BR112013000996B1 - Proteína l1 hpv58 truncada, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, partícula do tipo viral hpv58, composição, composição farmacêutica ou vacina, método para obter uma proteína l1 hpv58 truncada, método para preparar a partícula do tipo viral hpv58, método para preparar uma vacina, e uso da proteína l1 hpv58 truncada - Google Patents

Abstract

proteína l1 hpv58 truncada ou variante da mesma, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, partícula do tipo viral . hpv58, composição, composição farmacêutica ou vacina, método para obter uma proteína l1 hpv58 truncada, método para preparar a partícula do tipo viral hpv58, método para preparar uma vacina, método para prevenir a infecção hpv ou uma doença causada por infecção hpv e uso da proteína l1 hpv58 truncada ou variante da mesma são providas proteínas l1 truncadas, na extremidade n- terminal do papiloma vírus humano tipo 58, uma sequência codificante e o método de preparação da mesma, e uma partícula do tipo viral, compreendendo a proteína. o uso da proteína e da partícula do tipo viral na preparação de uma composição farmacêutica ou em uma vacina também é provido. a composição farmacêutica ou a vacina é utilizada para prevenção da infecção hpv e uma doença causada pela infecção hpv.

Description

Campo da invenção

[0001] A invenção refere-se ao campo da virologia e imunologia molecular. Em particular, a invenção se refere a uma proteína L1 truncada do papilomavírus humano tipo 58, sua sequencia codificante e método de preparação, e a uma partícula do tipo viral compreendendo a proteína, sendo que a proteína e a partícula do tipo viral são úteis para prevenir infecção HPV (particularmente HPV58) e uma doença causada por uma infecção HPV (particularmente HPV58), tal como, câncer cervical. A invenção também se refere ao uso da proteína e da partícula do tipo viral na preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina para prevenção da infecção por HPV (particularmente HPV58), e uma doença causada pela infecção por HPV (particularmente HPV58), tal como câncer cervical.

Histórico da invenção

[0002] O papilomavírus humano (HPV), é um vírus não- envelopado de ácido desoxirribonucléico (DNA), pertencente ao gênero da família Papovaviridae. O genoma viral é um DNA circular fechado de fita dupla, que tem aproximadamente 7,2-8kb de extensão, contendo 8 regiões de abertura de leitura (ORFs). O genoma pode ser dividido em três partes, em termos de função: (1) a região inicial (E), com aproximadamente 4,5kb de extensão, codificando para 6 proteínas não- estruturais E1, E2, E4~E7, associadas com a replicação, transcrição e transformação do vírus; (2) a região final (L), com aproximadamente 2,5KB de extensão, codificando da proteína de capsídeo maior L1 e da proteína de capsídeo menor L2; (3) a região de controle longa (LCR), situada entre o final da região L e o terminal de iniciação da região E, com aproximadamente 800-900bp de extensão e compreendendo elementos reguladores para replicação e expressão de DNA, ao invés de codificação para proteínas. As partículas virais de HPV têm de 45-55 nm de diâmetro, sendo que o nucleocapsídeo, consistindo de L1 e L2, exibe simetria icosaédrica e compreende 72 capsômeros.

[0003] Atualmente, existem mais de 100 tipos diferentes de HPV, que causam principalmente doença papilar na pele e na mucosa de seres humanos. Os tipos de HPV são divididos em três grupos, dependendo de sua relação com a tumorigênese: (1) grupo de baixo ou nenhum risco carcinogênico, contendo os tipos de HPV 6, 11, 39, 41, 42 e 43; (2) grupo de médio risco carcinogênico, contendo os tipos de HPV 31, 33, 35, 51 e 52; e (3) grupo de alto risco carcinogênico, contendo os tipos de HPV 16, 18, 45 e 58.

[0004] A investigação epidemiológica molecular de HPV demonstra que a infecção por tipos de HPV de alto risco é um fator importante para o desenvolvimento de câncer cervical. Entre todos os espécimes de câncer cervical, o DNA de PHV é detectado em acima de 80% deles. O câncer cervical é um tumor maligno comum entre as mulheres, a incidência dele é apenas próxima ao câncer de mama, e põem em risco seriamente a saúde das mulheres. Existem cerca de 490.000 novos casos relatados mundialmente a cada ano, e próximo de 270.000 pessoas morrem dessa doença anualmente (Boyle, P., e J. Ferlay., “Ann. Oncol.”, 2005, 16-481-8). Os casos nos países em desenvolvimento contam aproximadamente 83% dos casos de câncer cervical totais. Nesses países em desenvolvimento, os casos de câncer cervical contam cerca de 15% de tumores malignos nas fêmeas, em contraste com 1,5% nos países desenvolvidos. O câncer cervical é muito prevalente na África subsaariana, Ásia central e meridional, América Latina, e Ás ia Oriental. O câncer cervical também é prevalente na China. A incidência de câncer cervical entre as mulheres casadas é tal alta quanto 1026/100000 no município de Lyeyang da Província de Shanxi.

[0005] A meta-análise da distribuição dos tipos HPV nos espécimes de câncer cervical mundial mostra que os tipos de HPV mais comuns encontrados nos espécimes de câncer cervical são os HPV 16,1 8, 45, 31, 33, 58, 52, 35, 59, 56, 6, 51, 68, 39, 82, 73, 66 e 70 (listados na ordem decrescente), Clifford GM, Smith JS, Plummer M, et al., “Br J. Cancer” 2003, 2003, 88 (1): 63-73).

[0006] Entretanto, a distribuição dos tipos de HPV apresenta algumas características de distribuição geográfica e populacional. Em particular, a taxa de infeção de HPV58 na Ás ia é maior do que nos países desenvolvidos tais como na Europa e na América. Recentemente, uma investigação sobre os tipos de HPV infectados em mulheres chinesas mostrou que entre os pacientes de câncer cervical, a taxa de infecção de HPV58 é 7,2% é precedido apenas por HPV16 (58,7%) e HPV18 (11,0%), e entre mulheres com lesão epitelial escamosa de alto grau ou lesão epitelial escamosa de baixo grau e mulheres normais, a taxa de infecção de HPV58 é precedida apenas por HPAV16 (Y.P. Bao, N. Li, J. S. Smith e Y.L. Qian, “International Journal of STD & AIDS”, 2008, 19: 106-111). Isso sugere que a taxa de infecção de HPV58 em mulheres chineses é maior do que o nível mundial, e que HPV58 é um tipo de HPV para o qual as mulheres chinesas e as mulheres asiáticas são geralmente suscetíveis.

[0007] Atualmente, as vacinas HPV disponíveis comercial são Gardasil®, da Merck e a Cervarix® a partir GSK, que compreende HPV6/11/16/18 e HPV16/18 VLP, respectivamente, mas não compreende os HPV do tipo 58 para o qual as mulheres chinesas e as mulheres asiáticas são geralmente suscetíveis.

[0008] Portanto, as vacinas HPV que são seguras e eficazes para mulheres nos países desenvolvidos tais como na China e na Ásia, em particular, àquelas vacinas dirigidas aos tipos de alto risco, tais como HPV 16, 18 e 58, são meios eficazes para prevenir efetivamente o câncer cervical e aperfeiçoar a condição de saúde da mulher, em particular, a condição de saúde das mulheres chinesas e asiáticas.

[0009] A proteína L1 do HPV, com um peso molecular de 5560 kDa, é a maior proteína de capsídeo do papilomavírus humano e a proteína-alvo principal da vacina HPV. A proteína L1 do HPV expressa em muitos sistemas de expressão pode formar partículas tipo virais (VLPs) que lembram morfologicamente as partículas HPV nativas, sem a assistência da proteína L2. As VLPs, consistindo de 72 pentâmeros das proteínas L1, exibem simetria icosaédrica. Uma vez que as VLPs retêm os epítopos nativos das partículas virais, elas são altamente imunogênicas e podem induzir à geração de anticorpos de neutralização contra HPV homólogo (Kirnbauer, R.,F.Booy, et al. 1992, “Proc. Natl.Acad Sci” USA 89(24):12180-4). Além disso, as VLPs são seguras e não apresentam risco carcinogênico potencial, por não conterem ácidos nucléicos virais. Portanto, as vacinas VLP tornaram-se as principais candidatas para vacinas HPV.

[0010] A chave para o desenvolvimento de vacinas VLP HPV consiste na produção eficiente de amostras VLP em grande escala. Atualmente, os sistemas de expressão mais utilizados para VLP são divididos em sistemas de expressão eucarióticos e sistemas de expressão procarióticos.

[0011] Os sistemas eucarióticos comumente utilizados compreendem poxvírus (vírus da varíola), baculovírus de inseto e sistemas de expressão em leveduras. A proteína L1 do HPV expressa em sistemas de expressão eucarióticos mostra pouca diferença conformacional a partir daquela do vírus nativo, e pode se auto-arranjar em VLPs. Assim, as VLPs purificadas podem ser facilmente obtidas após simples centrifugação em gradiente de densidade. Isso é bastante conveniente ao trabalho de purificação. Porém, devido aos altos custos envolvidos com a cultura e ao baixo nível de expressão dos sistemas de expressão eucarióticos, é muito difícil a produção industrial em larga escala. A vacina Gardasil® contra o HPV, que foi lançada no mercado recentemente, é mais cara que as outras devido ao baixo nível de expressão e ao alto custo de produção do sistema de expressão em Saccharomyces cerevisiae empregado em sua fabricação e, portanto, sua aplicação geral é limitada.

