Felício M. M. Porchia, intitulada: “DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA TERAPÊUTICA PARA TUMORES CAUSADOS PELO VÍRUS PAPILOMA HUMANO TIPO 16 descreve uma estratégia vacinal contra tumores induzidos pelo HPV-16, empregando uma forma recombinante da proteína E7 obtida após fusão genética com a glicoproteína D (gD) do vírus Herpes tipo 1 (HSV-1). A proteína gDE7 gerada em sistema bacteriano foi testada como vacina em camundongos, onde conferiu 80% de proteção profilática para o crescimento tumoral em camundongos. A gDE7 solúvel foi capaz de proteger 30% dos animais quando testada de forma terapêutica.

[0016] A referida tese de mestrado, assim como o presente pedido utilizam proteínas de fusão. Entretanto, a proteína de fusão descrita na referida tese de mestrado é totalmente diferente da proteína de fusão revelada pelo presente pedido de invenção.

[0017] O pedido de patente PI 10037497, depositado em 18 de agosto de 2010 e publicado em 02 de maio de 2012, em nome de UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – USP e FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO – FAPESP e intitulado: “PROTEÍNA HÍBRIDA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLÉICOS RECOMBINANTE, VETORES/PLASMÍDEOS, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU VETERINÁRIAS E SEUS USOS NO CONTROLE DE TUMORES INDUZIDOS PELO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO E/OU DOENÇAS INFECCIOSAS OU DEGENERATIVAS descreve uma proteína híbrida, não-natural, formada pela fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do Papiloma humano tipo- 16 (HPV16) com uma forma modificada da glicoproteina D (gD) do herpes simplex tipo- 1 (HSV-1), deletada em seu peptídeo sinal e na região C-terminal que inclui a sequência envolvida no ancoramento à membrana citoplasmática (correspondente a sequência de aminoácidos 320 a 344), sequência de ácidos nucleicos recombinante (SEQ. ID. NO. 1 e SEQ. ID. NO. 2) que codifica a proteína recombinante, vetores/plasmídeos contendo a sequência recombinante e formulações farmacêuticas e/ou veterinárias que contenham a proteína híbrida e/ou a sequência recombinante que a codifique, preferencialmente, na forma de vacinas. Adicionalmente, o referido pedido de patente destina-se ao uso da construção genética, como adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo no preparo de formulações farmacêuticas e/ou veterinárias indicadas para o controle de tumores induzidos por vírus do papiloma humano e infecções por vírus herpes.

[0018] O pedido de patente PI 10037497, assim como o presente pedido revelam vacinas contra HPV. Entretanto, a construção genética descrita no pedido de patente PI 10037497 é totalmente diferente da proteína de fusão revelada pelo presente pedido.

[0019] O pedido de patente PI 9612675-2, depositado em 29 de julho de 1996, publicado em 20 de julho de 1999, em nome DE CANTAB PHARMACEUTICALS RESEARCH LIMITED e intitulado “POLIPEPTÍDEO OU COMPOSIÇÃO DE POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA ADEQUADA PARA ADMINISTRAÇÃO POR INJEÇÃO, E, USO DE POLIPEPTÍDEO OU DE COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA descreve polipeptídeos de fusão e agregados de polipeptídeos compreendendo antígenos derivados de Papilomavírus, e suas composições e seu uso, por exemplo, com adjuvantes para propósitos de vacina e imunogênicos na geração, por exemplo, de respostas imunes HPV-específicas. Os polipeptídeos podem ser purificados para resultar em agregados que, quando em solução ou em dispersão, podem passar através de um filtro de esterilização, e em agregados amorfos. Um exemplo de um tal polipeptídeo é uma proteína de fusão das proteínas L2 e E7 do Papilomavírus humano.

[0020] Com exceção do processo de fusão e uso de L2, o pedido de patente PI 9612675-2 descreve uma proposta de tratamento, completamente distinta do presente pedido de invenção. O pedido de patente PI 9612675-2 desenvolve um imunoterápico com L2 e E7 de HPV-6 (não oncogênico), para combater verrugas genitais, enquanto que o presente pedido apresenta L2 e E6 de HPV-16 (oncogênico), para a profilaxia e terapia de câncer cervical e outros cânceres associados a HPVs oncogênicos.

[0021] O pedido de patente internacional WO 2017/211886, depositado em 14 de dezembro de 2017 em nome de DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM (DKFZ) e intitulado “IMPROVEMENT OF HPV L2 PEPTIDE IMMUNOGENICITY refere-se a um polipeptídeo imunogênico que compreende uma multiplicidade de peptídeos N-terminal L2 de Papilomavírus humano (HPV) correspondentes aos aminoácidos 20 a 50 do polipeptídeo L2 de HPV16, em que os referidos peptídeos Nterminal L2 de HPV são peptídeos L2-N-terminais de pelo menos dois genótipos de HPV diferentes. O referido pedido de patente internacional WO 2017/211886 também se refere ao referido polipeptídeo imunogênico para utilização em medicamento e para utilização na vacinação contra a infecção por HPV. Além disso, o pedido de patente internacional WO 2017/211886 refere-se a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo imunogênico e a uma célula hospedeira compreendendo o mesmo.

[0022] Como pode ser observado, o pedido de patente internacional WO 2017/211886, assim como o objeto de busca revelam vacinas contra HPV. Entretanto, a construção genética descrita no pedido de patente internacional WO 2017/211886 é totalmente diferente da proteína de fusão revelada pelo presente pedido de invenção.

[0023] O pedido de patente internacional WO 2002/38769, depositado em 19 de setembro de 2001 e publicado em 16 de maio de 2002, em nome de DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM STIFTUNG DES ÖFFENTLICHEN RECHTS e IPK, INSTITUT FÜR PFLANZENGENETIK UND KULTURPFLANZENFORSCHUNG, intitulado “DNA SEQUENCES, WHICH CODE FOR OPTIMISED EUKARYOTIC HPV 16-L1 AND HPV 16-L2 refere-se a sequências de DNA que foram otimizadas em relação ao uso do códon, as quais codificam uma proteína do capsídeo de HPV 16-L1 ou uma proteína de capsídeo de HPV 16-L2. As referidas sequências de DNA compreendem as sequências de DNA ou fragmentos ou suas variantes que são ilustradas nas figuras 5, 6 ou 7 e permitem a produção recombinante simples de proteínas do capsídeo HPV 16-L1 ou HPV 16-L2 ou fragmentos dos mesmos com rendimentos elevados, sem ter que usar vetores virais. As proteínas do capsídeo são, de preferência, utilizadas para a produção de vacinas.

[0024] O pedido de patente internacional WO 2002/38769, assim como o presente pedido revelam vacinas contra HPV. Entretanto, a construção genética descrita no pedido de patente internacional WO 2002/38769 revela uma proteína do capsídeo de HPV 16-L1 ou uma proteína de capsídeo de HPV 16-L2, enquanto que o presente pedido revela uma proteína de fusão L2/E6, a qual é totalmente diferente da construção revelada pelo pedido de patente internacional WO 2002/38769.

[0025] Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou muito menos sugere uma vacina terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus para uso humano. Os tratamentos do estado da técnica utilizados contra lesões e os cânceres HPV-positivos não são específicos e dependem do grau de lesão. Normalmente envolvem tratamentos com substâncias químicas de ação citotótoxica, cauterizações químicas / físicas/ elétricas, cirurgias, radioterapias, quimioterapias ou a combinação de tratamentos, sendo altamente invasivos, agressivos e muitas vezes mutilantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0026] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação ao uso de uma proteína recombinante híbrida L2/E6, assim produzida com um efeito de induzir a produção de citocinas específicas como TNF e anticorpos específicos de ação anti-L2 e anti-E6, combatendo eficazmente as células transformadas por HPV (cancerígenas ou tumorais) que expressam a proteína E6 (efeito terapêutico), sem interferir com as células saudáveis do organismo (tropismo tecido-específico), e as novas infecções virais oportunistas por HPV (efeito profilático de amplo espectro). Desta forma não produz efeitos colaterais, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0027] A presente invenção se refere ao desenvolvimento de vacina profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus, destinada a pessoas infectadas por HPV que desenvolveram câncer. Refere-se a vetores de expressão de DNA que podem produzir eficientemente a proteína L2 do capsídeo do vírus HPV16, além da oncoproteína viral E6 associada a tumores do Papilomavírus humano.

[0028] Em particular, a presente invenção se refere à obtenção de proteínas recombinantes de fusão ou híbridas, através da clonagem gênica em vetores de expressão, produzidas pela tradução genética de genes fundidos formados pela combinação de sequências reguladoras de ácidos nucleicos de um ou mais genes, com as sequências codificadoras de proteína de um ou mais genes, empregadas para gerar respostas imunes contra HPV.

[0029] Especificamente, a presente invenção provê fusões de sequências de aminoácidos de L2 e E6 de HPV16, contendo apenas epítopos imunogênicos (peptídeos selecionados) e não os genes inteiros, fato que inabilita a atividade de transformação celular maligna (carcinogênese) desta proteína oncogênica, conferindo segurança às fusões L2/E6. Além disso, estas fusões mantêm ou aumentam a eficácia imunogênica de L2 e E6. Considerando que a produção de proteínas recombinantes mais complexas deve ocorrer em sistemas de expressão eucarióticos (células de mamíferos), como é o presente caso, para superar as desvantagens dos sistemas procarióticos (bactérias) que implicam em não fazerem certas modificações póstraducionais necessárias à eficiência funcional das proteínas heterólogas expressas (ex.: glicosilação), também a atividade biológica pode diferir da proteína natural; a bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas; ausência de um mecanismo de secreção; e ainda ocorre a formação de corpos de inclusão, cujas correções implicam no aumento do custo final do produto.

[0030] A proteína recombinante híbrida L2/E6, assim produzida da presente invenção tem como efeito induzir a produção de citocinas e anticorpos específicos de ação anti-L2 e anti-E6, combatendo eficazmente as células transformadas por HPV (cancerígenas ou tumorais) que expressam a proteína E6 (efeito terapêutico), sem interferir com as células saudáveis do organismo (tropismo tecido-específico), e as novas infecções virais oportunistas por HPV (efeito profilático de amplo espectro). Dessa forma, não produz efeitos colaterais.

[0031] A vacina desenvolvida pela presente invenção, pcDNA3.3/L2E6 demonstrou ser eficiente na indução de uma resposta imune humoral duradoura, capaz de estimular a produção de anticorpos específicos anti-L2 e anti-E6, de forma crescente e ao longo de todo período experimental (49 dias), assim como de ativar a resposta imune celular, combatendo as células tumorais e induzindo a expressão de citocinas TNF.

[0032] Portanto, vale destacar que a presente vacina não induz apenas a produção de anticorpos específicos contra HPV (ação profilática), como induz também a produção de citocinas, conforme demonstrado experimentalmente. As citocinas são importantes para demonstrar que também há uma indução de respostas por células, que são responsáveis pelo combate das células tumorais (ação terapêutica). Este é o principal diferencial do presente trabalho, com relação aos demais trabalhos aqui apresentados, pois aqueles induzem apenas as respostas via anticorpos.

