CN105907729B - 一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 - Google Patents
一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105907729B CN105907729B CN201610279535.6A CN201610279535A CN105907729B CN 105907729 B CN105907729 B CN 105907729B CN 201610279535 A CN201610279535 A CN 201610279535A CN 105907729 B CN105907729 B CN 105907729B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer
- virus
- particle
- destination protein
- reducing agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药领域，公开了一种快速获取重组人HPV L1类病毒样颗粒(VLP)的方法，该方法是羟基磷灰石层析法(Hydroxyapatite，HAP)的优化。将表达重组HPV L1的细胞破碎后得到的粗样液经初步纯化，加入还原剂使目的蛋白组分充分解聚，以五聚体状态均一存在，然后在一定条件下进行HAP，洗脱过程中目的蛋白L1能自组装成VLP。本发明的技术方案不仅能有效提高目的蛋白纯度，还能在层析过程中即获得类病毒颗粒，省去了专门的解聚重组装过程，对提高目的蛋白收率也有很大贡献，使目的蛋白L1的分离纯化工艺变得简便、易于控制，并适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及从表达人乳头瘤病毒L1蛋白的原核生物(特别是毕赤酵母菌)中快速有效获得高纯度的类病毒样颗粒的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属。HPV为小的(50～60nm)、无包膜的、由72个五聚体组成的二十面体DNA病毒。病毒基因组为约8kb的双链闭环DNA，具有8个开放框(ORF)，ORF间可部分或全部重叠。基因组早期区编码E1、E2、E4、E5、E6、E7六个非结构蛋白；晚期区编码L1、L2两个结构蛋白，其中L1是分子量为55-60kDa的主要结构蛋白，L1和L2蛋白质在不同的乳头瘤病毒中都是非常保守的，两者共同构成HPV衣壳，比例约5：1，且大多数L2蛋白质在病毒衣壳中的L1蛋白质的内部；长控制区(LCR)是非编码区，不编码任何蛋白。
由于无法通过组织培养获得HPV病毒，并且考虑到HPV E6、E7基因的潜在致癌性，因此不能通过减毒活疫苗或灭活疫苗等传统疫苗制备方式获得HPV疫苗。目前研究较多的HPV疫苗主要是HPV病毒样颗粒疫苗，而在多种表达系统中无需L2的辅助，单独L1蛋白质可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近的类病毒样颗粒(Virus like particles，VLP)的特性，正是制备HPV病毒样颗粒疫苗的基础。
目前较为常用的表达HPV L1的系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统等，但都不同程度存在纯化工艺繁琐，病毒样颗粒均一性较差的问题，US6,245,568B1、CN101153280A专利先将样品中目的蛋白解聚，再用切向流超滤法更换缓冲液，最后得到的病毒样颗粒均一性有了较大提高，但额外增加的工艺步骤不仅耗时费力，还会大大降低目的蛋白的回收率。专利CN1354787A利用羟磷灰石层析(Hydroxyapatite，HAP)直接分离重组酵母细胞表达的VLP，但最终获得的VLP均一完整度不够。因此，进行HPV L1VLP分离纯化相关工艺的改进很有必要。
发明内容
本发明的目的是针对现有工艺存在的不足，提供一种能将重组表达的不均一VLP以均一VLP的形式分离纯化出来的方法。
一个完整的HPV L1VLP是由72个五聚体(含5个L1蛋白，较稳定的L1蛋白的最小单位)组成，五聚体与五聚体之间存在二硫键，而L1具有自组装成VLP的特性也得益于二硫键形成时的作用力。通过基本重组表达的L1多以不均一VLP形式存在，因此要想获得均一的VLP，首先要进行解聚，可以通过加入一定浓度的还原剂破坏二硫键，然后进行重新组装，即通过有效方法去除还原剂，使二硫键重新形成。本发明即巧妙地将这一解聚重组装过程嵌合在了分离纯化工艺当中。申请人发明人在研究中意外地发现，在还原剂存在条件下，将HPV L1用羟磷灰石层析分离纯化，后在洗脱过程经去还原剂处理，可直接收获高纯度的组装完整且粒径均一的类病毒颗粒。根据上述发现，申请人研究得到了以下技术方案。
本发明的技术方案提供了一种制备人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取含人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒样颗粒的料液进行初步纯化，初步纯化过程中加入还原剂，得到初步纯化液；
2)调节初步纯化液电导率后，进行羟磷灰石层析，分两步进行洗脱，第一步用含盐的pH6.0～9.0的缓冲液I洗脱，第二步用含磷酸根离子的pH6.0～9.0的缓冲液II洗脱，缓冲液I、II均不含步骤1)所述还原剂。
3)收集缓冲液II的洗脱组分，得到粒径均一的人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒颗粒
根据本发明实施例，步骤1)所述初步纯化包括菌体细胞破碎、离心，过滤，在一些实施方式中，还需要阳离子交换层析；所述的阳离子交换层析所用填料为市售的阳离子填料，在一些实施方式中，填料是含有-R-SO3H的强酸型树脂，含有-PO3H2、-PO2H2或-O-PO2H2的中强酸型树脂，含有-COOH或-OH的弱酸型树脂。
根据本发明实施例，步骤1)所述还原剂能破坏二硫键，选自二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β-巯基乙醇(Mercaptoethanol)、三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)、半胱氨酸(L(+)-Cysteine)或抗坏血酸(Vitamin C)。
根据本发明实施例，步骤1)温度为4-30℃，还原剂的浓度为10-20mM。
根据本发明实施例，步骤2)中所述调节初步纯化液电导率为15-25mS/cm。
根据本发明实施例，步骤2)中所述羟磷灰石层析，温度为4-25℃或15-20℃。
