BRPI0811016B1 - Proteína li truncada do papiloma vírus humano tipo 16 - Google Patents
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Abstract
proteína l1 truncada do papiloma vírus humano tipo 16. a invenção refere-se à proteína l1 truncada do papiloma vírus humano tipo 16, uma partícula tipo vírus (vlp) que consiste da proteína, a vacina compreendendo a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.
Description
[001] A invenção refere-se à proteína L1 truncada do Vírus do Papiloma Humano Tipo 16, uma partícula semelhante a vírus (VLP, em inglês) que consiste da proteína, a vacina que compreende a mencionada partícula e ao uso da vacina na prevenção de câncer cervical.
[002] O vírus do papiloma humano, um vírus ácido desoxirribonucléico (DNA) sem cápsula viral, pertence à família papovaviridae. O genoma viral é um DNA círculo fechado de cadeia dupla que tem aproximadamente 7.2-8kb de extensão e contém 8 quadros de leitura aberta (ORF, em inglês). O genoma pode ser dividido em três partes em relação a funções: (1) a região inicial (E), de aproximadamente 4.5kb de extensão, que codifica 6 proteínas não estruturais, E1, E2, E4~E7, associadas à replicação, à transcrição e a transformação do vírus; (2) a região final (L), de aproximadamente 2.5kb de extensão, que codifica a proteína L1 principal do capsídio e a proteína L2 secundária do capsídeo; (3) a região reguladora (LCR, em inglês), localizada entre o final da região L e o terminal de início da região E, de aproximadamente 800-900bp de extensão, inclui elementos regulares para a réplica de NA e a expressão ao invés de codificar proteínas. As partículas virais têm 45-55nm de diâmetro, onde o nucleocapsídeo, que consiste de L1 e L2, exibe simetria icosaédrica e compreende 72 capsômeros.
[003] Atualmente, existem mais de 90 tipos diferentes de HPV, que causam, principalmente, doença papilar na pele e na mucosa humana. Os tipos de HPV são divididos em três grupos, dependendo de sua relação com carcinogênese: (1) grupo de sem ou de baixo risco de carcinogênese, que contém os tipos 6, 11, 39, 41, 42 e 43; (2) grupo de risco médio de carcinogênese, que contém os tipos 31, 33, 35, 51 e 52; e (3) grupo de risco alto de carcinogênese, que contém os tipos 16, 18, 45 e 58.
[004] A investigação epidemiológica molecular sugere que a infecção por tipos de HPV de risco alto é um fator importante no desenvolvimento de câncer cervical. O DNA do HPV é detectado em mais de 80% dos casos de câncer cervical, com por volta de 60% de HPV16 e outros 25-30% de outros tipos de risco alto, como HPV 18, 31, 45 e 58 (Clifford, G., S. Franceschi, et al. Vaccine 2006.24 Suppl 3:S26-34).
[005] O câncer cervical é o segundo tumor mais comum em mulheres, seguido de câncer de mama, e ameaça gravemente a saúde de mulheres. Existem por volta de 490.000 novos casos relatados todo ano no mundo e quase 270.000 pessoas morrem desta doença anualmente (Boyle, P., e J. Ferlay. Ann Oncol 2005, 16:481-8). Casos em países em desenvolvimento somam em aproximadamente 83% do total e, por volta de 15% destes casos, envolvem neoplasmas malignos, em contraste a 1.5% em países desenvolvidos. O câncer cervical é mais predominante na África Subsaariana, na América Latina, no Extremo Oriente e na Ásia Meridional. O câncer cervical também é predominante na China. A incidência de câncer cervical entre mulheres casadas é tão alta quanto 1026/100000 no Município de Lueyang, Província de Shanxi. Portanto, uma vacina segura e eficaz, especialmente contra os tipos de risco alto, como o HPV 16 e 18, seria um modo eficaz de prevenir câncer cervical e melhorar a saúde das mulheres.
[006] A proteína L1 de HPV, com peso molecular de 55-60kDa, é a proteína de capsídeo principal do vírus do papiloma humano e o alvo principal da vacina contra HPV. A proteína L1 de HPV expressada em múltiplos sistemas de expressão diferentes pode formar partículas semelhantes a vírus (VLP) que se assemelham morfologicamente às partículas de HPV nativas, sem a assistência da proteína L2. A VLP, que consiste de 721 pentâmeros das proteínas L1, exibe simetria icosaédrica. Como as VLPs mantêm o epítopos das partículas virais, elas são altamente imunogênicas e podem induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra o HPV homólogo (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4). Além disso, as VLPs são seguras e não têm risco carcinógeno em potencial já que elas não contêm DNA viral. Portanto, as vacinas de VLP tornam-se o candidato principal para uma vacina contra HPV.
[007] A chave para o desenvolvimento de uma vacina é produzir eficientemente vacinas de VLP de HPV em grande escala. Atualmente, os sistemas de expressão freqüentemente mais usados são sistemas de expressão eucariótica e sistemas de expressão procariótica.
[008] Os sistemas eucarióticos freqüentemente usados incluem poxvirus, baculovírus de insetos e vetores de levedura. A proteína L1 HPV expressa em sistemas eucarióticos demonstra pouca diferença de adaptação daquela do vírus nativo e pode formar-se em VLPs. Deste modo, VLPs purificadas podem ser facilmente obtidas após centrifugação por gradiente de densidade. Isto traz grande conveniência ao trabalho de purificação. Porém, devido aos altos custos de culturas e o baixo nível de expressão, é bastante difícil produzir industrialmente em grande escala. A vacina contra HPV Gardasil®, que entrou no mercado recentemente, é mais cara do que as outras devido ao baixo nível de expressão e o alto custo de produção do sistema de expressão por Saccharomyces cerevisiae empregado na sua fabricação.
[009] A expressão da proteína L1 HPV em um sistema procariótico como o por E. coli foi relatado anteriormente. Banks, Matlashewski, et al. publicou um artigo referente à expressão de HPV 16 L1 através de emprego de E. coli (Banks, L., G. Matlashewski, et al. (1987). J Gen Virol 68 (Pt 12): 3081-9). Porém, a maior parte das proteínas L1 HPV expressas por E. Coli perde sua configuração nativa e não podem induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV. Por outro lado, embora as VLPs de HPV possam ser obtidas a partir de proteínas revestidas incorretamente por etapas como purificação a partir de corpos de inclusão e novo revestimento, é difícil aplicar este método à produção em grande escala, já que a proteína é perdida em grandes proporções durante o processo de novo revestimento e a levedura é baixa (Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995). J Virol Methods 53(1): 75-90). Embora a proteína L1 HPV possa ser expressa em uma forma solúvel, com uma configuração correta em E. coli, e dissolvida em suspensão de lisado de E. coli, o nível de expressão é baixo. Além disso, como há um grande número e quantidade de proteínas impuras, é difícil isolar as proteínas em que estamos interessados das outras. Embora seja relatado que o nível de expressão da proteína L1 pode ser aumentado em suspensão por meio de expressão por fusão GST e a purificação da proteína em que estamos interessados é facilitada P. Cripe, et al. (1997), J Virol 71(4): 2988-95), ainda não se pode aplicar a produção em grande escala devido às enzimas caras que são necessárias para clivar a proteína de fusão.
