CN114395015B - 一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白及其制备方法，该产品通过如下方法制备：转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞并在细胞内进行表达、收获并破碎菌体、加热处理、尿素和氯化钠孵育、层析。产品粒径均匀，粒径大小批间一致性好。通过本发明方法制备产品可减少工业化大生产的成本，操作简单，产品杂质残留低，安全性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及重组颗粒蛋白产品及其生产制备方法。
背景技术
重组颗粒蛋白产品可通过多种普通技术知识范围内的制备方法(盐沉淀、密度梯度离心、过滤、层析、透析等)进行制备，但是仍然存在颗粒蛋白在工业化生产制备过程中不易成型、制备纯度低，工业化生产成本高等问题，因此开发适合工业化生产的高效、稳定、简便、低成本的重组颗粒蛋白产品及其制备方法，仍是本领域需要解决的问题。
发明内容
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
>SEQ ID NO:1
DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGGSGGSGGSGGSMKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKKKALAVFLGGVHLIEITFTVPDADTVIKELSFLKEMGAIIGAGTVTSVEQARKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFAKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPVEVAEKAKAFVEKIRGCTE
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用如下步骤制备：
(1)转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为7.0-9.0，在80℃-100℃加热15分钟以上，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠，尿素浓度为6M-8M；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用如下步骤制备：
(1)转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为8.0-10.0，在80℃-95℃加热15-80分钟，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-65℃条件下加热5-20分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用如下步骤制备：
(1)转染含编码所述重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为7.0-8.0，在4℃-25℃加热15分钟以上，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，采用如下步骤制备：
(1)转染含编码所述重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为9.0，在4℃-95℃加热15分钟以上；优选在60℃-90℃加热15-60分钟；更优选在80℃-90℃加热15-45分钟；然后，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其包括如下步骤：(1)转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为7.0-9.0，在80℃-100℃加热15分钟以上，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠，尿素浓度为6M-8M；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其包括如下步骤：(1)转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为8.0-10.0，在80℃-95℃加热15-80分钟，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-65℃条件下加热5-20分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其包括如下步骤：(1)转染含编码所述重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为7.0-8.0，在4℃-25℃加热15分钟以上，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