[0012] A expressão da proteína L1 do HPV em um sistema de expressão procariótico, tal como E.coli, tem sido anteriormente relatado (Banks L., G. Matlashewski, et. al. (1987), “J. Gen. Virol.”, 68 (Pt 12):3081-9). Entretanto, a maioria das proteínas L1 do HPV expressas em E.coli perdem sua conformação nativa e não podem induzir à geração de anticorpos protetores contra o HPV. Alternativamente, embora as VLPs do HPV possam ser obtidas a partir de proteínas, através de etapas tais como purificação a partir de corpos de inclusão e religação (“renaturation”) (Kelsall, S.R. e J.K.Kulski (1995), “J. Virol. Methods”, 53(1):75-90) é difícil aplicar esse método em uma produção em larga escala, já que as proteínas são amplamente perdidas durante o processo de religação e o rendimento é baixo. Embora a proteína L1 do HPV possa ser expressa em uma forma solúvel com uma correta conformação em E.coli e seja dissolvida nos sobrenadantes do lisado de E.coli, o nível de expressão é baixo. Além disso, por haver um grande número e quantidade de proteínas impuras, torna-se difícil isolar delas as proteínas de interesse. Embora seja também reportado que o nível de expressão da proteína L1 pode ser aumentado nos sobrenadantes por meio de expressão de fusão GST e que a purificação da proteína de interesse seja facilitada (Li, M., T.P. Cripe, et. Al. (1997), “J. Virol.”, 71(4):2988-95), não se pode ainda aplicar esse método em uma produção em larga escala, por serem requeridas enzimas de alto custo para clivar a proteína de fusão.

[0013] Portanto, uma proteína L1 do HPV, capaz de induzir a produção de anticorpos protetores contra o HPV, e uma partícula do tipo viral consistindo da mesma, em baixo custo, ainda são necessárias no estado da técnica, para possibilitar a produção industrial em larga escala das vacinas para câncer cervical.

Descrição Da Invenção

[0014] A invenção é pelo menos parcialmente baseada na descoberta surpreendente dos inventores que: uma proteína L1 HPV58 truncando capaz de induzir a produção de anticorpos de neutralização contra HPV58 pode ser expressa em um sistema de expressão de E. coli em uma larga escala, sendo que a proteína L1 HPV58 pode ser produzida com um rendimento elevado, e a pureza da proteína purificada alcançando pelo menos 50% ou mais (tal como 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99%). Além disso, o tratamento adicional da proteína purificada resulta na obtenção de VLPs capazes de induzir a produção de anticorpos protetores contra HPV58.

[0015] Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a uma proteína L1 HPV58 truncada ou variante da mesma, sendo que dita proteína tem de 5-70 aminoácidos, por exemplo, 5-60 aminoácidos, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40 aminoácidos, tais como 5, 15, 27, 35, 40, 60 ou 70 aminoácidos, truncados em sua N-terminal.

[0016] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma proteína L1 HPV58 truncada ou variante da mesma, sendo que dita proteína tem 5-70 aminoácidos, por exemplo, 5-60 aminoácidos, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40 aminoácidos, tais como 5, 15, 27, 35, 40, 60 ou 70 aminoácidos, truncados em sua N-terminal, quando comparado com a proteína L1 HPV58 alelo-selvagem.

[0017] Em uma concretização preferida, a proteína L1 HPV58 truncada tem 5-70 aminoácidos, tais como 5, 15, 27, 35, 40, 60, ou 70 aminoácidos, truncados em sua N-terminal, quando comparado com a proteína L1 HPV58 alelo-selvagem. Em uma outra concretização, a proteína L1 HPV58 truncada tem 35 aminoácidos truncados em sua N-terminal, quando comparado com a proteína L1 HPV58 alelo-selvagem.

[0018] Em uma outra concretização preferida, a proteína L1 HPV58 truncada (citada daqui em diante como proteína truncada) tem uma sequência de aminoácidos como representado na SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou SEQ ID NO: 7. Em uma outra concretização preferida, a proteína truncada tem uma sequência de aminoácidos tal como representada na SEQ ID NO: 1.

[0019] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica a proteína truncada ou variante de mesma, de acordo com a invenção, e um vetor contendo o polinucleotídeo.

[0020] Vetores para inserção de um polinucleotídeo de interesse são bem conhecidos do estado da técnica, incluindo, mas não limitados aos vetores de clonagem e vetores de expressão. Em uma concretização, os vetores são, por exemplo, plasmídeos, fagos, cosmídios, etc..

[0021] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo ou vetor. A célula hospedeira inclui, mas não está limitada as células procarióticas, tais como, células E. coli, e células eucarióticas, tais como células de levedura, células de inseto, células de planta e células animais (tais como células de mamífero, por exemplo, células de camundongo, células humanas, etc.). A célula hospedeira de acordo com a invenção também pode ser uma linha de célula, tal como as células 293T.

[0022] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma partícula do tipo viral HPV58, compreendendo ou consistindo da proteína truncada ou variantes da mesma, de acordo com a invenção.

[0023] Em uma concretização preferida, a partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção compreende ou é consistente de ou formada a partir de uma proteína L1 HPV58 truncada tendo 5-70 aminoácidos, por exemplo, 5-60, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40 aminoácidos, tais como 5, 15, 27, 35, 40, 60, ou 70 aminoácidos, truncados em sua N-terminal, quando comparado com a proteína L1 HPV58 alelo-selvagem. Em uma concretização particularmente preferida, a partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção compreende ou é consistente de ou formada a partir da proteína L1 HPV58 tendo uma sequência tal como representada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7.

[0024] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a uma composição compreendendo dita proteína truncada ou variantes da mesma, ou dito polinucleotídeo ou vetor ou células hospedeira ou a partícula HPV58do tipo viral. Em uma concretização preferida, a composição compreende a proteína truncada ou variantes da mesma, de acordo com a invenção. Em uma outra concretização referida, a composição compreende a partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção.

[0025] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou a uma vacina compreendendo a partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção e, opcionalmente, veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica ou a vacina de acordo com a invenção é útil para prevenção de invenção HPV (particularmente HPV58), e uma doença causada pela infecção de HPV (particularmente HPV58) tal como câncer cervical.

[0026] Em uma concretização preferida, a partícula HPV58 do tipo viral está presente em uma quantidade eficaz para prevenir a infecção HPV ou câncer cervical. Em uma outra concretização, a composição farmacêutica ou vacina de acordo com a invenção compreende ainda pelo menos uma partícula do tipo viral selecionada do grupo consistindo da proteína L1 HPV6, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV11, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV16, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV18, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV31, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV33, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV45, e partícula do tipo viral da proteína L1 HPV52; preferivelmente, essas partículas do tipo viral estão independentemente presentes em uma quantidade eficaz para prevenir o câncer cervical ou infecção pelos subtipos de HPV correspondentes.

[0027] A composição farmacêutica ou vacina de acordo com a invenção pode ser administrada pelos métodos bem conhecidos da técnica, por exemplo, mas não limitados a, administração oral, ou por injeção. Na invenção, a rota de administração particularmente preferida é a injeção.

[0028] Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica ou vacina de acordo com a invenção é administrada em uma forma de uma dosagem unitária. Por exemplo, mas não limitado a invenção, cada unidade de dosagem contém 5 μ g-80 μ g, preferivelmente, 20 μ g - 40μ g da partícula HPV58 do tipo viral.

[0029] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para obtenção da proteína truncada de acordo com a invenção, compreendendo a expressão da proteína truncada de acordo com a invenção com um sistema de expressão em E. coli, e carregando um processo de purificação na lise do sobrenadante contendo a proteína truncada.

[0030] Em uma concretização preferida, o método para obter a proteína truncada, de acordo com a invenção compreende: (a) expressar a proteína truncada em E. coli; (b) romper a E. coli, que expressa a proteína truncada, em uma solução em uma concentração de sal de 100 mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; (c) diminuir a concentração de sal do sobrenadante de (b) para 100 mM ou menos, por meio do uso de água ou de uma solução com uma baixa concentração de sal, menos que 0, e coletar um precipitado; (d) redissolver o precipitado de (c) em uma solução em uma concentração de sal de 150 mM a 2500 mM; e adicionar um redutor à solução, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução resultante contém a proteína L1 HPV58 truncada com uma pureza de pelo menos 50%.

[0031] Em uma concretização da invenção, a concentração de sal em (b) é de 200 mM a 500 mM.

[0032] Mais genericamente, a invenção também se refere a um método para obter a proteína L1 HPV, tal como a proteína truncada de acordo com a invenção, compreendendo: (a) expressar o gene HPV L1 que codifica a proteína L1 de HPV em E.coli; (b) romper a E.coli, que expressou a proteína L1 do HPV, em uma solução em uma concentração de sal de 100mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; (c) reduzir a concentração de sal do sobrenadante de (b) para 100 mM ou menos, através do uso de água ou uma solução em uma baixa concentração de sal, menor que 0, e coletar o precipitado; (d) re-dissolver a precipitação de (c) em uma solução em uma concentração de sal 150 mM a 2500 mM, e adicionar um redutor à solução, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução resultante contém a proteína L1 de HPV com uma pureza de pelo menos 50%.

[0033] A invenção também se refere a um método para obter a partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção, com base na obtenção da proteína truncada da invenção como descrito acima, compreendendo as etapas de: (e) purificar adicionalmente a proteína L1 de HPV6 truncada, de acordo com a invenção com uma pureza de pelo menos 50%, através de cromatografia; e (f) remover o redutor da proteína truncada obtida em (e).

