CN109134620A - 一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法 - Google Patents

一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纯化HBc‑VLPs或HBc‑VLPs衍生物的方法，所述方法为：将含有HBc‑VLPs的菌液或HBc‑VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc‑VLPs或纯化的HBc‑VLPs衍生物；本发明提供的纯化方法，通过两步梯度加热，解决了目前通用的一步加热法，面临杂蛋白去除率低与杂蛋白可能进入病毒样颗粒内部造成产品污染的问题，确保产品的质量好，纯度高，经过精制等手段最终可使得产品纯度可达到99％以上，收率可达到77％左右，具有较大的实际应用价值和工业推广前景。

Description

一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法
技术领域
本发明属于生化分离领域，涉及一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，尤其涉及一种使用二次梯度加热法纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis B virus core antigen，HBcAg)由183个氨基酸组成，相对分子质量为21000Da，在真核及原核表达系统中表达时，均能自我装配形成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，呈正二十面体对称的颗粒结构。HBcAg作为一种VLP，不仅自身具有很强的免疫原性，而且可以作为疫苗载体，在其C端、N端以及免疫原区(MIR)均可以插入外源片段而不影响其组装的正确性。HBc-VLP为载体的疫苗如口蹄疫疫苗，疟疾疫苗等均取得了良好的效果，另外，HBc-VLP由于具有空壳结构，也可以用来包裹核酸以及其他的小分子物质。
乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBc-VLPs)作为一种研究广泛的病毒样颗粒，纯化技术在其研究与应用进程中发挥着至关重要的作用。病毒样颗粒为基础的疫苗，由多个亚基自组装而成，与其他种类的疫苗纯化相比，纯化过程不仅要去除宿主蛋白，宿主DNA，内毒素等杂质，还需要去除未正确组装的VLPs，这就为病毒样颗粒的纯化带来了新的挑战。
传统纯化方法主要包括硫酸铵沉淀、超滤除杂、PEG沉淀等。这些方法难以获得高纯度的HBc-VLPs。密度梯度离心是目前实验室制备HBc-VLPs采用较多的方法，采用梯度离心，不仅可以达到较高的纯度，而且可以保持颗粒的结构与免疫原性，但是梯度离心处理量有限，同时操作成本也比较高，难以应用于工业规模化生产。
色谱技术具有分离效率高，应用范围广，易于放大等优点，其已经成功应用于多种VLPs的纯化。目前，利用层析技术发展了一种完整的HBc-VLP的纯化工艺(Expression,purification and characterization of full-length RNA-free hepatitis B coreparticles,Protein Expression and Purification,54(2007)30-37)，但其涉及离子交换层析，凝胶过滤层析以及亲和层洗，步骤繁多，收率很低，不足10％。另外，利用离子填料的扩张床吸附HBc-VLPs达到分离纯化的目的(Direct purification of recombinanthepatitis B core antigen from two different pre-conditioned unclarifiedEscherichia coli feedstocks via expanded bed adsorption chromatography,Journal of Chromatography A,1172(2007)47-56)；还有研究利用离子交换穿透式层析除去体系中的杂蛋白提纯HBc-VLPs(Negative chromatography purification ofhepatitis B virus-like particles using poly(oligo(ethylene glycol)methacrylate)grafted cationic adsorbent,Journal of Chromatography A,1415(2015)161-165；Negative chromatography of hepatitis B virus-like particle:Comparative study of different adsorbent designs,Journal of Chromatography A,1445(2016)1-9)，但是由于离子交换填料由于其配基与颗粒之间存在较强的相互作用力，可能导致大颗粒结构的破坏，往往收率是比较低的。另外，CN102199217B公开了一种采用Ni2+亲和层析纯化方法来纯化乙型肝炎病毒多表位融合蛋白。亲和色谱的载体一般较为昂贵，机械强度不够高，因此不能耐受高压，而且在洗脱的过程中，配基会发生脱落并进入分离体系，给纯化造成额外的负担。因此，HBc-VLPs的纯化仍然是限制其应用的瓶颈问题，发展一种规模化制备的技术是当务之急。