本发明提供一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其包括如下步骤：(1)转染含编码所述重组颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；(3)a.调节高压均质上清液pH为9.0，在4℃-95℃加热15分钟以上；优选在60℃-90℃加热15-60分钟；更优选在80℃-90℃加热15-45分钟；然后，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入稀释缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；b.将溶液置于50℃-70℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用重悬缓冲液在pH7.0-11.0条件下重悬沉淀；(4)加入尿素和氯化钠；(5)进行阴离子交换层析和疏水层析。
优选地，所述稀释缓冲液含有Tris-盐酸、醋酸-醋酸钠、柠檬酸或磷酸，其pH为6.5-8.0，浓度为50-100mM,优选为70mM、80mM、90mM、100mM。所述稀释缓冲液还可以包含乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为5mM-20mM。所述稀释缓冲液还可以包含去污剂，例如：聚乙二醇辛基苯基醚、吐温(Tween20、Tween80)、SDS、或NP-40等，浓度为0.1％-8％，优选浓度为2％、3％、4％或者5％。
用于表达重组颗粒蛋白的宿主细胞可以是应用基因工程方法生产重组蛋白的任何常规使用的宿主细胞，包括但不限于：人胚胎肾细胞(例如HEK293)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO及其各种亚型，例如CHO-K1、CHO-S、带有谷氨酞胺合成酶系统的CHO-GS细胞)、非洲绿猴肾成纤维细胞(例如COS-7)、大肠杆菌(DH5a、BL21、DH10B)等细胞。
所用细胞培养基可以是本领域已知的任何适合于CHO、HEK、大肠杆菌表达外源蛋白的培养基，包括但不限于：CD CHO、Dynamis、CD02、CD04、CD05、ExpiCHO、DMEM、FreeStyle293、Luria Broth、Terrific Broth等培养基。
使用尿素浓度为0.5-10M,优选地可以为4M、4.5M、5M、5.5M、6M、6.5M、7M、7.5M、8M、8.5M，更优选地可以为6M-8M，氯化钠终浓度为10mM-200mM,优选地可以为50-200mM。
阴离子交换层析介质可使用任何可行的介质，包括但不限于：DEAE SepharoseFF、Q Sepharose FF、Capto DEAE、Capto Q Impres、POROS HQ、POROS 50D、POROS PI、
DEAE、Fractogel TMAE。
疏水层析介质可使用任何可行的介质，包括但不限于：Butyl-S Sepharose 6FF、Butyl Sepharose 4FF、Octyl Bestarose 4FF、Phenyl Sepharose 6FF、Capto Butyl、Capto Phenyl、Capto Phenyl Impres、Capto Octyl。
优选地，离子交换层析填料是
DEAE，疏水层析介质是Octyl Bestarose4FF。
优选地，在阴离子交换层析获得的洗脱收集液中和疏水层析缓冲液中添加稳定剂，稳定剂选自氨基酸、多元醇或糖，氨基酸优选为精氨酸、甘氨酸或组氨酸，糖优选蔗糖、海藻糖，多元醇优选甘油、山梨醇，浓度为20％以上(w/v)。
本发明采用的所有的试剂均可商业化购买获得。
本发明的有益效果：
采用本发明的方法在层析前获得的样品纯度在层析前可达85％以上，减少层析步骤和压力，提高生产效率，节约大规模生产的成本。采用高浓度的尿素和特定浓度的氯化钠可以显著减少杂质，提高除杂效果。本发明的方法可获得粒径均匀、粒径大小批间一致性好、杂质残留低，无溶剂残留的产品。
综上，通过本方法制备所述重组颗粒产品，可减少工业化大生产的成本，操作简单，减少后续层析纯化中有机溶媒的用量，使用该颗粒制备出的产品，有效降低了由颗粒中杂质、宿主蛋白质、有机溶媒、外源性DNA、抗生素、细菌内毒素等物质的残留所带来的副作用，提高了安全性。
附图说明
图1为实施例1中的不同温度和pH条件处理菌体破碎上清液后的离心后上清的SDS-PAGE图。
图2为实施例1中不同加热时间处理的菌体破碎上清液离心后上清的SDS-PAGE图。