根据本发明实施例，步骤2)缓冲液I中所含的盐为不含磷酸根离子的中性盐，选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾。
根据本发明实施例，步骤2)缓冲液I中所含的盐的浓度为1.2～2.0M。
根据本发明实施例，步骤2)中所述缓冲液I选自所有不影响目的蛋白稳定性的溶液，优选为不含还原剂的有酸碱缓冲能力的溶液，包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(Phosphate Buffer，PB)，[三-(羟甲基)-氨基甲烷]-盐酸缓冲液，缓冲液I pH为6.0-9.0或7.0-8.5或7.2-7.8；缓冲液I的浓度为10-100mM或20-80mM或40-60mM。
根据本发明实施例，步骤2)中所述缓冲液I选自含磷酸根离子的溶液，优选地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，磷酸根离子的浓度为50mM-1M或200mM-700mM或400mM-600mM；洗脱缓冲液IIpH为6.0-9.0，或7.0-8.5或7.2-7.8；洗脱线性流速为40-240cm/h或50-120cm/h或60-70cm/h；洗脱缓冲液中不含前述还原剂。
本发明的技术方案提供的方法适于不同型别的人乳头瘤病毒(HPV)VLP的均一化，优选能致癌或具有高风险的病毒株，包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52及HPV58。
本发明的技术方案提供的方法适用于包括痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统等表达出来的类病毒颗粒的均一化，包括天然病毒颗粒的均一化，通常优选酵母表达系统和大肠杆菌表达系统表达的类病毒颗粒的均一化。
本发明的技术方案提供的方法解聚和重组装获得的均一VLP可由L1蛋白质单独组装，也可由L1蛋白质在L2蛋白质的辅助下组装。VLP直径约为50nm。
本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减，并且N-10％到N+10％之间的范围也被公开。例如，对于“VLP直径约为50nm”，则有50nm+/-1％，50nm+/-2％，50nm+/-3％，50nm+/-5％，50nm+/-7％，50nm+/-8％和50nm+/-10％的值被同时公开，同时，50nm-10％到50nm+10％之间的范围也属于公开的范围，亦即45nm-55nm之间的值。
本发明使用的定义“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们组合，也就是说，术语“或”包括每个所列出的单独备选方案以及它们的组合。例如，“还原剂选自二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗坏血酸”表示在一些实施方式中，还原剂可以是二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗坏血酸之中的一种，也可以是其一种以上的组合。
本发明的实施方式中使用的水均为去离子水。
本发明的有益效果在于：(1)能将不均一的VLP均一化，最终获得具有完整颗粒度的VLP；(2)省去额外的解聚重组装步骤，使解聚重组装作用在层析过程中得以实现，简略蛋白纯化步骤、减少工作量的同时，还能有效降低因纯化步骤过多造成的蛋白损失；(3)根据本发明的方法，只需两步层析即可获得高纯度、完整的VLP，省时省力，实验简便，特别是羟基磷灰石具有较高的目的蛋白载量，更易于实现工业化生产。
另外，该方法工艺简单，只需要实验室常用的层析装置；相关工艺步骤上下衔接紧密，中间不需要更换缓冲液；所述填料使用寿命较长，节约成本。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同阶段纯化HPV16L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图2是本发明实施例1经羟磷灰石层析步骤获得的酵母表达的HPV16L1VLP透射电镜观察结果。
图3是本发明实施例1经羟磷灰石层析步骤获得的酵母表达的HPV16L1VLP高压液相色谱-分子筛层析结果。
图4是本发明实施例2所述不同阶段纯化HPV16L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图5是本发明实施例2所述经羟磷灰石层析步骤获得的大肠杆菌表达的HPV16L1VLP透射电镜观察结果。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。
实施例1
1)初步纯化
菌体细胞破碎：收获发酵培养转化表达HPV16L1VLP的毕赤酵母细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞三次，去除发酵培养基组分残余，收集到的菌体细胞于-20℃冻存。取出冻存的菌体，称重后以菌液比1：10比例加入预冷至0℃的含0.2M NaCl、5mM EDTA-2Na、0.05％Tween-80、pH 8.050mM PB缓冲液，搅拌解冻至完全融溶，高压匀浆破碎，1200bar的操作压力下循环两次，使95％以上的菌体细胞破碎，溶胞产物在4℃继续搅拌1h，使目的蛋白完全溶解在溶胞悬液中，同时加入20mM DTT，使存在形式较不均一的目的蛋白完全解聚成为均一性较好的L1蛋白五聚体。
离心+深层过滤澄清：将溶胞悬液于12000g×20min离心，除去大部分的不溶性杂质和菌体碎片，收集上清，微滤膜过滤。微滤装置是Merck Millipore死端过滤器，滤膜孔径大小0.65微米。滞留物用1/5体积的微滤缓冲液冲洗收集残留的溶胞产物。微滤缓冲液是20mM DTT、0.2M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB。获得的含目的蛋白的溶胞悬液置于室温放置待用。
目的蛋白的捕获层析：以下步骤均在室温下进行。GEAKTApurifier UPC10层析系统。装填一个15mL的层析柱填料为GE Marco-Cap-SP强阳离子交换层析介质。该柱在使用前用0.5N NaOH溶液清洗消毒，同时将层析柱处理成OH-型，然后用10CV的去离子水冲洗至中性，再用10CV的微滤缓冲液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05％Tween-80、pH7.450mM PB]充分平衡。将含目的蛋白的溶胞悬液在室温条件下上样至已平衡的阳离子层析柱，上样流速200cm/h，上样完成后用10CV的微滤缓冲液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]冲洗去除未结合杂蛋白及不溶物。以200cm/h的流速，20CV的缓冲液，采用连续线性梯度洗脱法洗脱目的蛋白，从100％缓冲液A[20mM DTT、0.3M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]到100％缓冲液B[20mM DTT、1.0M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.4、50mM PB]，280nm检测，5mL/管分部收集，间隔2-3管进行分析检测，确认目的蛋白峰。将各目的蛋白合并，用0.45微米滤膜过滤，4℃备用。