[0033] Até o momento, não há nenhuma vacina terapêutica contra o HPV e cânceres associados ao vírus aprovada para uso humano, no mundo. As vacinas de DNA são estáveis, fáceis de produzir, de transportar e de armazenar, pois são termoestáveis e dispensam refrigeração. São capazes de manter a expressão dos genes de interesse, promovem a apresentação de antígenos através do MHC de Classe I e permitem a administração de repetidas doses, sem levar à produção de anticorpos neutralizantes contra a vacina. O custo também é bastante reduzido, em comparação com as demais vacinas. Não requerem adjuvantes para garantir a sua eficiência funcional e, ainda, são altamente toleráveis em humanos.

[0034] A vacina da presente invenção é obtida através das técnicas de Engenharia Genética: Tecnologia do DNA Recombinante, Clonagem Gênica e Expressão Gênica de Proteínas Recombinantes. Procedeu-se à construção de um vetor vacinal contendo peptídeos selecionados das proteínas L2 e E6 de HPV16, que são expressos em células de mamíferos. A amplificação do vetor vacinal ocorre em culturas bacterianas de Escherichia coli DH5α. A expressão deste vetor foi testada em linhagem de células epiteliais humanas e em modelo murino, neste caso para avaliar a eficiência da vacina em modelo profilático ou terapêutico, com os camundongos recebendo a vacina antes ou após desafio com células tumorais da linhagem TC-1.

[0035] Os ensaios de expressão da proteína L2E6 em células HEK 293T e 293F demonstraram a eficiência do vetor em produzir a proteína recombinante, demonstrada em ensaios de imunofluorescência indireta e Western blotting.

[0036] Já os ensaios em modelo animal demonstraram que a vacina foi capaz de induzir a produção de anticorpos específicos anti-L2 e anti-E6 testados em ELISA, assim como induzir a produção de citocinas TNF, demonstrados por ensaios em citômetro de fluxo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0037] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0038] A Figura 1 mostra o mapa da construção do vetor de expressão. O inserto L2E6 foi inserido no vetor pcDNA3.3 flanqueados por sítios de endonucleases Hind III e Nhe I, recebendo o nome de pcDNA3.3/L2E6. O plasmídeo construído tem origem de replicação bacteriana, pUC, gene de resistência à Ampicilina, Amp (R), e promotor de CMV (Citomegalovirus). Para análises dos vetores, foram realizados ensaios de eletroforese em gel de agarose a 0,8% (m/v) em tampão TAE 0,5x (Tris 40 mM, Acetato 20 mM, EDTA 1 mM) e submetidos à corrida eletroferética a 80V na presença do corante Blue Green Loading Dye (LGC Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil).

[0039] A Figura 2 mostra fotodocumentação do gel de agarose submetido à eletroforese para seleção das colônias contendo o vetor pcDNA3.3/L2E6.

[0040] A Figura 3 mostra Células transfectadas com o vetor pcDNA3.3/L2E6 expressando a proteína L2 recombinante (verde - b), o núcleo celular foi evidenciado por PI (vermelho - c) e em (a) a sobreposição das imagens (b) e (c).

[0041] A Figura 4 mostra a Expressão de E6 (verde - a) em células 293F transfectadas por pcDNA3.3/L2E6 em ensaio de imunofluorescência indireta. Em (b) é possível observar o núcleo celular evidenciado pelo reagente PI (vermelho). Em (c) a sobreposição da imagem (a) e (b).

[0042] A Figura 5 mostra a Fotodocumentação do resultado obtido do ensaio de Western blotting utilizado para detecção e caracterização da proteína recombinante L2E6, onde as amostras (1) e (5) são alíquotas de lisado de células não transfectadas, (2) e (6) lisado de células transfectadas e expressando L2E6, (3) e (7) eluídos intermediários obtidos do ensaio de cromatografia por gel filtração e interagindo com os anticorpos monoclonais específicos anti-L2 (3) e anti-E6 (7), demonstrando a presença de uma proteína de baixo peso molecular sendo reconhecida por ambos anticorpos comerciais, (4) amostra de eluição final do processo de gel filtração. (MM) marcador molecular Color Burst™.

[0043] A Figura 6 mostra um Gráfico de pesagem dos animais no ensaio de avaliação profilática da vacina de DNA.

[0044] A Figura 7 mostra um gráfico do volume dos tumores de células TC-1 nos animais imunizados previamente com a vacina de DNA.

[0045] A Figura 8 mostra um gráfico do peso dos animais do estudo terapêutico da vacina de DNA da presente invenção;

[0046] A Figura 9 mostra um gráfico dos volumes tumorais mediante o tratamento com a vacina de DNA da presente invenção.

[0047] A Figura 10 mostra o Ensaio de detecção de anticorpos anti-L2 por ELISA, onde o gráfico da reatividade das amostras de soro obtido dos animais no último dia experimental (49 dias), demonstrando que todos os animais imunizados com a vacina pcDNA3.3/L2E6 produziram anticorpos anti-L2 específicos detectados por ensaio de ELISA (Cut off = 0,0636).

[0048] A Figura 11 mostra o Ensaio de detecção de anticorpos anti-E6 por ELISA, onde o Gráfico das amostras de soro obtido dos animais no último dia experimental (49 dias), está demonstrando a reatividade dos anticorpos antiE6 que todos os animais imunizados produziram ao final do experimento (Cut off = 0,0675).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma concretização preferida com o entendimento de que a presente concretização deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito neste relatório.

[0050] A presente invenção se refere a uma vacina que é capaz de proteger contra a infecção pelo vírus HPV em amplo espectro de proteção, assim como combater as células já modificadas pelo mesmo. Em particular, esta invenção refere-se à obtenção de proteínas recombinantes de fusão ou híbridas, através da clonagem gênica em vetores de expressão, produzidas pela tradução genética de genes fundidos formados pela combinação de sequências reguladoras de ácidos nucleicos de um ou mais genes, com as sequências codificadoras de proteína de um ou mais genes, empregadas para gerar respostas imunes contra HPV. Especificamente, esta invenção provê fusões de sequências de aminoácidos de L2 e E6 de HPV16, contendo apenas epítopos imunogênicos, fato que inabilita a atividade de transformação desta proteina oncogênica, conferindo segurança às fusões L2/E6. Além disso, estas fusões mantêm ou aumentam a eficácia imunogênica de L2 e E6.

[0051] Embora as respostas imunes humorais tenham utilidade preventiva importante, várias linhas de evidência sugerem que as respostas imunes mediadas por células desempenham um papel crucial na regressão das lesões precancerosas e na eliminação da infecção, de elevada importância terapêutica. Sobretudo, as infecções persistentes por HPV de alto risco e lesões pré-invasivas são significativamente mais frequentes em estados imunossuprimidos, como a infecção por HIV não tratada ou o recebimento de terapia antirrejeição pós-transplante.

[0052] A regressão espontânea de CIN (Neoplasia Intraepitelial Cervical) de alto grau foi relatada como correlacionada com respostas imunes mediadas por células. As lesões de regressão são tipicamente infiltradas por células T CD8+ específicas para as oncoproteinas virais, E6 e E7.

[0053] Além disso, as respostas de células T CD4+ para E2, um regulador chave da transcrição, foram detectadas em individuos após a regressão de CIN. Também foram relatados aumento das proporções de CD4:CD8 no estroma. Em contraste, números reduzidos de células T CD4+ estão presentes em lesões CIN persistentes e / ou progressivas. As células T reguladoras (Tregs) também são encontradas em infecções persistentes por HPV, sendo a frequência crescente com o tamanho das verrugas genitais.

[0054] Após a administração, a vacina de DNA que codifica as proteínas híbridas L2/E6 irá expressá-las nos tecidos do paciente. A proteína recombinante híbrida L2/E6, assim produzida tem como efeito induzir a produção de citocinas e anticorpos específicos de ação anti-L2 e antiE6, combatendo eficazmente as células transformadas por HPV (cancerígenas ou tumorais) que expressam a proteina E6 (efeito terapêutico), sem interferir com as células saudáveis do organismo (tropismo tecido-específico), e as novas infecções virais oportunistas por HPV (efeito profilático de amplo espectro). Dessa forma, não produz efeitos colaterais.

1. Seleção dos epítopos e construção dos vetores

[0055] As sequências dos genes L2 e E6 do HPV16 foram obtidas do banco de dados internacionais GenBank(r), sendo que o código de acesso do gene E6 utilizado foi AAD33252 e a referência para acesso de L2 foi NC_001526.2. A partir das sequências dos genes completos, sequências de peptídeos foram selecionadas conforme sua capacidade de indução de resposta imune descritas em outros trabalhos.

[0056] Os peptídeos selecionados a partir do gene E6 estão entre os resíduos de aminoácidos 50 a 57 (YDFAFRDL) (SEQ ID NO: 5), responsáveis pela indução de resposta imune celular através da ativação de Linfócitos T citotóxicos.

[0057] Os códons foram otimizados para que haja maior sucesso em sua expressão em células humanas, utilizando a ferramenta Codon Optimization da IDT - Integrated DNA Technology, e a sequência final obtida foi TATGATTTCGCCTTCAGGGACCTC (SEQ ID NO: 4).

[0058] Para o gene L2, o peptídeo selecionado foi encontrado entre os resíduos de aminoácidos 17 a 36 (QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV) (SEQ ID NO: 2), sendo a sequência otimizada como descrito acima, resultando em: CAGCTGTATAAAACTTGTAAGCAGGCCGGTACGTGCCCCCCAGATATCATTCCAAAGGT C (SEQ ID NO: 3).

[0059] Ambas as sequências foram ligadas por 3 sequências "Linker", resultando na sequência de 96 pb (pares de bases), à qual foram adicionadas as sequências iniciadora e de terminação, dando origem à seguinte sequência de 102 pb: ATG CAG CTG TAT AAA ACC TGT AAA CAG GCA GGT ACA TGT CCG CCG GAT ATT ATT CCG AAA GTT GGT GGT AGC GGC TAT GAT TTT GCC TTT CGC GAT CTG TAA. (SEQ ID NO: 1). A sequência final foi sintetizada pela empresa Gene ArtTM (Thermo Fisher Scientific) dando origem ao gene sintético denominado L2E6.

2. Construção dos vetores

[0060] Foram desenhados 2 vetores contendo o gene sintético L2E6 e desenvolvidos pela empresa Gene ArtTM (Thermo Fisher Scientific), sendo um vetor de clonagem usando como base o vetor comercial pMAT (Thermo Fisher Scientific) e um vetor de expressão ou vetor vacinal em pcDNA (Thermo Fisher Scientific) que será melhor descrito abaixo.