[0010] Portanto, uma proteína L1 HPV capaz de induzir a geração de anticorpos protetores contra HPV e uma partícula semelhante a vírus que consista do mesmo ainda são necessárias na área, para que possa ser possível produzir vacinas para câncer cervical industrialmente em grande escala.
[0011] Est a invenção tem como objetivo fornecer uma proteína L1 HPV tipo 16 original, as VLPs que consistem dela e uma vacina que inclui as VLPs.
[0012] Durante a pesquisa, foi descoberto por acaso que o sistema de expressão por E. coli pode produzir uma proteína HPV 16 L1 que pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra HPV 16. Após a purificação, a proteína HPV 16 L1 pode ser produzida em levedura alta, com pelo menos 50% de pureza. O tratamento adicional da proteína HPV 16 L1 purificada pode produzir VLPs, que podem induzir a produção de anticorpos neutralizantes. A invenção foi completada baseando-se no que foi dito acima.
[0013] Portanto, o primeiro aspecto da invenção refere-se a proteínas HPV 16 L1 com 4, 6, 8, 10, 20, 30 ou 40 aminoácidos truncados no N-terminal quando comparado à proteína HPV 16 L1 do tipo natural. Preferencialmente, a proteína truncada tem a seqüência disposta nos N°s ID SEQ: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, especialmente a seqüência disposta no N° ID SEQ: 6.
[0014] Outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleótido que codifica a proteína truncada de acordo com a invenção e um vetor que contém o polinucleótido.
[0015] Outro aspecto da invenção refere-se a uma célula que compreende o vetor.
[0016] A invenção também se refere à composição que compreende a proteína truncada, o polinucleótido, o vetor ou a célula.
[0017] Outro aspecto da invenção refere-se à VLP HPV 16, que contém ou consiste de proteínas HPV 16 L1 com 4, 6, 8, 10, 20, 30 ou 40 aminoácidos truncados no N-terminal, como proteínas HPV 16 L1 que têm seqüência disposta no N°s ID SEQ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7.
[0018] Out ro aspecto da invenção refere-se ao método de obtenção da proteína HPV 16 L1, que inclui a expressão de um fragmento de gene HPV 16 L1 truncado em um sistema de expressão por E. coli e a purificação subseqüente da proteína da suspensão de lisados.
[0019] Na modalidade preferida da invenção, um método de obter proteína HPV 16 L1 inclui: a) expressar o fragmento de gene HPV 16 L1 truncado em sistema de expressão por E. coli; b) desfazer o E. coli, que expressou a proteína HPV 16 L1 truncada, em uma solução a uma concentração de sal de 100mM a 600mM, e isolar a suspensão; c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de 100mM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver a precipitação de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteína HPV 16 L1 com pureza a, pelo menos, 50%.
[0020] De forma mais geral, a invenção também se refere ao método de obtenção de proteína L1 HPV, como a proteína HPV 16 L1 de acordo com a invenção, que inclui: a) expressar gene HPV L1 que codifica a proteína HPV L1 em um sistema de expressão em E. coli; b) desfazer o E. coli que expressou a proteína L1 HPV, em uma solução a uma concentração de sal de 100mM a 600mM, e isolar a suspensão; c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de 100mM a 0, inclusive, usando água ou uma solução com baixo sal, e coletar o precipitado; d) re-dissolver a precipitação de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de uma redução, e, em seguida, isolar a solução resultante em que a solução contenha a proteína L1 HPV com pureza a, pelo menos, 50%.
[0021] A invenção também se refere a uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui VLPs de proteínas HPV 16 L1 de acordo com a invenção, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical. Preferencialmente, a vacina também inclui pelo menos uma VLP de proteínas L1 HPV18, 11, 6, 31, 33, 45, 52 ou 58, preferencialmente em uma quantidade eficaz para prevenir o câncer cervical ou a infecção causada pelos tipos de HPV correspondentes. Geralmente, a vacina também contém excipientes ou vetores para vacina.
[0022] Preferencialmente, a vacina compreende VLPs de HPV 16 e VLPs de HPV 18, especialmente VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 6, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 9. É ainda mais preferível que a vacina também compreenda VLPs de HPV 6 e VLPs de HPV 11, especialmente VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 10, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 11.
[0023] Especialmente em uma modalidade preferida, a vacina compreende VLPs de HPV 16 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 6, VLPs de HPV 18 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 9, VLPs de HPV 6 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 10, VLPs de HPV 11 que incluam ou consistam da proteína que tem a seqüência de aminoácidos disposta no N° ID SEQ: 11, preferencialmente, em uma quantidade eficaz para prevenir câncer cervical ou infecção causada pelos subtipos de HPV correspondentes.
[0024] A invenção, além disso, refere-se ao uso da proteína HPV 16 L1 ou aos VLPs dela na fabricação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical.
[0025] A invenção também se refere ao método de prevenção contra câncer cervical, que inclui administração de uma vacina que tem uma quantidade preventiva eficaz de proteína HPV 16 L1 para um indivíduo que dela necessita.
[0026] A invenção envolve um método de obtenção de VLPs da proteína HPV 16 L1, que compreende: e) purificação adicional da proteína HPV 16 L1 truncada com uma pureza de, pelo menos, 50% através de cromatografia; f) remoção da redução da proteína HPV 16 L1 obtida em e).
[0027] Est a invenção envolve um método de preparação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical, que inclui combinação dos VLPs acima e, opcionalmente, um ou mais VLPs selecionados do grupo que consiste de VLPs de tipos de HPV 6, 11, 18, 31, 33, 45, 52 e 58, e vetores ou excipientes para as vacinas.
[0028] De acordo com a invenção, o termo “sistema de expressão em E. coli” refere-se a um sistema de expressão que consiste de E. coli (estirpes) e vetores, no qual E. coli (estirpes) inclui, mas não está limitado a: ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), e BLR (DE3), que estão disponíveis no mercado.
[0029] De acordo com a invenção, o termo “vetores” refere-se aos dispositivos de transporte de ácido nucléico que tenham o polinucleótido codificando certa proteína inserida no local e permitam a expressão da proteína O “vetor” pode ter o material genético transportado expressado em uma célula hospedeira por transformação, transdução e transfecção dentro da célula hospedeira. Por exemplo, “vetores” incluem plasmídeos, fagos, cosmídeos e semelhantes.
[0030] De acordo com a invenção, o termo “um fragmento de gene da proteína HPV 16 L1 truncada” refere-se aos ácidos nucléicos com nucleotídeo (s) que codifica um ou mais seqüência de aminoácidos eliminados em 5’ ou 3’ terminal do gene HPV 16 L1 natural (cDNA). A seqüência inteira de gene do gene HPV 16 L1 natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, seguintes seqüência do NCBI: AY686583.1, DQ469930.1, DQ155283.1 e AF393502.1.
[0031] O termo “proteína HPV 16 L1 truncada” refere-se à proteína com um ou mais aminoácidos eliminados no N- e/ou C- terminal da proteína HPV 16 L1 natural. A seqüência inteira de gene do gene HPV 16 L1 natural pode ser encontrada nas, mas não limitado a, proteínas L1 inteiras codificadas pelas seguintes seqüência do NCBI: AY686583.1, DQ469930.1, DQ155283.1 e AF393502.1.