[0034] A invenção também refere-se a um método para preparar uma vacina, compreendendo a mistura da partícula do tipo viral de acordo com a invenção e, opcionalmente, um ou mais partículas do tipo viral selecionadas a partir do grupo consistindo de partículas do tipo viral de HPV tais como 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, e 52, com veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou excipientes. Como descrito acima, a vacina obtida é útil para prevenir a infecção de HPV (particularmente HPV58), e uma doença causada pela infecção de HPV (particularmente HPV58), tal como câncer cervical.

[0035] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para prevenir a infecção HPV ou uma doença caudada pela infecção de HPV, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade profilaticamente efetiva da partícula do tipo viral de HPV58 ou uma composição farmacêutica ou vacina de acordo com a invenção. Em uma concretização preferida, a infecção HPV é uma infecção de HPV58. Em uma outra concretização preferida, a doença causada pela infecção HPV inclui, mas não está limitada ao câncer cervical. Em uma outra concretização preferida, o indivíduo é um mamífero, tal como um humano.

[0036] Em um outro aspecto, a invenção também refere-se ao uso de uma proteína truncada ou variantes da mesma ou a uma partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção na preparação de uma composição farmacêutica ou vacina para prevenir a infecção HPV ou uma doença causada pela infecção HPV. Em uma concretização preferida, a infecção HPV é a infecção HPV58. Em uma outra concretização preferida, a doença causada pela infecção HPV inclui, mas não está limitado ao câncer cervical.

[0037] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a uma proteína truncada ou variantes da mesma ou a uma partícula HPV58 do tipo viral de acordo com a invenção, para uso na prevenção da infecção HPV ou uma doença causada pela infecção HPV. Em uma concretização preferida, a infecção HPV é a infecção HPV58. Em uma outra concretização preferida, a doença causada pela infecção HPV inclui, mas não está limitada ao câncer cervical.

Definições de termos na presente invenção

[0038] Na invenção, a menos que de outro modo especificado, os termos técnicos e científicos utilizados aqui tem o significado como geralmente entendido por um técnico no assunto. Além disso, as operações de laboratório de cultura celular, genética molecular, química do ácido nucléico, e imunologia utilizada aqui são operações de rotina amplamente utilizadas no campo correspondente. Entretanto, de modo a melhor entender a invenção as definições e explicações dos termos relevantes são providos como a seguir:

[0039] De acordo com a invenção, o termo “uma proteína tendo X aminoácidos truncados em sua N-terminal” refere-se a uma proteína resultado da substituição dos resíduos de aminoácidos a partir das posições 1 a X na N-termina da proteína com o resíduo de metionina codificado por um códon de iniciação (para iniciar a tradução da proteína). Por exemplo, uma proteína L1 HPV58 tendo 35 aminoácidos truncados em sua N-terminal refere-se a uma proteína resultante da substituição dos resíduos de aminoácidos a partir das posições 1 a 35 na extremidade N-terminal da proteína L1 HPV58 alelo-selvagem com o resíduo de metionina codificado por um códon de iniciação.

[0040] De acordo com a invenção, o termo “variante” refere-se a uma proteína, cuja sequência de aminoácidos é diferente daquela da proteína L1 HPV58 truncada de acordo com a invenção (por exemplo, a proteína tal como representada pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) em um ou mais (por exemplo, 1-10, ou 1-5 ou1-3) aminoácidos (tais como substituições conservativas de aminoácidos), ou que tem uma identidade de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% para a proteína L1 HPV58 truncada de acordo coma invenção (por exemplo, a proteína tal como representada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2), e que retém as características essenciais da proteína truncada. O termo “características essenciais” pode ser uma ou mais das características a seguir: capaz de induzir a produção de anticorpos de neutralização contra HPV58; capaz de ser expresso em E. coli de uma maneira solúvel; capaz de obter proteína purificada com um alto rendimento, através da métodos de expressão e de purificação como envolvido na invenção.

[0041] De acordo com a invenção, o termo “identidade” refere-se a um grau de comparação entre dois polipeptídios ou entre dois ácidos nucléicos. Quando duas sequências para comparação têm a mesma base ou subunidade de monômero de aminoácidos em um determinado sítio (por exemplo, cada uma das duas moléculas de DNA tem uma adenina em um determinado sítio, ou cada uma dos dois polipeptídios tem uma lisina em um determinado sítio), as duas moléculas são idênticas ao sítio. O percentual de identidade entre duas sequências é uma função do número de sítios idênticos divididos pelas duas sequências sobre o número total de sítios para comparação x 100. Por exemplo, se 6 de 10 sítios de duas sequências são combinadas, essas duas sequências tem uma identidade de 60%. Por exemplo, as sequências de DNA; CTGACT e CAGGTT dividem uma identidade de 50% (3 de 6 sítios são combinados). Geralmente, a comparação de duas sequências é conduzida de uma maneira a produzir a identidade máxima. Os referidos alinhamentos podem ser conduzidos pelo uso de um programa de computador tal como o programa Align (DNAstar, Inc.) que é baseado no método de Needleman, et al., (“J. Mol. Biol.”, 48:443-453, 1970). A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e ?W. Miller (“Comput. Appl. Biosci.”, 4:11-17 91988) que foi incorporada dentro do programa ALIGN (versão 2,0), usando uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma classificação de comprimento intervalo de 4. Em adição, a porcentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos podem ser determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (“J. Mol. Biol.”, 48:444-453 (1970)) que foi incorporada dentro do programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando tanto uma matrix Blossum 62 ou uma matrix PAM250, e um peso do intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um comprimento em peso de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[0042] Como utilizado na invenção, o termo “substituição conservativa” refere-se as substituições de aminoácidos que não iria afetar negativamente ou alterar a atividade biológica de uma proteína/polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição conservativa pode ser introduzida por técnicas padrões conhecidas do estado da técnica tal como mutagênese sítio direcionada e mutagênese mediada por PCR. As substituições conservativas de aminoácidos inclui substituições onde um resíduo de aminoácidos é substituído por um outro resíduo de aminoácidos tendo uma cadeia lateral similar, por exemplo, um resíduo similar ao correspondente resíduo de aminoácido fisicamente ou funcionalmente (tal como, tendo tamanho similar, forma, cargas, propriedades químicas incluindo a capacidade para formação de ligação covalente ou ligação de hidrogênio, etc.). As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos tendo cadeias laterais alcalinas (por exemplo, lisina, arginina, e histidina), aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), os aminoácidos tendo cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), aminoácidos tendo cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), aminoácidos tendo cadeias laterais β-ramificadas (tal como treonina, valina, isoleucina) e aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um resíduo de aminoácido correspondente é preferivelmente, substituído por um outro resíduo de aminoácido a partir da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificação de substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidos do estado da técnica (ver, por exemplo, Brummell et al., “Biochem.”, 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., “Protein Eng.,”, 12(10):879-884 (1999); e Burks et al., “Proc. Natl. Acad. Set, USA 94: 412-417 (1997), que são incorporadas aqui por referência).

[0043] De acordo com a invenção, o termo “sistema de expressão E. coli” refere-se a um sistema de expressão consistindo de E. coli (cepa) e um vetor, onde a (cepa) de E.coli inclui, mas não estão limitados a: G1698, ER2566, BL21 (DE3), B834 9DE3), BLR (DE3), etc., que estão disponíveis no mercado.

[0044] De acordo com a invenção, o termo “vetor” refere-se a um veículo de ácido nucléico que pode ter um polinucleotídeo inserido nele. Quando o vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo nele inserido, o vetor é chamado de um vetor de expressão. O vetor pode ter os elementos de materiais genéticos carregados expressos na célula hospedeira por transformação, transdução, e transfecção dentro da célula hospedeira. Os vetores são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo, mas não limitados aos plasmídeos, fagos, cosmídios, e do gênero.

[0045] De acordo com a invenção, o termo “uma proteína L1 HPV58 truncada” refere-se à proteína com um ou mais aminoácidos deletados no N-terminal e/ou C-terminal da proteína L1 de HPV58 alelo-selvagem, onde o exemplo da proteína L1 HPV58 alelo-selvagem inclui, mas não está limitado às proteína L1 de extensão completa, tais como ACJ13480, ACX32376.1, OU ACK37663.1 na base de dados NCB1.

[0046] De acordo com a invenção, o termo “um fragmento de gene de uma proteína L1 HPV58” refere-se aos fragmentos de gene com o nucleotídeo(s) codificante de um ou mais aminoácidos deletados no terminal 5’ ou 3’ do gene L1 HPV58 alelo-selvagem, onde a sequência de gene de extensão completa do gene L1 HPV58 alelo-selvagem inclui, mas não estão limitados às seguintes sequências: AY101598.2, D90400.1; FJ407208.1; FJ615305.1; e FN178626.1 na base de dados NCB1.

[0047] De acordo com a invenção, o termo "veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis"refere-se ao veículo e/ou excipientes que são farmacologicamente e/ou fisiologicamente compatíveis com os indivíduos e ingredientes ativos, e são bem conhecidos da técnica (ver, por exemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Editado por Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania; Mack Publishing Company, 1995), incluindo, mas não estão limitados a agentes de ajuste de pH, surfactantes, adjuvantes, e melhoradores de extensão iônica. Por exemplo, os agentes de ajuste de pH incluem, mas não estão limitados a, tampão fosfato; surfactantes, inclui, mas não estão limitados a: surfactantes incluem, mas não estão limitados a: surfactantes aniônicos, surfactantes catiônicos, ou surfactantes não-iônicos (por exemplo, Tween 80); adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio) e adjuvantes de Freund (por exemplo, adjuvante completo de Freund); e intensificadores de potência iônica, mas não estão limitados a NaCl.