[0061] Para a construção do vetor de clonagem, o gene sintético L2E6 foi inserido em pMA-T, sendo ambas as extremidades do gene sintético e do vetor flanqueadas por sequências da endonuclease Sfi I (Thermo Fisher Scientific).

[0062] O vetor denominado pMA-T/L2E6 possui origem de replicação bacteriana Col E1 e gene de resistência a ampicilina, AmpR. O vetor completo apresenta 2494 pb.

[0063] Para a construção do vetor de expressão, o inserto L2E6 foi inserido no vetor pcDNA3.3 flanqueado por sítios de endonucleases Hind III e Nhe I, recebendo o nome de pcDNA3.3/L2E6. O plasmídeo construído tem origem de replicação bacteriana, pUC, gene de resistência a Ampicilina, Amp (R), e promotor de CMV (Citomegalovirus).

[0064] Para análises dos vetores, foram realizados ensaios de eletroforese em gel de agarose a 0,8% (m/v) em tampão TAE 0,5x (Tris 40 mM, Acetato 20 mM, EDTA 1 mM) e submetidos a corrida eletroferética a 80V na presença do corante Blue Green Loading Dye (LGC Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil).

3. Quimiocompetência das bactérias

[0065] Para a amplificação dos vetores foram utilizadas as cepas bacterianas Escherichia coli DH5a e TOP10. As cepas bacterianas foram cultivadas em 3 mL de meio Luria-Bertani (LB) (Triptona 2%, Extrato de levedura 1%, NaCl 1%) a 37ºC, sob agitação a 250 rpm por aproximadamente 18 horas.

[0066] Em seguida, uma alíquota dessa cultura foi estriada em uma placa de Petri contendo meio LB acrescido de 1,5% de ágar, incubada a 37ºC, por aproximadamente 18 horas.

[0067] No dia seguinte, uma colônia foi escolhida para semear 3 mL de meio LB e cultivada nas mesmas condições descritas anteriormente. Após esse período, 1 mL dessa cultura foi utilizado para semear 100 mL de meio LB e cultivado a 37ºC, sob agitação até que a densidade óptica da cultura a 600 nm (DO600) atingisse 0,4, onde as bactérias cultivadas se encontravam na metade da fase exponencial de crescimento.

[0068] A indução da competência foi realizada segundo protocolo estabelecido por Sambrook e cols. (2001), onde após atingirem a densidade celular desejada, a cultura de bactérias foi transferida para um tubo cônico e centrifugada a 5000xg por 10 minutos e incubadas em solução de 0,1 M de CaCl2 por 1 hora no gelo. Em seguida, as bactérias foram novamente centrifugadas e ressuspendidas em solução de 0,1 M de CaCl2 acrescido de 10% de glicerol (m/v).

[0069] Alíquotas de 200 µL foram congeladas a -80ºC até sua utilização.

4. Transformação bacteriana

[0070] A partir das bactérias competentes descritas acima, foi realizada a transformação bacteriana, onde uma mistura de 10 µL de DNA plasmideal, aproximadamente 15 g, e uma alíquota de bactérias quimiocompetentes foi incubada por 30 minutos no gelo, submetida a um choque térmico por 2 minutos a 42ºC e incubada novamente no gelo durante 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 350 µL de meio S.O.C (Triptona 2%, Extrato de levedura 0,5%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 mM), sendo a mistura incubada por 90 minutos a 37ºC, sob agitação de 250 rpm. Em seguida, as bactérias transformadas foram semeadas em placas de meio LB-ágar contendo ou não 100 µg/ml de ampicilina e incubadas a 37ºC por 18 horas.

[0071] Colônias crescidas nas placas de meio LBágar contendo ampicilina identificam os clones positivos que foram selecionados por PCR de colônia e semeadas em tubos contendo 3 mL de meio LB, incubadas a 37ºC, sob agitação por aproximadamente 18 horas.

5. Seleção das colônias bacterianas

[0072] Para seleção das colônias bacterianas após a transformação foi utilizada a técnica de PCR da colônia, onde utilizando iniciadores específicos sintetizados a partir da sequência do gene L2E6 foram desenhados 2 iniciadores, EAK03 e EAK02, e sintetizados pela empresa EXXTEND Biotecnologia Ltda (Campinas, SP, Brasil), capazes de gerar um produto de 144 pb. A sequência dos iniciadores pode ser observada abaixo.
EAK03 – CCCYYAAGCTTGCCACCATGCAGC (SEQ ID NO: 6)
EAK02 – GAGTGTCTAGATGCCACGCT (SEQ ID NO: 7)

[0073] Os iniciadores foram ressuspendidos em tampão TE (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM) a uma concentração estoque de 100 µM.

[0074] Para a PCR, cada solução foi preparada isoladamente em microtubos contendo 25 µL de solução PCRMix (MgCl2 1,5 mM, Taq 0,5U, dNTPs 200 5M - LGC Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), 0,5 µL de cada iniciador a 25 µM e água ultrapura para um volume final de solução de 50 µL. Como DNA molde foi utilizada uma amostra de cada colônia de bactéria transformada, selecionada e crescida em meio LB com ampicilina. A amplificação em termociclador Mastercycler EpGradient (Eppendorf, Alemanha) ocorreu seguindo o protocolo: 95ºC por 5 minutos, 25 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 56ºC e 1 minuto a 72ºC, seguido por extensão final a 72ºC por 7 minutos.

[0075] A detecção dos produtos da PCR ocorreu através da eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 0,5X. As amostras foram preparadas com adição de 0,5 µL de corante Blue Green Loading Dye I e submetidos a uma corrida a 80 A por 30 minutos. Como parâmetro de tamanho dos fragmentos foram utilizados 2 marcadores de peso molecular, o Marcador Universal contendo 8 fragmentos de 10000 pb a 100 pb (LGC Biotecnologia) e o segundo marcador 50 pb DNA Ladder contendo 12 fragmentos de 1000 pb a 50 pb (LGC Biotecnologia). O gel foi analisado em transluminador High Perfomance Ultraviolet Translluminator (UVP Ultraviolet Products, Upland, EUA) e as imagens capturadas em fotodocumentador Alliance 9.7 (UVITEC Cambridget, Cambridget, Inglaterra).

6. Extração de DNA plasmideal

[0076] Os clones positivos selecionados pela PCR da colônia foram cultivados em 5 mL de meio LB, a 37°C, por aproximadamente 18 horas, sob agitação, na presença do antibiótico de seleção. No dia seguinte, foram centrifugados a temperatura ambiente, por 1 minuto a 12000xg para sedimentar as bactérias íntegras. Para a purificação do DNA plasmideal, foi utilizado o GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific), que é baseado no procedimento de lise alcalina combinado a uma coluna de ligação seletiva ao DNA circular, realizado de acordo com as instruções do fabricante. O DNA purificado foi analisado em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 0,5X e submetidos à técnica de sequenciamento para confirmação da inserção do gene de interesse ao vetor, quantificado em espectrofotômetro (ACTGene, Nova Jersei, EUA) e armazenado a -20ºC.

7. Sequenciamento de DNA

[0077] As amostras de DNA plasmideal foram sequenciadas para confirmação da correta inserção do gene L2E6 e sua integridade. Para isso, as amostras de DNA purificados do gel como descrito na sessão anterior foram quantificadas por espectrofotometria. Foi aliquotado um volume de 5 µL do plasmídeo e adicionado 2,5 µL do iniciador EAK03 a uma concentração de 5 µM. As amostras foram enviadas para o Centro de Genomas Humano, da Universidade de São Paulo, onde ocorreu a reação de sequenciamento no equipamento ABI 3730 DNA Analyser (Thermo Fisher Scientific).

8. Linhagens celulares e condições de cultivo

[0078] Em princípio, para verificar a expressão do vetor pcDNA3.3/L2E6, o processo de transfecção foi realizado em células HEK293T cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM,Cultilab,Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF,Cultilab, Campinas, SP, Brasil), D10, mantidas em atmosfera úmida, contendo 5% de CO2 até atingirem de 50-80% de confluência. Os repiques ocorreram a cada 3 ou 4 dias.

[0079] A linhagem celular escolhida para a expressão das proteínas recombinantes em maior escala foi a 293F, FreeStyleTM 293 Expression System (Life TechonologiesTM), que foi desenvolvida para permitir a transfecção em larga escala de células em suspensão em meio definido e livre de soro.

[0080] Células 293F foram cultivadas em 30 mL de meio FreeStyleTM 293 Expression (Life TechnologiesTM) em frascos de vidro estéril a 37ºC e 5% CO2, em atmosfera úmida, sob agitação com rotação a aproximadamente 135 rpm. Os repiques celulares foram realizados a cada 3 ou 4 dias, com densidade celular de aproximadamente 2 a 3x106 células viáveis/mL, onde as células eram transferidas para tubos cônicos e centrifugadas a 800 rpm por 5 minutos. Em seguida, a viabilidade celular foi analisada e as células diluídas a uma densidade celular final de 3x105 células viáveis/mL em meio fresco pré-aquecido.

[0081] Para determinação da viabilidade celular foi utilizado o método de exclusão por azul de tripan (0,4% em PBS) e contagem em câmara de Neubauer.

9. Transfecção celular

[0082] O ensaio de transfecção transiente das células da linhagem HEK 293T foram realizados por lipofecção utilizando o reagente de transfecção GeneJuice® Transfection Reagents (EMD Biosciences/Merck, Darmstadt, Alemanha), conforme especificações do fabricante. Resumidamente, o reagente de transfecção foi misturado por vórtex a uma alíquota de meio DMEM, sendo incubado por 5 minutos a temperatura ambiente. À mistura foi adicionado o DNA plasmideal de interesse, na proporção adequada, homogeneizado gentilmente e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a mistura Meio/reagente de transfecção/DNA foi adicionada às células com meio de cultura completo, e incubado em estufa a 37ºC e 5% de CO2. Após o período de 8 horas foi realizada a troca do meio de cultura, agora por meio completo contendo antibiótico e SBF a 10%. A incubação seguiu até aproximadamente 48 horas quando as células foram coletadas e analisadas em imunofluorescência e em gel de eletroforese SDS-PAGE, que serão descritas em tópicos posteriores.

[0083] Para as células 293F, os ensaios de transfecção aconteceram conforme instruções do fabricante, utilizando o reagente de transfecção 293fectin.

[0084] Um dia antes da tranfecção foi determinada e ajustada a densidade celular das células 293F viáveis. Em 28 mL de meio FreeStyleTM Expression Medium foram acrescidos 7x105 células, cultivadas em condições descritas anteriormente.

[0085] No dia seguinte, uma pequena alíquota da cultura celular foi transferida para um microtubo para determinação da taxa de viabilidade celular, que deve permanecer em torno de 90%. Para a transfecção de 3x107 células viáveis, foram preparadas duas soluções em diferentes tubos cônicos estéreis:

[0086] Tubo 1 - 30 µg de DNA plasmideal pcDNA3.3/L2E6 em 1 mL de volume final com meio Opti-MEM®, homogeneizados gentilmente;

[0087] Tubo 2 - 60 µL de 293fectinTM em 1 mL de volume final com meio Opti-MEM®, misturados gentilmente e incubado por 5 minutos a temperatura ambiente.