[0032] De acordo com a invenção, o termo “excipientes e vetores para vacinas” refere-se a um ou mais reagentes, incluindo, mas não limitado a: Reguladores de pH, surfactantes, adjuvantes e fortalecedores iônicos. Por exemplo, os regulares de pH incluem, mas não estão limitados a, soluções-tampão fosfato; surfactantes incluem, mas não estão limitados a: surfactantes de ânion, surfactantes de cátions, surfactantes não iônicos (por exemplo, mas não limitado a, Tween-80); adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, hidróxido de alumínio e adjuvante completo de Freund; e fortalecedores iônicos incluem, mas não estão limitados a, NaCl.
[0033] De acordo com a invenção, o termo “cromatografia” inclui, mas não está limitado a: cromatografia de troca iônica (por exemplo, cromatografia de troca de cátions), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia absorvente (por exemplo, cromatografia em hidroxiapatite), cromatografia em gel filtração (cromatografia de exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.
[0034] De acordo com a invenção, as proteínas HPV 16 L1 truncadas podem ser obtidas, preferencialmente, pelos seguintes passos: a) desfazer E. coli, que expressa a proteína HPV 16 L1 truncada, em uma solução-tampão que contenha 100-600mM de sal, preferencialmente 200-500mM; b) isolar a suspensão da solução rompida, em seguida, diminuir a concentração de sal da suspensão para 100 mM - 0M com água ou solução-tampão de baixo sal (geralmente, com uma concentração de sal menor do que aquela da solução-tampão para romper); c) separar um precipitante da suspensão com uma concentração de sal tão baixa quanto 100 mM—0; d) redissolver o precipitante em uma solução que contenha um redutor e tenha uma concentração de sal de 150-2000mM, preferencialmente maior do que 200mM; e) Isolar uma solução das proteínas HPV 16 L1 truncadas com pureza de, pelo menos, 50%, preferencialmente em, pelo menos, 70%, sendo mais preferível, pelo menos, 80%.
[0035] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteínas HPV 16 L1, o termo “tampão” refere-se à solução que pode manter o valor de pH estável dentro de certa variação, incluindo, mas não limitado a: Soluções-tampão tris, soluções-tampão fosfato, soluções-tampão HEPES e soluções-tampão MOPS.
[0036] De acordo com a invenção, o rompimento da célula hospedeira procariótica pode ser realizado por métodos que incluem, mas não estão limitados a, um ou mais rompimentos homogenizadores, tratamento ultra-sônico, trituração, extrusão por pressão alta e tratamento por lisozima.
[0037] De acordo com a invenção, no método de obtenção das proteínas HPV 16 L1 truncadas, os sais usados incluem, mas não estão limitados a: um ou mais dos sais neutros, especialmente sal de metal alcalino, sais de amônio, cloridratos, sulfatos, bicarbonatos, hidrogenofosfatos ou sais de fosfato, Especialmente NaCl, KCl, NH4Cl, (NH4)2SO4- . É preferível NaCl. A redução usada inclui, mas não está limitado a, DTT e 2-mercaptoetanol, em uma quantidade de, mas não limitado a, 10-100mM.
[0038] De acordo com a invenção, as VLPs das proteínas HPV 16 L1 truncadas podem ser produzidas pelos seguintes passos: purificação adicional da proteína HPV 16 L1 truncada com pureza de, pelo menos, 50% a submetendo à cromatografia e, com isso, obtendo uma solução purificada de proteína HPV 16 L1 truncada; e remoção da redução da solução purificada de proteína HPV 16 L1 e, com isso, obtendo as VLPs HPV 16 L1 truncadas. Os métodos para a remoção da redução incluem, mas não estão limitados a, técnicas conhecidas na área, como diálise, ultra filtração e cromatografia.
[0039] De acordo com a invenção, a proteína L1 HPV tem, preferencialmente, a seqüência disposta no N° ID SEQ: 6.
[0040] De acordo com a invenção, a vacina pode ser administrada em forma aceita pelo paciente, incluindo, mas não limitado a, oral e injeção, preferencialmente injeção.
[0041] De acordo com a invenção, a vacina é usada, preferencialmente, em dose única. Cada dose contém 5-80μg de VLP HPV 16 L1 truncada, preferencialmente 20-40μg.
[0042] Atualmente, os sistemas de expressão úteis à preparação de VLPs de HPV incluem sistemas de expressão eucarióticos e procarióticos.
[0043] As proteínas L1 HPV expressas em sistemas de expressão eucarióticos mantêm sua configuração nativa e podem formar VLPs sozinhas. Na maioria dos casos, uma VLP com configuração correta pode ser obtida por purificação simples. No entanto, sistemas de expressão eucarióticos, como sistemas de expressão por baculovírus e levedura, são difíceis de serem aplicados em produção de grande escala industrial devido aos níveis baixos de expressão e aos altos custos.
[0044] Sist emas de expressão procarióticos, como sistemas em E. coli, têm a vantagens de ter altos níveis de expressão a um menor custo. Porém, quando expressos em um sistema procarióticos, a proteína L1 HPV normalmente perde sua configuração nativa e é expressa em uma forma de corpos de inclusão no precipitante. A renaturação da proteína a partir de corpos de inclusão ainda é um problema mundial. Devido à dificuldade e da ineficiência da renaturação, este método está limitado à pesquisa laboratorial em pequena escala e não pode ser aplicado em grande escala para obter VLP com configuração correta a partir dos corpos de inclusão. Embora a proteína L1 HPV possa existir em sua configuração nativa na suspensão de lisado de E. coli, seus níveis de expressão são baixos. Além disso, é bastante difícil purificar a proteína L1 HPV a partir das numerosas proteínas solúveis na suspensão de lisado de E. coli. Geralmente, a purificação é completada através de métodos, como expressão por fusão e cromatografia de afinidade, que não são viáveis para processos em escala industrial devido às enzimas caras empregadas nos métodos.
[0045] Nesta invenção, a proteína HPV 16 L1 N-truncada é expressa em sistema de expressão em E. coli e é precipitada seletivamente a partir da suspensão do lisado de E. coli sob condições amenas. A proteína HPV 16 L1 é, em seguida, redissolvida em solução-tampão de sal para aprimorar significativamente sua pureza enquanto ainda mantém sua configuração nativa. A proteína redissolvida de interesse pode ser submetida imediatamente à cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica para se obter a proteína pura.
[0046] A proteína HPV 16 L1 truncada purificada, obtida a partir destes passos, pode formar-se em VLPs com boa imunogenicidade e com a habilidade de induzir anticorpos neutralizantes de alto título contra HPV 16, que é uma boa vacina para a prevenção humana contra a infecção de HPV 16.
[0047] Além disso, a proteína HPV 16 L1 truncada usada na presente invenção é facilmente expressa em um sistema de expressão em E. coli e pode ser purificada de forma econômica sem o uso de enzimas caras. Ademais, como a proteína de interesse não é submetida aos procedimentos intensos de desnaturação e renaturação durante a purificação, o método pode ser aplicado industrialmente em grande escala devido à baixa perda.
[0048] Estes e outros aspectos da invenção serão mais evidentes após a consulta da seguinte descrição detalhada e os desenhos. Todas as referências públicas são incorporadas pelo presente através de referências completas.
