CN101153280B - 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 - Google Patents
从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101153280B CN101153280B CN200610140613.0A CN200610140613A CN101153280B CN 101153280 B CN101153280 B CN 101153280B CN 200610140613 A CN200610140613 A CN 200610140613A CN 101153280 B CN101153280 B CN 101153280B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- papilloma virus
- concentration
- salt
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种从大肠杆菌中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白L1的方法。该方法通过对大肠杆菌菌体裂解上清中的L1蛋白进行无盐沉淀、复溶、离子交换层析、疏水层析和复性可以大规模制备电泳纯度达到98%以上的类病毒颗粒。该类病毒颗粒具有良好的免疫原性,能诱导针对同型HPV病毒的中和抗体,可作为预防HPV感染的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及利用原核生物(特别是大肠杆菌)表达系统表达、纯化人乳头瘤病毒L1蛋白,并获得类病毒颗粒的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒HPV(Human Pa pillomavirus)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属,为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA,大小约为7.2~8kb,具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域:①早期区(E),约4.5kb,编码E1、E2、E4~E76个与病毒复制,转录及转化有关的非结构蛋白;②晚期区(L),约2.5kb,编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2;③长调控区(LCR),位于L区末端与E区起始端之间,长约800~900bp,不编码任何蛋白,含DNA复制、表达调控元件。病毒颗粒直径为45~55nm,核衣壳呈20面体对称,有72个壳微粒,由L1及L2组成。
目前已知的HPV约有90多种亚型,在人群中主要引起皮肤,粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系又可分为3组:①低或无致癌风险组,包括HPV6、11、39、41、42、43;②中度致癌风险组,包括HPV31、33、35、51、52;③高度癌风险组,包括HPV16、18、45、56。其中HPV16、18与妇女宫颈癌的关系尤为显著,约有59%的宫颈癌患者HPV-16DNA阳性,12%患者为HPV-18DNA阳性。(Thoma s,D.B.,R.M.Ray,e tal.(2002).Cancer Causes Cont ro l13(7):683-90.)
HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白,分子量为55~60kDa,是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LikeParticle,VLP),且它保留了病毒颗粒的天然表位,具有较强的免疫原性,可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。(Kirnbauer,R.,F.Booy,et al.(1992).Proc Natl Acad Sci U S A89(24):12180-4.)因此,VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。
HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。
常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。痘病毒表达系统最早被用来制备HPV VLP,(Zhou,J.,X.Y.Sun,et al.(1991).Virology185(1):251-7.)。此后,相继有使用昆虫细胞表达系统及酵母表达系统制备VLP的报道(Hofmann,K.J.,J.C.Cook,et al.(1995).Virology209(2):506-18.)在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少,能自发的形成VLP,往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP,为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低,培养成本高,给大规模工业化生产带来了极大困难。
原核表达系统中大肠杆菌表达系统应用最为广泛。早在1987年,就有利用大肠杆菌表达HPV L1蛋白的报道(Banks,L.,G.Matlashewski,et al.(1987).J Gen Viro l68(Pt12):3081-9)。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象,主要以包含体形式存在。虽然通过包含体纯化,复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall,S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol Method s53(1):75-90),但是在复性过程中蛋白损失量大,得率低,难以在大规模生产上应用。HPV L1蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达,溶解于菌体的裂解上清中,但是表达量较低,而且上清中杂蛋白种类多且量大,要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量,而且有助目的蛋白的纯化(Li,M.,T.P.Cripe,et al.(1997).J Viro l71(4):2988-95.),但融和蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶,依然无法应用于大规模生产。
因此,本领域仍然需要改进生产病毒蛋白质(特别是HPV L1蛋白)的方法、纯化病毒蛋白(特别是HPV L1蛋白)的方法。
发明内容
本发明涉及如下编号的段落中所述的内容:
1.一种纯化乳头瘤病毒(特别是人类乳头瘤病毒)L1蛋白质的方法,该方法包括如下步骤:
(a)获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞,例如大肠杆菌细胞;这可以通过例如将表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞培养物离心、收集细胞而实现;
(b)将所述原核宿主细胞在重悬溶液中重悬,所述重悬溶液含有足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐,优选还含有缓冲液,例如Tris缓冲液(例如20mM Tris缓冲液pH7.2);
(c)破碎所述原核宿主细胞;优选通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现;
(d)除去不溶性部分,获得菌体裂解上清;优选通过如下方式实施:离心(例如以足以沉降细菌细胞碎片的离心力进行离心)裂解物,留取上清液;
(e)将菌体裂解上清中盐的浓度降低到所述乳头瘤病毒L1蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度;和
(f)非必需地收获沉淀,例如通过离心来实现。
2.段落1的方法,其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是人类乳头瘤病毒L1蛋白,特别是有利于在原核宿主细胞中以可溶性蛋白质形式表达的L1蛋白质变体,例如截短的L1蛋白质,例如N端和/或C端被截短的L1蛋白质,例如N端被截短不多于81个氨基酸和/或C端被截短不超过30个氨基酸的HPV16亚型的L1蛋白质变体,例如SEQ ID NO:6所示的多肽。
3.段落1-2任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含的盐是中性盐,特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐中的一种或者几种,特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4;优选地,步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度,例如使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的大约至少60%、优选至少80%、最优选至少90%保持溶解的浓度,例如可以是大约80mM-2500mM,优选100mM-2000mM,更优选200mM-2000mM,例如200-600mM,更优选300-500mM,例如300-400mM。
4.段落1-3任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是100mM-2000mM,200mM-1000mM,优选300-500mM,更优选300-400mM,特别是大约300mM NaCl。
5.段落1-4任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液是20mM Tris缓冲液pH7.2,300mM NaCl。
6.段落1-5任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质大约至少40%、优选至少60%、最优选至少80%被沉淀,而其它无关蛋白质基本上(例如大约至少40%、优选至少70%、最优选至少80%)不被沉淀;优选地,步骤(e)中所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少50%、至少60%、优选至少70%;优选地,步骤(e)中所述选择性沉淀步骤的乳头瘤病毒L1蛋白质的产率(沉淀后乳头瘤病毒L1蛋白质/沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质)为优选至少70%、至少80%、甚至至少90%。
7.段落1-6任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少50%、至少80%、例如至少90%;例如将所述盐浓度降低到低于150mM、低于100mM、低于50mM、或者不可检测。
8.段落1-7任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐浓度降低通过透析、溶液交换(例如采用切向流装置)或稀释来实现,例如采用不含重悬溶液中所述盐的缓冲液透析。
9.段落1-8任一项的方法,还包括步骤(g):采用复溶溶液复溶步骤(f)中获得的沉淀,使得目的乳头瘤病毒L1蛋白质溶解;例如,用含有适当盐(特别是中性盐)的复溶溶液复溶所述沉淀。
10.段落9的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含的盐是中性盐,特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐,特别是NaCl;优选地,步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度,例如使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的大约至少至少70%、优选或者80%、最优选至少90%保持溶解的浓度,例如大约200mM-2M,优选300-500mM,更优选300-400mM,特别是大约300mM、350mM、400mM。
11.段落9-10任一项的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是150mM-3M NaC l,优选200mM-2M,优选300-500mM,更优选300-400mM,特别是大约300mM、350mM、400mM NaCl。
12.段落9-11任一项的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液还含有适当的缓冲液,例如磷酸缓冲液,Tris缓冲液;优选地,步骤(g)中所述复溶溶液还含有适当的还原剂,例如DTT或巯基乙醇;例如,步骤(g)中所述复溶溶液是10mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,0.3MNaCl。