由于HBc-VLPs具有较高的热稳定性，通过对细胞破碎液进行加热，以沉淀除去部分热不稳定的宿主蛋白以及细胞碎片，可以降低后续层析纯化的负担。例如，利用加热的方法直接处理未澄清的细菌破碎原液，再经过进一步的离子交换层析纯化，使目的蛋白的收率和纯度都得到了一定的提高。也另有研究将加热用于层析的后处理，即对离子交换层析样品进行加热处理，同样能够将HBc-VLP的纯度提高到87.5％。但是在这些研究中，通常通过一步加热预处理去除部分杂质，再经过后续的一步层析步骤，因此HBc-VLPs的纯度仍然相对较低。
因此，如何进一步提升HBc-VLPs的纯度，对于HBc-VLPs的研究以及相关的下游研究具有重要的价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，以使得HBc-VLPs及其衍生物经过纯化后的纯度进一步提升，同时避免其他杂蛋白的污染。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。
在本发明中，HBc-VLPs为乙肝核心抗原病毒样颗粒，HBc-VLPs为乙肝核心抗原病毒样颗粒的衍生物。
本发明意外地发现，由于VLPs是由几十甚至几百个亚基自组装而成的具有空腔结构的纳米颗粒，在加热过程中，亚基与亚基之间容易发生结构变化，甚至在颗粒表面产生较大空隙，因此如果在较高温度下进行加热处理，较小分子量的杂蛋白会进入病毒样颗粒空腔内部，造成产品的污染。
而本发明提供的纯化方法，通过二次梯度加热的方法，实现了快速纯化制备HBc-VLPs及HBc-VLPs衍生物；由于HBc-VLPs具有突出的热稳定性，首先加热处理后，沉淀除去热不稳定的宿主蛋白，同时最大限度的保证了目的蛋白的结构，而后进一步提升温度，进一步除去杂蛋白，为后续可选择地精制纯化降低了负担，同时避免了小分子量的杂蛋白在加热过程中进入颗粒的内部，造成产品污染的问题。相比于目前关于HBc-VLPs的纯化方法，纯度得到了较大提高。
本发明提供的纯化方法降低了HBc-VLPs及HBc-VLPs衍生物的生产成本，在获得高纯度蛋白的前提下，节省了时间，提高了收率，收率可达到90％左右，并且可重复性好，稳定性高，适于工业规模化制备，具有较大的实际应用价值和工业推广前景。
优选地，所述第一次的温度低于第二次热处理的温度。
优选地，所述第一次热处理的温度为30℃～60℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃等。
事实上，本发明通过实验验证，第一次热处理的温度应低于70℃，这是由于温度高于70℃时，杂质蛋白进入颗粒内部，进而发现，当热处理的温度在30℃～60℃之间时，能达到较好的处理效果。
优选地，所述第一次热处理的温度为45℃～60℃。
优选地，所述第一次热处理的时间为10min～300min，例如可以是10min、50min、80min、100min、120min、150min、180min、200min、220min、250min、280min或300min等。
优选地，所述第二次热处理的温度为65℃～90℃，例如可以是65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃等。
在本发明中，通过进一步加热处理，没有小分子量的杂蛋白进入HBc-VLPs内部，保证了纯化的效果。
优选地，所述第二次热处理的温度为70℃～80℃。
优选地，所述第二次热处理的时间为10min～300min，例如可以是10min、50min、70min、100min、120min、150min、170min、200min、230min、250min、270min或300min等。
在本发明中，两次热处理的时间相对比较宽泛，只要是能够达到较好的分离效果的处理时间，均可行。本发明中所涉及到热处理的方式，本领域技术人员可选择的方式较多，如水浴加热、油浴加热、沙浴加热等等方式，对菌液进行热处理。
优选地，所述第一次热处理和第二次热处理之间，还包括离心菌液，收集离心后的上清液的步骤。
在本发明中，经过第一次热处理后，此时会沉淀出部分热不稳定的蛋白以及其他杂质，通过离心的步骤，可将热不稳定的蛋白以及其他杂质进行分离，为后续的二次热处理做铺垫。
优选地，所述离心的离心力为5000g～30000g，例如可以是5000g、6000g、8000g、10000g、13000g、18000g、21000g、26000g或30000g等。
优选地，所述离心的时间为10min～40min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min或40min等。
优选地，所述离心时的温度为4℃～25℃，例如可以是4℃、6℃、10℃、11℃、15℃、16℃、19℃、21℃、23℃或25℃等。
优选地，所述第二次热处理后，还包括进一步精制。
优选地，所述精制的方法包括疏水层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，精制的方法不仅仅限于上述所列举的方法，本领域常用的纯化精制技术均可作为精制的方法在本发明中使用。
优选地，所述纯化的HBc-VLPs的纯度大于95％。
优选地，所述纯化的HBc-VLPs衍生物的纯度大于95％。
在本发明中，经过进一步精制的HBc-VLPs及其衍生物的纯度能够达到95％以上。
优选地，所述HBc-VLPs的菌液由如下步骤制备得到：