[0049] A Fig. 1 mostra o resultado de SDS-PAGE da proteína HPV16N30C-L1 nos diferentes passos do Exemplo 2 de acordo com a invenção. M: Marcador de Peso Molecular; Rota 1: Suspensão de lisado; Rota 2: Precipitação seguida de diálise de dessanilização; Rota 3: precipitação após re-suspensão; Rota 4: a suspensão após a re-suspensão. O resultado mostra que a pureza da HPV1630C-L1 aumentou de por volta de 10% a por volta de 70% após os passos de precipitação e re-dissolução.
[0050] A Fig. 2 mostra o resultado de SDS-PAGE da HPV16N30C-L1 purificada por CIH (Cromatografia por Interação Hidrofóbica) no Exemplo 3. Rota 1: HPV16N30C-L1 antes de carregar a coluna de butil; Rotas 2 e 3: HPV16N30C-L1 passa através da coluna de butil; Rotas 4 e 5: HPV16N30C-L1 eluida com 1M NaCl; Rota 6: HPV16N30C-L1 eluida com 800mM NaCl; Rota 7: HPV16N30C-L1 eluida com 500mM NaCl. Após a purificação por coluna Hidrofóbica de Rápido Fluxo 4 Butyl Sepharose, a pureza da proteína HPV 16 L1 eluida com 800mM NaCl e 500mM NaCl atinge por volta de 98%.
[0051] A Fig. 3 mostra a fotografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das VLPs da HPV16N30C-V1 obtidas no Exemplo 4, tiradas em 100.000x de ampliação, bar representa 0,1μm. Foram observadas muitas VLPs em um raio de por volta de 25 nm no campo visual, onde o tamanho das partículas era consistente com o tamanho teórico e as partículas eram homogêneas.
[0052] A Fig. 4 mostra o resultado da medição por Difusão dinâmica da luz das VLPs da HPV16N30C obtidas no Exemplo 4. O resultado mostra que as VLPs da HPV16N30C-L1 tinham um raio hidrodinâmico de 25,86nm e uma taxa de reunião de partículas de 95,7%.
[0053] A Fig. 5: 5: mostra os títulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de cabra com VLPs de HPV16N30C-L1 obtidas no Exemplo 5. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O título de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente uma semana após a primeira vacinação e atingiu o nível máximo de 106-107após um reforço.
[0054] A Fig. 6 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes em soro a diferentes estágios após a inoculação de coelho com VLPs de HPV16N30C-L1 obtidas no Exemplo 5. Os momentos de vacinação são indicados com setas. O título de anticorpos neutralizantes aumentou rapidamente uma semana após a primeira vacinação e atingiu o nível máximo de 106após um reforço.
[0055] A Fig. 7 mostra os títulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O título de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.
[0056] A Fig. 8 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 16 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O título de anticorpo neutralizante aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.
[0057] A Fig. 9 mostra os títulos de anticorpo imunoglobulina G (IgG) total contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O título de anticorpo IgG total aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.
[0058] A Fig. 10 mostra os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV 18 em soro a diferentes momentos após a inoculação de macaco-resus com vacina bivalente de HPV16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 4 semanas. O título de anticorpo neutralizante aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 20.000 vezes do original.
[0059] A Fig. 11 mostra as mudanças de títulos de anticorpos neutralizantes HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 após a inoculação de rato com vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18 obtida no Exemplo 5. A vacina foi administrada em 0 e 2 semanas. O título de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 aumentou rapidamente após a primeira vacinação, atingindo 105-106 após um reforço.
[0068] A descrição é ilustrada melhor juntamente com os Exemplos, onde não se limita aos Exemplos.
[0069] O DNA extraído da secreção vaginal de pacientes com câncer cervical da Cidade de Xiamen na província Fujian foi usado como modelo. Os iniciadores "forward" eram 16H5521F: 5’-TAT AGT TCC AGG GTC TCC AC-3’ (N° ID SEQ:12) e os iniciadores "reverse" eram 16H7190R: 5’-ACA ACA AAC AAC ACT AAT TCA A-3’ (N° ID SEQ:13). A reação em cadeia da polimerase (PCR, em inglês) foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros: 94Cdesnaturação 5min
[0070] O produto de amplificação específica, por volta de 1.6kb de extensão, foi usado como modelo para produzir fragmentos de DNA da proteína HPV16 L1 truncada na invenção.
[0071] Os fragmentos de DNA (1.6kb) produzidos no passo anterior foram usados como modelo para a próxima reação em PCR. O iniciador "forward" era 16N30F: 5’-GGA TCC CAT ATG CTT CCT AGT GAG GCC ACT GTC-3’, no 5’ terminal no qual os sítios de restrição das endonucleases BamHI e NdeI foram introduzidos. A seqüência do sítio NedI era CAT ATG, onde ATG era o códon de iniciação no sistema de E. coli. O iniciador "reverse" era 16CR: 5’-CTC GAG TTA CAG CTT ACG TTT TTT GC-3’, no 5’ terminal no qual o sítio de restrição da endonuclease XhoI foi introduzido. A reação em PCR foi realizada em um termociclador Biometria T3 PCR com o uso dos seguintes parâmetros:
[0072] Os fragmentos de DNA, por volta de 1.5kb de extensão, foram obtidos após a amplificação. Os produtos de PCR foram ligados ao vetor pMD 18-T (Takara Biosciences). Após a digestão com BamHI / HindIII, identificou-se que as colônias positivas, onde o gene L1 truncado HPV16 foi inserido, foram obtidas, designadas como PMD 18-T-HPV16N30C-L1.
[0073] A seqüência de nucleotídeos de interesse, que foi inserida no plasmídeo pMD 18-T-HPV16N30C-L1, foi determinada como N° ID SEQ: 8 por Shanghai Boya Bio Co. através da utilização de iniciadores +/- M13. N° ID SEQ: 8 codifica a seqüência de aminoácidos disposta N° ID SEQ: 6, que corresponde a uma proteína HPV 16 L1 com 30 aminoácidos truncados em seu N-terminal e nenhum aminoácido truncado em seu C-terminal e foi designada como HPV16N30C-L1.
[0074] Os fragmentos do gene HPV16N30C-L1 truncado foram obtidos por digestão do plasmídeo pMD 18-T-HPV16N30C-L1 com BamHI / XhoI. Os fragmentos foram ligados ao vetor de expressão sem fusão PTO-T7 digerido com NdeI / XhoI (Xinwen et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16: 53-57). Após a digestão com NdeI / XhoI, foi identificado que as colônias de expressão positiva, onde gene da proteína L1 foi inserido, foram obtidos, designadas como PTO-T7-HPV16N30C-L1. 1μL de plasmídeo PTO-T7-HPV16N30C-L1 (0,15 mg / ml) foi usado para transformar 40μL de E. coli ER2566 adequado (New England Biolabs), preparado pelo método de Cloreto de cálcio e, em seguida, foi revestido em meio LB sólido contendo canamicina (a uma concentração final de 25mg/ml, o mesmo que abaixo). As placas foram incubadas a 37°C por cerca de 10-12h até que se pudessem ser observadas claramente colônias únicas. As colônias únicas foram transferidas para um tubo contendo 4ml de meio LB líquido contendo canamicina. As culturas foram incubadas em uma incubadora com agitação a 220rpm por 10h a 37°C e, em seguida, 1 ml de solução bacteriana foi liofilizada e armazenada a -70°C.