[0048] De acordo com a invenção, o termo “uma quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade que pode efetivamente conseguida para o propósito pretendido. Por exemplo, uma quantidade eficaz para prevenção de uma doença (tal como infecção HPV) refere-se a uma quantidade efetiva para prevenção, supressão, ou retardo da ocorrência de uma doença (tal como infecção HPV). A determinação da referida quantidade efetiva está dentro da habilidade de um técnico no assunto.

[0049] De acordo com a invenção, o termo "cromatografia" inclui, mas não está limitado a cromatografia de troca iônica (por exemplo: cromatografia de troca catiônica), cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia absorvente (por exemplo: cromatografia em hidroxiapatita), cromatografia de filtração em gel (cromatografia por exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.

[0050] De acordo com a invenção, as proteínas L1 de HPV58 truncadas, de acordo com a invenção podem ser obtidas preferivelmente através das etapas a seguir: - romper E.coli, que expressa a proteína L1 de HPV58 truncada, em um tampão em uma concentração de sal de 100-600 mM, preferivelmente de 200-500mM; e centrifugar a solução de rompimento para obter um sobrenadante; - precipitar a proteína L1 HPV58 truncada a partir do sobrenadante através da diminuição da concentração do sal do sobrenadante resultante para 100 mM - 0 mM com água ou uma solução de baixo sal (geralmente, cum uma concentração de sal menor que um do tampão para rompimento); - re-dissolver o precipitado em uma solução contendo um redutor e tendo uma concentração de sal de 150-2500 mM, preferivelmente, maior que 200 mM, resultando em uma solução compreendendo a proteína L1 HPV58 truncada com uma pureza de pelo menos 50%, preferivelmente em pelo menos 70%, mais preferivelmente, pelo menos 80%.

[0051] O tampão utilizado no método da invenção é conhecido do estado da técnica, incluindo, mas não limitados a: tampões Tris, tampões fosfato, tampões HEPES e tampões MOPS, etc.

[0052] De acordo com a invenção, o rompimento da célula hospedeira pode ser acompanhado através de métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo, mas não limitados a rompimento com homogeneizador, tratamento ultrassônico, trituração, extrusão sob alta-pressão, e tratamento com lisozima, etc.

[0053] Os sais utilizados no método da invenção, incluem mas não estão limitados a um ou mais sais ácidos, sais básicos, sais neutros, por exemplo, sal de metal alcalino, sais de metal alcalino terroso, sais de amônio, cloridratos, sulfatos, bicarbonatos, sais de fosfato ou bifosfatos, especialmente, NaCl, KCl, NH4Cl (NH4)2SO4. NaCl é particularmente preferido. O redutor utilizado nos métodos da invenção inclui, mas não está limitado a DTT e 2- mercaptoetanol, em uma quantidade que inclui, mas não está limitada a 10-100mM.

[0054] De acordo com a invenção, as VLPs da proteína HPV58 de acordo com a invenção podem ser produzidas através das seguintes etapas: purificar adicional da proteína L1 de HPV58 truncada, com uma pureza de pelo menos 50% como descrito acima, por exemplo, uma cromatografia, e obtendo assim uma solução de proteína truncada; e remover o redutor a partir da solução para obter as VLPs de HPV58. Métodos para remover o redutor são conhecidos do estado da técnica, incluindo, porém não se restringem a, diálise, ultra-filtração e cromatografia.

Efeitos benéficos:

[0055] Atualmente, os sistemas de expressão úteis para o preparo de VLPs de HPV incluem sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.

[0056] As proteínas L1 de HPV expressas em sistemas de expressão eucarióticos mostram pouca diferença na conformação a partir daquela do vírus nativo, e podem se auto-arranjar em VLPs. Na maioria dos casos, as VLPs com uma conformação correta podem ser obtidas através de purificação simples. Entretanto, os sistemas de expressão eucarióticos, tais como, os sistemas de expressão em baculovírus e leveduras são de difícil aplicação em produção industrial em larga escala devido aos baixos níveis de expressão e aos altos custos de cultivo envolvidos.

[0057] Os sistemas de expressão procarióticos, tais como os sistemas de expressão em E.coli, apresentam vantagens de altos níveis de expressão e baixo custo de cultivo. Porém, quando expressa em um sistema E. coli, a proteína L1 de HPV geralmente perde sua conformação nativa e é expressa em uma forma de corpos de inclusão no precipitante. Atualmente, a renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão ainda representa um problema em todo o mundo. Devido à dificuldade e ineficiência da renaturação, esse método está limitado à pesquisa em pequena escala e a nível laboratorial, não podendo ser aplicada em larga escala para se obter VLPs com uma conformação correta a partir de corpos de inclusão. Embora a proteína L1 do HPV possa ser expressa em uma forma solúvel com uma conformação correta em E. coli, seus níveis de expressão são baixos. Além disso, é muito difícil purificar a proteína L1 do HPV a partir de numerosas proteínas solúveis no sobrenadante lisado de E.coli. Geralmente, a purificação é realizada através de meios tais como expressão por fusão e cromatografia por afinidade, os quais são processos possíveis em escala industrial devido ao alto custo das enzimas neles empregadas.

[0058] A proteína L1 de HPV58 N-truncada e o método para preparar a mesma, como providos na invenção resolvem efetivamente esse problema. Primeiramente, o sistema de expressão em E. coli são utilizados na invenção para expressar a proteína L1 HPV58 N-truncada, que garante um nível de expressão alto. Em segundo lugar, a proteína truncada é seletivamente precipitada a partir do sobrenadante lisado de E.coli sob condições brandas. A proteína é então redissolvida em um tampão salino para melhorar significativamente sua pureza, enquanto ao mesmo tempo mantém sua conformação correta. A solução da proteína truncada assim obtida pode ser ainda purificada adicionalmente diretamente por cromatografia, tal como cromatografia de troca iônica e hidrofóbica de modo a obter a proteína de interesse com uma alta pureza (tal como uma pureza de até 80%). Ademais, a proteína truncada purificada obtida a partir dessas etapas, pode ser auto-arranjar em VLP com boa imunogenicidade e com a capacidade de induzir anticorpos neutralizantes de alta titulação contra o HPV58, que é uma boa vacina para a prevenção de infecção por HPV58 em humanos.

[0059] Portanto, a invenção tem as vantagens a seguir. A proteína truncada da invenção pode ser expressa em sistema de expressão em E. coli em uma larga escala enquanto retém a antigenicidade, imunogenicidade, e a capacidade de se auto- arranjar da proteína L1 HPV58 de extensão completa. Enzimas de alto custo não são requeridas no método de preparação utilizado na invenção, ou seja, o custo é baixo. Além disso, uma vez que a proteína truncada não é submetida a procedimentos intensivos de denaturação e renaturação durante a purificação, a perda da proteína é baixa e o rendimento é maior. As VLPs formadas a partir da proteína truncada podem induzir a produção de anticorpos protetores contra HPV em uma titulação maior e podem ser aplicados à preparação de vacinas. Assim, a proteína truncada da invenção e o método de preparação da mesma podem ser aplicados a produção industrial em larga escala, e tornar possível a produção industrial em larga escala de vacinas para o câncer cervical.

[0060] As concretizações da invenção serão ainda descritas em detalhes com referência aos desenhos a seguir e exemplos dados a título ilustrativo da invenção apenas, além da definição do escopo de proteção da invenção. De acordo com a descrição detalhada dos desenhos a seguir e das concretizações preferidas, vários propósitos e vantagens da invenção serão aparentes aos técnicos no assunto.

Descrição dos desenhos

[0061] A Figura 1 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteína HPV58N35C-L1 obtida durante as diferentes etapas do Exemplo 2 da invenção. Faixa M: marcador do peso molecular da proteína; Faixa 1: sobrenadante da bactéria rompida (ou seja, o sobrenadante obtido por centrifugação da bactéria rompida); Faixa 2: produto precipitado livre de sais (ou seja, o precipitado obtido por centrifugação após diálise); Faixa 3: sobrenadante re-dissolvido (ou seja, o sobrenadante obtido por centrifugação da solução resultante da re-dissolução do precipitado do produto livre de sais); Faixa 4: precipitado obtido após a re-dissolução (ou seja, o precipitado obtido por centrifugação da solução resultante da re-dissolução do precipitado de produto livre de sais). O resultado mostrou que a pureza da proteína HPV58N35C-L1 foi aumentado de cerca de 10% (ver faixa 1) a cerca de 70% (ver faixa 3) após as etapas de precipitação e re-dissolução;

[0062] A Figura 2 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteína HPV58N35C-L1 purificada através da cromatografia de troca catiônica e CHT-II (cromatografia hidroxiapatita) no Exemplo 3. Faixa M: marcador de peso molecular da proteína; Faixa 1: amostra antes da purificação com a coluna CHT-II; Faixe 2: fração através de fluxo durante a purificação com a coluna CHT-II; Faixa 3: eluição da fração eluída com 500 mmol/L de NaCl; Faixa 4: eluição da fração eluída com 1000 mmol/L (o volume carregado foi de

[0063] 10μ L); Faixa 5: eluição da fração eluída com 1000 mmol/L de NaCl (o volume carregado foi de 20μ L). O resultado mostrou que Hapós purificação com CHT, a proteína HPV58N35C- L1 eluida com 1000 mmol/L de NaCl atingiu uma pureza de cerca de 98%;

[0064] A Figura 3 mostra a fotografia da microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de VLPs de HPV58N35C-L1 obtida no Exemplo 4 (tomada em 50.000x de magnitude), Barra - 0,2 μ m). Foram observados um grande numero de VLPs com um raio de cerca de 25 nm em um campo visual, sendo que o tamanho de partícula foi consistente com o tamanho teórico e as partículas foram homogêneas;

[0065] A Figura 4 mostra o resultado de medição de difusão de luz dinâmica das VLPs de HPV58N35C-L1 obtidas no Exemplo 4. O resultado mostrou que as VLPs de HPV58N35C-L1 tinham um raio hidrodinâmico de 25,64 nm e uma taxa de arranjo de partícula de 100%;

[0066] A Figura 5 mostra títulos de neutralização de anticorpos no soro em diferentes estágios após vacinação de coelhos com VLPs de HPV58N35-L1 como determinado no Exemplo 5. Os títulos de neutralização dos anticorpos aumentaram significativamente em 2 meses após a primeira vacinação, e atingiram um nível de pico de 105 após um impulso. O eixo longitudinal representa os títulos de neutralização dos anticorpos; o eixo horizontal representa o tempo da amostra de sangue.