[0088] Em seguida, os conteúdos do tubo 1 e 2, descritos acima, foram misturados gentilmente resultando em uma solução de 2 mL, que foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente, para permitir que o DNA plasmideal forme complexos com o reagente 293fectin®.

[0089] Enquanto o complexo DNA-293fectin® era incubado, as células em cultivo foram centrifugadas em tubos cônicos a 800 rpm por 5 minutos, sendo o meio em cultivo substituído por 28 mL de meio FreeStyleTM Expression Medium fresco, pré-aquecido.

[0090] Por fim, os 2 mL do complexo DNA-293fectin® foi adicionado aos 28 mL de meio e células em suspensão, totalizando 30 mL de solução para transfecção, incubado 48 horas a 37ºC e 5% CO2, em atmosfera úmida, sob agitação em shaker orbital a aproximadamente 125 rpm.

10. Expressão e caracterização das proteínas recombinantes 10.1. Expressão intracelular das proteínas

[0091] Após transfecção, uma alíquota das células foi separada para análise da expressão das proteínas recombinantes intracelulares através de ensaios de imunofluorescência.

[0092] As células HEK 293T foram cultivadas sobre lamínulas redondas de 13 mm de diâmetro em placas de cultura (TPP®) de 12 poços. As linhagens facilmente aderentes foram cultivadas diretamente sobre as lamínulas em meio D10, mantidas em atmosfera úmida, contendo 5% de CO2, por aproximadamente 18 horas. No dia seguinte, foi realizado o ensaio de transfecção celular conforme descrito no item anterior.

[0093] Para os ensaios utilizando as células 293F já transfectadas, conforme descrito anteriormente, foram centrifugadas em microtubos e o sobrenadante descartado.

[0094] Após as transfecções, ambas as linhagens de células foram lavadas 2 vezes em PBS e fixadas em solução de paraformaldeído a 1% em PBS, por 1 hora a 4ºC. Após sucessivas lavagens para remoção de todo fixador, as células foram incubadas em solução PBS+BSA 5% para o bloqueio de ligações inespecíficas e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas em PBS por 3 vezes e então incubadas com anticorpo primário específico anti-HPV16 L2 ou anti-HPV16 E6 diluídos em 0,5% BSA e 0,05% Tween 20 em PBS por 1 hora a temperatura ambiente, agitando-se o tubo frequentemente. Após nova lavagem, as células foram incubadas com os respectivos anticorpos secundários específicos diluídos em 1,5% BSA e 0,01% Tween 20 em PBS por 1 hora a temperatura ambiente, com frequentes agitaçes no tubo contendo as células e a solução com os anticorpos. Os anticorpos secundários usados foram AlexaFluor® 488 anti-IgG de camundongo produzido em cabra (Molecular Probes®, OR) e AlexaFluor® 633 anti-IgG de coelho produzido em cabra. Após uma última lavagem em PBS, as células 293F foram distribuídas sobre lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina a 0,5% em PBS.

[0095] Por fim, as lamínulas contendo as células HEK 293T ou 293F foram montadas sobre lâminas com Mowiol (Calbiochem, CA, EUA), contendo Iodeto de propídio (PI - Molecular Probes®, OR) que evidenciam a presença e localização dos ácidos nucleicos.

[0096] As preparações foram mantidas a 4ºC, protegidas da luz até o momento de suas análises no microscópio confocal Zeiss LSM 510 Meta laser-scanning. 10.2. Análise da expressão das proteínas recombinantes

[0097] Após cada reação de transfecção, as células foram lisadas em tampão (Tris 0,5 M pH 7,4, NaCl 0,5 M, EDTA 0,5 M pH 8,0, EGTA 0,2 M, Triton X-100, coquetel inibidor de protease), centrifugadas a 10.000xg por 5 minutos, sendo o precipitado descartado e o sobrenadante armazenado a -20ºC até o momento do uso.

[0098] Para confirmar a transfecção, as amostras de lisados celulares foram analisadas de uma maneira mais rápida e simples através de ensaios de dot blotting. Assim, 10 µL de amostras foram expostas a tiras de membrana de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Inc.), após secarem, as tiras foram incubadas em solução contendo 5% de leite em pó desnatado em PBST por 1 hora, sob agitação a temperatura ambiente. Em seguida as tiras de membrana foram lavadas 4 vezes em PBST, por 10 minutos, e incubadas com solução de anticorpos monoclonais anti-HPV16 L2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ou anti-HPV16/18 E6 (Abcam®) diluídos em 1% de leite em pó desnatado em PBST durante 1 hora a temperatura ambiente, sob agitação. E então, as tiras foram novamente lavadas por 10 minutos em PBST, 4 vezes, e incubadas em anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado a horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich®) diluídos em PBST e 1% de leite em pó desnatado, por mais 1 hora, sob agitação a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas por mais 4 vezes de 10 minutos em PBST e a revelação se deu por uma solução substrato DAB (diaminobenzidina) - peroxidase (DAB 0,05%, H2O2 0,015%, PBS 0,01 M, pH 7,2), incubado a temperatura ambiente por até 10 minutos, sob agitação e protegido da incidência da luz.

[0099] As amostras positivas nos ensaios de dot blot seguiram para análise de expressão das proteínas recombinantes, realizada através de ensaios de Western blotting. Para isso, um gel Tricina-SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) a 16% foi preparado e submetido para separação eletroforética (30 V por 300 minutos), sob condições desnaturantes, contendo amostras de lisados de células transfectadas diluídas em tampão de corrida. Em seguida, o gel foi corado em solução Coomassie Blue (ácido acético 7%, Metanol 50%, Coomassie Brilhante Blue R-250 0,1%) ou as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose para realização de ensaios de Western blotting. Após transferência eletroforética (30 V e 15 mA por 18 horas, ou 70 V e 35 mA por 2 horas) em tampão de transferência (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M, Metanol 20%) a 4ºC, a membrana foi corada em solução contendo corante temporário Ponceau (Ponceau S 0,1%, ácido acético 5%) para confirmação da transferência e marcação dos indicadores de peso molecular. Em seguida, as membranas foram lavadas em água destilada para remoção da coloração temporária e incubadas em solução contendo 5% de leite em pó desnatado diluído em PBST (Tween 20 0,05%, PBS), por 1 hora, a temperatura ambiente, sob agitação. Após esse período, as membranas foram lavadas 4 vezes em PBST e incubadas com soluções de leite em pó desnatado a 1% em PBST contendo os anticorpos primários anti-HPV16 L2 monoclonal, anti-HPV16 L2 policlonal produzido em coelho (gentilmente cedido pelo Prof Dr R. B. S. Roden, John Hopkins School of Medicine, USA) e/ou antiHPV16 E6 por 2 hora a temperatura ambiente, sob agitação. A seguir, as membranas foram novamente lavadas 4 vezes em PBST e incubadas em solução contendo os respectivos anticorpos secundários anti-IgG de camundongo ou anti-IgG de coelho conjugados com horseradish peroxidase em solução de leite em pó desnatado a 1% em PBST, incubadas por 2 horas a temperatura ambiente, sob agitação. A reação foi detectada usando o kit Novex® ECL HRP Chemiluminescent Substrate Reagent (Invitrogen) em filmes sensíveis à luz verde (Kodak).

11. Análises proteicas

[00100] As amostras de lisado celular foram analisadas em gel de eletroforese Tricina-SDS-PAGE a 16%, sendo o mais indicado para a separação de proteínas de 1 a 100 KDa (SCHAGGER, 2006).

[00101] Para isso, primeiramente foi preparado o gel de separação a 16%, onde o tampão AB-6 (acrilamida 46,5 g, bis-acrilamida 3 g) foi diluído em tampão do gel (Tris 3 M, HCl 1M, SDS 0,3%, pH 8,45), acrescido de PA 10% [(NH4)2S2O8] e TEMED [(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2] . Rapidamente o gel foi colocado no aparato para polimerizar. Em seguida, foi preparado um novo gel de separação a 10%, utilizando o tampão AB-3 (acrilamida 48 g, bis-acrilamida 1,5 g) foi diluído no mesmo tampão de gel, água, PA 10% e TEMED. Após o preparo, o gel a 10% foi colocado sobre o gel a 16% delicadamente. Por fim, foi preparado um gel de empilhamento, onde o tampão AB-3 foi diluído em tampão do gel, água, PA 10% e TEMED a uma concentração final de 4%.

[00102] As amostras proteicas foram quantificadas e suas concentrações ajustadas para que cada amostra contenha aproximadamente 15 µg de proteínas. A dosagem das proteínas ocorreu pelo método de Bradford (Bio-Rad Laboratories Inc.), conforme instruções do fabricante. Assim, as amostras foram diluídas em tampão de amostra (Tris-Cl 1 M pH 6,8, SDS 0,8%, azul de bromofenol 0,1%, glicerol 40%, bmercaptoetanol 14,4 M) e finalmente submetidas a separação eletroforética (30 V por 300 minutos) em tampão tristricina (Tris 0,1 M; Tricina 0,1 M; SDS 0,1%, pH 8,5). Após separação, o gel foi corado com solução Coomassie blue.

12. Síntese de peptídeos

[00103] Para serem usados como controles positivos dos peptídeos desenhados no presente estudo, peptídeos sintéticos L2 (PEP2) e E6 (PEP1) foram solicitados a empresa FastBio Ltda. (Ribeirão Preto, SP).

[00104] Sendo o PEP1, referente ao peptídeo selecionado da proteína E6 de HPV16, cuja sequência YDFAFRDL, contendo 8 aminoácidos e pureza > 85%.

[00105] O PEP2, selecionado da proteína L2 de HPV16, tem a sequência LYKTCKQAGTCPPDIIPKV, com 19 aminoácidos e pureza > 85%.

[00106] Os peptídeos foram recebidos liofilizados e foram ressuspendidos em água ultrapura a uma concentração de 5 mg/mL.

13. Cultivo de células tumorais TC-1

[00107] Células primárias de pulmão de camundongos C57BL/6 foram transduzidas com os genes E6 e E7 de HPV16, em seguida, as células imortalizadas foram novamente transduzidas com o gene humano ativado c-Has-ras, gerando a linhagem de células transformadas estáveis TC-1 que expressam a proteína E6 e E7 de HPV16, sendo capazes de gerar tumores sólidos em camundongos de mesmo background genético (LIN, 1996).