13.段落1-12任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白在总蛋白的含量提高到至少60%、优选至少70%、更优选至少80%;优选地,目的蛋白的损失率低于20%,优选低于10%,更优选低于5%。
14.段落1-13任一项的方法,还包括进一步纯化步骤(e)、(f)或者(g)的产物;优选地,所述进一步纯化通过采用一种或者多种纯化方法来进行,所述纯化方法选自:离心、微孔滤膜过滤、超滤、透析、沉淀、离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法;优选地,所述进一步纯化包括阳离子交换层析和疏水相互作用色谱。
15.一种生产乳头瘤病毒类病毒颗粒的方法,包括:采用段落1-14任一项的方法纯化能组装成类病毒颗粒的乳头瘤病毒L1蛋白质;将该乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒。
16.段落15的方法,其中所述将乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒包括:加入足量还原剂(例如加入DTT至终浓度10-200mM,例如30-100mM,例如50mM),充分打开目的蛋白之间二硫键,使得病毒颗粒充分解聚,而后逐步去除还原剂(例如通过透析、溶液交换和稀释,特别是切向流溶液交换法),使得目的蛋白组装为类病毒颗粒(VLP)。
17.一种制备抗病毒疫苗的方法,包括:采用段落1-14任一项的方法纯化乳头瘤病毒L1蛋白质,将乳头瘤病毒L1蛋白质和适当的佐剂(特别是氢氧化铝佐剂)一起配制成疫苗。
18.一种制备抗病毒疫苗的方法,包括:采用段落15-16任一项的方法制备类病毒颗粒,将类病毒颗粒和适当的佐剂(特别是氢氧化铝佐剂)一起配制成疫苗。
19.可通过段落1-14任一项的方法制备的HPV L1蛋白质制品;可通过段落15-16任一项的方法制备的HPV类病毒颗粒制品;可通过段落17或者18的方法制备的HPV病毒疫苗制品。
20.用于破碎表达目的乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞的介质液,其包含足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐;优选地,其是段落1-5任一项中定义的重悬溶液。
在参考下列详述和附图后,本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
附图说明
图1显示了在裂解液含有不同浓度NaCl时沉淀的目的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M,分子量Marker;1,裂解液I(100mMNaCl)沉淀;2,裂解液II(200mM NaCl)沉淀;3,裂解液III(600mMNaCl)沉淀;4,裂解液IV(2M NaCl)沉淀;5,裂解液V(300mM NaCl)沉淀;6,裂解液VI(500mM NaCl)沉淀。结果显示,当裂解液中的NaCl浓度在100mM-2M之间时,目的蛋白均能被特异性沉淀,但是当NaCl浓度在300mM-500mM之间时沉淀目的蛋白的效果最佳。
图2显示了在透析液含有不同浓度NaCl时沉淀的目的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M,分子量Marker;1,透析液I沉淀;2,透析液II沉淀;3,透析液III沉淀;4,透析液IV沉淀;5,透析液V沉淀。结果显示,透析缓冲液中的NaCl浓度在0-150mM之间时,目的蛋白均能被较好的选择性沉淀。但是当NaCl浓度提高到200mM时,沉淀量明显减少。
图3显示了在复溶液含有不同浓度NaCl时复溶的目的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M,分子量Marker;1,复溶液I复溶上清;2,复溶液II复溶上清;3,复溶液III复溶上清;4,复溶液IV复溶上清;5,复溶液V复溶上清;6,无盐沉淀产物。结果显示,当复溶液中盐浓度在200mM-2M之间时均能取得较好的溶解效果。
图4显示了复溶液中含还原剂与不含还原剂时复溶目的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M,分子量Marker;1,无盐沉淀产物;2,20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,300mM NaC l复溶上清;3,20mM磷酸缓冲液pH7.5,300mM NaC l复溶上清。结果显示,即使在没有还原剂存在的条件下,只要复溶液中的盐浓度适宜,目的蛋白均能被重溶。
图5显示了粗纯过程中不同阶段样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M:分子量Marker;1:破菌上清;2:无盐沉淀产物;3:重悬后沉淀;4:重悬后上清。结果显示,HPV16L1蛋白在通过沉淀,复溶的步骤之后,纯度从之前的10%左右提高到了70%左右。
图6显示了HPV-16L1多肽的阳离子交换色谱纯化的洗脱流程图。在400mM NaCl,500mM NaCl洗脱梯度均有大量蛋白洗脱。
图7显示了阳离子交换色谱纯化各阶段样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1:SP柱上柱前,2:SP柱穿透,3,4:400mM NaCl洗脱,5-7:500mM NaCl洗脱。经过SP Sepharose4Fast Flow阳离子柱纯化,杂蛋白在400mM NaCl洗脱梯度被洗脱。目的蛋白主要在500mMNaCl洗脱,洗脱的HPV16L1蛋白纯度达到90%以上。
图8显示了HPV16L1疏水相互作用色谱柱过柱模式图。在1mol/LNaCl,800mM与500mM NaCl浓度洗脱梯度均由大量蛋白被洗脱。
图9显示了HPV-16L1多肽的HIC(疏水相互作用色谱)纯化各阶段样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1:Butyl柱上柱前;2,3:Butyl柱穿透;4,5:1M NaCl洗脱;6,800mM NaCl洗脱;7,500mM NaCl。经过Butyl Sepharose4Fast Flow疏水柱纯化,800mM NaCl洗脱500mM NaC l洗脱的HPV16L1蛋白纯度达到98%以上。
图10显示了HPV16VLP透射电镜观察(50,000倍)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒,颗粒大小与理论大小相符,均匀一致。
图11显示了HPV16VLP的动态光散射观测结果。结果显示,HPV16VLP的水化分子动力学半径为25.86nm,颗粒组装百分比为95.7%。
图12显示了HPV16VLP接种羊后不同阶段血清中和抗体滴度。在初免一周后,中和抗体滴度即有明显上升,在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到106-107的较高水平。
图13显示了HPV16VLP接种兔后不同阶段血清中和抗体滴度。在初免一周后,中和抗体滴度即有明显上升,在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。
图14显示按实施例2-7所述方法所制备的HPV18VLP样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M,分子量标记;1,HPV18VLP上样5μl样品;2,HPV18VLP上样25μl样品。结果显示,所获得HPV18VLP纯度达到98%以上。
图15显示了HPV18VLP透射电镜观察(100,000倍)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒,颗粒大小与理论大小相符,均匀一致。
图16显示了HPV18VLP的动态光散射观测结果。结果显示,HPV18VLP的水化分子动力学半径为29.38nm,颗粒组装百分比为100%。
图17显示了HPV18VLP接种羊后不同阶段血清中和抗体滴度。在初免一周后,中和抗体滴度即有明显上升,在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到105-107的较高水平。
图18显示了HPV18VLP接种兔后不同阶段血清中和抗体滴度。在初免一周后,中和抗体滴度即有明显上升,在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。
图19显示按实施例2-7所述方法所制备的HPV16VLP样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1,HPV-6VLP上样10μl样品;2,HPV-6VLP上样20μl样品。结果显示,所获得HPV6VLP纯度达到98%以上。
图20显示了HPV6VLP透射电镜观察(50,000倍)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒,颗粒大小与理论大小相符,均匀一致。
图21显示了HPV6VLP的动态光散射观测结果。结果显示,HPV6VLP的水化分子动力学半径为25.46nm,颗粒组装百分比为100%。
图22显示了按实施例2-7所述方法所制备的HPV11VLP样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1,HPV-11VLP上样10μl;2,HPV-11VLP上样20μl。结果显示,所获得HPV11VLP纯度达到98%以上。
图23显示了HPV11VLP透射电镜观察(100,000倍)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒,颗粒大小与理论大小相符,均匀一致。
图24显示了HPV11VLP的动态光散射观测结果。结果显示,HPV11VLP的水化分子动力学半径为22.82nm,颗粒组装百分比为82%。
具体实施方式
一般性地,本发明提供了纯化病毒蛋白质的方法,该方法包括如下步骤:
(a)获得表达有所述病毒蛋白质的原核宿主细胞;
(b)将所述原核宿主细胞在重悬溶液中重悬,所述重悬溶液含有足以溶解所述病毒蛋白质的浓度的盐;
(c)破碎所述原核宿主细胞;
(d)除去不溶性部分,获得菌体裂解上清;
(e)将菌体裂解上清中所述盐的浓度降低到所述病毒蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度;和
(f)非必需地收获沉淀。
所述病毒可以选自乳头瘤病毒,特别是人乳头瘤病毒(HPV)、戊型肝炎病毒(HEV)或乙型肝炎病毒(HBV)。所述病毒蛋白质特别是病毒衣壳蛋白,或者免疫原性蛋白质,例如乳头瘤病毒L1蛋白。特别是人类乳头瘤病毒L1蛋白。
在一个实施方案中,本发明提供了一种从重组乳头瘤病毒L1蛋白质的原核细胞中纯化乳头瘤病毒L1蛋白质的方法,该方法包括如下步骤:
(a)获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞;
(b)将所述原核宿主细胞在重悬溶液中重悬,所述重悬溶液含有足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐;
(c)破碎所述原核宿主细胞;
(d)除去不溶性部分,获得菌体裂解上清;
(e)将菌体裂解上清中所述盐的浓度降低到所述乳头瘤病毒L1蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度;和
(f)非必需地收获沉淀。
本发明方法特别适合于大规模纯化目的蛋白质。
(a)获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞
在本发明方法中,表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞通常是重组细胞,一般是包含编码乳头瘤病毒L1蛋白质的外源核酸分子的细胞。构建这类重组细胞的方法是本领域已知的。例如可以采用核酸重组技术构建适于在原核细胞中表达目的蛋白的表达载体,然后转化宿主细胞。
在本发明的方法中,所述乳头瘤病毒L1蛋白优选是人类乳头瘤病毒L1蛋白,特别是有利于在原核宿主细胞中以可溶性蛋白质形式表达的L1蛋白质变体。
人乳头瘤病毒L1蛋白可以是任何人乳头瘤病毒亚型的蛋白质L1蛋白。优选是HPV16、18、6、11亚型的L1蛋白。
在本发明中,“人类乳头瘤病毒L1蛋白”是指天然或者修饰的人类乳头瘤病毒L1蛋白。优选地,本发明的L1蛋白能够装配成具有免疫原性的类病毒颗粒(VLP),该类病毒颗粒可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。修饰的人类乳头瘤病毒L1蛋白包括与天然蛋白相比具有一或多个(例如1-50个,1-30个,1-20个,1-10个)氨基酸的替代、添加、缺失和/或插入的蛋白质。所述修饰可以是保守的或者不保守的。优选地,所述修饰蛋白质的免疫原性相对于天然蛋白不减少,优选增加。一般可以按本文所述方法或者现有技术已知的方法评价对该蛋白的免疫原性的影响。
在一个优选实施方案中,本发明蛋白质是与天然蛋白质相比截短的L1蛋白质,例如N端和/或C端被截短的L1蛋白质。例如N端被截短不多于81个氨基酸和/或C端被截短不超过30个氨基酸的HPV16亚型的L1蛋白质变体。