[0075] E. coli transformada com PTO-T7-HPV16-L1 foi tirada da estirpe liofilizada a -70°C e diluída com um pouco de água estéril e, em seguida, incubada em 50ml de meio LB contendo canamicina a 200 rpm e 37°C por 8h. Em seguida, as culturas foram transferidas para dez frascos (5 ml de cultura por frasco), cada um contendo 500mL de meio LB, e foram incubadas em uma incubadora com agitação durante a noite a 200rpm e 30°C. As culturas eram as culturas iniciais.
[0076] Os componentes acima foram dissolvidos em 1L de água deionizada; a solução resultante foi ajustada a pH 7,2 por adição de NaOH, esterilizada a 121°C por 30 minutos e resfriada a 50°C.
[0077] Um fermentador de 50L feito pela Shanghai Baoxing Biological Ltd foi usado na incubação em grande escala. O eletrodo de pH foi calibrado. 30L de meio LB foi preparado e transferido para o fermentador, esterilizado "in situ" a 121°C por 30 minutos. O eletrodo de oxigênio dissolvido foi calibrado, onde o valor foi determinado como 0 antes da introdução de ar após a esterilização e como 100% antes da inoculação após a introdução de ar, agitando a 100rpm no início.
[0078] Preparação da alimentação: 20g de peptona e 10g de extrato de levedura foram dissolvidas em 100 ml de água deionizada para preparar uma mistura de peptona e extrato de levedura (30%) e 50g de glicose foram dissolvidas em 100 ml de água deionizada para preparar uma solução de glicose (50%). As duas misturas foram esterilizadas a 121°C por 20min.
[0079] No segundo dia, as culturas iniciais nos dez frascos (para um total de 5L) foram transferidas para o fermentador. A 37°C e pH 7.0, o O2 dissolvido foi mantido a > 40% através de regulação da taxa de agitação ou de fornecimento de ar manualmente.
[0080] Fluxo de alimentação: 50% de glicose e 30% de mistura de peptona e extrato de levedura foram misturados em uma proporção de 2:1 de massa.
[0081] As taxas de fluxo foram as seguintes: A velocidade de alimentação: 1h: 5% 2h: 10% 3h: 20% 4h: 40% 6h até o fim: 60%
[0082] Quando OD600nm atingiu cerca de 10.0, a temperatura da cultura foi reduzida a 25°C e 4g de IPTG foram adicionadas para iniciar a indução da cultura de 4h. A fermentação foi interrompida quando OD600nm atingiu cerca de 60. A cultura foi, então, centrifugada para obter estirpes-alvo que expressassem a proteína HPV16N30C-L1 (cerca de 3 kg).
[0083] Estirpes de 1g foram re-suspensos em 10ml de tampão de lise (20mM de tampão tris com pH 7.2, 300mM de NaCl). Estirpes foram interrompidas pela passagem através de um homogeneizador APV (Invensys Group) por cinco vezes a uma pressão de 600bar. O homogenato foi centrifugado a 30.000 g (13.500 rpm em rotor JA-14) por 15min. A suspensão foi submetida a SDS-PAGE em 10% de gel. Nesta fase, a HPV16N30C-L1 tinha uma pureza de cerca de 10%. A suspensão foi dialisada por um Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.) funcionando a uma pressão de 0.5psi, a uma taxa de fluxo de 500ml/min e a uma taxa de fluxo tangencial de 200ml/min, onde a retenção do peso molecular foi de 30kDa, o dialisato foi de 10mM de tampão de fosfato a pH 6.0, e o volume de diálise foi três vezes maior do que o volume da suspensão. Após a diálise completa, a mistura foi centrifugada a 12.000g (9500 rpm em rotor JA-10 (centrífuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20min e a precipitação foi coletada. A precipitação foi re-suspensa em 10mM de tampão de fosfato a pH 7.5 contendo 10mM de DTT e 300mM de NaCl, onde o volume do tampão foi 1/10 vezes maior do que o volume da suspensão. A mistura foi agitada por 30 min e centrifugada a 30.000g (13.500 rpm em rotor JA-14 (centrífuga de alta velocidade Beckman J25)) por 20 min. A suspensão passa através de uma membrana filtrante de 0.22μm. A amostra foi ainda submetida à cromatografia de troca catiônica. 30μL de 6x de tampão de carregamento foram adicionados a 150μL da suspensão filtrada e a solução resultante foi misturada. Depois de aquecer em banho-maria a 80C, por 10min, uma amostra de 10 uL foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120min. As bandas eletroforéticas foram tingidas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 1. Segundo a análise de SDS-PAGE, a proteína HPV16N30C-L1 foi purificada e enriquecida após as etapas de precipitação e re-dissolução, com a pureza aumentada de cerca de 10% para cerca de 70%. Exemplo 3: Purificação por Cromatografia de HPV16N30C-L1 Cromatografia de Troca Catiônica de HPV16N30C-L1
[0084] Equipamento: Sistema de cromatografia líquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a Amershan Pharmacia Co. original)
[0085] Me ios de cromatografia: SP Sepharose 4 Fluxo Rápido
[0086] Volume de Coluna: 5.5cmx20cm
[0087] Tampão: 20mM tampão de fosfato a pH 7.5, 10mM de DTT
[0088] 20mM tampão de fosfato a pH 7.5, 10mM de DTT, 2M de NaCl
[0089] Taxa de Fluxo: 25mL/min
[0090] Detector de Comprimento de Onda: 280nm
[0091] Amostra: a suspensão em 10mM de tampão de fosfato a pH 7.5, 10mM de DTT, 300mM de NaCl no Exemplo 2
[0092] Protocolo de eluição: eluir proteínas indesejadas com 400mm de NaCl, eluir a proteína de interesse com 500mM de NaCl, coletar 500mM de eluato de NaCl e, finalmente, recolher cerca de 1000mL de amostra de HPV16-L1 purificada.
[0093] Equipamento: Sistema de cromatografia líquida preparativa AKTA Explorer 100 (GE Healthcare, ou seja, a Amershan Pharmacia Co. original)
[0094] Meios de cromatografia: Butil Sepharose 4 Fluxo Rápido
[0095] Volume de Coluna: 5.5cmx20cm
[0096] Tampão: 10mM tampão de fosfato a pH 7.5, 10mM de DTT, 2M de NaCl
[0097] Tampão de Eluição: 10mM tampão de fosfato a pH 7.5, 10mM de DTT
[0098] Taxa de Fluxo: 20mL/min
[0099] Detector de Comprimento de Onda: 280nm
[00100] Amostra: o eluato de SP Sepharose 4 Fluxo Rápido
[00101] Protocolo de eluição: eluir proteínas indesejadas com 1M de NaCl, eluir a proteína de interesse com 800mM de NaCl e 500mM de NaCl.
[00102] O eluato foi coletado ao eluir com 800mM e 500mM de NaCl. Cerca de 1300 ml da amostra de HPV16N30C-L1 purificada L1 foram obtidos. 150μL de eluato coletado ao eluir com 800mM/500mM de NaCl foram adicionados a 30μL de 6x de tampão de carregamento e, em seguida, a solução resultante foi misturada. Depois de aquecer em banho-maria a 8 0°C por 10min, uma amostra de 10 uL foi submetida a SDS-PAGE em gel a 10% a 120V por 120min. As bandas eletroforéticas foram tingidas por azul brilhante Coomassie. O resultado foi mostrado na Fig. 2. A concentração da proteína de interesse foi de cerca de 0,5 mg/ml e a pureza foi maior do que 98% de acordo com SDS-PAGE.