[00108] As células TC-1 foram cultivadas em frascos de poliestireno de 75 cm2 (TPP - TPP Techno Plastic Products AG, Suíça) em meio RPMI (Cultilab, Campinas, SP, Brasil), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) a 37ºC e 5% CO2. O repique das células ou a troca dos meios de cultura foram realizados a cada 3 ou 4 dias. Para o repique, solução de Tripsina/EDTA a 250 mg% (Cultilab) foi utilizada para remover as células aderidas ao fundo dos frascos de cultura, incubadas por até 15 minutos, a 37ºC. Em seguida, as células foram centrifugadas a 800xg por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante descartado e as células ressuspendidas em novo meio de cultura. Para armazenamento da linhagem celular durante períodos longos, alíquotas das células foram armazenadas em solução de meio de cultura RPMI contendo 10% de SBF, acrescido de 10% de DMSO, em nitrogênio líquido.

14. Experimentos in vivo

[00109] Com o intuito de avaliar a possibilidade de utilização dos vetores construídos como vetores vacinais, visto que o plasmídeo escolhido, pcDNA, também permite tal utilização, foram realizados ensaios in vivo.

[00110] Para os ensaios em animais, a presente invenção foi analisada e aprovada junto à Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan, sob o número de protocolo 923/12.

[00111] Camundongos C57BL/6 machos de 4 a 8 semanas fornecidos pelo Biotério Central do Instituto Butantan, com peso médio de 20 g, foram separados em 4 grupos contendo 10 animais em cada grupo, mantidos em biotério com alimento e água ad libitum e ciclo luminoso controlado.

[00112] Os animais foram pesados semanalmente antes e durante todo o experimento.

14.1. Avaliação profilática

[00113] Dois grupos de 4 ou 6 animais foram selecionados para avaliação profilática da vacina de DNA proposta.

[00114] O primeiro grupo, denominado de grupo I, contendo 4 animais recebeu 50 µL de solução PBS intramuscular em 3 doses no intervalo de 14 dias entre a primeira (dia 1) e segunda dose (dia 14), e 7 dias (dia 21) entre a segunda e a terceira dose.

[00115] Já os 6 animais que compuseram o grupo II, receberem 3 doses da construção vacinal pcDNA3.3/L2E6 em solução PBS, em concentrações decrescentes. A primeira dose ocorreu no dia 1 e os animais receberam 50 µg da vacina de DNA. A segunda dose foi ministrada 14 dias após, em concentração de 20 µg, enquanto a terceira e última dose apresentava a concentração de 5 µg do vetor vacinal, aplicada 7 dias após a dose anterior.

[00116] As vacinas foram ministradas pela via intramuscular no músculo tibial anterior da pata traseira, sendo que as doses foram administradas intercalando entre as patas traseiras direitas e esquerdas. O volume inoculado nunca superou 50 µL de solução.

[00117] Sete dias após a última dose (dia 28), todos os animais de ambos os grupos foram desafiados com 105 células TC-1 em solução PBS pela via subcutânea na região dorso-lateral esquerdo de cada animal. Os camundongos foram observados diariamente e 8 dias após implementação das células tumorais foi possível detectar a formação de massa palpável. A partir da detecção dos tumores, esses foram medidos a cada 2 dias com auxílio de um paquímetro digital (Western®, China). Os tumores cresceram em formas irregulares e foram medidos quanto ao comprimento e o eixo perpendicular, a largura, no mesmo plano. A partir desses dados foi calculado o volume do tumor de cada camundongo em cm3, os dados foram agrupados e analisados estatisticamente utilizando os testes t de Student (p=5,00%), e o software Graphic-Pad Prism 6, versão 3.0.

[00118] Foram realizadas coletas de pequenas alíquotas de sangue, aproximadamente 100 µL, de todos os animais nos dias 0, 14, 28, 42. Os camundongos foram eutanasiados cerca de 3 semanas após a implantação dos tumores (dia 49), seguindo as normas éticas em experimentação animal (TAMBOURGI et al., 2010) e foi coletado todo sangue.

[00119] A partir das amostras de sangue, o soro dos animais foi coletado através de centrifugação a 800 rpm, onde aproximadamente 30 µL de soro foram obtidos e armazenados a -20ºC até o momento das análises.

14.2. Avaliação terapêutica

[00120] Para avaliação da eficiência do uso do vetor vacinal construído, pcDNA3.3/L2E6, na terapêutica de cânceres associados ao HPV, 3 grupos animais foram selecionados para os ensaios.

[00121] Os grupos foram formados por 10 animais e desafiados com 7x104 células TC-1 em meio de cultura DMEM e inoculados pela via subcutânea na região dorso-lateral esquerdo de cada animal. Previamente, a área foi preparada com a raspagem dos pelos para facilitar a aplicação das células tumorais pela via correta.

[00122] No dia seguinte à inoculação das células tumorais, dia 1, os animais do grupo controle, grupo III, receberam 5 µg do vetor vazio, pcDNA3.3, e no dia 10, ministrada uma segunda dose contendo 5 µg do mesmo vetor.

[00123] Os animais foram acompanhados diariamente e a região apalpada para verificar a implantação do tumor. Assim que detectados, os tumores foram medidos manualmente com auxílio de um paquímetro digital a cada 2 dias, ou até que os tumores atingissem aproximadamente 20 mm de diâmetro, quando os animais foram eutanasiados.

[00124] Para os ensaios experimentais, os animais foram divididos em 2 novos grupos, onde o primeiro grupo, grupo IV, recebeu a primeira dose da vacina de DNA, pcDNA3.3/L2E6, no primeiro dia de experimentação e a segunda dose, aos 15 dias. A primeira dose com 5 µg de vetor pcDNA3.3/L2E6, enquanto que a segunda dose foi composta por 5 µg do vetor vacinal. Esses animais ainda receberam uma terceira dose vacinal de 5 µg aos 28 dias experimentais. Ambas as doses foram diluídas em solução PBS.

[00125] Já os animais do segundo grupo experimental, grupo V, receberam a primeira dose da vacina de DNA contendo 5µg de pcDNA3.3/L2E6 no primeiro dia experimental, ou seja, 1 dia após receberem as células tumorais, e a segunda dose 10 dias após a primeira contendo 5 µg.

[00126] Os animais foram acompanhados diariamente e a região apalpada para verificar o crescimento tumoral. Se detectados, os tumores seriam medidos manualmente com auxílio de um paquímetro digital a cada 2 dias, ou até que os tumores atingissem aproximadamente 20 mm de diâmetro, quando os animais seriam eutanasiados.

[00127] Pequenas alíquotas de sangue foram retiradas nos dias 0, 21, 28 e 49 para obtenção de soro e armazenados a -20ºC até o momento do uso.

[00128] Os baços dos animais que fizeram parte dos grupos testados para a ação terapêutica da vacina de DNA, grupo III, IV e V, foram coletados em ambiente estéril, lavados 2 vezes em solução PBS estéril e cultivados conforme descrito abaixo.

15. Cultura de esplenócitos

[00129] O baço retirado de cada animal, após dupla lavagem em solução PBS estéril, foi macerado contra um pedaço de gaze estéril com auxílio de um embolo de seringa em uma placa de Petri. Sobre o macerado foi adicionado 3 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal (R10). As células foram coletadas em um tubo cônico estéril e centrifugado a 12000 rpm por 5 minutos.

[00130] Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as hemácias foram lisadas acrescentando 500 µL de água destilada estéril, homogeneizada rapidamente e acrescido mais 500 µL de solução PBS duas vezes concentrada e estéril, homogeneizando bem. Após nova centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado ressuspendido com 1 mL de meio R10.

[00131] As células viáveis do baço foram contadas com auxílio do corante azul de trypan em solução a 0,4% em PBS em câmara de Neubauer.

[00132] As células foram distribuídas em triplicata em uma placa de cultura de 12 poços a uma concentração de 106 células/mL, sendo o volume completado com 1 mL de meio R10. Em cada poço foi adicionado 10 µL do peptídeo sintético PEP1 (E6), descrito anteriormente. Em seguida, as placas contendo os esplenócitos e PEP1 foram incubadas por 48 horas a 37ºC e 5% de CO2, em ambiente úmido. Após esse período, o sobrenadante da cultura foi recuperado e armazenado a -80ºC até o momento das análises de dosagem de citocinas, descritas abaixo.

16. Ensaio de detecção de citocinas

[00133] A partir de alíquotas de soro coletado dos animais em experimentação e do sobrenadante da cultura de esplenócitos foram realizadas dosagens de citocinas solúveis com auxílio do kit BD CBA Mouse Th1/Th2 Cytokine (BDTM Biosciences, EUA) conforme especificações do fabricante.

[00134] Resumidamente, as amostras foram separadas por grupos e datas experimentais, sendo analisadas em pools apenas as amostras de soro coletadas nos dias 0, 28 e 49, assim como as amostras do sobrenadante da cultura dos esplenócitos. As amostras foram incubadas com beads revestidas por anticorpos específicos contra 5 diferentes tipos de citocinas (IL-2, IL-4, IL-5, INF-g e TNF), junto ao reagente de detecção conjugado a proteína fluorescente PE (Ficoeritrina) e incubados por 2 horas a temperatura ambiente, protegido da incidência luminosa.

[00135] Em seguida, as beads foram lavadas com tampão de lavagem (componente do kit) e ressuspendidas em 300 µL de tampão de lavagem, sendo então analisados em citômetro de fluxo, BD FACSCanto II (BD™ Biosciences). Os dados foram analisados utilizando o software FCAP Array versão 3.0 (BD™ Biosciences).

17. ELISA indireto

[00136] Para análise da indução de resposta imune humoral pela vacina pcDNA3.3/L2E6 foram realizados ensaios de ELISA (Enzymed-Linked ImmunoSorbent Assay), onde as placas de fundo chato com alta capacidade de adesão (Sarstedt, Numbrecht, Alemanha) foram sensibilizadas com 0,6 mg/mL de PEP1 ou 0,3 mg/mL de PEP2 em tampão carbonatobicarbonato (Na2CO3 0,2 M, NaHCO3 0,2 M, pH 9,6) e incubado por 18 horas a 4ºC. No dia seguinte, o antígeno foi recuperado e a placa lavada 3 vezes com PBST. Em seguida, foram adicionados 150 µL de solução PBST + 5% leite em pó desnatado para o bloqueio das ligações inespecíficas e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. A placa foi lavada novamente 3 vezes com PBST e em cada poço foram distribuídas as amostras de soro coletados dos animais nos dias 0, 28 e 49, diluídas 1:100 em solução PBST + 1% de leite em pó desnatado. Os anticorpos primários foram incubados por 2 horas a temperatura ambiente. Após esse período, as amostras foram descartadas e a placa lavada por mais 3 vezes com solução PBST. Aos poços então foram adicionados 100 µL do anticorpo secundário, anti-IgG de camundongo produzido em carneiro conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich), diluído a 1:250 em solução PBST + 1% de leite em pó desnatado e incubados por 1 hora e 30 minutos a temperatura ambiente. A placa foi lavada novamente 3 vezes com solução PBST e 1 vez com PBS. Por fim, cada poço recebeu 100 µL de solução reveladora (C6H8O7 0,05M, Na2HPO4 0,05M, pH 5) em que foi diluído um tablete de OPD (ophenylenediamine dihydrochloride, Invitrogen) contendo 5 mg e adicionado 12 µL de H2O2 a 30%. Incubada por 15 minutos a temperatura ambiente em local protegido da incidência direta de luz. Então, cada poço recebeu 50 µL de solução H2SO4 a 2,5 M para paralisar a reação. A placa seguiu para leitura em Leitor MultiSkan EX (LabSystems) a 492 nm. As amostras foram testadas em triplicata.