为了表达这样的蛋白质,本发明的重组表达载体含有编码如上所述蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以含有天然序列或可以含有该序列的变体、或生物学或抗原功能等同物。优选地,该多核苷酸所编码的蛋白质的免疫原性相对于天然蛋白不减少,优选增加。该多核苷酸的例子有例如SEQ ID NO:5中所示的编码序列,以及编码实施例中所述各L1蛋白质的多核苷酸序列。
在一个优选实施方案中,本发明目的蛋白质(乳头瘤病毒L1蛋白)在选定的宿主中高水平表达。可以采用本领域的多种方法提高原核宿主中目的蛋白质表达水平。
特别是,本发明的表达系统优选能够以可溶性蛋白质高水平表达目的蛋白质。在一个优选实施方案中,目的蛋白质或者编码目的蛋白质的多核苷酸有利于在选定的宿主中高表达目的蛋白质。优选地,在所述原核宿主细胞中所述乳头瘤病毒L1蛋白质大部分(例如大约至少20%、优选至少40%、50%、60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%)以可溶性蛋白质表达。这样,可以通过分离宿主细胞裂解物的可溶性部分分离目的蛋白质。本发明的优选多核苷酸和蛋白质是人乳头瘤病毒(特别是16、18、6和11亚型)晚期蛋白L1基因和其编码的L1蛋白质。
所述原核宿主细胞优选是大肠杆菌细胞。
获得表达目的蛋白质的宿主细胞后,可以在有利于目的蛋白质以可溶性形式高水平表达的条件下培养宿主细胞。本发明方法特别适合于大规模培养物。培养后,可以通过常规方法收集该细胞,由此获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞。在一个优选方案中,步骤(a)所述获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞是通过将表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞培养物离心、收集细胞而实现。例如,这可以通过大约4000-8500r pm离心大约10min来实现。特别是,原核宿主细胞培养物是通过大规模培养制备的培养物。
(b)将收集的原核宿主细胞在重悬溶液中重悬
所述重悬溶液优选含有足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐。
在一个优选实施方案中,步骤(b)中所述重悬溶液所含的盐是中性盐,特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐中的一种或几种,特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4。
在一个优选实施方案中,步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度,例如使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的大约至少20%、优选至少40%、50%、60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%保持溶解的浓度。例如所述盐浓度可以是大约50mM-3000mM,例如80mM-2500mM,优选100mM-2000mM,更优选200mM-2000mM,例如200mM-1000mM、200-600mM,更优选300-500mM,例如300-400mM,特别是大约300mM、400mM。可用的浓度范围包括大约50mM-3000mM,80mM-2500mM,100mM-2000mM,150mM-1500mM,150mM-500mM;优选200mM-2000mM,更优选200mM-800mM,200mM-600mM,200mM-400mM,更优选300mM-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM,特别是大约300mM、400mM。
在一个实施方案中,步骤(b)中所述重悬溶液所含盐可以是100mM-2000mM,200mM-1000mM,优选300mM-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约300mM NaCl。可用的浓度范围包括大约50mM-3000mM,80mM-2500mM,100mM-2000mM,150mM-1500mM,150mM-500mM;优选200mM-2000mM,更优选200mM-800mM,200mM-600mM,200mM-400mM,更优选300mM-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM,特别是大约300mM、400mM NaCl。
优选地,本发明所述重悬溶液还含有适当的缓冲液,例如Tris缓冲液和其它常见用于溶解核酸的缓冲液。本发明方法对缓冲液没有任何特别的限制。在一个实施方案中,本发明所述重悬溶液由盐和缓冲液组成(或者基本上由盐和缓冲液组成)。
在一个具体的优选实施方案中,步骤(b)中所述重悬溶液是大约20mM Tris缓冲液pH7.2,大约300mM NaCl。
(c)破碎所述原核宿主细胞;
在重悬本发明的细胞后,可以采用常规方法破碎所述原核宿主细胞。这可以通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现。优选采用超声波处理或者均质机压力破碎。
(d)除去不溶性部分,获得菌体裂解上清
破碎所述原核宿主细胞后,除去破碎产物(细菌裂解物)的不溶性部分,获得菌体裂解上清。这可以通过例如离心、然后留取上清液来实施。例如,以足以沉降细胞碎片的离心力进行离心,例如以高速离心机最大速度离心15-30分钟或者相当的离心力,例如大约30000g离心15-30分钟,然后收集上清液。
步骤(d)不溶性部分优选包括细菌细胞碎片、未破碎的细菌细胞等。细菌裂解物上清通常包括可溶性胞质部分。
(e)沉淀目的蛋白质
在获得细菌裂解物上清液后,将其中所述盐的浓度降低到所述乳头瘤病毒L1蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度。
发明人出人意料地发现,在将细菌裂解物上清液中所述盐浓度降低到足够低时,会导致可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质大部分被沉淀,而其它无关蛋白质沉淀较少,由此选择性沉淀目的蛋白质。
优选地,所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质大约至少40%、50%、优选至少60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%被沉淀,而其它无关蛋白质基本上(例如大约至少40%、50%、优选至少60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%)不被沉淀。
优选地,所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少40%、50%、优选至少60%、至少70%、至少80%、甚至至少90%。
优选地,所述选择性沉淀步骤的乳头瘤病毒L1蛋白质的产率(沉淀后乳头瘤病毒L1蛋白质/沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质)为至少60%、优选至少70%、至少80%、甚至至少90%、95%。
在一个实施方案中,步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少50%、至少60%、优选至少70%、至少80%、例如至少90%、95%。例如将菌体裂解上清中所述盐浓度降低到低于150mM、低于100mM、低于50mM、或者不可检测,优选不可检测。降低后的浓度范围包括低于50mM、低于40mM、低于30mM、低于20mM、低于10mM、低于1mM、低于0.1mM、低于0.01mM、低于0.001mM,或者不可检测。
在一个具体实施方案中,本发明所述重悬溶液含有的盐是NaC l,沉淀目的蛋白质时将菌体裂解上清中NaCl浓度降低至少50%、至少60%、优选至少70%、至少80%、例如至少90%、95%。例如将菌体裂解上清中所述盐浓度降低到低于150mM、低于100mM、低于50mMNaCl、或者不可检测,优选不可检测。降低后的浓度范围包括低于50mM、低于40mM、低于30mM、低于20mM、低于10mM、低于1mM、低于0.1mM、低于0.01mM、低于0.001mM NaCl,或者不可检测。
在另一个优选实施方案中,步骤(e)中将菌体裂解上清中盐浓度降低通过透析、溶液交换(优选采用切向流装置进行交换)或稀释的方法来实现。例如切向流交换采用不含重悬溶液中所述盐的缓冲液,例如10mM磷酸缓冲液pH6.0缓冲液来进行。交换体积为例如三倍-五倍上清体积,或者更多。
步骤(e)中目的蛋白质的沉淀优选是可逆沉淀,不引起蛋白质变性,优选不破坏目的蛋白质的三级结构,保持蛋白正确构象。
(f)收获沉淀
在优选的实施方案中,本发明方法还包括收集沉淀的蛋白质。步骤(f)收获沉淀可以通过离心或超滤来实现,例如通过以大约10000-15000g离心大约5-15分钟来收获沉淀。
沉淀复溶
优选地,本发明方法还包括步骤(g):采用复溶溶液复溶步骤(f)中获得的沉淀,使得目的乳头瘤病毒L1蛋白质溶解。例如,用含有适当浓度的适当盐(特别是中性盐)的复溶溶液溶解所述沉淀。优选地,所述浓度的盐足以溶解大部分所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度。特别优选的是,其它无关蛋白质较少溶解,由此选择性地溶解目的蛋白质。
优选地,所述选择性溶解使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质大约至少40%、50%、优选至少60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%被溶解,而其它无关蛋白质基本上(例如大约至少40%、50%、优选至少60%、70%、或者80%、最优选至少90%或者95%)不被溶解。
优选地,所述选择性溶解得到的溶液中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少50%、优选至少60%、至少70%、至少80%、甚至至少90%。
优选地,所述选择性溶解的乳头瘤病毒L1蛋白质的产率(溶解后乳头瘤病毒L1蛋白质/溶解前乳头瘤病毒L1蛋白质)为至少60%、优选至少70%、至少80%、甚至至少90%、95%。
在一个实施方案中,步骤(g)中所述复溶溶液所含的盐是中性盐,特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐,特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种。优选NaCl。
在另一个实施方案中,步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度,例如使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的大约至少50%、60%、优选至少70%、或者80%、最优选至少90%或者95%保持溶解的浓度。
在另一个实施方案中,所述复溶溶液包含例如大约200mM-2000mM,优选300mM-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约300mM、350mM、400mM的上述盐。可用的盐浓度包括大约100mM-3000mM,150mM-2500mM,200mM-2000mM,200mM-1500mM,200mM-500mM;优选200mM-2000mM,更优选200mM-800mM,200mM-600mM,200mM-400mM,更优选300mM-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM,特别是大约300mM、400mM。
在另一个实施方案中,步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是150mM-3000mM NaCl,优选200mM-2000mM,优选300-500mM,更优选300mM-400mM,特别是大约300mM、350mM、400mM NaCl。可用的NaCl浓度包括大约100mM-3000mM,150mM-2500mM,200mM-2000mM,200mM-1500mM,200mM-500mM;优选200mM-2000mM,更优选200mM-800mM,200mM-600mM,200mM-400mM,更优选300-500mM,更优选300-400mM,特别是大约200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM,特别是大约300mM、400mM。
在另一个实施方案中,步骤(g)中所述复溶溶液还可非必需地含有还原剂,例如DTT或巯基乙醇,以充分还原L1蛋白亚基之间的二硫键,有利于进一步的色谱纯化。例如加入DTT或巯基乙醇至终浓度10mM-200mM,例如10mM。实验证明,还原剂对复溶效果并无明显影响,复溶液中可以完全不含还原剂。