(1)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBc；
(2)将重组质粒pET21a-HBc转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，离心，收集上清液，得到所述HBc-VLPs的菌液；
优选地，所述HBc-VLPs衍生物的菌液由以下步骤制备得到：
(a)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，而后将目的蛋白的核苷酸序列插入到HBcAg的核苷酸序列中，获得重组质粒pET21a-HBc衍生物；
(b)将重组质粒pET21a-HBc衍生物转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，离心，收集上清液，得到所述HBc-VLPs衍生物的菌液。
在本发明中，HBc-VLPs和HBc-VLPs衍生物的表达，可通过构建工程菌实现表达。一般优选使用大肠杆菌进行表达。质粒的选择优选使用pET21a，可选地质粒包括pET23a、pET28a等等。
优选地，步骤(1)中所述HBcAg的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.
在本发明中，步骤(a)中目的蛋白的核苷酸序列可以是任意可正常表达的功能蛋白的核苷酸序列，包括但不限于以下序列：流感病毒基质蛋白M2e的核苷酸序列、流感病毒核蛋白NP的核苷酸序列或卵清蛋白OVA的核苷酸序列等等。
在本发明中，HBcAg衍生物不仅仅限于上述所列举的蛋白，任何可以插入到HBcAg序列中正常表达的功能蛋白，均适用于本发明。
在本发明中，扩增表达全长的HBcAg的氨基酸序列，其长度为185aa，具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.
在本发明中，一般是将编码外源肽段的HBcAg衍生物的基因序列克隆到HBcAg基因序列的氮端、碳端或者MIR区域进行构建以及后续的转化表达。
优选地，步骤(2)和步骤(b)中转入大肠杆菌表达系统的方法均独立地为热转化法或电转化法。
优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述IPTG的浓度均各自独立地为0.1mmol/L～1mmol/L，例如可以是0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L或1mmol/L等。
在本发明中，使用适宜浓度的IPTG诱导后，目的蛋白即可正确组装成为病毒样颗粒。
优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述破碎菌体的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种。
优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0，例如可以是5.0、5.3、5.8、6、6.5、6.9、7.0、7.3、7.5、8.0、8.1、8.6或9.0等。
优选地，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，经过时间为10min～300min、温度为30℃～60℃第一次热处理后，在离心力为5000g～30000g，温度为4℃～25℃下离心10min～40min，收集上清液，将上清液在温度为65℃～90℃下进行第二次热处理10min～300min，经过进一步精制后得到纯度大于95％纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。
本发明所提供的纯化方法，具有普适性，适于HBc-VLPs这一类物质的分离纯化。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过两步梯度加热，首先可以去除大量热不稳定的杂蛋白，同时保证了目的蛋白的结构，而后进一步提升温度，进一步除去杂蛋白，同时避免了小分子量的杂蛋白进入到颗粒内部，降低后续精制纯度的负担，后续仅需一步层析精制即可获得高纯度的产品。
(2)解决了目前通用的一步加热法，面临杂蛋白去除率低与杂蛋白可能进入病毒样颗粒内部造成产品污染的问题，确保产品的质量好，纯度高。
(3)本发明具有很好的普适性，不仅适用于HBc-VLPs的纯化，而且适用于其衍生物的分离纯化，应用范围广。
(4)本发明操作简单，成本低、时间短，产品纯度高，经过两步加热以及进一步精制，产品纯度可达到99％以上，收率可达到77％左右，适合于工业放大应用。
附图说明
图1是本发明实施例2中测定HBc-VLPs的DSC热稳定性分析图。
图2A是本发明实施例2中HBc-VLPs在不同温度下热处理后的杂蛋白去除率图。
图2B是本发明实施例2中HBc-VLPs释放出的宿主蛋白含量检测图。
图3是本发明实施例3中HBc-VLPs菌体破碎后的上清液、在第一次60℃热处理、第二次70℃热处理三种情况下的高效液相色谱检测图。
图4是本发明实施例4中HBc-VLPs纯化各阶段的SDS-PAGE电泳图，其中M为marker，泳道1为实施例2中得到的具体破碎上清液，泳道2为实施例3中第一次在60℃下热处理后上清液，泳道3为实施例3中第二次在70℃下热处理后上清液，泳道4为实施例4经过精制纯化的产品，泳道5为实施例5中经一步60℃热处理并精制纯化后的产品。