[0067] A Figura 6 mostra os resultados de SDS-PAGE das proteínas HPV58 L1, tendo 5, 15, 27, 40, 60, ou 70 aminoácidos truncadas na N-terminal, respectivamente, ou seja, HPV58N5C-L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C-L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, HPV58N70C-L1, (suas respectivas sequências de aminoácido sendo representadas na SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, e 7, respectivamente) como obtidas no Exemplo 6. Faixa M: marcador do peso molecular da proteína; Faixa 1: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N5C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L); Faixa 2: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N15C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L); Faixa 3: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N27C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L); Faixa 4: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N40C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L); Faixa 5: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N60C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L); Faixa 6: a proteína L1 HPV58 truncada de HPV58N70C-L1 (o volume de carga foi de 10μ L). O resultado mostrou que a proteína L1 HPV58 tendo 5,1 5, 27, 40, 60 ou 70 aminoácidos truncados na N-terminal, respectivamente, ou seja, HPV58N5C- L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C-L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, e HPV58N70C-L1,como obtido no Exemplo 6, atingiu uma pureza acima de 98%;

[0068] A Figura 7 mostra a fotografia da microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das VLPs de HPV58N5C-L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C-L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, e HPV58N70C-L1, obtidas no Exemplo 6 (tomado em 50.00x de magnitude, Barra - 0,2 μim) . A figura 7A ilustra a VLPs HPV58N5C-L1; A figura 7B ilustra a VLP de HPV58N15C-L1; A figura 7C ilustra a VLP de HPV58N27C-L1; A figura 7D ilustra a VLP de HPV58N40C-L1; A figura 7E ilustra a VLP de HPV58N60C-L1; e A figura 7F ilustra a VLP de HPV58N70C-L1. Os resultados mostraram que um grande número de VLPs com um raio de cerca de 25 nm foram observados no campo visual das figuras 7A - 7F, sendo que o tamanho de partícula foi consistente com o tamanho teórico e as partículas foram homogêneas; e

[0069] A Figura 8 mostra o resultado de medição de difusão de luz dinâmica das VLPs das proteínas HPV58N5C-L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C-L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, e HPV58N70C-L1, obtidas do Exemplo 6. A figura 8A ilustra a VLPs HPV58N5C-L1; A figura 8B ilustra a VLP de HPV58N15C-L1; A figura 8C ilustra a VLP de HPV58N27C-L1; A figura 8D ilustra a VLP de HPV58N40C-L1; A figura 8E ilustra a VLP de HPV58N60C-L1; e A figura 8F ilustra a VLP de HPV58N70C-L1. O resultado mostrou que as VLPs de A figura 7 A ilustra a VLPs HPV58N5C-L1; A figura 7B ilustra a VLP de HPV58N15C-L1; A figura 7C ilustra a VLP de HPV58N27C-L1; A figura 7D ilustra a VLP de HPV58N40C-L1; A figura 7E ilustra a VLP de HPV58N60C-L1; e A figura 7f ilustra a VLP de HPV58N70C-L1 tinham um raio dinâmico de cerca de 25 nm e uma taxa de arranjo de partícula de 100%.

Informação da sequência

[0070] A informação sobre as sequências envolvidas na invenção está provida na tabela 1 a seguir. Tabela 1 Representação da Sequência

Formas específicas para realização da invenção

[0075] A presente invenção é ilustrada ainda em detalhes através de referência aos Exemplos como a seguir. Deve ser entendido pelos técnicos no assunto que os exemplos são utilizados apenas para o propósito de ilustração da presente invenção, em vez de limitar o escopo de proteção da presente invenção.

[0076] A menos que de outro modo indicado, os métodos experimentais biológicos moleculares e a análise imunológica utilizada na presente invenção são realizados substancialmente de acordo com os métodos como descrito em “Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring, Harbor Laboratory Press”, 1989, e F. M. Ausubel et al., “Short Protocols in Molecular Biology”, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995, ou de acordo com as instruções do produto. Os reagentes e instrumentos utilizados na presente invenção sem a marca de seus fabricantes são todos produtos convencionais comercialmente disponíveis no mercado. Os técnicos no assunto entendem que os exemplos são utilizados para ilustrar a presente invenção, mas não pretendem limitar o escopo de proteção da presente invenção.

[0077] Exemplo 1: Expressão das Proteínas L1 HPV58 Truncada com uma sequência, tal como representada em SEQ ID NO:1

Preparação de gene L1 HPV58 de extensão completa como um padrão

[0078] O gene de extensão completa L1 HPV58 como um padrão foi sintetizado por Shanghai Boya Bio Co. O gene sintetizado tinha uma extensão completa de 1575 bp e sua sequência é como representada na SEQ ID NO:8. Com base no fragmento do gene L1 HPV58 sintético de extensão completa, os polinucleotídeos codificantes da proteína L1 HPV58 truncada, de acordo com a invenção foram preparados.

Construção de Vetores de Expressão Não-fundidos para expressão das proteínas L1 HPV58 truncada

[0079] O gene de extensão completa L1 HPV58 como sintetizado na etapa anterior foi utilizado como padrão para a reação PCR. O primer sequencial ("forward primer") foi 58N35F: 5’-cAT ATgAcc gTg TAc cTg ccc-3’ (SEQ ID NO:16), na extremidade 5’ terminal, da qual o sítio NdeI da endonuclease de restrição CAT ATG foi introduzido, onde ATG foi o códon de iniciação em um sistema E. coli. O primer reverso ("reverse primer") foi 58CR: 5’-gTC gAC TTA CCT CTT CAC CTT GTT CC-3' (SEQ ID NO:17), na extremidade 5’ terminal, da qual o sítio Sa1I foi introduzido. A reação de PCR foi realizada em um Termociclador para PCR (Biometra T3) sob as condições a seguir:

[0080] Os fragmentos de DNA, com cerca de 1,5kb de comprimento, foram obtidos após amplificação. Os produtos de PCR foram ligados dentro do vetor pMD 18-T comercialmente disponível (Takara Biosciences), e foram então transformados em E. coli DH5α. As colônias bacterianas positivas serem filtradas, os plasmídeos foram extraídos. Após digestão com NdeI/Sa1I, foram identificados quais os clones positivos, designados como pMD 18-T-HPV58N35C-L1, que foram obtidos, onde o gene HPV58 L1 truncados foi inserido.

[0081] A sequência de nucleotídeo do fragmento de interesse, que foi inserida dentro do plasmídeo pMD 18-T- HPV58N35C-L1, foi determinada como SEQ ID NO:9 por Shanghai Boya Bio Co., usando primers M13 (+)/(-), e a sequência de aminoácidos codificados desse modo foi representada pela SEQ ID NO:1. A sequência correspondeu a uma proteína L1 HPV58 tendo 35 aminoácidos truncados em sua N-terminal e nenhum aminoácido truncado em sua extremidade C-terminal, sendo designada como HPV58N35C-L1.

[0082] Os fragmentos de gene HPV58N35C-L1 truncados foram obtidos através de digestão com NdeI/Sa1I do plasmídeo pMD 18-T-HPV58N35C-L1. Os fragmentos foram ligados ao Vetor de expressão não fundido pT0-T7 (Luo wenxin et al., “Chinese Journal of Biotechnology”, 2000, 16: 53-57) digerido com NdeI/Sa1I, e foi então transformado dentro de E. coli ER2566. As colônias bacterianas positivas foram filtradas, e os plasmídeos foram extraídos. Após digestão com NdeI/SalI, foi identificado aqueles clones positivos, designados como Pt0- t7-hpv58n35c-l1, foram obtidos, onde o fragmento de interesse foi inserido.

[0083] 1μ L de plasmídeo pT0-T7—HPV58N35C-L1 (0,15 mg/ml) foi utilizado para transformar 40μ L de E.coli ER2566 competente (adquirido da New England Biolabs) preparado através do método de cloreto de cálcio, e então a bactéria foi plaqueada em meio sólido LB (os componentes do meio LB: 10g/L peptona, 5g/L de pó de levedura; e 10g/L de NaCl, o mesmo como abaixo) contendo Canamicina (em uma concentração final de 25 mg/ml, o mesmo como abaixo). As placas foram estaticamente incubadas a 37°C por certa de 10-12 horas até as colônias únicas poderem ser observadas claramente. As colônias únicas obtidas das placas foram transferidas para um tubo contendo 4ml de meio LB líquido contendo Canamicina. As culturas foram incubadas em um incubador com agitação a 220 rpm durante 10 horas a 37oC, e então 1ml de solução bacteriana foi tomada e armazenada a -70oC.