在另一个实施方案中,步骤(g)中所述复溶溶液还可以含有适当的缓冲液,例如磷酸缓冲液,Tris缓冲液。缓冲液可以考虑后续纯化步骤的需要来选择。缓冲液对复溶效果无明显影响,但考虑到后续过柱步骤,可以优选采用磷酸缓冲液。
在一个具体实施方案中,本发明所述复溶溶液由上述盐和缓冲液组成,或者由上述盐、还原剂和缓冲液组成。例如,步骤(g)中所述复溶溶液可以方便地是10mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,300mMNaCl。
通过以上步骤(b)-(g),目的蛋白在总蛋白的含量提高到至少60%、优选至少70%、更优选至少80%。在一个实施方案中,目的蛋白在总蛋白的含量由3%-5%提高到80%左右。在该过程中,目的蛋白的损失率很低,一般低于20%,优选低于10%,更优选低于5%、3%、1%。该过程是一个温和的过程,不会引起蛋白的不可逆变性。
进一步纯化
在一个优选实施方案中,本发明上述方法还包括进一步纯化步骤(e)、(f)或者(g)的产物。优选本发明方法包括对复溶后的目的蛋白质进行进一步纯化。
在本发明中,所述进一步纯化可以采用本领域已知的方法进行。例如,所述进一步纯化可以通过采用一种或者多种纯化方法来进行,所述纯化方法选自:离心、微孔滤膜过滤、超滤、透析、沉淀、离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
一个优选实施方案是,所述进一步纯化包括阳离子交换层析和疏水相互作用色谱。优选地,在阳离子交换层析之后,HPV L1蛋白纯度达到90%以上。优选地,在阳离子交换层析和疏水相互作用色谱纯化后,HPV L1蛋白纯度达到95%以上,更优选98%以上。
生产类病毒颗粒
在另一方面,本发明还涉及生产乳头瘤病毒类病毒颗粒的方法,包括:采用本发明方法纯化能组装成类病毒颗粒的乳头瘤病毒L1蛋白质;将该乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒。特别优选的是,本发明方法用于产生人乳头瘤病毒类病毒颗粒。
所述的L1蛋白质优选能够装配成具有免疫原性的类病毒颗粒(VLP)。该类病毒颗粒优选可在接种的动物(优选人类)体内诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。因此,本发明的类病毒颗粒优选可以用作疫苗。L1蛋白质的例子有例如截短的L1蛋白质,例如N端和/或C端被截短的L1蛋白质,特别是上文所述的那些L1蛋白质。
在一个实施方案中,所述将乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒的步骤包括:加入足量还原剂(例如加入DTT至终浓度10-200mM,例如30-100mM,例如50mM),充分打开目的蛋白之间二硫键,使得病毒颗粒充分解聚,而后逐步去除还原剂(例如通过透析法、稀释和溶液交换,特别是切向流交换),使得目的蛋白组装为类病毒颗粒。
本发明中,L1蛋白的复性指的是还原剂的去除,二硫键的重新形成,从而组装成为类病毒颗粒VLP。
生产抗病毒疫苗
另一方面,本发明还涉及制备抗病毒乳头瘤病毒(特别是人类乳头瘤病毒)疫苗的方法,包括:采用本发明方法纯化乳头瘤病毒L1蛋白质,将乳头瘤病毒L1蛋白质和适当的佐剂(特别是氢氧化铝佐剂)一起配制成疫苗。
本发明还涉及一种制备抗病毒乳头瘤病毒(特别是人类乳头瘤病毒)疫苗的方法,包括:采用本发明方法制备乳头瘤病毒类病毒颗粒,将类病毒颗粒和适当的佐剂(特别是氢氧化铝佐剂)一起配制成疫苗。
相关产品
本发明还涉及可通过本发明纯化病毒蛋白质的方法制备的HPVL1蛋白质制品。本发明还涉及可通过本发明方法制备的HPV类病毒颗粒制品。本发明还涉及可通过本发方法制备的HPV病毒疫苗制品。
本发明涉及的HPV病毒疫苗制品可通过将HPV VLP与商用的疫苗佐剂(优选氢氧化铝或磷酸铝佐剂)按一定的比例混合,灌装于常用的西林瓶、一次性注射器或安瓿瓶中。该疫苗可通过肌肉注射方式按每剂量大约10-50μg(例如大约20μg)的HPV VLP量接种人体,优选免疫程序为0、1、6月各一次。本发明疫苗制品可以采用本领域已知的方法配制和给药。
本发明还涉及用于破碎表达有目的乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞的介质液,其包含足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐。在一个实施方案中,该介质液是上文定义的重悬溶液。
本发明还涉及本文公开的具体氨基酸序列,以及和该序列相比具有一或多个(例如1-50个,1-30个,1-20个,1-10个)氨基酸的替代、添加、缺失和/或插入并基本上保留其活性的氨基酸序列。本发明还涉及本文公开的具体核苷酸序列,能够和该序列在严紧杂交条件下杂交并保留编码相应蛋白质活性的核苷酸序列,以及这些序列的互补序列。
在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。典型地,“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如,“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm5℃);“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃;“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃;“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代,或者进一步地,杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如,6×SSC=极低严紧性;3×SSC=低至中等严紧性;1×SSC=中等严紧性;0.5×SSC=高等严紧性。Samb rook等(Sambrook,J.等(1989)分子克隆,实验室手册,Co ld Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
在下文用于举例说明的具体实施例中,本发明通过对大肠杆菌菌体破碎上清中的L1蛋白无盐沉淀,复溶两个简单步骤使得上清中的L1蛋白的纯度从大约10%左右提升至大约70%~80%。而且该方法较为温和,不使用尿素等变性剂,不影响后续的VLP组装。该方法使得从大肠杆菌裂解上清中大规模纯化制备HPV VLP成为可能。
无盐沉淀为HPV L1蛋白纯化的最关键步骤。无盐沉淀工艺优选包括以下几个方面:(1)使用含有适当浓度范围的NaCl(也可以适用其它盐)的缓冲液破碎菌体。(2)将含NaCl的菌体裂解上清透析至低盐,则上清中的L1蛋白可以选择性沉淀。(3)采用含有还原剂或者不含有还原剂的、优选含有NaCl的复溶液复溶目的蛋白。通过以上三个步骤,目的蛋白占裂解上清中的总蛋白的含量由大约3%-5%提高到占重悬样品中总蛋白的大约70%-80%。该过程是一个温和的过程,不会引起蛋白的不可逆变性,而且这个过程中目的蛋白的损失率很低,在10%以下。正是有了无盐沉淀这一纯化步骤,使得从大肠杆菌上清中纯化出L1蛋白成为可能。
据目前文献报道,在大肠杆菌表达系统中表达L1蛋白多采用将其表达在包含体沉淀当中的策略。包含体中表达的蛋白失去了正确构象,是无功能的蛋白,需要经过繁琐及低效的复性过程才能最终得到类病毒颗粒(在包含体策略中,目的蛋白的大部分三级结构在尿素等变性剂的作用下被破坏,复性过程中要进行三级结构的再组装)。在这个过程中,目的蛋白损失量往往在80%以上,而且最后得到类病毒颗粒结构上往往有所缺陷。因此采用包含体策略是难以进行产业化生产的。
在一个特别优选的具体实施方案中,本发明方法包括如下步骤:
1.构建含有L1基因的原核表达载体
2.表达载体导入大肠杆菌,筛选获得含有表达载体的大肠杆菌克隆
3.高密度发酵大肠杆菌表达目的蛋白
4.离心,收集菌体,采用含NaC l缓冲液重悬菌体
5.高压均质机破碎菌体。离心,获得上清
6.无盐沉淀,选择性沉淀目的蛋白离心,收集沉淀,复溶液溶解目的蛋白
7.阳离子交换层析,疏水层析纯化蛋白
8.加入足量还原剂,充分打开目的蛋白之间二硫键
9.逐步去处还原剂,使得目的蛋白重新组装为类病毒颗粒
10.加入佐剂,吸附目的蛋白,分装
该方法通过对大肠杆菌菌体裂解上清中的L1蛋白进行无盐沉淀、复溶、离子交换层析、疏水层析和复性可以大规模制备电泳纯度达到98%以上的类病毒颗粒。该类病毒颗粒具有良好的免疫原性,能诱导针对同型HPV病毒的中和抗体,可作为预防HPV感染的疫苗。
有益效果
目前HPV VLP的制备所采用的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。
在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少,能自发的形成VLP,往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统所采用的杆状病毒表达系统及酵母表达系统均有表达量低,培养成本高等缺陷,给大规模工业化生产带来了极大困难。
在原核表达系统中,大肠杆菌表达系统具有培养成本低,表达量大的优点。但在大肠杆菌表达系统中表达的HPV L1蛋白往往失去正确天然构象,以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难,效率低下,使得从包含体中获得有正确构象的VLP在大规模生产中难以实施,只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以正确构象可溶性形式表达于大肠杆菌裂解上清中,但是表达量低下,而且要从大肠杆菌裂解上清中种类繁多的可溶性蛋白纯化出HPV L1蛋白也相当困难,往往需要借助融合表达及亲和层析等手段进行纯化,以上手段往往需要昂贵的酶,难以进行工业化生产。可见,长期以来本领域一直缺少从大肠杆菌裂解上清中高效纯化以正确构象可溶性形式表达的人乳头瘤病毒L1蛋白的方法,尤其是对于表达量低下和/或不含融合蛋白的情况。本发明通过选择性沉淀,复溶使得目的蛋白得到富集,使得大规模纯化以正确构象可溶性形式表达于大肠杆菌裂解上清中的L1蛋白质成为可能。
本发明通过温和的手段选择性沉淀HPV L1蛋白,并且采用含盐缓冲液重溶HPV L1蛋白,使得在保持HPV L1蛋白正确构象前提下使其纯度有了显著提高。且重溶后的目的蛋白可以直接进行离子交换层析及疏水交换层析纯化获得纯蛋白。表达的目的蛋白不含任何融合蛋白,整个过程无需使用昂贵的酶,成本低廉。而且目的蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程,损失小,可应用于大规模工业化生产。
尽管本发明可以有以上和其它优点,但是,应当理解,在特定的实施方案或者特定的应用中,不需要同时具备所有这些优点。每一个优点都可以构成对现有技术的改进,独立地构成一项发明。
下面结合实施例对本发明进一步举例描述,主要以HPV16亚型L1蛋白为例,并例举用本发明的方法纯化HPV18、HPV6和HPV11等其它亚型L1蛋白的效果。这些实施例是非限制性的。
实施例1:重组HPV16L1基因表达载体的构建及HPV16L1蛋白质的表达
pT0-T7-HPV16L1非融合表达载体的构建
以从福建省厦门市子宫颈癌病人阴道分泌物中提取的DNA为模板,16H5521F:5’-TAT AgT TCC Agg gTC TCC AC-3’(SEQ ID NO:1)为正向引物,16H7190R:5’-ACA ACA AAC AAC ACT AAT TCA A-3’(SEQID NO:2)为反向引物,在PCR热循环仪(Biometra公司生产的T3型PCR仪)按照如下条件进行PCR反应:94℃5分钟;随后是94℃50秒,57℃50秒,72℃2分30秒的25个循环;最后为72℃延伸10分钟。得到特异的1.6kb左右大小的产物,用做再次PCR反应的模板。c16HL5653F:5’-ggA TCC CAT ATg CTT CCT AgT gAg gCC ACT gTC-3’(SEQ ID NO:3)为正向引物,其5’端引入限制性内切酶BamHI和Nde I位点,Nde I位点序列为CAT ATG,ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子;c16H7154R:5′-CTC gAg TTA CAg CTT ACg TTT TTT gC-3′(SEQ IDNO:4)为反向引物,其5’端引入限制型内切酶Xho I位点。在PCR热循环仪(Bi ometra T3)按照如下条件进行PCR反应:94℃5分钟;随后是94℃50秒,57℃50秒,72℃2分的25个循环;最后为72℃延伸10分钟。得到特异的1.5kb左右大小的DNA片段,将上述获得的PCR产物与商售的pMD18-T载体(TAKARA公司生产)连接,经BamHI/HindIII酶切鉴定,得到插入L1基因的阳性克隆pMD18-T-HPV16-L1。
在上海博亚生物工程公司,利用M13(+)/(-)引物,测得pMD18-T-HPV16-L1质粒中插入的目的核苷酸序列为:
catatgcttcctagtgaggccactgtctacttgcctcctgtcccagtatctaaggttgtaagcacggatgaatatgttgcacgcacaaacatatattatcatgcaggaacatccagactacttgcagttggacatccctattttcctattaaaaaacctaacaataacaaaatattagttcctaaagtatcaggattacaatacagggtatttagaatacatttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacctcattttataatccagatacacagcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgggcattagtggccatcctttattaaataaattggatgacacagaaaatgctagtgcttatgcagcaaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatctatggattacaaacaaacacaattgtgtttaattggttgcaaaccacctataggggaacactggggcaaaggatccccatgtaccaatgttgcagtaaatccaggtgattgtccaccattagagttaataaacacagttattcaggatggtgatatggttgatactggctttggtgctatggactttactacattacaggctaacaaaagtgaagttccactggatatttgtacatctatttgcaaatatccagattatattaaaatggtgtcagaaccatatggcgacagcttatttttttatctacgaagggaacaaatgtttgttagacatttatttaatagggctggtgctgttggtgataatgtaccagacgatttatacattaaaggctctgggtctactgcaaatttagccagttcaaattattttcctacacctagtggttctatggttacctctgatgcccaaatattcaataaaccttactggttacaacgagcacagggccacaataatggcatttgttggggtaaccaactatttgttactgttgttgatactacacgcagtacaaatatgtcattatgtgctgccatatctacttcagaaactacatataaaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatttacagtttatttttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgttatgacatacatacattctatgaattccactattttggaggactggaattttggtctacaacctcccccaggaggcacactagaagatacttataggtttgtaacatcccaggcaattgcttgtcaaaaacatacacctccagcacctaaagaagatccccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaaaggaaaagttttctgcagacctagatcagtttcctttaggacgcaaatttttactacaagcaggattggaggccaaaccaaaatttacattaggaaaacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaacgcaaaaaacgtaagctgtaactcgag(SEQIDNO:5),其编码的氨基酸序列为:
MLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGDNVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLEAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL(SEQ ID NO:6)。该氨基酸序列为N端被截短30个氨基酸、C端未被截短的HPV16L1蛋白。下列实施例将以该蛋白为例,描述本发明的方法应用于乳头瘤病毒L1蛋白的高效纯化及VLP的组装。更多的实验结果表明,N端被截短不多于81个氨基酸和/或C端被截短不超过30个氨基酸的HPV16亚型的L1蛋白质变体和没有截短的L1天然蛋白质均可用本发明的方法进行高效地纯化并组装成为VLP。
重组HPV16L1基因的非融合表达载体的构建
将上述的pMD18-T-HPV16L1质粒,经BamH I/Xho I酶切,再与经Nde I/Xho I酶切的非融合表达载体pT0-T7(罗文新等,生物工程学报,2000,16:53-57)相连接,Nde I/Xho I酶切鉴定得到插入L1蛋白基因的阳性表达克隆pT0-T7-HPV-16L1。
HPV16L1蛋白的小量表达
1μL的pT0-T7-HPV-16L1质粒(0.15mg/m l)转化40mL的氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司),涂布于卡那霉素(终浓度25mg/mL,下同)抗性的固体LB培养基,37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL卡那霉素抗性的液体LB培养基之试管,37℃220转/分振荡培养10小时,至菌体浓度为OD600nm≈1.5,从中取1mL保存于4℃,剩余的3mL加入2mL0.5M I PTG(终浓度为0.3mM),37℃220转/分振荡进一步诱导培养转化的表达菌株4小时。取1.5mL经诱导培养的表达菌株培养液,12,000转/分离心30秒,弃去上清,扣干,用100mL1×凝胶加样缓冲液(50mM TrisC l(pH6.8),100mM二硫苏糖醇(DTT),2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)重悬;沸水浴处理10分钟;12,000转/分,离心10分钟;取出10μL进行12%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。挑选表达量较高(表达量为菌体蛋白SDS-PAGE分析中目的蛋白占总蛋白的相对含量)的转化菌株进行-80℃长期保种,以进行下述的大量表达或高密度发酵。
实施例2HPV16L1蛋白无盐沉淀及复溶条件的研究
HPV-16L1蛋白的大量表达
每个1L三角培养瓶中盛装500mL LB液体培养基(卡那霉素抗性)接种种子菌100μL,37℃摇瓶培养8小时,加入IPTG终浓度为0.3mM,于25℃诱导6小时。表达的HPV-16L1蛋白以包含体和可溶形式蛋白两种形式表达于细胞质中,其中以可溶性形式表达的蛋白在细胞破碎后即可释放到菌体裂解上清中。虽然可溶性蛋白的相对含量较低,但是通过本发明所采用的特异无盐沉淀的方法依然能够得以纯化。
菌体裂解液的确定
8500r pm离心10min,收集菌体。1000mL的菌液离心得到的沉淀分别用以下几种菌体裂解液各50mL重悬:
裂解液I:20mM Tris缓冲液pH7.2,100mM NaCl
裂解液II:20mM Tris缓冲液pH7.2,200mM NaCl
裂解液III:20mM Tris缓冲液pH7.2,600M NaCl
裂解液IV:20mM Tris缓冲液pH7.2,2000mM NaCl
裂解液V:20mM Tris缓冲液pH7.2,300mM NaCl
裂解液VI:20mM Tris缓冲液pH7.2,500mM NaCl
超声波破碎细胞。30000g离心15min,留取上清40mL。分别取10mL裂解上清分别透析至1L的透析液(10mM磷酸缓冲液pH6.0)。待透析充分后,将透析产物1.5mL,以12000g离心5min,弃上清。150μLddH2O重悬沉淀,加入6X Loading Buffer(0.3M Tris-HCl,pH6.8,60%甘油,5%2-巯基乙醇,0.6%溴酚兰,12%SDS)30μL混匀,80℃水浴10min。取10μL样品于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图1。从该结果可知,当裂解液中的NaC l浓度在100mM-2000mM之间时,HPV16L1(约55kD)蛋白均能被特异性沉淀,但是当NaC l浓度在300mM-500mM之间时沉淀目的蛋白的效果最佳。
HPV-16L1蛋白的无盐沉淀条件的摸索
8500rpm离心10min,收集菌体。1000mL的菌液离心得到的沉淀用50mL的裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2,300mM NaCl)重悬,超声波破碎细胞。30000g离心15min,留取上清40mL。分别取10mL裂解上清分别透析至1L的下列透析液中:
透析液I(10mM磷酸缓冲液pH6.0),
透析液II(10mM磷酸缓冲液pH6.0,50mM NaCl),
透析液III(10mM磷酸缓冲液pH6.0,100mM NaCl)
透析液IV(10mM磷酸缓冲液pH6.0150mM NaCl),
透析液V(10mM磷酸缓冲液pH6.0200mM NaCl)。
待透析充分后,将透析产物1.5mL,12000g离心5min,以150μLddH2O重悬沉淀,加入6X Loading Buffer(同上)30μL,混匀。80℃水浴10min后取10μL样品于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min,考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图2。结果显示,当透析缓冲液中的NaC l浓度在0-150mM之间时,目的蛋白均能被较好的选择性沉淀。但是当NaCl浓度提高到200mM时,沉淀量明显减少。
HPV-16L1蛋白无盐沉淀的重悬
8500r pm离心10min,收集菌体。1000mL的菌液离得的沉淀用50mL的裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2,300mM NaC l)重悬,超声波破碎细胞。30000g离心15min,留取上清。分别取50ml裂解上清透析至1L的透析液(10mM磷酸缓冲液pH6.0),待透析充分后,分别取出透析产物各10mL以12000g离心5min,弃上清,沉淀以1mL的
复溶液I(20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,100mM NaCl)
复溶液II(20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,200mM NaCl),
复溶液III(20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,300mM NaCl),
复溶液IV(20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,400mM NaCl),或者
复溶液V(20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,2M NaCl)重悬,随后以1min的100W功率超声助溶,20000g离心5min,收集上清,分别进行SDS-PAGE鉴定。电泳结果见图3。结果显示,当复溶液中NaCl浓度在200mM-2000mM之间时均能取得较好的溶解效果。但考虑到后续进行阳离子交换色谱纯化时,如果上柱盐浓度过高,目的蛋白不易与介质结合,因此将复溶液中的盐浓度定为300mM NaCl。
分别取出透析产物各10ml以12000g离心5min,弃上清,沉淀以1ml的20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,300mM NaCl及20mM磷酸缓冲液pH7.5,300mM NaCl重悬,随后以1min的100W功率超声助溶,20000g离心5min,收集上清,分别进行SDS-PAGE鉴定。电泳结果见图4。结果显示,在300mM NaC l的盐浓度下,是否存在还原剂DTT并不影响复溶液对目的蛋白L1的溶解效果。
实施例3:HPV16L1的高密度发酵
从-70℃中取出带有表达质粒pT0-T7-HPV16-L1的大肠杆菌冻干菌种用少量无菌水溶解,接入卡那霉素抗性的50mL LB培养基中,200r pm、37℃培养大约8小时,然后转接入10瓶500mL LB培养基中,每瓶接入5mL菌液,200rpm、30℃摇瓶培养过夜,作为种子液。
LB培养基配方:
蛋白胨: 10g
酵母抽提物: 5g
NaCl: 10g
将以上成分份溶解于1000mL去离子水中,用NaOH调节pH值至7.2,121℃灭菌30min,冷却至50℃。
采用上海保兴生物公司50L发酵罐进行大规模培养。校正发酵罐PH电极,配制30L LB培养基装入发酵罐,原位121℃灭菌30min,校正溶氧电极,以灭菌后未通气前为零点,以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100r pm时为100%。
补料准备:配制浓度为30%(20g蛋白胨、10g酵母膏溶至100ml)的蛋白胨和酵母膏混合物,50%葡萄糖(50g溶至100ml),121℃灭菌20min。
次日将10瓶种子液共5L接入发酵罐中,设定温度37℃,PH值7.0,手动调节搅拌速度及通气量,维持溶氧在40%以上。
流加补料:将50%葡萄糖和30%蛋白胨和酵母膏混合物按溶质质量比2:1的比例混合。
流加速度如下:
100%为25mL/min
第一小时: 5%;
第二小时:10%;
第三小时:20%;
第四小时:40%;
第五小时以后60%。
当菌浓度达到OD600nm大约10左右时将培养温度降至25℃,加入4gIPTG诱导培养4小时。终浓度大约为60左右(OD600nm)下罐,离心收集菌体湿重大约3kg。