图5为本发明实施例4中纯化后的HBc-VLPs检测结果图。
图6为本发明实施例4中纯化后的HBc-VLPs的透射电镜图(标尺100nm)。
图7为本发明实施例6-8制备的HBc-VLPs衍生物SDS-PAGE检测图，其中M为marker，泳道1为实施例6制备的含HBc-M2e VLP的菌体破碎上清液，泳道2为实施例6制备的HBc-M2eVLP纯化后的纯品，泳道3为实施例7制备的含HBc-NP VLP的菌体破碎上清液，泳道4为实施例7制备的HBc-NP VLP纯化后的纯品，泳道5为实施例8制备的含HBc-OVA VLP的菌体破碎上清液，泳道6为实施例8制备的HBc-OVA VLP纯化后的纯品。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在本发明以下实施例中，大肠杆菌BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；疏水填料，离子交换填料，以及凝胶过滤填料，均可从市面直接购买得到，既可以是在层析柱中预装填好的，也可以是自行将填料装填至层析柱中。
实施例1
本实施例通过以下步骤制备含有HBc-VLPs的菌液
HBc-VLPs质粒构建与转化：乙肝核心抗原的核苷酸序列，SEQ ID NO.1:ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG.
其氨基酸序列SEQ ID NO.2：MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.
通过PCR扩增，将扩增出的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBc并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。
HBc-VLPs菌种活化：LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。灭菌后，冷却至低于50℃，加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL，将大约25mL培养基倒入无菌的培养皿中放置冷却。用涂布棒将少量的菌液(转入质粒后的菌液)在凝固后的平板表面涂布，然后在培养箱中37℃下培养直至长出单菌落(一般12h即可)。
一级扩增培养：从平板上用无菌牙签挑选一株单菌落，加入到含50mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)的菌锥形瓶中，37℃下200rpm下培养12小时，获得活化扩增后的工程菌菌液。
二级扩增培养：按1％的接种量加入到含500mL LB培养基的菌锥形瓶中，37℃下200rpm扩增培养培养至OD600达到0.5-1.0。
目的蛋白诱导表达：用终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，37℃下200rpm继续培养3.5h。
菌体的收集与破碎：发酵液经Hitachi高速离心机4℃，4000rpm离心30min后收集菌体。按照质量体积比1:10的比例(即1g湿菌体重悬于10mL破碎液)将菌体重悬于破碎缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9)中，冰浴超声破碎菌体。超声功率为300W，超声2s后停3s，超声时间为60min。在10000rpm，4℃离心菌体破碎液30min后弃去细胞碎片等沉淀，保留上清，即为含有HBc-VLPs的菌液。
实施例2
本实施例进行HBc-VLPs热稳定性检测及加热温度确定
利用DSC技术检测HBc-VLPs的热稳定性，如图1所示，其变性温度为96℃。为了充分利用HBc-VLPs耐热性这一优点，考察不同加热温度与时间对杂蛋白去除率以及目的蛋白收率的影响，在加热30min情况下，随着对细胞破碎上清液的加热温度从25℃(室温)提高到80℃，杂蛋白的去除率逐渐增加(图2A)。将加热处理后的样品，利用密度梯度离心法纯化得到HBc-VLPs纯品，然后尿素或盐酸胍等变性剂对颗粒进行变性处理，使病毒样颗粒完全裂解，释放出可能包裹到病毒样颗粒内部的大肠杆菌宿主蛋白HCP。透析去除变性剂之后，用ELISA法检测释放出的HCP含量。根据图2B结果可以看出，当加热温度为60℃以及更低温度时，HCP极低；而当加热预处理温度为70℃及以上时，检测到有较高含量的HCP，说明有菌体破碎上清液中的杂质蛋白进入颗粒内部，因此HBc-VLPs热处理的温度应小于70℃。
本实施例中，将含有HBc-VLPs菌体破碎上清液采用60℃处理30min，体系为20mMTris-HCl(pH＝7.9)缓冲液，HBc-VLPs收率为91.14％，纯度为32.14％，杂蛋白去除率为75.3％。
实施例3
本实施例进行二次梯度加热，并进行菌液的高效液相检测
将60℃加热处理30min后的细菌破碎上清，在4℃离心15min后，再次在70℃加热处理30min，4℃离心20min。利用TSK5000高效液相尺寸排阻色谱分析两次梯度加热过程中上清液中蛋白质的变化情况，色谱分析条件为：流动相：50mM pH 6.8的PB buffer；流速：0.5mL/min；上样量：100μL。