图3为实施例2中第二步加热除杂中不同温度和加热时间下离心上清的SDS-PAGE图。
图4为实施例3中两步加热后的纯度的SDS-PAGE图。
图5为实施例4中三种尿素浸泡时间的分子筛层析图谱。
图6为实施例4中分子筛洗脱峰的SDS-PAGE检测结果。
图7为实施例4中四种浓度的氯化钠处理后的层析峰SDS-PAGE分析。
图8为实施例7-9中制备出的重组颗粒产品纯度检测SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1确定大肠杆菌破碎上清液中重组颗粒蛋白的第一步加热工艺条件
采用常规方法将编码目标重组颗粒蛋白序列的质粒转染宿主细胞并在细胞内进行表达，并收获菌体，然后通过高压均质破碎释放目标蛋白，目标重组颗粒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
1、不同pH和温度对菌体破碎上清液中重组颗粒蛋白溶解度的影响
对于pH设置8个考察点：pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0。对于温度设置8个考察点：4℃、25℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。样品为E.coli菌体破碎上清液，调节pH的情况如表1和表2所示。将上述不同pH的样品分别置于4℃、25℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃孵育60min后，立即15000g离心15min，取上清液进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。
表1孵育温度为4℃～70℃的样品pH调节情况
表2孵育温度为80℃和90℃的样品pH调节情况
结果与分析：
由图1可见，当pH处于3.0、4.0、5.0、6.0时，所有温度条件下处理1小时的离心上清液中，均不能分辨出明显的目标重组颗粒蛋白条带，且在pH分别调节至3.0、4.0、5.0、6.0的过程中，菌体破碎上清中出现大量淡黄色沉淀且不能复溶的现象，说明在pH3.0～6.0时，无论温度在4℃至90℃如何变化，重组颗粒蛋白溶解度均极低。由图1a/b可见，在pH7.0、8.0时，当处理温度为4或25℃时，上清液中出现重组颗粒蛋白条带，但条带灰度低于同温度下pH9.0或10.0的样品，推测在pH7.0或8.0，温度在4或25℃处理1小时条件下，重组颗粒蛋白在菌泥破碎液中具有一定的溶解度，但溶解度未达到最大。由图1c/d/e/f/g/h可观察到，在pH为7.0或8.0时，温度分别为40、50、60、70、80、90℃处理1小时后，上清中重组颗粒蛋白条带相比于4℃和25℃组样品减少。该结果说明在pH7.0或8.0条件下，在40℃、50、60、70、80、90℃加热处理1小时后，重组颗粒蛋白溶解性大幅降低。在pH＝9.0时，4℃、25、40、50、60、70、80、90℃孵育1小时后上清液中重组颗粒蛋白均显著高于其他pH组，说明重组颗粒蛋白在pH9.0时溶解性较其他pH更好。80℃和90℃处理1小时的上清液中重组颗粒蛋白浓度高于其他温度处理组，且电泳结果表明样品中杂质含量也较低。在pH9.0时，经过40℃和50℃处理后的离心上清中重组颗粒蛋白含量明显低于4℃和25℃处理后的含量，但在60℃和70℃处理组中上清液重组颗粒蛋白含量重新上升，80℃和90℃时溶解度最高。说明在pH9.0时，重组颗粒蛋白的溶解度在50℃～60℃之间存在一个拐点，在4℃至拐点温度之间，重组颗粒蛋白溶解度随温度上升而下降；在拐点温度至90℃之间，重组颗粒蛋白溶解度随温度上升而上升。当pH为10.0时，在4℃～90℃的不同温度处理1小时的上清液中均存在大量重组颗粒蛋白，说明重组颗粒蛋白在此pH下溶解度较高，但上清中同时观察到存在大量杂质蛋白的存在。
综上，经过第一步加热处理时，E.coli菌体重悬液中的重组颗粒蛋白在不同pH和温度条件下的溶解性表现为：
a)在偏酸性(pH3.0～6.0)条件下，无论采用何种温度处理，重组颗粒蛋白溶解度均较低；
b)在pH＝7.0～8.0条件下，重组颗粒蛋白在4℃-25℃孵育下呈现出一定的溶解度，40℃～90℃加热处理时，重组颗粒蛋白溶解度迅速降低；
c)在pH9.0时，重组颗粒蛋白在4℃～90℃均呈现相较于低pH时的较高溶解度，在80℃～90℃时溶解度最高，且除杂效果最好；重组颗粒蛋白在pH9.0时的溶解度在50℃～60℃之间存在拐点；
d)在pH10.0时，重组颗粒蛋白在4℃～90℃之间均有极高的溶解性，但同时杂质溶解性也很高，除杂效果不佳，且样品跑胶出现拖尾现象，可能由于在该pH条件下蛋白产生变性导致。
2、不同加热时间对菌体破碎上清液中重组颗粒蛋白溶解度的影响
进一步对加热时间进行研究，确定重组颗粒蛋白溶解度较高时的加热时间限度：