Expressão da proteína HPV58N35C-L1 em larga escala

[0084] A solução de E.coli carregando o plasmídeo recombinante pT0-T7-HPV58N35C-L1 a -70° como preparado na etapa anterior foi semeada em 50 mL de meio LB líquido contendo Canamicaina e incubada a 200 rpm e a 37°C por cerca de 8 horas. Então, as culturas foram transferidas para dez frascos (5 ml de cultura por frasco), cada um dos quais contendo 500ml de meio LB contendo Canamicaina, e então foram incubadas em um incubador com agitação durante a noite a 200 rpm e 37oC, como uma cultura inicial.

[0085] Um fermentador de 50L feito pela Shanghai Baoxing Biological Ltd., foi utilizado em incubação de larga escala. O eletrodo de pH do fermentador foi calibrado. 30L de meio LB foram preparados dentro do fermentador, in situ, esterilizados a 121°C durante 30 minutos. O eletrodo de oxigênio dissolvido foi calibrado, sendo que o valor foi determinado como 0 antes da introdução de ar após a esterilização e como 100% antes da vacinação após a introdução de ar, enquanto era agitado em uma taxa inicial de 100 rpm.

[0086] Preparação da alimentação: A mistura de peptona e extrato de levedura em uma concentração de 30% foi preparada (20g de peptona e 10g de extrato de levedura foram dissolvidos em 100mL); uma solução de glicose de 50% foi preparada (50 g de glicose foi dissolvido em 100 ml). As duas soluções foram esterilizadas a 121oC por 20 minutos.

[0087] No dia seguinte, as culturas de partida/iniciais nos dez frascos (para um total de 5L) foram transferidas para o fermentador. Uma temperatura de 30oC e um pH de 7,0 foram fixados, o O2 dissolvido foi mantido a >40%, por meio da taxa de agitação regulada e fornecimento de ar manual.

[0088] Fluxo de alimentação: a solução de glicose (50%), e a mistura de peptona e extrato de levedura (30%) foram misturadas em uma proporção em massa de soluto de 2:1.

[0089] As taxas de fluxo foram como a seguir (25 ml/minuto foram definidos como 100%):

[0090] 1a hora: 5%

[0091] 2a hora: 10%

[0092] 3a hora: 20%

[0093] 4a hora: 40%

[0094] 5a hora até o final: 60%

[0095] Quando a concentração bacteriana alcançou um OD600 de cerca de 10,0, a temperatura da cultura foi reduzida para 25oC e 4g de IPTG foram adicionados para iniciar uma cultura de indução de 4 horas. A fermentação foi interrompida quando a concentração final alcançou um OD600 de cerca de 60. As bactérias foram colhidas por centrifugação. A bactéria expressando a proteína HPV58N35C-L1 foram obtidas, pesando cerca de 2,5 kg.

[0096] Exemplo 2: Preparação da proteína HPV58N35C-L1 com uma pureza de cerca de 70%

[0097] As bactérias foram re-suspensas em uma proporção de 1g de bactéria correspondente a 10 ml de tampão de lise (20mM tampão Tris pH 7,2, 300mM NaCl). As bactérias foram rompidas através de passagem por um homogeneizador APV (Invensys Group) por cinco vezes em uma pressão de 600bar. O homogeneizado foi centrifugado a 13.500 rpm (30.000g) usando um rotor JA-14 durante 15 minutos, e o sobrenadante (ou seja, o sobrenadante de bactéria rompida) foi obtido. O sobrenadante foi submetido a um SDS-PAGE a 10%. Nesse estágio, a proteína HPV58N35C-L1 no sobrenadante tinha uma pureza de cerca de 10% (ver a figura 1, coluna 1).

[0098] O sobrenadante foi dialisado através de um Filtro de Fluxo Tangencial CENTRASETTE 5 (Pall Co.), operando em uma pressão de 0,5 psi, uma taxa de fluxo de 500ml/minutos, e uma taxa de fluxo tangencial de 200ml/minutos, onde o peso molecular de retenção e membrana foi de 30kDa, a solução de diálise foi 10 mM de tampão fosfato e o pH 6,0, e o volume de dialisado três vezes maior que o volume do sobrenadante.

[0099] Após diálise completa, a mistura foi centrifugada a 9500 rpm (12.000g) usando um rotor JA-10 (centrífuga Beckman J25 de alta velocidade) durante 20 minutos, e o precipitado (ou seja, o produto precipitado livre de sais) foi colhido. O precipitado foi re-suspenso em 20 mM de tampão fosfato (pH 8,0) contendo 20mM de DTT e 600mM de NaCl, sendo que o volume do tampão foi 1/10 do volume do sobrenadante. A mistura foi agitada durante 30 minutos e centrifugada a 13.500rpm (30.000g) usando um rotor JA-14 (centrífuga de alta velocidade Beckman J25) durante 20 minutos. O sobrenadante e o precipitado (ou seja, o precipitado obtido após re- dissolução) foram coletados. O sobrenadante foi diluído com 20 mM de tampão fosfato (pH 8,0) contendo 20 mM de DTT em um volume igual, resultando na concentração final de NaCl de 0,3 M. Então, o sobrenadante diluído foi filtrado usando uma filtro de membrana com uma abertura de 0,22μ m. A amostra obtida (ou seja, sobrenadante re-dissolvido) foi purificada através de cromatografia de troca catiônica (como descrito no Exemplo 3). 30μ L de 6x tampão de carga (12% (p/v) de SDS, 0,6% (p/v) de bromofenol blue, 0,3 M de Tris-HCl, pH 6,8, 60% (v/v) de glicerina, 5% (v/v) de β-mercaptoetanol) foram adicionados a 150mL do sobrenadante filtrado, e a solução resultante foi misturada homogeneamente e foi colocada em um banho-maria a 80°C durante 10 minutos. Então, uma amostra de 10μ L foi submetida a SDS-PAGE 10% a 120V durante 120 minutos. As bandas eletroforéticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado eletroforético foi mostrado na Figura 1. O resultado mostrou que a proteína HPV58N35C-L1 foi purificada e enriquecida após as etapas de precipitação e de re-dissolução, com sua pureza aumentada a partir de cerca de 10% a cerca de 70% (ver Figura 1, coluna 1 e Coluna 3).

[0100] Exemplo 3: Purificação da proteína HPV58N35C-L1 através de Cromatografia:

1) Purificação da proteína HPV58N35C-L1 através de Cromatografia de Troca Catiônica

[0101] Equipamento: sistema de cromatografia líquida preparatória AKTA Explorer 100 produzido pela GE Healthcare (ou seja, a antiga Amershan Pharmacia Co.).

[0102] Meios cromatográficos: SP Sepharose 4 de Fluxo Rápido (GE Healthcare Co.)

[0103] Volume da coluna: 5,5cm x 20 cm

[0104] Tampão: 20 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 20mM de DTT

[0105] 20 mM tampão fosfato, pH 8,0; 20mM de DTT, 2M de NaCl

[0106] Taxa de fluxo: 25 mL/min

[0107] Detector de comprimento de onda: 280 nm

[0108] Amostra: cerca de 70% da solução pura da proteína HPV58N35C-L1, como filtrada através de uma membrana de filtro com uma abertura de 0,22 μ m no Exemplo 2.

[0109] Protocolo de eluição: eluir as proteínas indesejadas com 500mN de NaCl, eluindo a proteína de interesse com 1000 mM de NaCl, coletando o eluido com 1000mM de NaCl e, finalmente, obter cerca de 900 mL de amostra purificada de HPV58N35C-L1.

2) Purificação de HPV58N35C-L1 através de Cromatografia CTH- II (cromatografia de hidroxiapatita)

[0110] Equipamento: sistema de cromatografia líquida preparatória AKTA Explorer 100, produzido pela GE Healthcare (ou seja, a antiga Amershan Pharmacia Co).

[0111] Meios cromatográficos: CTH-II (obtida a partir da Bio-Rad).

[0112] Volume da coluna: 5,5cm x 20 cm

[0113] Tampão: 20 mM tampão fosfato; pH 8,0; 20mM de DTT, 1) 20 mM tampão fosfato; pH 8,0; 20mM de DTT, 2M de NaCl.

[0114] Taxa de fluxo: 20 mL/min

[0115] Detector de comprimento de onda: 280 nm

[0116] Amostra: 1000 mN de eluição em NaCl do produto obtido na etapa anterior, diluído em uma concentração de NaCl de 0,3M com 20 mM de tampão fosfato, pH 80,0; 20 mM de DTT.

[0117] Protocolo de eluição: eluir as proteínas indesejadas com 500mN de NaCl, eluindo a proteína de interesse com 1000 mM de NaCl, coletando o eluído com 1000mM de NaCl e, finalmente, obter cerca de 800 mL de amostra purificada de HPV58N35C-L1.