[00103] Equipamento: Filtro de Fluxo Tangencial Centrasette 5 (Pall Co.), MW 30kDa de retenção.
[00104] Amostra: 1500ml de HPV16N30C-L1 obtida no Exemplo 3
[00105] Concentração da Amostra: A amostra foi concentrada a 800mL com taxa de fluxo tangencial do sistema a 50mL/min
[00106] Renaturação de Amostra: O tampão da amostra foi trocado com 10L de tampão de renaturação (50mM de PB a pH 6.0, 2mM de CaCl2, 2mM de MgCl2, 0,5M de NaCl, 0,003% de Tween-80) completamente. Ao executar o Filtro de Fluxo Tangencial, a pressão era de 0,5psi e a taxa de fluxo tangencial era de 10ml/min. Quando troca foi concluída, o tampão da amostra foi substituído por tampão de armazenamento (20L de PBS: 20mM de PB a pH 6.5, 0,5M de NaCl). O volume de troca foi de 20L. A pressão em execução foi de 0.5psi e a taxa de fluxo tangencial foi de 25mL/min. Quando o líquido de troca foi finalizado, a amostra foi assepticamente filtrada com um filtro Pall (0,20 μm). As VLPs de HPV16N30C-L1 foram obtidas. Exemplo 5: Determinação da Morfologia e Imunogenicidade das VLPs de HPV16N30C-L1 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de VLPs de HPV16N30C-L1
[00107] O equipamento foi um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL 100kV (100.000x de ampliação). As VLPs de HPV16N30C-L1 foram negativamente coradas com 2% de ácido fosfotúngstico a pH 7.0 e fixadas em uma grade de cobre. Os resultados foram mostrados na Fig. 3. Pôde-se ver que as VLPs obtidas no Exemplo 4 tinham um raio de cerca de 25nm e eram homogêneas e de forma oca.
[00108] Um instrumento de dispersão dinâmica de luz DynaPro MS/X (incluindo um controlador de temperatura) (US Protein Solutions Co.) foi utilizado para medições de dispersão de luz. O algoritmo de regulação foi utilizado nas medições. A amostra foi aquela obtida no Exemplo 4. A amostra foi passada através de uma membrana filtrante de 0.22μm antes da medição. Os resultados foram mostrados na Fig. 4. O resultado mostra que as VLPs de HPV16N30C-L1 tinham um raio Hidrodinâmico de 25.86nm.
[00109] O HPV dificilmente pode ser cultivado in vitro e o hospedeiro do HPV tinha forte especificidade. Assim, dificilmente o HPV pode ser propagado em outros hospedeiros que não sejam humanos. Ou seja, não existia um modelo animal adequado ao HPV. Portanto, a fim de avaliar a produtividade imunológica da vacina contra HPV rapidamente, houve a necessidade de estabelecer um modelo eficiente para neutralização em ensaios in vitro.
[00110] Modelo de Infecção In Vitro de Pseudo-vírion: De acordo com a característica de que a VLP de HPV pode acondicionar ácidos nucléicos não especificamente, o pseudo-vírion de HPV foi formado pela expressão da proteína L1 e L2 do HPV em células e pelo acondicionamento de DNA viral do episome ou introdução de plasmídeos repórteres de forma heterogênea. Os métodos incluem sistemas de expressão baseados em vírus recombinantes e cotransfecção de multi-plasmídeos (ver Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570-7).
[00111] A invenção utiliza cotransfecção de um sistema de multi-plasmídeos. Algumas melhorias foram feitas da seguinte maneira. Um método otimizado de transfecção de fosfato de cálcio foi estabelecido para a linhagem celular 293FT, com uma eficiência de transfecção de acima de 90%, o que facilita a produção em grande escala. O plasmídeo de expressão por códon otimizado resultante de proteína estrutural do HPV pode expressar o gene HPV L1 e L2 eficientemente em linhas de células de mamíferos, facilitando a montagem eficiente de pseudovíron.
[00112] P16L1h, p16L2h e pN31-EGFP (doado pelo Professor T. Schiller da NIH) contêm genes para HPV16L1, HPV16L2 e GFP, respectivamente. Estes plasmídeos foram purificados utilizando CsCl centrifugação em gradiente de densidade, conforme descrito em The Molecular Cloning Experiment Guide, (3aedição). O procedimento de purificação foi o seguinte: • Plasmídeos foram usados para transformar E. coli DH5α; • Colônias únicas foram transferidos para meio de cultura LB de 500mL e incubadas em um frasco de agitação a 37°C por 16h; • O meio de cultura foi centrifugado a 9.000g durante 5min e as manchas foram coletadas; • As seguintes substâncias foram adicionadas sucessivamente às bactérias em cada 1000mL de LB: 40mL de solução I (50mM glicose, 25mM de Tris-Cl a pH 8.0, 10mM de EDTA a pH 8.0) e 2ml de 1μg/μL de RNase A), 40mL de solução II (0.2M de NaOH, 1% de SDS), e 48ml de solução III (60mL de 5M de acetato de potássio , 11.5mL de ácido acético e 28.5mL de água deionizada); • Após colocar em gelo por 10min, a mistura foi centrifugada a 15.000g por 20min a 4°C; • A suspensão foi misturada com 0,6 de volume de álcool isopropílico, em seguida, foi novamente centrifugada a 15.000g por 30min a 4°C; • A suspensão foi decantada em resíduos e a precipitação foi lavada com 70% de etanol; • A precipitação foi dissolvida em TE e o teor de DNA foi determinado; • CsCl foi dissolvido na solução de DNA (1g de DNA por 1.01g de CsCl) e, em seguida, 100μL de 10mg/mL de solução EB também foi dissolvido em DNA; • A mistura foi centrifugada, usando uma centrífuga Beckman NVT65, a 62.000g por 10hr a 20°C; • A seção do DNA de círculo fechado foi obtida com o uso de um injetor cabeça de alfinete; • EB foi extraído com volume equivalente de álcool isoamílico repetidamente por quatro vezes; • Três volumes de água deionizada e oito volumes de etanol seco foram adicionados a um volume de solução de DNA e, em seguida, a mistura foi centrifugada a 20000G por 30min a 4°C; • A precipitação foi coletada e lavada com 75% de etanol e, em seguida, dissolvida em 1mL de TE; • A concentração da solução de DNA foi determinada, em seguida, a solução foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.
[00113] P16L1h, p16L2h e células 293FT co-transfectadas pN31-EGFP (Invitrogen) purificados cultivados em uma placa de cultura de células de 10cm pelo método de fosfato de cálcio. O método de fosfato de cálcio foi descrito da seguinte forma. 40μg de p16L1h, 40μg de p16L2h e 40μg de pN31-EGFP foram adicionados separadamente à mistura de 1ml de solução HEPES (125μL de 1M de HEPES/50mL de água deionizada, a pH 7.3 e 4°C;) e 1mL de solução de 0,5 M de CaCl2. Depois de misturar, 2mL de 2X da solução HeBS (0.28M de NaCl (16.36g), 0,05M de HEPES (11,9 g), 1.5mm de Na2HPO4 (0.213g), dissolvidos em 1000mL de água deionizada, a pH 6.96 e -70°C;), foram adicionados gota a gota. Após ficar em temperatura ambiente por 1 min, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 10cm, onde as células 293FT foram cultivadas. O meio de cultura original foi substituído por 10 ml de meio completo (Invitrogen Co.) 6 horas mais tarde. 48 horas após a transfecção, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram coletadas e contadas. Cada 108de células foram suspensos em 1mL de solução citolítica (0,25% de Brij58, 9.5mm de MgCl2). Após a lise, o lisado celular foi centrifugado a 5.000g por 10min e a suspensão foi coletada. A solução pseudo-vírion foi obtida após a adição de 5M de NaCl à suspensão a uma concentração final de 850mM, em seguida, foi armazenada em pequenas embalagens a -20°C.