实施例4:HPV-16L1多肽的无盐沉淀
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2,300mMNaC l)的比例重悬菌体,采用APV均质机(AnInven sysGroup产品)以600bar压力破碎菌体5次。JA-14转头13500r pm(30000g),离心15min,留取上清。采用CENTRASETTE5切向流装置(PALL产品)对上清进行透析,所用膜包截留分子量为30kDa,透析液为10mM磷酸缓冲液pH6.0缓冲液,透析体积为三倍上清体积,运行时压力为0.5psi,流速为500mL/min,切向流速为200mL/min。透析充分后,JA-10转头(BeckmanJ25高速离心机)9500rpm(12000g),20min离心收获沉淀,用1/10上清体积的10mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,300mM NaCl重悬沉淀,搅拌30min。JA-14转头(BeckmanJ25高速离心机),13500rpm(30000g),离心20min,离心得上清,使用0.22μm孔径滤膜过滤样品,以该样品进行下一步的阳离子交换色谱纯化。取150μL过滤后样品,加入6X Loading Buffer30μL。混匀,于80℃水浴10min后取10μL于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带,电泳结果见图5。由电泳结果可知HPV16L1蛋白在通过沉淀、复溶的步骤之后,纯度从之前的5%(此时蛋白纯度较低,只能做粗略判断)左右提高到了70%左右。按照上文类似的无盐沉淀方法纯化后,天然L1蛋白或C端截断10或20个氨基酸L1蛋白的纯度均能达到70%左右。
实施例5:HPV-16L1多肽的阳离子交换色谱纯化
仪器系统:GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA expl orer100型制备型液相色谱系统。
层析介质:SP Sepharose4FastFlow。
柱体积:5.5cm×20cm。
缓冲液:20mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT300mM NaCl。
洗脱液:20mM磷酸缓冲液pH7.510mM DTT2M NaCl。
流速:25mL/min
检测器波长:280nm。
样品为3L切向流吹溶产物。
洗脱程序为:400mM NaC l洗脱杂蛋白,500mM NaCl洗脱目的蛋白,收集500mM NaCl洗脱产物,共获得HPV16-L1纯化样品3000mL。洗脱流程图见图6。
取上柱前、穿透及不同洗脱梯度样品各150μL,加入6X LoadingBuffer30μL混匀,于80℃水浴10min后取10μL于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带,电泳结果见图7。由SDS-PAGE电泳结果可知,蛋白浓度约为0.3mg/mL,纯度大于90%。
实施例6:HPV-16L1多肽的HIC(疏水相互作用色谱)纯化
仪器系统::GE Healthcare原Amer shan Pharmacia公司生产的AKTA explorer100型制备型液相色谱系统。
层析介质:Butyl Sepharose4FastFlow。
柱体积:5.5cm×20cm
缓冲液:10mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT,2M NaCl。
洗脱液:10mM磷酸缓冲液pH7.5,10mM DTT。
流速:20mL/min。
检测器波长:280nm。
样品为:SP Sepharose4Fast Flow洗脱产物。
洗脱程序为:1M NaCl洗脱杂蛋白,800mM与500mmol/L NaCl浓度洗脱目的蛋白。色谱结果如图8所示。
收集800mM与500mM NaCl浓度时的洗脱产物,获得纯化的HPV16L1样品1300mL。取上柱前,穿透及不同洗脱梯度样品各150μL,加入6X Loading Buffer30μL混匀,于80℃水浴10min后取10μl于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带,电泳结果见图9。由电泳结果可知,目的蛋白浓度约为0.5mg/m l,SDS-PAGE考染纯度大于95%。
实施例7:HPV-16VLP切向流复性
仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE5切向流系统;膜包截留分子量为30kDa;样品为HPV-16L1的HIC纯化样品1500m l。
样品的浓缩:调节系统切向流速为50mL/min,浓缩样品至总体积为800mL。
样品的充分变性:在进行复性前,补充DTT至终浓度为50mM,室温充分反应8h。
样品的复性:以10L复性缓冲液(50mM PB pH6.0,2mM CaC l2,2mMMgC l2,0.5M NaCl)充分交换样品缓冲液。切向流装置运行时压力为0.5psi,切向流速度为10mL/min,待复性缓冲液交换完后,改为储存缓冲液(20L PBS:20mM PB pH6.5,0.5M NaCl)进行交换,交换体积为20L。运行时压力为0.5psi,切向流速为25mL/min。待所有液体交换完毕后,使用PALL0.20μm滤器无菌过滤样品,得到HPV16-L1的VLP样品。
实施例8:HPV16VLP透射电镜观察
仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜,放大倍数为100,000倍。HPV16-L1重组蛋白复性样品经2%磷钨酸pH7.0负染,固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图10,可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒,大小均匀,呈现为空心形态。
实施例9:HPV16VLP动态光散射观察
仪器为美国ProteinSolutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器),使用算法为Regulation算法。样品为HPV16-L1VLP。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图11。结果显示HPV16-L1VLP的水化分子动力学半径为25.86nm。
实施例10:HPV16VLP疫苗的免疫保护性评价
HPV16假病毒中和细胞模型的建立
由于HPV难以在体外进行培养,而且HPV宿主特异性强,难以在人以外的宿主上繁殖,缺乏合适的动物模型。因此,为了能对HPV疫苗的免疫保护性进行快速评估,需要建立有效体外中和实验模型。
假病毒(pseudovirions)体外感染模型:利用了HPV VLP可非特异包装核酸的特性,通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白,通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒组成HPV假病毒。(Yeager,M.D,Aste-Amezaga,M.et al(2000)Virology(278)570-7)具体方法有重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。
本发明采用的多质粒共转染方法,并且针对HPV系统采取了如下的改进:建立了对293FT细胞的优化的磷酸钙转染方法,可获得高达90%以上的转染效率,有利于进行较大规模的生产。获得了密码子优化的HPV结构蛋白的表达质粒,其可在哺乳动物细胞中高效表达HPVL1和L2基因,有利于高效组装假病毒。
HPV假病毒的构建
用CsCl密度梯度离心方法分别纯化带有HPV16L1基因的质粒p16L1h、带有HPV16L2基因的质粒p16L2h、及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP(以上质粒由NIH的John T.Schiller教授馈赠)。CsCl密度梯度离心纯化质粒的方法参照《分子克隆:第三版》。简言之:将质粒转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落接种到500mL LB培养基中,37℃摇瓶培养16小时。9000g离心5min,收集菌体。每1000mL菌液收获的菌体,依次加入40mL溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-Cl(pH8.0),10mM EDTA(pH=8.0))和2mL RNaseA(1μg/μL),40mL溶液II(0.2M NaOH,1%SDS),48mL溶液III(5M乙酸钾60.0mL,冰乙酸11.5mL,去离子水28.5mL)。在冰上放置10min后,15000g,4℃离心20min,取上清与0.6倍体积的异丙醇混合,15000g离心30min,弃去上清,用70%乙醇洗沉淀1次,用TE溶解沉淀,测定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA对应1.01gCsCl),再溶入100uL10mg/mL的溴化乙锭溶液,用Beckman NVT65转子,62000rpm,20℃离心10hr。用注射器针头收集闭环DNA区带,用等体积的异戊醇重复抽提4次。加入3倍体积的水和8倍体积的无水乙醇,20000g,4℃离心30min,收集DNA沉淀。75%酒精洗涤1次,用1mL TE溶解DNA沉淀。测定DNA溶液的浓度,分装成小份储存于-20℃。
纯化后的p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP用磷酸钙方法共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。磷酸钙转染方法:将p16L1h、p16L2h、pN31-EGFP各40ug加入1mL的HEPES溶液(每50mL去离子水含有pH=7.3的1M Hepes125uL,4℃储存)和1mL的0.5mol/L CaCl2溶液的混合溶液,混合后逐滴加入2mL2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g),0.05M HEPES(11.9g),1.5mMNa2HPO4(0.213g),溶解于1000mL去离子水,pH=6.96,-70℃储存)中,室温下静置1min后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中,6hr后弃去原培养液,加入10mL完全培养液(invitrogen公司产品)。转染48hr后,弃去培养基,用PBS洗2次,将细胞刮下收集细胞,细胞计数,每108个细胞用1mL裂解液(0.25%Brij58,9.5mM MgC l2)重悬。裂解完成后,5000g离心10min,收集上清,加入5M NaC l(终浓度为850mM),即为假病毒液,分装为小份后置于-20℃保存。
将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×104/孔)。5hr后进行中和实验,将待测的血清样品分别用10%DMEM进行连续倍比稀释,然后取50μL分别与50μL稀释于10%DMEM的上文制备的假病毒液(moi=0.1)混合。4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中,37℃培养72h后先用荧光观察确定各样品大概的中和滴度,再用流式细胞仪(EPICS XL,美国Beckman Coulter公司)检测各孔细胞的感染率,计算单抗或多抗血清的准确中和滴度。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。
感染抑制率=(1-阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100%。
抗体中和滴度的定义为:达到高于50%感染抑制率的最大稀释倍数。经50倍稀释后能达到50%以上感染抑制率的单抗或多抗被视为具有中和能力。
HPV16VLP疫苗免疫动物的免疫保护性评价
兔:普通级,雌性,6~8周龄,购自广西省疾病预防与控制中心,并在该中心饲养。HPV16VLP(按实施例2-7方法所制备)初免与等量福氏完全佐剂混合,加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备,免疫方式为肌肉注射,初次免疫剂量为100ug/只,此后分别于4,10周各加强一次,加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后,每周抽取外周静脉血,分离血清,保存待检。
羊:普通级,雌性,6~8周龄,购自广西省疾病预防与控制中心,并在该中心饲养。HPV16VLP(按实施例2-7方法所制备)初免与等量福氏完全佐剂混合,加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备,免疫方式为肌肉注射,初次免疫剂量为1mg/只,此后分别于4,10,18周各加强一次,加强免疫剂量为0.5mg/只。自免疫后,每周抽取外周静脉血,分离血清,保存待检。