2)羟磷灰石层析
所有步骤均在室温下进行。GE AKTA purifier UPC10层析系统。装填一个11mL的层析柱填料为Ⅱ型BIO-RAD Marco-Prep Ceramic Hydroxyapatite TypeⅡ。该柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，然后用10CV的去离子水冲洗至中性，再用10CV的平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。取样品液，上样前用平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]适当稀释样品液至其电导率降至20mS/cm，以200cm/h的流速泵入层析柱，上样完成后先用10CV的平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]充分冲洗除去未结合的杂蛋白和不溶物，再用20CV平衡缓冲液B[0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]平衡完全清除DTT残留，消除DTT对后续处理的影响。先用洗脱缓冲液I[1.5M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.4、50mM PB]洗脱去除杂蛋白组分，然后用洗脱缓冲液II[0.05％Tween-80、pH 7.4、500mM PB]洗脱目的蛋白组分。
3)收集人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒颗粒
收集含目的蛋白组分的洗脱峰，进行SDS-PAGE检测、透射电镜观察和HPLC-SEC(High Performance Liquid Chromatography-Size-Exclusion Chromatography，高压液相色谱-分子筛层析)分析。
检测结果见附图。图1中，Mr:标准分子量Marker；1，阳离子层析捕获的HPV16L1；2，羟磷灰石穿透液；3，羟磷灰石过程0.3M NaCl洗脱杂蛋白峰；4，羟磷灰石精纯得到的HPV16L1。电泳结果显示，通过捕获和精纯两步层析，获得的是单一蛋白条带；图2中，视野中可见大量直径为50nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致；从图3分析可知，VLP组装后能获得单一组分峰。
实施例2
1)初步纯化
样品前处理：收获发酵培养转化表达HPV18L1VLP的大肠杆菌细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞一次，以去除发酵培养基组分残余，将收集到的菌体细胞于-20℃冻存。取出冻存的菌体，称重后以菌液比1：10比例加入预冷至0℃的含0.2M NaCl、5mM EDTA-2Na、0.05％Tween-80、pH 8.050mM PB缓冲液，搅拌解冻至完全融溶，高压匀浆破碎，700bar的操作压力下循环两次，能使95％以上的菌体细胞破碎，溶胞产物在4℃继续搅拌1h，使目的蛋白完全溶解在溶胞悬液中，同时加入20mM DTT，使存在形式较不均一的目的蛋白完全解聚成为均一性较好的L1蛋白五聚体。将溶胞悬液于12000g×20min离心，除去大部分的不溶性杂质和菌体碎片，收集上清，即粗提液。
目的蛋白的捕获层析：以下步骤均在室温下进行。GEAKTApurifier UPC10层析系统。装填一个15mL的层析柱填料为GE Marco-Cap-SP强阳离子交换层析介质。该柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，同时将层析柱处理成OH-型，然后用10CV的去离子水冲洗至中性，再用10CV的微滤缓冲液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05％Tween-80、pH7.450mM PB]充分平衡。将含目的蛋白的粗提液在室温条件下上样至已平衡的阳离子层析柱，上样流速200cm/h，上样完成后用10CV的微滤缓冲液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]冲洗去除未结合杂蛋白及不溶物。以200cm/h的流速，20CV的缓冲液，采用连续线性梯度洗脱法洗脱目的蛋白，从100％缓冲液A[20mM DTT、0.3M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]到100％缓冲液B[20mM DTT、1.0M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]，280nm检测，5mL/管分部收集，间隔2-3管进行分析检测，确认目的蛋白峰。将各目的蛋白合并，用0.45微米滤膜过滤，4℃备用。
2)羟磷灰石层析
所有步骤均在室温下进行。GE AKTA purifier UPC10层析系统。装填一个11mL的层析柱填料为Ⅱ型BIO-RAD Marco-Prep Ceramic Hydroxyapatite TypeⅡ。该柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，然后用10CV的去离子水冲洗至中性，再用10CV的平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。取样品液，上样前用平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]适当稀释样品液至其电导率降至20mS/cm，以200cm/h的流速泵入层析柱，上样完成后先用10CV的平衡缓冲液A[20mM DTT、0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]充分冲洗除去未结合的杂蛋白和不溶物，再用20CV平衡缓冲液B[0.05％Tween-80、pH 7.450mM PB]平衡完全清除DTT残留，消除DTT对后续处理的影响。先用洗脱缓冲液I[1.5M NaCl、0.05％Tween-80、pH 7.4、50mM PB]洗脱去除杂蛋白组分，然后用洗脱缓冲液II[0.05％Tween-80、pH 7.4、500mM PB]洗脱目的蛋白组分。