[0118] 30μ L 6x tampão de carga foram adicionados a 150μ L de amostra de HPV58N35C-L1 como purificada pelo método no presente Exemplo, e então a solução resultante foi misturada homogeneamente. Após incubação da solução em um banho-maria a 80°C durante 10 minutos, uma amostra de 10μ L foi submetida a SDS-PAGE em 10%, a 120V durante 120 minutos. As bandas eletroforéticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado eletroforético foi mostrado na Figura 2. O resultado mostrou que após a referida etapa de purificação, a concentração da proteína HPV58N35C-L1 foi de cerca de 1,0mg/ml; com uma pureza maior que 98%.

[0119] Exemplo 4: Montagem de VLPs de HPV58N35C-L1

[0120] Equipamento: Filtro de fluxo tangencial CENTRASETTE 5 (Pall Co.), onde o peso molecular de retenção em membrana foi de 30 kDa. Amostra: HPV58N35C-L1 com uma pureza maior que 98%, como obtida no Exemplo 3.

[0121] Renaturação da Amostra: O tampão da amostra foi completamente trocado por 10L de tampão de renaturação (50mM PB (tampão de fosfato de sódio), pH 6,0, 2mM de CaCl2, 2mM de MgCl2, 0,5M de NaCl, 0,003% de Tween-80). A operação do Filtro de Fluxo Tangencial foi em uma pressão de 0,5psi e a taxa de fluxo tangencial de 10ml/min. Quando a troca com tampão de renaturação foi finalizada, o tampão de renaturação foi substituído por tampão de armazenamento (20L PBS: 20mM de PB; pH 6,5, 0,5M de NaCl) com um volume de troa de 20L. O filtro de fluxo tangencial foi operado em uma pressão de 0,5 psi e uma taxa de fluxo tangencial de 25 mL/minuto. Quando a troca foi finalizada, a amostra foi assepticamente filtrada com um filtro Pall (0,20 μ m) e, desse modo, obteve-se VLPs de HPV58N35C-L1. As VLPs de HPV58N35C-L1 foram armazenadas a 4oC para uso posterior.

[0122] Exemplo 5: Determinação de morfologia de VLPs de HPV58N35C-L1 e determinação da imunogenicidade das mesmas.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de VLPs de HPV58N35C-L1

[0123] O equipamento foi um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL 100kV (aumentado em 100,000x). As VLPs de HPV58N35C-L1 obtidas do Exemplo 4 foram negativamente coradas com ácido fosfotúngstico a 2%, pH 7,0, e fixadas sobre grade de cobre para observação. Os resultados estão mostrados na Figura 3. Um grande número de VLPs com um raio de aproximadamente 2 nnm, que foram homogêneas e em uma forma oca, foi observado.

Medição de VLPs de HPV58N35C-L1 com difusão de luz dinâmica

[0124] O instrumento de dispersão de luz dinâmica DynaPro MS/X (incluindo um controlador de temperatura) (US Protein Solutions Co.) foi utilizado nas medições por difusão de luz. A amostra foi VLPs HPV58N35C-L1 obtidas no Exemplo 4. A amostra foi passada através de uma membrana de filtro de membrana de 0,22 μ m antes da medição. Os resultados estão mostrados na Figura 4. O resultado mostrou que as VLPs de HPV58N35C-L1 tinham um raio hidrodinâmico de 25,46nm.

Estabelecimento de um modelo celular para a Neutralização de HPV58

[0125] O HPV dificilmente pode ser cultivado in vitro, e o hospedeiro do HPV apresenta forte especificidade. Assim, o HPV dificilmente pode ser propagado em outros hospedeiros além dos humanos. Ou seja, não há um modelo animal apropriado para o HPV. Portanto, de modo a avaliar rapidamente a proteção imune de vacinas contra o HPV, surge a necessidade urgente de se estabelecer um modelo eficiente para ensaios de neutralização in vitro.

[0126] No modelo de Infecção de Pseudovírion in Vitro: por meio das características de que a VLP de HPV pode empacotar ácidos nucléicos de forma não específica, o pseudovírion do HPV foi formado através da expressão da proteína L1 e L2 do HPV em células, e por meio do empacotamento do DNA viral epissomal ou de plasmídeos repórteres introduzidos heterologamente (Yager, M.D., Aste-Amezaga, M. et al (2000) - “Virology (278) 570-7). Os métodos concretos incluem os sistemas de expressão viral recombinante e os métodos de co- transfecção de múltiplos plasmídeos. Métodos de co- transfecção de múltiplos plasmídeos forma utilizados para exemplificação dos Exemplos.

[0127] Adicionalmente, alguns aperfeiçoamentos foram feitos nos sistemas HPV por meio de métodos convencionais como a seguir descrito. O método de transfecção de fosfato de cálcio para a linhagem celular 293FT foi otimizado para obter uma eficiência de transfecção até ou maior que 90%, facilitando, dessa forma, a produção em larga escala. O plasmídeo de expressão para expressão das proteínas estruturais de HPV foi um códon-otimizado para expressar o gene L1 e L2 de HPV eficientemente em células de mamíferos, facilitando, dessa forma, a montagem eficiente do pseudovírion.

Construção de Pseudovírion de HPV

[0128] O plasmídeo p58L1h (o vetor pAAV carregando a sequência de plasmídeo codificante da proteína HPV58 L1 (NCBI database, Número de acesso: P26535.1)), plasmídeo p58L2h (o vetor pAAV carregando a sequência de nucleotídeo codificante da proteína L2 HPV58 (NCBI database, Número de Acesso: P26535.1)), e o plasmídeo pN31-EGFP carregando o gene da proteína fluorescente verde, foram purificados por meio de centrifugação em gradiente de densidade CsC1, onde ditos vetores pN31-EGFP e os referidos vetores pAAv foram doados pelo Professor John T. Schiller da NIH. Os métodos de purificação de plasmídeo usando a centrifugação de gradiente de densidade CsC1 são bem conhecidos do estado da técnica (ver “The Molecular cloning Expeirment Guide, 3rd Edition).

[0129] As células 293FT (Invitrogen) cultivadas em uma placa de cultura de células de 10cm, foram co-transfectadas com os p58L1h, p58L2h e pN31-EGFP (40μ m para cada)através do método de transfecção de fosfato de cálcio. O método de transfecção com fosfato de cálcio foi bem conhecido no estado da técnica (ver “The Molecular cloning Experiment Guide, 3rd Edition). Em resumo, os p58L1h, p58L2h e pN31-EGFP (40μ m para cada) foram adicionados à mistura de 1 mL de solução HEPES (125μ L 1M HEPES, pH 7,3 por 50 μ L de água deionizada, armazenada a 4°C) e 1 mL de 0,5M da solução de CaCl2. Após misturar homogeneamente, 2mL 2X de solução HeBS (0,28 M NaCl (16,36g), 0,05M HEPES (11,9g) e 1,5mM de Na2HPO4 (0,213g), foram dissolvidos em 1000mL de água deionizada, pH 6,96, armazenada a -70°C) foi adicionada gota a gota. Após aguardar em temperatura ambiente, por 1 minuto, a mistura foi adicionada em uma placa de cultura de 10cm onde as células 293FT foram cultivadas. Após cultivo de 6 horas, o meio de cultura original foi decantado e 10 ml de meio completo fresco (Invitrogen Co.) foi adicionado. Após transfecção por 48 horas, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Então, as células foram colhidas e contadas. Cada 10&células foram re-suspensas em 1 mL de solução de lise (0,25% de Brij58, 9,5 mM de MgCl2). Após a lise, o lisado celular foi centrifugado a 5.000g por 10 minutos e o sobrenadante foi colhido. A solução de pseudovírion foi obtida após adição de 5M de NaCl para uma concentração final de 850 mM, e então foi armazenada em porções pequenas a -20°C.

Determinação dos títulos de neutralização dos anticorpos

[0130] As células 293FT (Invitrogen) foram plaqueadas em uma placa de cultura de células de 96 poços (1,5X104células/cavidade). O ensaio de neutralização foi conduzido cinco horas depois. As amostras de soro compreendendo os anticorpos a serem testados foram serialmente diluídas com DMEM 10% meio a meio. As amostras diluídas (50μ L para cada) foram respectivamente misturadas com soluções de 50μ L de Pseudovírion diluídas com DMEM 10% como preparado acima (moi=0,1). Após incubar a 4oC durante 1 hora, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 96 poços tendo nela semeadas as células 293FT. A mistura foi então incubada por 72 horas a 37oC. Os títulos de anticorpos das amostras foram estimados através da observação por fluorescência. A porcentagem de infecção das células em cada poço foi verificada através de citometria de fluxo (EPICS CL, American Beckman Coulter Co.). Os títulos exatos de anticorpos foram calculados. A porcentagem de infecção foi a porcentagem de células na região positiva da amostra celular a ser testada minimamente que na região positiva da amostra de células controle não-infectada.

[0131] Porcentagem de inibição de infecção =(1 - porcentagem de infecção dos poços com a porcentagem soro/infecção dos poços com soro) x 100%.

[0132] A região positiva foi definida como a região celular tendo um sinal GFP determinado pela citometria de fluxo pelo menos 10 vezes maior do que o sinal das células controle.

[0133] O título de neutralização dos anticorpos foi definido como diluições múltiplas maiores pelas quais uma porcentagem de inibição de infecção alcança acima de 50%. Os anticorpos foram considerados como tendo capacidade de neutralização se sua porcentagem de inibição de infecção foi acima de 50% após diluições de 50x.