样品为E.coli菌体破碎上清液，将pH调节为pH＝9.0，分装后分别置于80℃和90℃加热孵育，设置15min，30min，45min三个加热时间考察点，孵育后立即15000g离心15min，取上清液进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2。
结果与分析：
由图2可见，在pH9.0,80℃～90℃孵育15min,30min,45min后的离心上清液中，存在显著的重组颗粒蛋白条带。与加热孵育1小时条件对比后发现，15min-45min加热后上清的条带灰度小于加热1小时，更加接近于60℃和70℃加热1小时的条带。而其除杂效果与60-90℃加热1小时的效果接近。在80～90℃，pH9.0，加热15min,30min,45min时重组颗粒蛋白同样可以呈现较高的溶解度，同时仍能保持较好的除杂效果。
因此，重组颗粒蛋白产品的第一步加热工艺条件优选为pH8.0～9.0，60～90℃热处理，加热时间15min以上。经过第一步加热，可使重组颗粒蛋白纯度达到60％以上。
因此，重组颗粒蛋白产品的第一步加热工艺条件在pH＝7.0～8.0，4℃-25℃热处理，加热时间15min以上；或者pH＝9.0，4℃～90℃热处理15min以上，尤其是pH＝9.0，60℃～90℃热处理15min以上，可提高重组颗粒蛋白纯度。经过第一步加热，可使重组颗粒蛋白纯度达到60％以上。
实施例2确定大肠杆菌破碎上清液中重组颗粒蛋白的第二步加热工艺条件
E.Coli菌体破碎液经过第一步加热处理分离杂质和重组颗粒蛋白，再对样品进行第二步加热处理，进一步分离杂质和重组颗粒蛋白。在第一步加热的基础上，在pH7.4条件下，摸索处理温度与时间对重组颗粒蛋白和杂质的溶解度的影响。
第一步加热：取菌体破碎上清液调整至pH9.0后，80℃加热1h，12000g 4℃离心30min取上清液。上清液中加入等体积的100mM Tris-HCl、5mM EDTA 4％、Triton、pH 7.4缓冲液和总体积的10％的1M Tris-HCl pH7.4缓冲液。
第二步加热：加热温度设置6个考察点：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。加热时间设置5个考察点：1min,3min,5min,10min,15min。将前处理样品分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃加热1、3、5、10、15min后，立即进行15000g离心60s取上清液。随后对上清液进行SDS-PAGE检测，检测结果如图3。
结果与分析：
由图3a/b可知，在40℃和50℃的加热条件下，重组颗粒蛋白在加热3min后全部沉淀，上清液中无重组颗粒蛋白，在加热的前3min时看到上清液中仍有重组颗粒蛋白条带，推测可能是加热时间较短样品温度尚未升高至设定温度所致。由图3c/d/e/f可知，在60℃、70℃、80℃、90℃加热条件下，上清液中的重组颗粒蛋白含量在前3min随加热时间延长增加，且随着加热温度的升高，重组颗粒蛋白溶解度增加，至5min溶解度不再变化。
综上，经过第一步加热处理后的样品，再进行第二步加热时，表现为：
a)重组颗粒蛋白在50℃条件下溶解度最低，电泳显示杂质蛋白仍然存在于上清液中；
b)60～90℃加热时，温度越高重组颗粒蛋白溶解度越高。
通过对重组颗粒蛋白在不同温度、pH条件下进行实验，发现该颗粒蛋白可在高温条件下保持高稳定性和高溶解度，亦可在特定pH条件下形成可复溶的沉淀。
重组颗粒蛋白产品的第二步加热工艺条件优选为40-90℃、热处理5-15min，pH7.4。
实施例3重组颗粒蛋白产品的两步加热制备工艺
重组颗粒蛋白在大肠杆菌内进行表达，收获菌体后需要通过高压均质破碎释放目标蛋白并进行料液澄清，主要目的是去除菌体碎片与杂质蛋白。料液澄清主要通过加热处理完成。使用实施例1和实施例2的方法进行加热处理，对E.coli破碎后上清液进行第一步加热和第二步加热(即“两步加热”)，并对两步加热步骤的除杂效果和重组颗粒蛋白的纯度进行测算。
取离心收集的E.coli湿菌体60g，重悬于240ml的缓冲液(20mM Tris-HCl、2mMPMSF、pH＝9.0)，使用高压匀质机1000bar压力下破碎，离心后收集到280ml上清液，取其中40ml进行两步加热操作。对破碎后的上清液、第一步加热离心上清液，第二步加热离心沉淀重悬液进行SDS-PAGE分析(如图4所示)。图4显示了E.coli的破碎后上清液，第一步加热后上清液，第二步加热后沉淀重悬液之间的SDS-PAGE检测结果。
结果与分析：
如表3所示，第一步加热中，调节pH＝9.0，80℃水浴加热1小时，恢复至室温后离心收集到约35ml上清液。第二步加热中，向其中加入100mM Tris-HCl、5mM EDTA、4％Triton、pH 7.4缓冲液35ml，再加入7ml的1M Tris-HCl pH7.4，混匀。置于60℃水浴加热10min，立即离心收集沉淀，使用20mM Tris-HCl 5mM EDTA pH＝9.0的缓冲液复溶沉淀。