结果如图3所示，其中保留体积为5.6mL处的出峰为HBc-VLPs。将60℃热处理前、后的细胞破碎上清进行对比发现，保留体积在11.8mL之后的蛋白的含量大幅度减少。进一步70℃加热30min后，保留体积在11.8mL之前的杂蛋白进一步减少，而11.8mL之后的杂蛋白变化不大。根据HPSEC的原理，小分子量的物质保留时间长，因此表明进一步70℃加热过程中，没有小分子量的杂蛋白质进入病毒样颗粒目标产品内部；同时，利用ELISA检测二次梯度加热后的HBc-VLPs，也证实了其内部没有包裹宿主蛋白。经过二次梯度加热，HBc-VLPs的收率为82.17％，纯度为74.637％。
实施例4
本实施例将实施例3中的产品进一步精制纯化以及表征
HBc-VLP两步加热后的精制纯化：
向上述实施例3中二次加热处理后的上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率为70mS/cm，pH 7.2左右后，进料到预先用电导为70mS/cm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡的Butyl-S Sepharose 6FF疏水层析柱(GE Healthcare，15cm×1.6cm I.D.)中，进料后经继续淋洗，然后用电导为3mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生，收集产品。
制备的HBc-VLP结构表征：
SDS-PAGE表征显示，(图4)单一的21kDa左右的目的条带，说明纯化的HBc-VLPs达到了高纯度，采用HPSEC检测颗粒纯度(图5)，单个对称峰很好，说明了经过以二次加热为核心纯化制备的HBc-VLPs全部为正确组装的完整颗粒。同时，对纯品进行透射电镜TEM(图6)检测，其颗粒呈均一的球形结构，说明纯化后的HBc-VLPs是正确组装的颗粒结构，而且在纯化过程中，颗粒结构没有遭到破坏。根据电泳检测结果，HBc-VLPs的纯度可以达到99.03％，工艺总收率为77.72％。利用ELISA法检测制备的HBc-VLPs纯品，结果表明内部未包裹宿主蛋白。
实施例5
本实施例采用一步加热法纯化HBc-VLPs
将仅经过60℃一步加热30min后的菌液依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液分别调至电导率为70mS/cm，pH 7.2左右后，进料到预先用电导70mS/cm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡的Butyl-S Sepharose 6FF疏水层析柱(GE Healthcare，15cm×1.6cmI.D.)中，进料后经继续淋洗，然后用电导为3mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。洗脱液电泳检测如图4中的条带5所示，除了21kDa左右的目的条带，还明显存在其他杂蛋白，根据电泳分析纯度为78.2％，说明单步加热后，再经过同样的疏水层析精制，达不到理想的纯化效果。
实施例6
本实施通过以下步骤纯化含有流感病毒基质蛋白M2e的HBc-VLPs衍生物
将编码流感病毒基质蛋白M2e的序列插入到HBcAg的MIR区域，即第79aa与80aa之间，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。菌种活化后进行培养，当OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，进行目的蛋白的诱导表达，继续培养4h，离心收集菌体，超声破碎法破碎工程菌，离心后收集上清液。
取100mL含HBc-M2e VLP的破碎上清，总蛋白浓度为5.75mg/mL，正确组装的HBc-M2e VLP为400μg/mL，将上清液的pH用NaOH调至7.4左右后，60℃热处理30min，加热过程中为确保加热均匀，边搅拌边加热，后用10000g的离心力离心15min收集上清，保持上清pH不变，进行第二步80℃加热处理30min，后用20000g的离心力离心20min，弃沉淀，收集上清。
检测上清中目的蛋白的浓度及总蛋白浓度，最后得到完整的HBc-M2e VLP相对于细菌破碎上清液的收率为73.8％，纯度为67.79％。为进一步得到更高纯度的HBc-M2e VLP，在热处理后的上清液中依次用硫酸铵和氢氧化钠溶液调节电导率和pH分别为60mS/cm和pH7.2左右，进料到电导60mS/cm的含有硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡的Butyl-SSepharose 6FF疏水层析柱(GE Healthcare，15cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗，然后电导为3mS/cm磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。
对洗脱峰样品进行SDS-PAGE检测，检测到分子量25kDa上下的目的条带，表明收集到的为HBc-M2e VLP。高效液相凝胶过滤色谱的单一对称峰以及透射电镜检测的均一完整颗粒均说明纯化所得为正确组装的完整HBc-M2e VLP颗粒。同时，利用ELISA法检测制备的HBc-M2e VLP纯品的内部未包裹宿主蛋白。利用高效液相法对完整的HBc-M2e VLP进行定量，考马斯亮蓝法对总蛋白进行定量，计算得到HBc-M2e VLP的收率为61.9％，纯度为99.6％。利用ELISA法检测制备的HBc-M2e VLP纯品，结果表明内部未包裹宿主蛋白。