[00137] As análises dos resultados foram realizadas calculando-se o ponto de corte ("cut off") pela média das amostras negativas acrescida de 3 vezes o valor do desvio padrão (s) dessas amostras, sendo acrescido mais 10% do valor final. O número de desvio padrão utilizado na fórmula garante o nível de confiança do resultado.

[00138] Ponto de corte = média + 3x s + 10%

[00139] Todos os pontos obtidos acima desse ponto de corte foram considerados como sendo amostras positivas.

18. Análises estatísticas

[00140] As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software GraphPad Prism®(GraphPad Software, Inc.). Para as análises estatísticas realizadas sobre os dados obtidos em experimento com animais, peso dos animais e volume dos tumores, foram utilizados os testes t de Student (p = 0,05%). Já nos ensaios de detecção de citocinas foi utilizado o teste paramétrico ANOVA (p<0,05).

19. Análises de bioinformática da sequência L2E6.

[00141] A partir da sequência de DNA codificadora para a proteína L2E6 definida, análises in silico foram realizadas para melhor entendimento do produto a ser gerado e das características da proteína para auxiliar o desenvolvimento do presente estudo.

[00142] A Tabela 1 mostra as análises de bioinformática da sequência L2E6. A partir da sequência de DNA codificadora para a proteína L2E6 definida, análises in silico foram realizadas para melhor entendimento do produto a ser gerado e das características da proteína para auxiliar no desenvolvimento do presente estudo. Diversos softwares e sites “online” para análises proteômicas surgiram nos últimos anos, baseados em algoritmos que predizem características das proteínas a partir de suas sequências de aminoácidos. Um dos sites mais utilizados e descritos na literatura capaz de predizer características físico-químicas das proteínas é o http://protcalc.sourceforge.net/, que estima massa molecular, pH, pI e realiza a contagem dos resíduos de aminoácidos. Foram consultados diversos sites referências e os dados foram analisados e compilados na tabela abaixo, onde a sequência definida QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVGGSGYDFAFRDL com 32 resíduos de aminoácidos apresentando as demais características:

[00143] Utilizando outros sites de predição de possíveis alterações pós-traducionais foram analisados diversos parâmetros através do site do “Center for Biological Sequence Analysis” – CBS - da Universidade Técnica da Dinamarca através do link http://www.cbs.dtu.dk/index.shtml.

[00144] As análises demonstraram que o peptídeo L2E6 desenvolvido apresenta sítios de predição para acetilação, fosforilação, sítios ricos em leucina indicando sinais de exportação para o núcleo e um sítio de clivagem entre os resíduos de aminoácido 23 e 24, gerando um peptídeo sinal com possível sinalização de exportação dessa proteína para região transmembrana. Além da presença de 2 resíduos de aminoácido cisteína, o que pode levar à formação de ligações dissulfeto com modificações pós-traducionais gerando possíveis alterações na conformação e estabilidade da proteína.

[00145] A Figura 2 mostra a fotodocumentação do gel de eletroforese em agarose 0,8% para seleção das colônias bacterianas após transformação com o vetor pcDNA3.3/L2E6. Após os ensaios de transformação bacteriana para amplificação dos vetores, as colônias bacterianas foram submetidas a PCR para seleção dos clones positivos. Os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose e submetidos a eletroforese (Figura 2), onde (MM1) representa o marcador universal e (MM2) o marcador 50 pb DNA Ladder. Em (1) temos uma amostra do plasmídeo íntegro pcDNA3.3/L2E6, em (2) e (3) produtos de PCRs das colônias bacterianas transformadas por pcDNA3.3/L2E6 e (4) produto da PCR de uma colônia não transformada.

[00146] Assim, a colônia apresentada na coluna 3 (Figura 2) foi selecionada para amplificação da colônia de bactérias e em seguida para a purificação do DNA plasmideal. O DNA plasmideal recuperado foi quantificado por espectrofotometria, resultando em uma média de 150 ng/µL por amostra.

[00147] O sequenciamento do DNA plasmideal recuperado e quantificado conforme descrito anteriormente confirmou a correta formação e sequência do gene L2E6 desenvolvido no presente trabalho.

[00148] As Figuras 3 e 4 mostram a avaliação da expressão intracelular da proteína recombinante fusionada L2E6, realizada em células HEK293T (Figura 3) e 293F (Figura 4).

[00149] Através de ensaios de imunofluorescência indireta foi possível evidenciar a expressão da proteína recombinante, sendo reconhecida pelo anticorpo monoclonal específico anti-L2 comercial. A proteína foi visualizada na forma de pontos distribuídos por toda a célula (Figuras 3 e 4).

[00150] A Figura 5 mostra a análise da expressão da proteína recombinante L2E6. Após a transfecção de células 293F com o vetor pcDNA3.3/L2E6, as células foram coletadas e lisadas conforme descrito anteriormente. O lisado celular foi analisado em SDS-PAGE 12 %, como observado na Figura 5. A massa molecular teórica da proteína recombinante L2E6 produzida seria de aproximadamente 3,5 KDa.

[00151] A comparação do perfil de corrida das amostras do lisado celular de células não transfectadas e transfectadas revelou a presença de uma proteína de baixíssima massa molecular, abaixo de 8 KDa, presente somente nas amostras transfectadas, sugerindo tratar-se da proteína recombinante L2E6. Adicionalmente, ensaios de Western blotting foram realizados para confirmar a expressão das proteínas recombinantes e o reconhecimento dessas proteínas por anticorpos monoclonais comerciais específicos anti-L2 e anti-E6, para confirmar a identidade da proteína expressa. Os resultados obtidos revelaram que ambos os anticorpos monoclonais, anti-L2 e anti-E6, reconheceram uma proteína de aproximadamente 3,5 KDa, sugerindo a confirmação da identidade da proteína de interesse (Figura 5).

[00152] A fotodocumentação do resultado obtido do ensaio de Western blotting utilizado para detecção e caracterização da proteína recombinante L2E6, onde as amostras (1) e (5) são alíquotas de lisado de células não transfectadas, (2) e (6) lisado de células transfectadas e expressando L2E6, (3) e (7) eluídos intermediários obtidos do ensaio de cromatografia por gel filtração e interagindo com os anticorpos monoclonais específicos anti-L2 (3) e anti-E6 (7), demonstrando a presença de uma proteína de baixo peso molecular sendo reconhecida por ambos os anticorpos comerciais, (4) amostra de eluição final do processo de gel filtração. (MM) marcador molecular Color Burst™.

[00153] A Figura 6 mostra a avaliação profilática em ensaios in vivo realizados no presente trabalho, em experimentos para análise do uso do vetor como uma vacina de DNA em modelo murino. Os animais foram separados em 4 grupos experimentais, sendo avaliados quanto à possibilidade de indução de proteção profilática e terapêutica ao desafio com células tumorais TC-1.

[00154] A partir da pesagem semanal dos animais foi possível observar que o peso se manteve constante durante todo o experimento. Observou-se uma pequena diferença de peso entre os animais do grupo experimental e controle, que receberam apenas PBS, desde o dia 0 (zero) experimental, porém tal diferença não é estatisticamente significante, segundo teste t de Student, sugerindo que a vacina de DNA não interferiu no ganho ou perda de peso dos animais (Figura 6).

[00155] A Figura 7 mostra que uma semana após a aplicação das 3 doses da vacina de DNA proposta no presente estudo, os animais foram desafiados com as células tumorais TC-1 para avaliar se houve indução de resposta imune protetora e sua capacidade de proteção profilática, no desenvolvimento tumoral de células HPV-positivas. A partir do momento que os tumores se estabeleceram e se tornaram palpáveis, foram medidos a cada 2 dias e os dados analisados. O volume tumoral aumentou ao longo do experimento, demonstrando que houve a implantação tumoral com desenvolvimento do tumor. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os animais de um mesmo grupo, assim como não foi possível observar diferença no volume tumoral dos animais entre os grupos experimentais e controles (Figura 7), sugerindo que a vacina de DNA usada profilaticamente não induziu resposta imune capaz de impedir ou controlar o desenvolvimento tumoral. Entretanto, tal resultado era esperado, visto que a capacidade profilática da vacina em desenvolvimento se limitaria na capacidade de induzir a produção de anticorpos específicos capazes de impedir a infecção das células pelo HPV.

[00156] A Figura 8 mostra a avaliação terapêutica da vacina de DNA. Durante todo procedimento experimental os animais foram pesados semanalmente para acompanhamento de seu desenvolvimento e de possíveis alterações induzidas pela aplicação das vacinas de DNA. As células TC-1 quando aplicadas pela via subcutânea têm a capacidade de se estabelecer e formar tumores sólidos e não invasivos, porém seu crescimento é rápido e capaz de induzir a formação de feridas externas na pele dos animais. Assim, após aplicação das células tumorais, os animais foram monitorados quanto ao desenvolvimento tumoral, sendo que quando os mesmos induzissem formação de feridas expostas ou quando o maior diâmetro da massa tumoral atingisse 200 mm, os animais foram eutanasiados. Dessa maneira, todos os animais do grupo controle, grupo II, que receberam as células tumorais e não receberam a vacina de DNA, recebendo apenas o vetor vazio, foram eutanasiados no vigésimo oitavo dia experimental. Assim, no grupo dos animais que receberam as células tumorais e o tratamento com o vetor vazio, foi possível observar que a implantação tumoral induziu a perda de peso dos animais desde o sétimo dia após a inoculação das células neoplásicas, porém essa diferença de peso não é estatisticamente significante. Apenas no vigésimo oitavo dia experimental foi possível observar uma grande diminuição de peso nos animais (Grupos III e IV, Figura 8), sendo estatisticamente significativa quando comparados às pesagens anteriores (p>0,0001). Dentro do mesmo grupo não houve diferença significativa no peso dos animais (Figura 8). Os animais que receberam as células tumorais e a vacina pcDNA3.3/L2E6 não demonstraram perda significativa de peso durante todo o experimento, inclusive o grupo que recebeu as vacinas em períodos menores entre as doses, grupo V, o crescimento dos animais demonstrou ser contínuo ao longo de todo o experimento.