表3重组颗粒蛋白产品两步加热提取方法
综上，在层析操作之前，经过两步加热工艺，可将重组颗粒蛋白纯度提升至85％以上，从而可减轻后续层析纯化的压力，减少所需的层析步骤和生产成本。
实施例4重组颗粒蛋白产品的尿素和氯化钠联合制备工艺
在两步加热工艺之后，层析纯化之前加入不同浓度的尿素和氯化钠可以显著减少目标重组颗粒蛋白条带附近存在的不明物质，并通过实验确定了最适宜的尿素处理时间和氯化钠浓度。
1、尿素处理：
取菌体破碎上清液调整至pH9.0后，80℃加热1h，12000g,4℃离心30min取上清液。上清液中加入等体积的100mM Tris-HCl,5mM EDTA,4％Triton,pH 7.4缓冲液和总体积的10％的1M Tris-HCl pH7.4缓冲液。60℃加热10min，立即6000g，10min离心去除上清液。将沉淀重溶于20mM Tris-HCl,5mM EDTA,pH 9.0缓冲液中。
设置无尿素对照组、8M尿素短时浸泡(1h)、8M尿素过夜浸泡(16-18h)三种处理条件。对处理后的样品使用分子筛层析进行物质分离(如图5所示)，并对重组颗粒蛋白主峰后的小分子峰进行SDS-PAGE检测以确定其分子量(如图6所示)。
结果与分析：
由图5可知，三种不同时间的高浓度尿素处理之后，分子筛均能分离出分子量小于重组颗粒蛋白主峰的其他物质(peak1-5)，且出峰时间基本相同。由图6可知，只有5号峰(8M尿素浸泡16h)出现明显的25-35kDa之间的条带；3号峰(8M尿素浸泡1h)出现较浅的25-35kDa之间的条带。无尿素浸泡的1号和2号峰则无可见条带。实验表明，8M高浓度尿素浸泡有助于去除部分小分子杂质，优选的浸泡时间12h以上。
2、氯化钠处理
实验样品与尿素实验样品相同。在加入8M尿素的基础上，再加入氯化钠对样品进行处理。设置四个氯化钠浓度考察点：50mM、100mM、150mM、200mM。
分别使用8M尿素和50mM、100mM、150mM、200mM四种浓度的氯化钠对重组颗粒蛋白样品浸泡16h。随后使用Fractogel DEAE M填料对其进行层析纯化，并对其流穿液和洗脱峰各部分进行SDS-PAGE检测(如图7所示)。
结果与分析：
根据图7a可观察到，在8M尿素和50mM氯化钠浸泡16h后，主洗脱峰中的25-35kDa的物质含量明显降低，同时在层析上样流穿液中出现该物质。由图7b可以观察到，提高氯化钠浓度后，25-35kDa的条带相比于50mM氯化钠处理并未明显减少。
a)8M高浓度尿素浸泡重组颗粒蛋白的前处理步骤有助于去除25-35kDa的不明物质。
b)在8M尿素基础上添加氯化钠浸泡同样有助于去除该不明物质，且50mM-200mM氯化钠的除杂效果并无显著差别。
综上，在Fractogel DEAE M层析前对重组颗粒蛋白样品进行预处理的优选工艺条件为8M尿素和50-200mM氯化钠浸泡。
实施例5重组颗粒蛋白产品的两步层析纯化工艺
将先后经过实施例3和实施例4预处理的重组颗粒蛋白样液使用离子交换和疏水层析进行精制，第一步层析纯化使用Fractogel DEAE M层析工艺进行层析纯化，具体步骤和参数参见表4。Fractogel DEAE M洗脱收集液样品先进行缓冲液稀释，添加50％(w/v)蔗糖稳定剂防止下一步层析过程中产生重组颗粒蛋白沉淀，具体参数参见表5。然后使用疏水层析Octyl Bestarose 4FF层析工艺进行精纯(第二步层析纯化)，具体步骤和参数参见表6。
1、第一步层析方法：层析填料-Fractogel DEAE M，保留时间-12.5min
表4：第一步层析方法
表5：第二步层析前样品稀释方法
2、第二步层析方法：层析填料-Octyl Bestarose 4FF，保留时间-12.5min
表6：第二步层析方法
结果与分析：
通过纯度检测发现，进一步经过以上层析介质组合进行精制后，获得产品的纯度可达到99.0％以上。
实施例6稳定剂浓度与种类对重组颗粒蛋白产品的保护作用
在不同层析步骤的间隔中，观察到重组颗粒蛋白因浓度较高出现的沉淀聚集现象，且沉淀现象显示出随温度升高而增加的趋势。需要加入稳定剂提高蛋白稳定性和工艺稳健性。为摸索加入稳定剂的浓度与种类对重组颗粒蛋白的保护作用的影响，本实验选取蔗糖(Sucrose)、山梨糖醇(Sorbitol)、海藻糖(Trehalose)三种稳定剂，根据工艺需要和常规经验，考察下表7所示浓度的稳定剂对重组颗粒蛋白的保护作用。取Fractogel DEAE M的洗脱液，按照表8体积和顺序混合样品、稳定剂与缓冲液，此外，设置将稳定剂替换为纯化水的阴性对照组。将混匀的样品置于30℃下孵育30min，测量并记录孵育后的UV320nm和UV280nm吸光值。UV320nm的吸光值越高，表明蛋白产生聚集沉淀的程度更高。具体结果如表9所示。
结果与分析：