实施例7
本实施例通过以下步骤纯化含有流感病毒核蛋白NP的HBc-VLPs衍生物
将编码流感病毒核蛋白NP的序列插入到HBcAg的N端，获得重组质粒pET21a-HBc-NP转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。经过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基筛选，挑取成功转入质粒的单菌落扩大培养。取10μL菌液加入至600mL LB培养基中37℃，200rpm培养，OD600＝0.7时，加入IPTG至终浓度为1.0mM进行目的蛋白的诱导表达，3h后停止培养。4000g离心15min收集菌体。菌体以1:20重悬于20mM Tris-HCl(pH＝8.0)的缓冲液中，利用950W的功率，工作2s，停3s，共超声30min对菌体进行超声破碎。
取500mL超声破碎液通过离心去除细胞碎片，上清中蛋白浓度为4.95mg/mL，HBc-NP VLP的颗粒浓度为380μg/mL。将上清液的pH调至pH 7.0左右后，50℃热处理60min，加热过程中为确保加热均匀，边搅拌边加热，后用8000g的离心力离心30min收集上清；之后调节上清液pH为8.2，进行第二步70℃加热处理60min，后用10000g的离心力离心30min，弃沉淀，收集上清。
检测上清中目的蛋白的浓度及总蛋白浓度，最后得到完整的HBc-NP VLP相对于细菌破碎上清液的收率为83.8％，纯度为69.83％。为进一步得到更高纯度的HBc-NP VLP，将热处理后的上清液进料到装有离子交换层析填料DEAE Sepharose FF的层析柱中(GEHealthcare，15cm×1.6cm I.D.)，填料预先用20mM Tris-HCl(pH 8.2)平衡，进料后经继续淋洗，然后经过电导为5mS/cm，含有1M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 8.2)进行梯度洗脱，收集洗脱峰。层析介质采用1.0M氢氧化钠溶液再生。
对含有HBc-NP VLP的洗脱峰样品分别进行SDS-PAGE与高效液相检测，，检测到分子量25kDa上下的目的条带，高效液相检测图为单一对称峰，透射电镜检测表明收集到的为完整颗粒结构的HBc-NP VLP。根据高效液相峰面积计算得到HBc-NP VLP的收率为73.67％，纯度为99.8％。利用ELISA法检测制备的HBc-NP VLP纯品，结果表明内部未包裹宿主蛋白。
实施例8
本实施例通过以下步骤纯化含有卵清蛋白OVA的HBc-VLPs衍生物
将编码卵清蛋白OVA的序列插入HBcAg的C端，获得重组质粒pET21a-HBc-OVA，转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。工程菌经过扩增培养后，取10μL菌液加入到500mL LB培养基中培养，OD600＝0.9时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，开始诱导表达，30℃培养10h后停止培养。6000g离心力下离心10min收集菌体，菌体重悬后用高压匀浆机进行破碎。破碎液经过离心去除细胞碎片。
取10mL含HBc-OVA VLP的破碎上清，总蛋白浓度为4.52g/L，HBc-OVA VLP为260μg/mL。将上清液的pH调至pH 7.9左右后，60℃热处理20min，加热过程中为确保加热均匀，边搅拌边加热，后用6000g的离心力离心15min收集上清，之后继续90℃热处理10min，后用10000g的离心力离心20min，弃沉淀，收集上清。
检测上清中目的蛋白的浓度及总蛋白浓度，最后得到HBc-OVA VLP相对于细菌破碎上清液的收率为62.36％，纯度为56.93％。为进一步得到更高纯度的HBc-OVA VLP，将热处理后的上清液进料到Sephacryl S-400凝胶过滤柱(GE Healthcare，120cm×1.6cmI.D.)，流速为1mL/min，流动相为含有0.15M氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.9)。
对含有HBc-OVA VLP的洗脱峰样品进行检测，SDS-PAGE检测到分子量23kDa上下的目的条带，高效液相检测图为单一对称峰，说明收集到的为HBc-OVA VLP纯品，透射电镜检测表明收集到的为完整颗粒结构的HBc-OVA VLP。根据高效液相峰面积计算得到HBc-OVAVLP的收率为51.93％，纯度为97.3％。利用ELISA法检测制备的HBc-OVA VLP纯品，结果表明内部未包裹有宿主蛋白。
实施例6-8制备的流感病毒基质蛋白M2e的HBc-VLPs衍生物、含有流感病毒核蛋白NP的HBc-VLPs衍生物和含有卵清蛋白OVA的HBc-VLPs衍生物如图7所示，从图7中可以看出，收集到的HBc-VLPs衍生物均为纯品，纯化效果优良。
通过以上实施例可以证明，本发明提供的纯化方法，不仅可以纯化HBc-VLPs，同时可以纯化HBc-VLPs衍生物，为相关研究提供了一种平台化的手段，为制备纯化提供了新的思路和策略。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法
<130> 2018.9.20
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180
tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240
tccagggatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 300
ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420
tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480
agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540
cgggaatctc aatgttag 558
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
165 170 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 185

Claims (10)

1.一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，其特征在于，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次的温度低于第二次热处理的温度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一次热处理的温度为30℃～60℃；
优选地，所述第一次热处理的温度为45℃～60℃；
优选地，所述第一次热处理的时间为10min～300min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次热处理的温度为65℃～90℃；
优选地，所述第二次热处理的温度为70℃～80℃；
优选地，所述第二次热处理的时间为10min～300min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次热处理和第二次热处理之间，还包括离心菌液，收集离心后的上清液的步骤；
优选地，所述离心的离心力为5000g～30000g；
优选地，所述离心的时间为10min～40min；
优选地，所述离心时的温度为4℃～25℃。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次热处理后，还包括进一步精制；
优选地，所述精制的方法包括疏水层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述纯化的HBc-VLPs的纯度大于95％；
优选地，所述纯化的HBc-VLPs衍生物的纯度大于95％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述HBc-VLPs的菌液由如下步骤制备得到：
(1)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBc；
(2)将重组质粒pET21a-HBc转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，离心，收集上清液，得到所述HBc-VLPs的菌液；
优选地，所述HBc-VLPs衍生物的菌液由以下步骤制备得到：
(a)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，而后将目的蛋白的核苷酸序列插入到HBcAg的核苷酸序列中，获得重组质粒pET21a-HBc衍生物；
(b)将重组质粒pET21a-HBc衍生物转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，离心，收集上清液，得到所述HBc-VLPs衍生物的菌液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述HBcAg的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(b)中转入大肠杆菌表达系统的方法均独立地为热转化法或电转化法；
优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述IPTG的浓度均各自独立地为0.1mmol/L～1mmol/L；
优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述破碎菌体的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种；
优选地，所述缓冲溶液的pH值为5.0～9.0。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，经过时间为10min～300min、温度为30℃～60℃第一次热处理后，在转速为5000g～30000g，温度为4℃～25℃下离心10min～40min，收集上清液，将上清液在温度为65℃～90℃下进行第二次热处理10min～300min，经过进一步精制后得到纯度大于95％纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。
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