[00157] A Figura 9 mostra que a partir do décimo dia após inoculação das células TC-1 já foi possível detectar a presença de massa tumoral palpável, porém ainda não mensuráveis em todos os animais do grupo III, que receberam a vacina contendo o vetor vazio. Entretanto, com o crescimento rápido dos tumores, após 2 dias foram iniciadas as medições dos diâmetros tumorais, seguidas de medições a cada 2 dias. Os dados obtidos demonstram um rápido crescimento tumoral, com volumes tumorais semelhantes entre os animais do mesmo grupo. Nos animais do grupo IV, que receberam 3 doses da vacina pcDNA3.3/L2E6 em intervalos de 15 dias, 3 animais do grupo desenvolveram tumores sólidos a partir do 12 dia experimental. Com o desenvolvimento rápido dos tumores, esses 3 animais foram eutanasiados no vigésimo oitavo dia experimental. Os demais 7 animais do grupo não desenvolveram tumores ao longo de todo o período analisado.

[00158] Dos animais do grupo V, que receberam apenas 2 doses da vacina pcDNA3.3/L2E6 em intervalos de 10 dias, 8 deles não desenvolveram qualquer tumor associado à aplicação das células TC-1, sendo mantidos por todo o período experimental. Dois animais desse grupo apresentaram o desenvolvimento de um tumor, porém de volumes bem menores quando comparados aos animais do grupo controle, III.

[00159] Entre os grupos a diferença dos volumes tumorais foi estatisticamente significante (p<0,0001), imediatamente após a imunização da segunda dose da vacina de DNA, sugerindo que a mesma induziu uma resposta imune suficientemente capaz de conter o crescimento tumoral nos animais do grupo IV. Com o passar do tempo, essa diferença no volume tumoral entre os grupos III e IV se tornou mais evidente, como pode ser observado na Figura 9. Os volumes tumorais dos animais do grupo que recebeu a vacina de DNA, grupo IV, permaneceram aumentados, embora apenas levemente, sugerindo a estabilidade até 14 dias após a última dose, quando as medidas voltaram a demonstrar um pequeno aumento, porém não estatisticamente significante. Já os animais do grupo V, aqueles que apresentaram a formação das massas tumorais, essas foram crescendo em ritmo bem lento, quando comparado aos demais animais que apresentaram desenvolvimento de tumores. E o volume final atingido por esses tumores foi bem menor quando comparado aos demais animais.

[00160] A Tabela 2 mostra a análise da produção de citocinas.

[00161] A partir dos soros obtidos dos animais utilizados nos experimentos, ensaios de detecção e dosagem de citocinas foram realizados na tentativa de traçar um perfil de resposta imune induzida pela vacina de DNA.

[00162] Um pool de amostras de soro dos dias 0, 28 e 49 foram separados por grupos e com auxílio do kit BD CBA Mouse Th1/Th2 Cytokine. Em todas as amostras testadas foi possível detectar a presença das citocinas analisadas, entretanto os resultados obtidos para as citocinas IFN, IL2, IL-4 e IL-5, as concentrações encontradas foram baixas e não foi possível observar diferenças nas concentrações das amostras coletadas antes e depois dos tratamentos, como pode ser observado na tabela 2, abaixo (Tabela 2).

[00163] A análise estatística através do teste não paramétrico de Mann & Whitney revelou que não houve diferença significativa nas concentrações de TNF detectadas entre os grupos controle e experimental (p<0,05).

[00164] Porém nas análises de TNF (fator de necrose tumoral) das amostras de soro foi possível observar o aumento expressivo nas concentrações dessa citocina no último dia experimental, 49, como pode ser observado na tabela abaixo (Tabela 3).

[00165] As mesmas análises de detecção de citocinas também foram realizadas com as amostras do sobrenadante de cultura de esplenócitos quando incubados com alíquotas do peptídeo sintético PEP1 (E6). Os níveis de IFN, IL-2, IL-4 e IL-5 não foram detectados, pois as concentrações encontradas estavam todas fora da curva de concentração padrão. Entretanto, níveis elevados de TNF foram detectados nas amostras dos animais dos grupos IV e V, como pode ser observado na tabela 4 (abaixo).

[00166] As Figuras 10 e 11 mostram a análise da produção de anticorpos específicos. As amostras de soro coletadas de todos os animais e grupos foram analisadas em ensaios de ELISA indireto, para demonstrar se houve indução de resposta imune humoral induzida pela vacina pcDNA3.3/L2E6 com a produção de anticorpos específicos anti-L2 ou anti-E6. As amostras foram testadas em triplicata e seus resultados foram analisados conforme descrito anteriormente. Os dados obtidos demonstraram que nas amostras do dia 0 não foram detectados anticorpos antiL2 ou anti-E6 em nenhum dos animais, conforme o esperado. Mas, nas amostras dos dias 28 já foi possível detectar a presença dos anticorpos específicos em níveis elevados, entretanto, o pico de reatividade foi encontrado no dia 49 e a presença dos anticorpos específicos anti-L2 (Figura 10) e anti-E6 (Figura 11) foi então demonstrada. Os animais do grupo IV que desenvolveram tumores foram os mesmos que demonstraram menor capacidade de produção dos anticorpos anti-L2 e anti-E6, recebendo os números 5, 6, 7 e 9. Já os 2 animais do grupo V que desenvolveram tumores sólidos também tiveram os menores níveis de produção de anticorpos anti-L2 e anti-E6, sendo 4 e 5. Os dados dos animais que não aparecem nas figuras abaixo representam aqueles que tiveram um maior desenvolvimento tumoral, não resistindo até os 49 dias experimentais, sendo eutanasiados ao atingirem os parâmetros citados anteriormente.

[00167] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações na vacina de DNA profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

[00168] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidas e contempladas.

[00169] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceitual. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims (47)