根据表9可知，蔗糖、山梨糖醇和海藻糖均在浓度≧20％时，可以使重组颗粒蛋白溶液在30℃加热30min后不出现沉淀，且三者的效果较为接近。
可见，在Fractogel DEAE M层析之后，使用≧20％浓度的蔗糖、山梨糖醇或海藻糖作为稳定剂，可以对重组颗粒蛋白起到有效的保护作用。由于实验室和生产车间对室内温度控制范围在18-26℃之间，加入稳定剂后可提供足够的蛋白稳定性和工艺稳健性保证。
表7：稳定剂种类及其考察浓度
表8：稳定剂实验样品稀释方法
表9：不同稳定剂和浓度30℃孵育后吸光度
实施例7重组颗粒蛋白产品的工业化生产制备
材料：氯化钠、蛋白胨、甘油、硫酸铵、Tris、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠二水、Triton、尿素购自sigma公司。
采用常规方法转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至大肠杆菌，并在细胞内进行表达。取一支制备的大肠杆菌菌株接种到200ml种子培养基中进行培养，摇床转速200rpm，温度37℃。培养到OD值到3.0时，接种到反应器中培养，培养初始体积16L，初始OD600值为1.0，初始温度为37℃，初始转速为150rpm，pH为7.0。当培养OD600值为15时，加入终浓度为0.2mM IPTG进行诱导表达，调节培养温度为32℃，控制比生长速率为0.04/h，诱导培养22h结束培养。离心收获得到菌泥2992g。
采用10mM Tris缓冲液重悬500g菌泥，调节重悬液pH为8.0。采用1300bar压力对重悬后的菌泥进行破碎，破碎次数为2次。重悬后离心收集上清液。
将离心后的上清液进行90℃的热处理，处理时间为40min，热处理完成后将处理后的悬液冷却至25℃。离心收集上清液。加入10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠、1％Triton，再次将温度升到50℃进行热处理，处理时间为20min，离心，控制离心温度为30℃，弃去离心上清液。离心次数为2次，采用BCA法检测总蛋白含量为5020g。
采用10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠二水、1％Triton缓冲液重悬沉淀，加入6M尿素和氯化钠，搅拌混匀，控制温度2-8℃，孵育12.5h。
6.离子交换层析：采用Tris缓冲液调节尿素处理后样品pH为8.5，采用DEAE阴离子交换填料对尿素处理后的样品进行层析。采用10mM Tris、1mM乙二胺四乙酸二钠二水、6M尿素、20mM氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中的氯化钠浓度为120mM。采用BCA法检测总蛋白含量为4178g。
7.疏水相互作用层析：采用50mM Tris、15％蔗糖、1M氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中不含氯化钠溶液。采用BCA法检测总蛋白含量为2320g。
8.超滤：使用截留孔径为100KDa的膜包对疏水相互作用后的洗脱组分进行超滤浓缩和缓冲液置换。浓缩至蛋白浓度为0.8mg/ml，对浓缩后的蛋白进行稀释处理，采用0.22um除菌过滤器对稀释后的超滤浓缩置换液过滤。过滤后即为重组颗粒纯化产物。经SDS-PAGE检测，纯度为99.4％，SEC-HPLC检测纯度为100％，颗粒的粒径为33nm。SDS-PAGE检测结果如图8(a)所示。
实施例8重组颗粒蛋白产品的工业化生产制备
材料：氯化钠、蛋白胨、甘油、硫酸铵、Tris、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠二水、Triton、尿素购自sigma公司。
采用常规方法转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至大肠杆菌，并在细胞内进行表达。取一支制备的大肠杆菌菌株接种到200ml种子培养基中进行培养，摇床转速200rpm，温度30℃。培养到OD值到2.0时，接种到反应器中培养，培养初始体积16L，初始OD600值为1.0，初始温度为33℃，初始转速为180rpm，pH为7.0。当培养OD600值为20时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达，调节培养温度为32℃，控制比生长速率为0.09/h，诱导培养20h结束培养。离心收获得到菌泥2692g。
采用10mM Tris缓冲液重悬530g菌泥，调节重悬液pH为8.5。采用1200bar压力对重悬后的菌泥进行破碎，破碎次数为3次。重悬后离心收集上清液。