以上述假病毒中和细胞模型实验评估上述抗血清的中和效价,如图12和13所示。结果表明,本发明获得的HPV16VLP与佐剂(除了实验中用到的福氏佐剂外,也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗,具有良好的免疫原性,可在动物体内诱导高滴度的中和抗体,可作为预防HPV感染的疫苗。
实施例11HPV18,HPV6,HPV11亚型的L1蛋白的纯化及其组装成为VLP的免疫保护性评估
HPV18L1蛋白的纯化及VLP免疫保护性评估
按本发明实施例2-7所述方法得到纯化后的N端截短65个氨基酸的HPV18L1蛋白,并且组装为VLP,经SDS-PAG,考马斯亮蓝染色检测其纯度可达98%以上,结果见图14。HPV-18VLP的透射电镜结果见图15,结果显示,视野中可见大量半径为25~30nm的类病毒颗粒。动态光散射结果见图16,结果显示HPV18VLP的水化分子动力学半径为29.38nm。HPV18VLP疫苗的免疫保护性评价结果见图17和18。结果表明,本发明获得的HPV18VLP与佐剂(除了实验中用到的福氏佐剂外,也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗,具有良好的免疫原性,可在动物体内诱导高滴度的中和抗体,可作为预防HPV感染的疫苗。
HPV6L1蛋白的纯化及VLP的组装
按本发明实施例2-7所述方法得到纯化后的N端截短3个氨基酸的HPV6L1蛋白,并且组装为VLP,经SDS-PAG,考马斯亮蓝染色检测其纯度可达98%以上,结果见图19。HPV6VLP的透射电镜结果见图20,结果显示,视野中可见大量半径为25~30nm的类病毒颗粒。动态光散射结果见图21,结果显示HPV6VLP的水化分子动力学半径为25.46nm。
HPV11L1蛋白的纯化及VLP的组装
按本发明实施例2-7所述方法得到纯化后的的N端截短4个氨基酸的HPV11L1蛋白,并且组装为VLP,经SDS-PAG,考马斯亮蓝染色检测其纯度可达95%以上,结果见图22。HPV-11VLP的透射电镜结果见图23,结果显示,视野中可见大量半径为25~30nm的类病毒颗粒。动态光散射结果见图24,结果显示HPV11VLP的水化分子动力学半径为22.82nm。
序列表
<110>厦门大学
<120>从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白L1的方法
<130>待定
<160>6
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>1518
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(1512)
<400>5
<210>6
<211>502
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Claims (89)
1.一种纯化乳头瘤病毒L1蛋白质的方法,该方法包括如下步骤:
(a)获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞;
(b)将所述原核宿主细胞在重悬溶液中重悬,所述重悬溶液含有足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐,且所述重悬溶液所含盐的浓度是300mM-500mM;
(c)破碎所述原核宿主细胞;
(d)除去不溶性部分,获得菌体裂解上清;
(e)将菌体裂解上清中盐的浓度降低到所述乳头瘤病毒L1蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度,且降低后的盐浓度低于100mM;和
(f)非必需地收获沉淀,
其中,步骤(b)中所述重悬溶液所含的盐是中性盐,并且是碱金属盐、铵盐、盐酸盐中的一种或者几种。
2.权利要求1的方法,其中所述乳头瘤病毒是人类乳头瘤病毒。
3.权利要求1的方法,其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌细胞。
4.权利要求1的方法,其中步骤(a)所述获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞是通过将表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞培养物离心、收集细胞而实现的。
5.权利要求1的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液还含有缓冲液。
6.权利要求5的方法,其中所述缓冲液是Tris缓冲液。
7.权利要求6的方法,其中所述Tris缓冲液是20mM pH7.2的Tris缓冲液。
8.权利要求1的方法,其中步骤(c)所述破碎所述原核宿主细胞是通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现的。
9.权利要求1的方法,其中步骤(d)所述除去不溶性部分、获得菌体裂解上清是通过如下方式实施:离心裂解物,留取上清液。
10.权利要求9的方法,其中所述离心是以足以沉降细菌细胞碎片的离心力进行离心。
11.权利要求1的方法,其中步骤(f)中所述的收获沉淀是通过离心来实现的。
12.权利要求1的方法,其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是人类乳头瘤病毒L1蛋白。
13.权利要求12的方法,其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是有利于在原核宿主细胞中以可溶性蛋白质形式表达的L1蛋白质变体。
14.权利要求12或13的方法,其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是截短的L1蛋白质。
15.权利要求14的方法,其中所述截短的L1蛋白质是N端和/或C端被截短的L1蛋白质。
16.权利要求14的方法,其中所述截短的L1蛋白质是N端被截短不多于81个氨基酸和/或C端被截短不超过30个氨基酸的HPV 16亚型的L1蛋白质变体。
17.权利要求12的方法,其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是SEQ ID NO:6所示的多肽。
18.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含的盐选自NaCl、KCl、NH4Cl。
19.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度。
20.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少60%保持溶解的浓度。
21.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少80%保持溶解的浓度。
22.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少90%保持溶解的浓度。
23.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是200mM-2000mM。
24.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是200-600mM。
25.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是300-500mM。
26.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是300-400mM。
27.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是200mM-1000mM NaCl。
28.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是300-500mM NaCl。
29.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是300-400mM NaCl。
30.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是300mM NaCl。
31.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(b)中所述重悬溶液是20mM Tris缓冲液pH7.2,300mM NaCl。
32.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质至少40%被沉淀,而其它无关蛋白质基本上不被沉淀。
33.权利要求42的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质至少60%被沉淀。
34.权利要求42的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质至少80%被沉淀。
35.权利要求42的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得所述其它无关蛋白质至少40%不被沉淀。
36.权利要求42的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得所述其它无关蛋白质至少70%不被沉淀。
37.权利要求42的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得所述其它无关蛋白质至少80%不被沉淀。
38.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少50%。
39.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少60%。
40.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少70%。
41.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中所述选择性沉淀步骤的乳头瘤病毒L1蛋白质的产率,以沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质/沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质计算,为至少70%。
42.权利要求41的方法,其中所述产率为至少80%。
43.权利要求41的方法,其中所述产率为至少90%。
44.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少50%。
45.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少80%。
46.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少90%。
47.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低到低于50mM。
48.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低到不可检测。
49.权利要求1-13任一项的方法,其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐浓度降低通过透析来实现。
50.权利要求49的方法,其中所述透析是采用切向流装置透析。
51.权利要求49的方法,其中所述透析是采用不含重悬溶液中所述盐的缓冲液透析。
52.权利要求1的方法,还包括步骤(g):采用复溶溶液复溶步骤(f)中获得的沉淀,使得目的乳头瘤病毒L1蛋白质溶解,
其中所述复溶溶液是含有适当盐的复溶溶液,
步骤(g)中所述复溶溶液所含的盐是中性盐,
步骤(g)中所述复溶溶液所含的盐是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、或硫酸盐,
而且步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是250mM-2M。
53.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含的盐是NaCl。
54.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度。
55.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少70%保持溶解的浓度。
56.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少80%保持溶解的浓度。
57.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的至少90%保持溶解的浓度。
58.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是300-500mM。
59.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是300-400mM。
60.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐的浓度是300、350或400mM。