[00114] As células 293FT (Invitrogen) foram espalhadas em uma placa de cultura de células de 96 compartimentos (1.5X104células/compartimento). A análise de neutralização foi realizada cinco horas mais tarde. As amostras de soro foram diluídas em série com 10% de DMEM metade a metade. Amostras diluídas de 50μL foram separadamente misturadas com 50μL de soluções de pseudo-vírus diluídas com 10% de DMEM (moi = 0.1). Após incubação a 4°C por 1h, a mistura foi adicionada à placa de cultura de células de 96 compartimentos espalhadas com células 293FT. A mistura foi então incubada por 72h a 37°C. Títulos de neutralização das amostras foram avaliados pela observação de fluorescência. O percentual de infecção de células em cada compartimento foi verificado por citometria de fluxo (EPICS XL, American Beckman Coulter Co.). Os títulos exatos de anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais foram calculados. O percentual de infecção foi a porcentagem de células na região positiva menos a células não infectadas na região positiva.
[00115] A porcentagem de controle de infecção é =(1 - porcentagem de infecção da célula de amostra / percentual de infecção de células negativas) X 100%
[00116] O título de neutralização foi definido como o múltiplo de diluição mais elevado através do qual a porcentagem de controle de infecção era um pouco acima de 50%. Anticorpos monoclonais e policlonais foram considerados como tendo capacidade de neutralização se a sua porcentagem de controle de infecção estivessem acima de 50% após diluições por 50 vezes.
[00117] Análise de 50% da Dose Eficaz (ED50) em Camundongo: As VLPs de HPV16N30C-L1 produzidas no Exemplo 4 foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de alumínio e, em seguida, foram diluídas com diluentes da vacina a quatro diferentes concentrações, na proporção de 1:3 (ou seja, 0.1μg/mL, 0.033μg/mL, 0.011 μg/mL e 0.004μg/mL). Em cada grupo experimental, dez camundongos BALB/c foram inoculados com 1ml da vacina acima por injeção intraperitoneal. O soro foi coletado na quarta e na quinta semana após a injeção e os anticorpos neutralizantes de HPV foram avaliados pelas análises de neutralização de pseudo-víron pela EIA. Após a última coleta de soro, os camundongos foram sacrificados. O grupo de controle inclui dez camundongos BALB/c.
[00118] Val or de corte para EIA foi o valor negativo médio mais 0.16 (se o valor negativo médio estivesse abaixo do que 0.05, 0.05 foi usado no cálculo). Antes da inoculação, todos os camundongos BALB/c tiveram resultado negativo nas análises de anticorpos neutralizantes de HPV, os resultados foram apresentados na Tabela 1.
[00120] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV16N30C-L1 tinham um ED50 de 0.019μg na quarta semana e 0.011μg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de 0.1μg.
[00121] Os resultados da análise de neutralização de pseudo-víron só pode ser aceita quando mais de 20% das células do grupo de controle negativo e nenhuma das células do grupo de controle positivo produziu fluorescência. Foi considerado como resultado positivo quando menos de 50% das células no grupo de controle negativo produziu fluorescência. Os resultados foram apresentados na Tabela 2.
[00122] Tabela 2: Resultado ED50 de VLPs de HPV16N30C-L1 VLP em camundongos Balb/c em Análise de Neutralização de Pseudo-víron
[00123] ED50 foi calculado de acordo com o método de Reed-Muench. Após a inoculação, foi coletado sangue para detectar ED50 na quarta e na quinta semana. As VLPs de HPV16N30C-L1 tinham um ED50 de 0.019μg na quarta semana e O.Ollμg na quinta semana. Portanto, a imunização nestas doses pode induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes. A eficácia dessas doses foi muito menor do que a de 0.1μg.
[00124] Coelhas (nível geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPVl6N3OC-Ll, preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPVl6N3OC-Ll foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As coelhas foram imunizadas através de injeção muscular, com 100μg por coelha para a primeira imunização, e separadamente com 50μg por coelha para o reforço na semana 4, lO. Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado a cada semana e o soro foi separado e armazenado para detecção.
[00125] Cabras (nível geral) com 6-8 semanas de idade foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção à Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. As VLPs de HPV16N30C-L1, preparadas no Exemplo 4, foram misturadas com quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização. Para o reforço, as VLPs de HPV16N30C-L1 foram misturadas com adjuvante de Freund incompleto. As cabras foram imunizadas através de injeção muscular, com 1mg por cabra para a primeira imunização, e com 0.5 mg por cabra para o reforço separadamente nas semanas 4, 10 e 18. Após a imunização, o sangue foi coletado da veia externa e o soro foi separado e armazenado para detecção.
[00126] Os títulos de neutralização dos anti-soros foram avaliados usando uma análise de modelo de célula de neutralização a base de pseudo-víron. Como mostrado na Fig. 5 e 6, a vacina produzida a partir de VLPs de HPV16N30C-L1 preparadas no Exemplo 4 teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com título elevado de animais e poderia ser usada como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV.
[00127] As fêmeas de macacos rhesus (nível geral), 2 anos, foram adquiridas do Centro de Controle e Prevenção a Doenças da província de Guangxi, onde foram criadas. A HPV16N30C-L1 preparada no Exemplo 4 foi adsorvida em adjuvantes de hidróxido de alumínio e VLPs de HPV18N65C-L1 preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4 também foram adsorvidas em adjuvantes de hidróxido de alumínio. Em seguida, as duas foram misturados na proporção de 2:1 de peso para produzir uma vacina bivalente de HPV16/18. Cada dose (0,5 ml) continha 40μg de VLPs de HPV16N30C-L1, 20μg de VLPs de HPV18N65C-L1 e 0,6 mg de hidróxido de alumínio. Foi administrado separadamente aos macacos Rhesus 5μg, 10μg e 20μg de HPV 16 por injeção no deltóide do membro superior (em triplicata). Todos os animais candidatos mostraram que os anticorpos IgG totais e os anticorpos neutralizantes contra HPV 16 eram negativos antes da vacinação. A vacina foi administrada a 0 e 4 semanas. Os animais foram criados durante 9 semanas e o sangue foi coletado toda semana. As amostras de sangue foram armazenadas a 37°C por 1.5h e, em seguida, centrifugadas a 10.000rpm por 5min. O soro foi coletado para dosagem de títulos de anticorpos IgG totais e de anticorpos neutralizantes contra HPV16 e HPV18. Métodos de análise semelhantes foram usados para os dois tipos de anticorpos.