3)收集人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒颗粒
收集含目的蛋白组分的洗脱峰，进行SDS-PAGE检测、透射电镜观。检测结果见附图4、5。图4中，1为粗提液；2为阳离子捕获穿透液；3为阳离子纯化过程杂蛋白峰；4，阳离子纯化过程目的蛋白峰；5，羟磷灰石过程1.5M NaCl洗脱杂蛋白峰；4为羟磷灰石精纯得到的HPV16L1；图5视野中可见大量直径为50nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。
Claims (8)
1.一种制备重组人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取含人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒样颗粒的料液进行初步纯化，所述的初步纯化包括菌体细胞破碎、过滤、阳离子交换层析，初步纯化过程中加入还原剂和非离子型表面活性剂，得到初步纯化液；
2)调节初步纯化液电导率后，进行羟磷灰石层析，分两步进行洗脱，第一步用含盐的pH6.0-9.0的缓冲液I洗脱，第二步用含磷酸根离子的pH6.0-9.0的缓冲液II洗脱，缓冲液I、II均不含步骤1)所述还原剂；所述的缓冲液I为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或[三-(羟甲基)-氨基甲烷]-盐酸缓冲液，缓冲液I的浓度为10～100mM；所述的缓冲液II为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液II中磷酸根离子的浓度为400mM-600mM；其中缓冲液I和缓冲液II中还含有非离子型表面活性剂；
3)收集缓冲液II的洗脱组分，得到粒径均一的人乳头瘤病毒L1蛋白类病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组人乳头瘤病毒L1其表达系统选自痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统或大肠杆菌表达系统。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV5、HPV58。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的还原剂能破坏二硫键，为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗坏血酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的还原剂的浓度为10-20mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的调节初步纯化液电导率为15-25mS/cm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的缓冲液I和缓冲液II的pH值独立地为7.2-7.8。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的缓冲液I中所含的盐为不含磷酸根离子的中性盐，缓冲液I中盐的浓度为1.2～2.0M。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2015102232690 | 2015-05-05 | ||
| CN201510223269 | 2015-05-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105907729A CN105907729A (zh) | 2016-08-31 |
| CN105907729B true CN105907729B (zh) | 2019-08-16 |
Family
ID=56752391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610279535.6A Expired - Fee Related CN105907729B (zh) | 2015-05-05 | 2016-04-29 | 一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105907729B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108524929B (zh) * | 2017-03-06 | 2019-05-07 | 广州瑞贝斯药业有限公司 | 一种狂犬病疫苗的生产方法 |
| EP3420076B1 (en) | 2017-03-06 | 2024-02-21 | Guangzhou Realbenefitspot Pharmaceutical Co., Ltd. | Methods of producing and characterizing virus vaccine and virus vaccine composition |
| EP4382183A2 (en) | 2017-03-06 | 2024-06-12 | Guangzhou Realbenefitspot Pharmaceutical Co., Ltd. | Methods of producing and characterizing virus vaccine and virus vaccine composition |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1354787A (zh) * | 1998-08-14 | 2002-06-19 | 麦克公司 | 纯化人乳头瘤病毒样颗粒的方法 |
| CN101153280A (zh) * | 2006-09-29 | 2008-04-02 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
| CN102803478A (zh) * | 2009-06-16 | 2012-11-28 | 建新公司 | 用于纯化重组aav载体的改进方法 |
| CN103740656A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-04-23 | 大连汉信生物制药有限公司 | 重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及应用 |