Avaliação da proteção imune da vacinação de animais com VLPs de HPV58:

[0134] Coelhos foram utilizados para avaliar a proteção imune das VLPs de HPV58 de acordo com a invenção. Os animais para vacinação foram 5 coelhas fêmeas (grau geral) com 6-8 semanas de vida, adquiridas da “Disease Prevention and Control Center”, da província de Guangxy. As VLPs de HPV58N35C-L1 (em uma concentração de 0,1 mg/ml) preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com igual volume de Adjuvante de Freund completo para a primeira vacinação ou com igual volume de Adjuvante de Freund incompleto para o estímulo (“booster”). O procedimento de vacinação foi realizado como a seguir: a primeira vacinação no mês 0, e o estímulo nos meses 1, 2, e 3 respectivamente. As coelhas foram vacinadas através de injeção muscular, com uma quantidade de 200μ g de VLPs de HPV58N35C-L1, preparado no Exemplo 4, por coelha.

[0135] Após a primeira vacinação, o sangue venoso foi colhido a cada semana, e o soro foi separado e armazenado para teste. Os títulos de neutralização dos anticorpos contra pseudovírion HPV58 no soro de coelhos foram determinados pelo método acima.

[0136] O resultado foi mostrado na figura 5. A figura 5 demonstrou os títulos de neutralização dos anticorpos no soro em estágios diferentes após a vacinação dos coelhos com VLPs de HPV58N35C-L1 preparadas no Exemplo 4. Pode ser observado que os títulos de neutralização dos anticorpos aumentou significativamente 2 meses após a primeira vacinação, e alcançou um nível de pico de 105após o estímulo. Foi sugerido que as VLPs de HPV58N35C-L1, como preparadas no Exemplo 4, têm boa imunogenicidade, podendo induzir a produção de anticorpos de neutralização contra HPV58 com uma titulação alta em animais, e podem ser utilizadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção de HPV58. Em adição ao adjuvante de Freund, outros adjuvantes bem conhecidos do estado da técnica podem também ser utilizados nas vacinas, por exemplo, os adjuvantes de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.

Exe mplo 6: Preparação e observação morfológica de outras proteínas truncadas e VLPs.

[0137] A proteína HPV58 L1 tendo 5, 15, 27, 40, 60 ou 70 aminoácidos truncados na extremidade N-terminal, respectivamente, ou seja, HPV58N5C-L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C-L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, HPV58N70C-L1 (suas sequências de aminoácidos estão representadas em SEQ ID Nos: 10, 11, 12, 13, 14 e 15, respectivamente), foram preparadas e purificadas basicamente através do método como descrito nos

Exemplos 1-3. As proteínas assim obtidas tiveram uma pureza acima de 98% (ver figura 6).

[0138] As proteínas HPV58N5C-L1, HPV58N15C-L1, HPV58N27C- L1, HPV58N40C-L1, HPV58N60C-L1, e HPV58N70C-L1 foram arranjadas em VLPs basicamente por meio dos métodos descritos no Exemplo 4, respectivamente, designadas como VLPs HPV58N5C- L1, VLPs HPV58N15C-L1, VLPs HPV58N27C-L1, VLPs HPV58N40C-L1, VLPs HPV58N60C-L1, e VLPs HPV58N70C-L1, respectivamente.

[0139] As VLPs HPV58N5C-L1, VLPs HPV58N15C-L1, VLPs HPV58N27C-L1, VLPs HPV58N40C-L1, VLPs HPV58N60C-L1, e VLPs HPV58N70C-L1, foram submetidas a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e observação de disseminação dinâmica de luz, basicamente através do método descrito no Exemplo 5, respectivamente. Os resultados estão mostrados nas figuras 7 e 8. A figura 7 mostrou que as proteínas truncadas podem formar um grande número de VLPs com um raio de cerca de 25 nm, onde o tamanho da partícula foi consistente com o tamanho teórico e as partículas foram homogêneas. A figura 8 mostrou que as VLPs HPV58N5C-L1, VLPs HPV58N15C-L1, VLPs HPV58N27C- L1, VLPs HPV58N40C-L1, VLPs HPV58N60C-L1, e VLPs HPV58N70C- L1, tiveram um raio hidrodinâmico de cerca de 25 nm e uma taxa de arranjo de partícula de 100%.

[0140] Adicionalmente, foi demonstrado pelo método, como descrito no Exemplo 5 que as VLPs HPV58N5C-L1, VLPs HPV58N15C-L1, VLPs HPV58N27C-L1, VLPs HPV58N40C-L1, VLPs HPV58N60C-L1, e VLPs HPV58N70C-L1, obtidas na presente invenção também tiveram boa imunogenicidade, podendo induzir a produção de anticorpos de neutralização com uma alta titulação em animais e, portanto, podem ser utilizados como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção por HPV.

[0141] Apesar de concretizações específicas da presente invenção terem sido descritas em detalhes, os técnicos no assunto entenderão que, de acordo com os ensinamentos discutidos no relatório descritivo, várias modificações e alterações poderão ser feitas sem fugir do espírito e do escopo de proteção da presente invenção, tal como genericamente descrito e, que as citadas modificações e alterações estão dentro do escopo de proteção da invenção. O escopo da presente invenção é determinado pelas reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

Claims (18)

1. Proteína L1 HPV58 truncada, caracterizadapelo fato de dita proteína LI HPV58 truncada ser diferente da proteína L1 HPV58 alelo-selvagem pela deleção de aminoácido nas posições 2-35, 2-40, 2-60 ou 2-70 em sua N-terminal, da proteína LI HPV58 alelo-selvagem.

2. Proteína L1 HPV58 truncada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de dita proteína L1 HPV58 truncada ter uma sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7.

3. Proteína L1 HPV58 truncada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de consistir das sequências de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 1.

4. Ácido nucléico isolado, caracterizadopelo fato de codificar a proteína L1 HPV58 truncada, tal como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 sendo que o ácido nucleico consiste das sequências de nucleotídeos como representadas na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, ou as sequências degeneradas do mesmo que codificam a proteína das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7.

5. Vetor, caracterizadopelo fato de compreender o ácido nucléico isolado, conforme definido na reivindicação 4.

6. Célula hospedeira, caracterizadapelo fato de compreender o ácido nucléico isolado, conforme definido na reivindicação 4 ou o vetor, conforme definido na reivindicação 5, sendo que a célula hospedeira é uma célula procarionte.

7. Partícula do tipo viral HPV58, caracterizada pelo fato de compreender ou consistir da proteína L1 HPV58 truncada, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

8. Composição, caracterizada pelo fato de compreender a proteína L1 HPV58 truncada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, ou o ácido nucléico isolado, conforme definido na reivindicação 4, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 5, ou a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 6, ou a partícula do tipo viral HPV58, conforme definida na reivindicação 7.

9. Composição farmacêutica ou vacina, caracterizada pelo fato de compreender a partícula do tipo viral HPV58, conforme definida na reivindicação 7 e, um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

10. Composição farmacêutica ou vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de a partícula do tipo viral HPV58 está presente em uma quantidade efetiva para prevenir a infecção de HPV ou o câncer cervical.

11. Composição farmacêutica ou vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizada pelo fato de a composição farmacêutica ou vacina compreender ainda pelo menos uma partícula do tipo viral selecionada do grupo consistindo de proteína L1 HPV6, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV11, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV16, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV18, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV31, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV33, partícula do tipo viral da proteína L1 HPV45, e partícula do tipo viral da proteína L1 HPV52.

12. Método para obter uma proteína L1 HPV58 truncada, caracterizado pelo fato de compreender: expressar a proteína L1 HPV58 truncada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, com um sistema de expressão E. COLI; e realizar um processo de purificação no sobrenadante da lise contendo a referida proteína.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) expressar a proteína L1 HPV58 truncada em E. COLI; (b) romper a E. COLI, que expressa a proteína L1 HPV58 truncada, em uma solução em uma concentração de sal de 100 mM a 600 mM, e isolar o sobrenadante; (c) diminuir a concentração de sal do sobrenadante de (b) para 100 mM ou menos, por meio do uso de água ou uma solução com uma baixa concentração de sal, e coletar um precipitado; (d) redissolver o precipitado de (c) em uma solução em uma concentração de sal de 150 mM a 2500 mM; e adicionar um redutor à solução, e então isolar a solução resultante, sendo que a solução contém a proteína L1 HPV58 truncada com uma pureza de pelo menos 50%.

14. Método para preparar a partícula do tipo viral HPV58, conforme definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato compreender as etapas de: (a) purificar por cromatografia da proteína L1 HPV58 truncada com uma pureza de pelo menos 50% como obtido pelo método, definido de acordo com a reivindicação 13; e (b) remover o redutor a partir da proteína obtida em (a).

15. Método para preparar uma vacina, caracterizado pelo fato de compreender a mistura da partícula do tipo viral HPV58, conforme definida na reivindicação 7, ou a partícula do tipo viral HPV58 obtida através do método definido na reivindicação 14 com um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente e, com ou sem uma ou mais partículas do tipo viral selecionada a partir do grupo consistindo de partículas virais dos tipos HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45 e 52 .

16. Uso da proteína L1 HPV58 truncada, caracterizado pelo fato de utilizar a proteína L1 HPV58 truncada conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, ou a partícula do tipo viral HPV58, conforme definida na reivindicação 7, ou a proteína L1 HPV58 truncada obtida pelo método definido em qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, ou a partícula do tipo viral HPV58 obtida pelo método definido na reivindicação 14, na preparação de uma composição farmacêutica ou de uma vacina para prevenção da infecção HPV ou uma doença causada pela infecção HPV.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a infecção HPV ser uma infecção HPV58.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a doença causada pela infecção HPV ser o câncer cervical.

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