61.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是200mM-2M NaCl。
62.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是300-500mM NaCl。
63.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是300-400mM NaCl。
64.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液所含盐是300、350、400mM NaCl。
65.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液还含有适当的缓冲液。
66.权利要求65的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液含有的缓冲液是磷酸缓冲液或Tris缓冲液。
67.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液还含有适当的还原剂。
68.权利要求67的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液含有的还原剂是DTT或巯基乙醇。
69.权利要求52的方法,其中步骤(g)中所述复溶溶液是10mmol/L磷酸缓冲液pH7.5,10mmol/L DTT,0.3mol/L NaCl。
70.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白在总蛋白的含量提高到至少60%。
71.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g), 目的蛋白在总蛋白的含量提高到至少70%。
72.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白在总蛋白的含量提高到至少80%。
73.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白的损失率低于20%。
74.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白的损失率低于10%。
75.权利要求1-13任一项的方法,其中通过步骤(b)-(g),目的蛋白的损失率低于5%。
76.权利要求1或52的方法,还包括进一步纯化步骤(e)、(f)或者(g)的产物。
77.权利要求76的方法,其中所述进一步纯化通过采用一种或者多种纯化方法来进行,所述纯化方法选自:离心、微孔滤膜过滤、超滤、透析、沉淀、HPLC或者FPLC、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、吸附层析法、凝胶过滤层析、亲和层析法。
78.权利要求77的方法,其中所述离子交换色谱是阳离子交换色谱。
79.权利要求77的方法,其中所述吸附层析法是羟基磷灰石色谱。
80.权利要求76的方法,其中所述进一步纯化包括阳离子交换层析和疏水相互作用色谱。
81.一种生产乳头瘤病毒类病毒颗粒的方法,包括:采用权利要求1-80任一项的方法纯化能组装成类病毒颗粒的乳头瘤病毒L1蛋白质;将该乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒。
82.权利要求81的方法,其中所述将乳头瘤病毒L1蛋白质组装成类病毒颗粒包括:加入足量还原剂,充分打开目的蛋白之间二硫键,使得病毒颗粒充分解聚,而后逐步去除还原剂,使得目的蛋白组装为类病毒颗粒。
83.权利要求82的方法,其中所述加入足量还原剂是加入DTT至终浓度10-200mmol/ml。
84.权利要求82的方法,其中所述加入足量还原剂是加入DTT至终浓度30-100mmol/ml。
85.权利要求82的方法,其中所述加入足量还原剂是加入DTT至终浓度50mmol/ml。
86.权利要求82的方法,其中所述逐步去除还原剂是通过透析法来实现的。
87.权利要求86的方法,其中透析法是切向流透析法。
88.一种制备抗病毒疫苗的方法,包括:采用权利要求1-80任一项的方法纯化乳头瘤病毒L1蛋白质,将乳头瘤病毒L1蛋白质和适当的佐剂一起配制成疫苗。
89.一种制备抗病毒疫苗的方法,包括:采用权利要求81-87任一项的方法制备类病毒颗粒,将类病毒颗粒和适当的佐剂一起配制成疫苗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200610140613.0A CN101153280B (zh) | 2006-09-29 | 2006-09-29 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200610140613.0A CN101153280B (zh) | 2006-09-29 | 2006-09-29 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101153280A CN101153280A (zh) | 2008-04-02 |
CN101153280B true CN101153280B (zh) | 2015-08-19 |
Family
ID=39255165
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200610140613.0A Active CN101153280B (zh) | 2006-09-29 | 2006-09-29 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101153280B (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9428555B2 (en) | 2007-04-29 | 2016-08-30 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of Human Papillomavirus type 16 |
EP2147926B1 (en) | 2007-04-29 | 2016-08-24 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated human papillomavirus type 18 l1 proteins |
DK2154149T3 (da) * | 2007-05-29 | 2019-10-14 | Univ Xiamen | En trunkeret l1-protein af human papillomavirus 6 |
DK2910566T5 (en) | 2007-05-29 | 2016-11-07 | Univ Xiamen | Truncated L1 protein of human papillomavirus 11 |
WO2012000454A1 (zh) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | 厦门大学 | 截短的人乳头瘤病毒52型l1蛋白 |
KR101559622B1 (ko) | 2012-07-30 | 2015-10-13 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법 |
CN104673760B (zh) * | 2013-11-29 | 2018-01-02 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法 |
CN105177025B (zh) * | 2013-12-03 | 2022-11-01 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 18型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法 |
WO2015196112A1 (en) * | 2014-06-19 | 2015-12-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Human papilloma virus constructs |
CN105907729B (zh) * | 2015-05-05 | 2019-08-16 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1578787A (zh) * | 2001-08-31 | 2005-02-09 | 开普敦大学 | 关于hpv-11和hpv-16l1衣壳蛋白的载体,构建体,和转基因植物 |
CN1696152A (zh) * | 2004-11-23 | 2005-11-16 | 中国疾病预防控治中心病毒病预防控制所 | 大肠杆菌表达的人乳头瘤病毒16型l1e7重组蛋白 |
-
2006
- 2006-09-29 CN CN200610140613.0A patent/CN101153280B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1578787A (zh) * | 2001-08-31 | 2005-02-09 | 开普敦大学 | 关于hpv-11和hpv-16l1衣壳蛋白的载体,构建体,和转基因植物 |
CN1696152A (zh) * | 2004-11-23 | 2005-11-16 | 中国疾病预防控治中心病毒病预防控制所 | 大肠杆菌表达的人乳头瘤病毒16型l1e7重组蛋白 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
刘希君;庄敏;商庆龙;王燕;魏兰兰;李迪;谷鸿喜.HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定.微生物学杂志25 4.2005,25(4),25-27. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101153280A (zh) | 2008-04-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101153280B (zh) | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 | |
CN101293918B (zh) | 截短的人乳头瘤病毒16型l1蛋白 | |
CN101343314B (zh) | 截短的人乳头瘤病毒11型l1蛋白 | |
CN102229660B (zh) | 截短的人乳头瘤病毒33型l1蛋白 | |
CN111393531B (zh) | 一种亚单位融合蛋白CD2V-Fc及其制备方法和应用 | |
US9745351B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 6 | |
CN104710515B (zh) | 人乳头瘤病毒l1蛋白突变体及其制备方法 | |
CN101570571B (zh) | 截短的人乳头瘤病毒18型l1蛋白 | |
CN102719453B (zh) | 一种hpv18l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用 | |
US9738691B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 58 | |
CN104212818A (zh) | 一种优化的人乳头瘤病毒31型l1蛋白的基因序列 | |
CN104211782B (zh) | 截短的人乳头瘤病毒45型l1蛋白 | |
CN102586287A (zh) | 一种hpv16l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用 | |
CN103215302B (zh) | 用汉逊酵母表达系统产生hpv18 l1蛋白的方法 | |
CN104120088B (zh) | 用汉逊酵母表达系统产生hpv58 l1蛋白的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190726 Address after: Siming District of Xiamen city in Fujian Province, 361005 South Siming Road No. 422 Co-patentee after: Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. Patentee after: Xiamen University Address before: Siming District of Xiamen city in Fujian Province, 361005 South Siming Road No. 422 Co-patentee before: Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. Patentee before: Xiamen University |
|
TR01 | Transfer of patent right |