| CN104583393A (zh) * | 2012-06-22 | 2015-04-29 | 武田疫苗股份有限公司 | 病毒样颗粒的纯化 |
| CN104650200A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-05-27 | 郑振海 | 一种肿瘤抗原性植物蛋白 |
-
2016
- 2016-04-29 CN CN201610279535.6A patent/CN105907729B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1354787A (zh) * | 1998-08-14 | 2002-06-19 | 麦克公司 | 纯化人乳头瘤病毒样颗粒的方法 |
| CN101153280A (zh) * | 2006-09-29 | 2008-04-02 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
| CN102803478A (zh) * | 2009-06-16 | 2012-11-28 | 建新公司 | 用于纯化重组aav载体的改进方法 |
| CN104583393A (zh) * | 2012-06-22 | 2015-04-29 | 武田疫苗股份有限公司 | 病毒样颗粒的纯化 |
| CN103740656A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-04-23 | 大连汉信生物制药有限公司 | 重组汉逊酵母戊型肝炎类病毒颗粒的纯化方法及应用 |
| CN104650200A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-05-27 | 郑振海 | 一种肿瘤抗原性植物蛋白 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105907729A (zh) | 2016-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11091519B2 (en) | Purification of virus like particles | |
| Cook et al. | Purification of virus-like particles of recombinant human papillomavirus type 11 major capsid protein L1 from Saccharomyces cerevisiae | |
| Kim et al. | One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
| CN105907729B (zh) | 一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 | |
| DE69931053T2 (de) | Verfahren zur reinigung von menschlichen, dem papillomavirus ähnlichen partikeln. | |
| JP5948343B2 (ja) | トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを精製する方法 | |
| CN101153280B (zh) | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 | |
| CN108070032A (zh) | 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 | |
| EP2907821A1 (en) | Method for producing a N-terminaly truncated L1 protein of human papillomavirus (HPV) | |
| US9868762B2 (en) | Method for purifying virus-like particles (VLP) | |
| CN111187353B (zh) | 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法 | |
| CN116535520A (zh) | 一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN108823245A (zh) | 一种病毒样颗粒的纯化方法 | |
| CN109134620A (zh) | 一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法 | |
| RU2445357C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 | |
| RU2322504C1 (ru) | Способ получения генно-инженерного инсулина человека | |
| RU2546240C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 | |
| EP1699811B1 (en) | A process for the preparation and purification of recombinant proteins | |
| Alvim et al. | Production of yellow fever VLPs by perfusion cultivation of stable recombinant HEK293 cells | |
| TW202216992A (zh) | 從細胞培養物中製備純化之桿狀病毒之方法 | |
| RU2445358C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 | |
| CN118240054A (zh) | 一种纯化Sox2蛋白的方法 | |
| CN109750049A (zh) | 重组人乳头瘤病毒52亚型蛋白表达 | |
| CN106148359A (zh) | 重组人乳头瘤病毒33亚型蛋白表达 | |
| CN104878022A (zh) | 编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190816 |