[00128] Como mostrado na Fig. 7 e Fig. 8, as VLPs de HPV16N30C-L1 de acordo com a invenção puderam induzir altos títulos de IgG total e anticorpos neutralizantes, superior a 20.000 na 9asemana após a primeira imunização. As VLPs de HPV16N30C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV16. Além disso, as VLPs de HPV18N65C-L1 da Vacina Bivalente pôde induzir altos títulos de IgG total e anticorpos neutralizantes contra o HPV18, superior a 20.000 na 9asemana após a primeira imunização, como mostrado na Fig. 9 e Fig. 10. Foi mostrado que as VLPs de HPV18N65C-L1 tiveram boa imunogenicidade e poderiam, também, ser usadas como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção pelo HPV18.
[00130] Quatro camundongos SPF BALB/c de 4-5 semanas de idade foram utilizados. As VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1 e HPV18N65C-L1, preparadas de acordo com o método semelhante ao do Exemplo 4, foram misturadas na proporção de 1:2:2:1 (por peso), onde a concentração final deles foi 40μg/mL, 80μg/mL, 80μg/mL e 40μg/mL, respectivamente. A vacina foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund completo para a primeira imunização e foi misturada a uma quantidade igual de adjuvante de Freund incompleto para o reforço.
[00131] Os camundongos foram imunizados por injeção muscular. A quantidade para a primeira imunização foi de 10μg de HPV6N5C-L1, 10μg de HPV18N65C-L1, 20μg de HPV11N4C-L1, e 20μg de HPV16N30C-L1 por camundongo. O reforço foi administrado a cada duas semanas. A quantidade para o reforço foi de 20μg de HPV6N5C-L1, 20μg de HPV18N65C-L1, 40μg de HPV11N4C-L1, e 40μg de HPV16N30C-L1 por camundongo.
[00132] Após a imunização, o sangue da veia externa foi coletado semanalmente e o soro foi separado. Os títulos de anticorpos neutralizantes contra HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18 em camundongos imunizados foram separadamente determinados de acordo com o método do Exemplo 5.
[00133] Os resultados foram mostrados na Fig. 11, indicando que a vacina quadrivalente de HPV6/11/16/18, preparada pela combinação de VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 preparadas nos Exemplos 1-4, teve boa imunogenicidade, puderam induzir anticorpos neutralizantes com título elevado contra HPV 6, HPV 11, HPV 16 e HPV 18 em animais, e poderia ser usada como uma vacina eficaz para a prevenção da infecção por HPV6/HPV11/HPV16/HPV18 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, a vacina poderia ser preparada combinando as quatro VLPs de HPV6N5C-L1, HPV11N4C-L1, HPV16N30C-L1 e HPV18N65C-L1 com adjuvantes de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório).
[00134] A Sequência de Aminoácidos de HPV6N5C-L1 é mostrada no N° ID SEQ 10.
A Sequência de Aminoácidos de HPV11N4C-L1 é mostrada no N°
[00136] A seqüência de aminoácidos de HPV18N65C-L1 é mostrada no N° ID SEQ. 9.
[00137] Os resultados experimentais mostram que a vacina que foi formada VLPs de HPV16N30C-L1 preparadas no Exemplo 4 (além de adjuvantes de Freund utilizados nos experimentos, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio adjuvantes disponíveis comercialmente ou preparados em laboratório também poderiam ser usados), teve boa imunogenicidade, pôde induzir anticorpos neutralizantes com título elevado de animais e poderia ser uma vacina eficaz útil para a prevenção da infecção pelo HPV.
[00138] As proteínas HPV16L1 dispostas nos N°s ID SEQ: 1, 2, 3, 4, 5 e 7 foram preparadas de acordo com as técnicas usadas nos exemplos 1-5. Todas estas proteínas truncadas podem ser montadas em VLPs.
Claims (17)
1. Uma proteína HPV16 L1 com 30 ou 40 aminoácidos truncada em seu N-terminal caracterizada por a proteína HPV16 L1 ter a sequência estabelecida em SEQ ID Nos: 6 ou 7.
2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ter a seqüência estabelecida no SEQ ID NO: 6.
3. Um polinucleótido caracterizador por ter a sequência apresentada na SEQ ID No. 8, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam a proteína da SEQ ID No. 6.
4. Um vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo conforme a reivindicação 3.
5. Uma célula hospedeira procariótica caracterizada por compreender o vetor conforme a reivindicação 4.
6. Uma composição caracterizada por compreender a proteína conforme a reivindicação 1 ou 2.
7. Uma partícula tipo vírus (VLP) HPV16 caracterizada por compreender ou consistindo da proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
8. Um método para a produção da proteína HPV L1 caracterizado por compreender: a) expressar um gene HPV L1 codificando a proteína HPV L1 em um sistema de expressão em E. coli; b) separar o E. coli, que expressou a proteína HPV L1, em uma solução com uma concentração de sal de 100mM a 600mM, e isolar a suspensão; c) diminuir a concentração de sal da suspensão de b) de 100 mM para 0 usando água ou uma solução pouco salina, e coletar o precipitado; d) re-dissolver a precipitação de c) em uma solução a uma concentração de sal de 150mM a 2500mM, com adição de um redutor a ela, e, em seguida, isolar a solução resultante, onde a solução contém a proteína HPV L1 com pureza a, pelo menos, 50%.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína HPV L1 é a proteína HPV16 L1 de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2.
10. Uma vacina para a prevenção de câncer cervical, caracterizada por compreender: (1) HPV16 VLP de acordo com a reivindicação 7, (2) opcionalmente, pelo menos um HPV VLP selecionados do grupo que consiste de VLPs de tipos de HPV 6, 11, 18, 31, 33, 45, 52 e 58, e (3) carreadores ou excipientes para as vacinas.
11. Vacina de acordo com a reivindicação 10 caracterizada por a vacina compreender HPV16 VLP e HPV18 VLP.
12. Vacina de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por o HPV 16 VLP compreender uma proteína que tem a sequência de aminoácidos definida no SEQ ID No: 6, e o HPV 18 VLP compreender uma proteína que tem a sequência de aminoácidos definida no SEQ ID No: 9.
13. Vacina de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por a vacina também compreender HPV 6 VLP e HPV 11 VLP.
14. Vacina de acordo com a reivindicação 13 caracterizada por compreender uma proteína que tem a sequência de aminoácidos definida no SEQ ID No: 10, e o HPV 11 VLP compreender uma proteína que tem a sequência de aminoácidos definida no SEQ ID No: 11.
15. Us o da proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou do VLP de acordo com a reivindicação 7 caracterizada por ser usada na fabricação de uma vacina para a prevenção de câncer cervical.
16. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o método ser usado para a obtenção do VLP da proteína HPV 16 L1, e ainda compreender: e) purificação adicional da proteína HPV 16 L1 da reivindicação 1 ou 2 com uma pureza de, pelo menos, 50% tal como obtido na etapa d) através de cromatografia; f) remoção do redutor da proteína HPV 16 L1 obtida em e).
17. Um método para a produção de uma vacina para a prevenção de câncer cervical caracterizado por compreender a combinação da VLP conforme a reivindicação 7, e, opcionalmente, com uma ou mais VLPs selecionadas do grupo que consiste de VLPs de tipos de HPV 6, 11, 18, 31, 33, 45, 52 e 58, com carreadores ou excipientes para as vacinas.
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