1. Processo para produzir vacina profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   • a) seleção dos epítopos e construção de um vetor vacinal contendo peptídeos selecionados das proteínas L2 e E6 de HPV16,
   • b) amplificação do vetor vacinal;
   • c) transformação bacteriana;
   • d) Seleção das colônias bacterianas
   • e) extração de DNA plasmideal
   • f) sequenciamento de DNA
   • g) transfecção celular
   • h) expressão e caracterização das proteínas recombinantes
   • i) Síntese proteica.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b), amplificação do vetor vacinal ocorre em culturas bacterianas de Escherichia coli DH5α.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a), foram utilizadas as sequências dos genes L2 e E6 do HPV16 que foram obtidas do banco de dados internacionais GenBank(r), sendo que o código de acesso do gene E6 utilizado foi AAD33252 e a referência para acesso de L2 foi NC_001526.2.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os peptídeos selecionados a partir do gene E6 estão entre os resíduos de aminoácidos 50 a 57 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os códons foram otimizados para que haja maior sucesso em sua expressão em células humanas, utilizando a ferramenta Codon Optimization da IDT - Integrated DNA Technology, e a sequência final obtida foi conforme estabelecido na SEQ ID NO: 4.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para o gene L2, o peptídeo selecionado foi encontrado entre os resíduos de aminoácidos 17 a 36 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, sendo a sequência otimizada resultando na: SEQ ID NO: 3.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ambas as sequências foram ligadas por 3 sequências "Linker", resultando na sequência de 96 pb (pares de bases), à qual foram adicionadas as sequências iniciadora e de terminação, dando origem à sequência de 102 pb conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 1.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência final foi sintetizada dando origem ao gene sintético denominado L2E6.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a), foram desenhados 2 vetores contendo o gene sintético L2E6, sendo um vetor de clonagem usando como base o vetor comercial pMAT e um vetor de expressão ou vetor vacinal em pcDNA.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que para a construção do vetor de clonagem, o gene sintético L2E6 foi inserido em pMA-T, sendo ambas as extremidades do gene sintético e do vetor flanqueadas por sequências da endonuclease Sfi I.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o vetor denominado pMAT/L2E6 possui origem de replicação bacteriana Col E1 e gene de resistência a ampicilina, AmpR.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor completo apresenta 2494 pb.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que para a construção do vetor de expressão, o inserto L2E6 foi inserido no vetor pcDNA3.3 flanqueado por sítios de endonucleases Hind III e Nhe I, recebendo o nome de pcDNA3.3/L2E6, em que o plasmídeo construído tem origem de replicação bacteriana, pUC, gene de resistência a Ampicilina, Amp (R) e promotor de CMV (Citomegalovirus).
14. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que para análises dos vetores, foram realizados ensaios de eletroforese em gel de agarose a 0,8% (m/v) em tampão TAE 0,5x (Tris 40 mM, Acetato 20 mM, EDTA 1 mM) e submetidos a corrida eletroferética a 80V na presença do corante Blue Green Loading Dye.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) para a amplificação dos vetores foram utilizadas as cepas bacterianas Escherichia coli DH5a e TOP10, em que as cepas bacterianas foram cultivadas em 3 mL de meio Luria-Bertani (LB) (Triptona 2%, Extrato de levedura 1%, NaCl 1%) a 37ºC, sob agitação a 250 rpm por aproximadamente 18 horas, em seguida, uma alíquota dessa cultura foi estriada em uma placa de Petri contendo meio LB acrescido de 1,5% de ágar, incubada a 37ºC, por aproximadamente 18 horas, onde, uma colônia foi escolhida para semear 3 mL de meio LB e cultivada nas mesmas condições descritas anteriormente, após esse período, 1 mL dessa cultura foi utilizado para semear 100 mL de meio LB e cultivado a 37ºC, sob agitação até que a densidade óptica da cultura a 600 nm (DO600) atingisse 0,4, onde as bactérias cultivadas se encontravam na metade da fase exponencial de crescimento.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a indução da competência foi realizada, onde após atingirem a densidade celular desejada, a cultura de bactérias foi transferida para um tubo cônico e centrifugada a 5000xg por 10 minutos e incubadas em solução de 0,1 M de CaCl2 por 1 hora no gelo, em seguida, as bactérias foram novamente centrifugadas e ressuspendidas em solução de 0,1 M de CaCl2 acrescido de 10% de glicerol (m/v), onde alíquotas de 200 µL foram congeladas a -80ºC até sua utilização.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a partir das bactérias competentes foi realizada a etapa (c) de transformação bacteriana, onde uma mistura de 10 µL de DNA plasmideal, aproximadamente 15 g, e uma alíquota de bactérias quimiocompetentes foi incubada por 30 minutos no gelo, submetida a um choque térmico por 2 minutos a 42ºC e incubada novamente no gelo durante 5 minutos, em seguida, foram adicionados 350 µL de meio S.O.C (Triptona 2%, Extrato de levedura 0,5%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 mM), sendo a mistura incubada por 90 minutos a 37ºC, sob agitação de 250 rpm, em seguida, as bactérias transformadas foram semeadas em placas de meio LB-ágar contendo ou não 100 µg/ml de ampicilina e incubadas a 37ºC por 18 horas.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que colônias crescidas nas placas de meio LB-ágar contendo ampicilina identificam os clones positivos que foram selecionados por PCR de colônia e semeadas em tubos contendo 3 mL de meio LB, incubadas a 37ºC, sob agitação por aproximadamente 18 horas.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para seleção das colônias bacterianas na etapa (d) após a transformação foi utilizada a técnica de PCR da colônia, onde 2 iniciadores específicos sintetizados a partir da sequência do gene L2E6 foram desenhados, EAK03 e EAK02, e capazes de gerar um produto de 144 pb.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os iniciadores são conforme estabelecidos pelas SEQ ID NO 6 e SEQ ID NO: 7
21. Processo, de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que os iniciadores foram ressuspendidos em tampão TE (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM) a uma concentração estoque de 100 µM, em que para a PCR, cada solução foi preparada isoladamente em microtubos contendo 25 µL de solução PCR-Mix (MgCl2 1,5 mM, Taq 0,5U, dNTPs 200 5M - LGC Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), 0,5 µL de cada iniciador a 25 µM e água ultrapura para um volume final de solução de 50 µL.
22. Processo, de acordo com as reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que como DNA molde foi utilizada uma amostra de cada colônia de bactéria transformada, selecionada e crescida em meio LB com ampicilina, onde a amplificação foi realizada em termociclador ocorrendo conforme o protocolo: 95ºC por 5 minutos, 25 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 56ºC e 1 minuto a 72ºC, seguido por extensão final a 72ºC por 7 minutos.
23. Processo, de acordo com as reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que detecção dos produtos da PCR ocorreu através da eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 0,5X. As amostras foram preparadas com adição de 0,5 µL de corante Blue Green Loading Dye I e submetidos a uma corrida a 80 A por 30 minutos.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (e) de extração de DNA plasmideal, os clones positivos selecionados pela PCR da colônia foram cultivados em 5 mL de meio LB, a 37°C, por aproximadamente 18 horas, sob agitação, na presença do antibiótico de seleção, em seguida, foram centrifugados a temperatura ambiente, por 1 minuto a 12000xg para sedimentar as bactérias íntegras.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que para a purificação do DNA plasmideal, foi utilizado o GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific), onde o DNA purificado foi analisado em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 0,5X e submetidos à técnica de sequenciamento para confirmação da inserção do gene de interesse ao vetor, quantificado em espectrofotômetro e armazenado a -20ºC.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (f) de sequenciamento de DNA , as amostras de DNA plasmideal foram sequenciadas para confirmação da correta inserção do gene L2E6 e sua integridade, onde as amostras de DNA purificados do gel foram quantificadas por espectrofotometria, e foi aliquotado um volume de 5 µL do plasmídeo e adicionado 2,5 µL do iniciador EAK03 a uma concentração de 5 µM.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (g) a transfecção transiente das células da linhagem HEK 293T foram realizados por lipofecção utilizando o reagente de transfecção GeneJuice® Transfection Reagents, onde o reagente de transfecção foi misturado por vórtex a uma alíquota de meio DMEM, sendo incubado por 5 minutos a temperatura ambiente; à mistura foi adicionado o DNA plasmideal de interesse, na proporção adequada, homogeneizado gentilmente e incubado por 15 minutos em temperatura ambiente, em seguida, a mistura Meio/reagente de transfecção/DNA foi adicionada as células com meio de cultura completo, e incubado em estufa a 37ºC e 5% de CO2, onde após o período de 8 horas foi realizada a troca do meio de cultura, agora por meio completo contendo antibiótico e SBF a 10%, em que a incubação seguiu até aproximadamente 48 horas quando as células foram coletadas e analisadas em imunofluorescência e em gel de eletroforese SDS-PAGE.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que na etapa (g) para as células 293F, os ensaios de transfecção aconteceram utilizando o reagente de transfecção 293fectin.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (h), as células HEK 293T foram cultivadas sobre lamínulas redondas de 13 mm de diâmetro em placas de cultura (TPP®) de 12 poços, onde as linhagens facilmente aderentes foram cultivadas diretamente sobre as lamínulas em meio D10, mantidas em atmosfera úmida, contendo 5% de CO2, por aproximadamente 18 horas.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que na etapa (h), para os ensaios utilizando as células 293F já transfectadas foram centrifugadas em microtubos e o sobrenadante descartado.
31. Processo, de acordo com as reivindicações 29 e 30, caracterizado pelo fato de que após as transfecções, ambas as linhagens de células foram lavadas 2 vezes em PBS e fixadas em solução de paraformaldeído a 1% em PBS, por 1 hora a 4ºC, onde após sucessivas lavagens para remoção de todo fixador, as células foram incubadas em solução PBS+BSA 5% para o bloqueio de ligações inespecíficas e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente, em seguida, as células foram lavadas em PBS por 3 vezes e então incubadas com anticorpo primário específico anti-HPV16 L2 ou anti-HPV16 E6 diluídos em 0,5% BSA e 0,05% Tween 20 em PBS por 1 hora a temperatura ambiente, agitando-se o tubo frequentemente, onde após nova lavagem, as células foram incubadas com os respectivos anticorpos secundários específicos diluídos em 1,5% BSA e 0,01% Tween 20 em PBS por 1 hora a temperatura ambiente, com frequentes agitaçes no tubo contendo as células e a solução com os anticorpos, em que os anticorpos secundários usados foram AlexaFluor® 488 anti-IgG de camundongo produzido em cabra (Molecular Probes®, OR) e AlexaFluor® 633 anti-IgG de coelho produzido em cabra, onde após uma última lavagem em PBS, as células 293F foram distribuídas sobre lamínulas de vidro revestidas com poliL-lisina a 0,5% em PBS.
32. Processo, de acordo com as reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que após cada reação de transfecção, as células foram lisadas em tampão (Tris 0,5 M pH 7,4, NaCl 0,5 M, EDTA 0,5 M pH 8,0, EGTA 0,2 M, Triton X-100, coquetel inibidor de protease), centrifugadas a 10.000xg por 5 minutos, sendo o precipitado descartado e o sobrenadante armazenado a -20ºC até o momento do uso.
33. Processo, de acordo com as reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que as amostras positivas nos ensaios de dot blot seguiram para análise de expressão das proteínas recombinantes, realizada através de ensaios de Western blotting.
34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que um gel Tricina-SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) a 16% foi preparado e submetido para separação eletroforética (30 V por 300 minutos), sob condições desnaturantes, contendo amostras de lisados de células transfectadas diluídas em tampão de corrida, em seguida, o gel foi corado em solução Coomassie Blue (ácido acético 7%, Metanol 50%, Coomassie Brilhante Blue R-250 0,1%) ou as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose para realização de ensaios de Western blotting, após transferência eletroforética (30 V e 15 mA por 18 horas, ou 70 V e 35 mA por 2 horas) em tampão de transferência (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M, Metanol 20%) a 4ºC, a membrana foi corada em solução contendo corante temporário Ponceau (Ponceau S 0,1%, ácido acético 5%) para confirmação da transferência e marcação dos indicadores de peso molecular, em seguida, as membranas foram lavadas em água destilada para remoção da coloração temporária e incubadas em solução contendo 5% de leite em pó desnatado diluído em PBST (Tween 20 0,05%, PBS), por 1 hora, a temperatura ambiente, sob agitação. Após esse período, as membranas foram lavadas 4 vezes em PBST e incubadas com soluções de leite em pó desnatado a 1% em PBST contendo os anticorpos primários anti-HPV16 L2 monoclonal, anti-HPV16 L2 policlonal produzido em coelho e/ou anti-HPV16 E6 por 2 hora a temperatura ambiente, sob agitação, em seguida, as membranas foram novamente lavadas 4 vezes em PBST e incubadas em solução contendo os respectivos anticorpos secundários anti-IgG de camundongo ou anti-IgG de coelho conjugados com horseradish peroxidase em solução de leite em pó desnatado a 1% em PBST, incubadas por 2 horas a temperatura ambiente, sob agitação.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as amostras de lisado celular foram analisadas em gel de eletroforese TricinaSDS-PAGE a 16%, sendo o mais indicado para a separação de proteínas de 1 a 100 KDa.
36. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as amostras proteicas foram quantificadas e suas concentrações ajustadas para que cada amostra contenha aproximadamente 15 µg de proteínas, onde a dosagem das proteínas ocorreu pelo método de Bradford (BioRad Laboratories Inc.), em que, as amostras foram diluídas em tampão de amostra (Tris-Cl 1 M pH 6,8, SDS 0,8%, azul de bromofenol 0,1%, glicerol 40%, b-mercaptoetanol 14,4 M) e finalmente submetidas a separação eletroforética (30 V por 300 minutos) em tampão tris-tricina (Tris 0,1 M; Tricina 0,1 M; SDS 0,1%, pH 8,5), após separação, o gel foi corado com solução Coomassie blue.
37. Sequência de ácido nucleico caracterizado pelo fato de compreende a sequência otimizada do gene L2 conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3 e sequência otimizada do gene E6 conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4 ligadas por 3 sequências "Linker",
38. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de ser conforme estabelecido pela SEQ ID NO: 1.
39. Proteína híbrida caracterizada pelo fato de ser codificada pela sequência de ácido nucleico conforme definida pela reivindicação 37 ou 38.
40. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definido pelas reivindicações 37 e 38.
41. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que para a construção do vetor de expressão, a sequência de ácido nucleico L2E6 foi inserida no vetor pcDNA3.3 flanqueado por sítios de endonucleases Hind III e Nhe I, recebendo o nome de pcDNA3.3/L2E6, em que o plasmídeo construído tem origem de replicação bacteriana, pUC, gene de resistência a Ampicilina, Amp (R) e promotor de CMV (Citomegalovirus).
42. Composição imunológica caracterizada pelo fato de que compreende a proteína híbrida conforme definida pela reinvindicação 39 ou o vetor, conforme definido pelas reivindicações 40 e 41, e veículos, excipientes, transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de compreender opcionalmente, adjuvantes vacinais, particularmente, lipídios catiônicos e VLPs (Virus-like particles) de HPV, ou sem adjuvantes.
44. Composição, de acordo com as reivindicações 42 a 43, caracterizada pelo fato da composição compreender formas farmacêuticas administradas via intramuscular e intra-dérmica, preferencialmente, administradas com seringas e agulhas, por eletroporação, bioinjetores sem necessidade de agulhas, ou através de técnicas como a tatuagem de DNA, ou por via oral.
45. Uso da proteína híbrida conforme definido pela reivindicação 39 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma vacina profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus.
46. Uso do vetor de expressão conforme definido pelas reivindicações 40 e 41 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma vacina profilática e terapêutica contra HPV e cânceres associados ao vírus.
47. Uso, de acordo com as reivindicações 45 e 46, caracterizado pelo fato de que produz uma resposta imune humoral duradoura, capaz de estimular a produção de anticorpos específicos anti-L2 e anti-E6 contra a infecção por HPV (ação profilática), assim como ativa a resposta imune celular, para combater as células tumorais e induzida pela expressão de citocinas TNF (Tumor Necrosis Factor) ou Fator de Necrose Tumoral (ação terapêutica).

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