将离心后的上清液进行95℃的热处理，处理时间为50min，热处理完成后将处理后的悬液冷却至25℃。离心收集上清液。加入10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠、1％Triton，再次将温度升到55℃进行热处理，处理时间为15min，离心，控制离心温度为30℃，弃去离心上清液。离心次数为2次，采用BCA法检测总蛋白含量为5320g。
采用10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠二水、1％Triton缓冲液重悬沉淀，加入6M尿素和氯化钠，搅拌混匀，控制温度2-8℃，孵育15h。
6.离子交换层析：采用Tris缓冲液调节尿素处理后样品pH为8.5，采用DEAE阴离子交换填料对尿素处理后的样品进行层析。采用15mM Tris、1mM乙二胺四乙酸二钠二水、7M尿素、20mM氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中的氯化钠浓度为120mM。采用BCA法检测总蛋白含量为4478g。
7.疏水相互作用层析：采用30mM Tris、20％蔗糖、1M氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中不含氯化钠溶液。采用BCA法检测总蛋白含量为2620g。
8.超滤：使用截留孔径为200KDa的膜包对疏水相互作用后的洗脱组分进行超滤浓缩和缓冲液置换。浓缩至蛋白浓度为0.8mg/ml，对浓缩后的蛋白进行稀释处理，采用0.22um除菌过滤器对稀释后的超滤浓缩置换液过滤。过滤后即为重组颗粒纯化产物。经SDS-PAGE检测，纯度为100％，SEC-HPLC检测纯度为100％，颗粒的粒径为33nm。SDS-PAGE检测结果如图8(b)所示。
实施例9重组颗粒蛋白产品的工业化生产制备
材料：氯化钠、蛋白胨、甘油、硫酸铵、Tris、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠二水、Triton、尿素购自sigma公司。
采用常规方法转染含编码重组颗粒蛋白序列的质粒载体至大肠杆菌，并在细胞内进行表达。取一支制备的大肠杆菌菌株接种到200ml种子培养基中进行培养，摇床转速200rpm，温度28℃。培养到OD值到2.0时，接种到反应器中培养，培养初始体积35L，初始OD600值为1.0，初始温度为33℃，初始转速为180rpm，pH为7.0。当培养OD600值为25时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达，调节培养温度为30℃，控制比生长速率为1.2/h，诱导培养20h结束培养。离心收获得到菌泥6152g。
采用10mM Tris缓冲液重悬520g菌泥，调节重悬液pH为8.0。采用1200bar压力对重悬后的菌泥进行破碎，破碎次数为4次。重悬后离心收集上清液。
将离心后的上清液进行85℃的热处理，处理时间为80min，热处理完成后将处理后的悬液冷却至25℃。离心收集上清液。加入10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠、1％Triton，再次将温度升到65℃进行热处理，处理时间为20min，离心，控制离心温度为30℃，弃去离心上清液。离心次数为2次，采用BCA法检测总蛋白含量为4820g。
采用10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸二钠二水、1％Triton缓冲液重悬沉淀，加入6M尿素和氯化钠，搅拌混匀，控制温度2-8℃，孵育24h。
6.离子交换层析：采用Tris缓冲液调节尿素处理后样品pH为8.5，采用DEAE阴离子交换填料对尿素处理后的样品进行层析。采用15mM Tris、1mM乙二胺四乙酸二钠二水、8M尿素、20mM氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中的氯化钠浓度为120mM。采用BCA法检测总蛋白含量为4365g。
7.疏水相互作用层析：采用25mM Tris、30％蔗糖、1M氯化钠缓冲液对层析柱进行平衡，上样，淋洗、洗脱处理，洗脱液中不含氯化钠溶液。采用BCA法检测总蛋白含量为2820g。
8.超滤：使用截留孔径为250KDa的膜包对疏水相互作用后的洗脱组分进行超滤浓缩和缓冲液置换。浓缩至蛋白浓度为0.8mg/ml，对浓缩后的蛋白进行稀释处理，采用0.22um除菌过滤器对稀释后的超滤浓缩置换液过滤。过滤后即为重组颗粒纯化产物。经SDS-PAGE检测，纯度为99.0％，SEC-HPLC检测纯度为100％，颗粒的粒径为32nm。SDS-PAGE检测结果如图8(c)所示。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 烟台派诺生物技术有限公司
<120> 一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys
1 5 10 15
Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr
35 40 45
Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu
50 55 60
Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr
65 70 75 80
Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys
100 105 110
Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala
115 120 125
Lys Lys Lys Ala Leu Ala Val Phe Leu Gly Gly Val His Leu Ile Glu
130 135 140
Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Glu Leu Ser
145 150 155 160
Phe Leu Lys Glu Met Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser
165 170 175
Val Glu Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val
180 185 190
Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly
195 200 205
Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala
210 215 220
Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val
225 230 235 240
Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys
245 250 255
Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe
260 265 270
Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly
275 280 285
Thr Pro Val Glu Val Ala Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile
290 295 300
Arg Gly Cys Thr Glu
305
Claims (5)
1.一种重组颗粒蛋白产品的工业化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)转染含编码颗粒蛋白序列的质粒载体至宿主细胞，并在细胞内进行表达；
(2)收获菌体，并通过高压均质破碎；
(3)a.调节高压均质上清液pH为9.0-10.0，在80℃-100℃加热15分钟以上，恢复至室温后离心，弃沉淀，收集上清液；加入缓冲液，调节pH值为pH7.0-8.0；
b.将溶液置于50℃-65℃条件下加热5-30分钟，立即离心，弃上清，收集沉淀；使用缓冲液在pH9.0-11.0条件下重悬沉淀；
(4)加入尿素和氯化钠，尿素的浓度为6M-8M；
(5)进行阴离子交换层析和疏水层析；
所述重组颗粒蛋白产品如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(3)a中加热温度为80℃-95℃，加热时间15-80分钟；步骤(3)b中加热时间5-20分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，阴离子交换层析介质选自DEAE SepharoseFF、Q Sepharose FF、Capto DEAE、Capto Q Impres、POROS HQ、POROS 50D、POROS PI、Fractogel DEAE或Fractogel TMAE，疏水层析介质选自Butyl-S Sepharose 6FF、ButylSepharose 4FF、Octyl Bestarose 4FF、Phenyl Sepharose 6FF、Capto Butyl、CaptoPhenyl、Capto Phenyl Impres或Capto Octyl。
4.根据权利要求1所述的制备方法，在阴离子交换层析获得的洗脱收集液中和疏水层析缓冲液中添加稳定剂，稳定剂选自氨基酸、多元醇或糖，所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸或组氨酸，糖选自蔗糖、海藻糖或山梨糖醇。
5.根据权利要求4所述的方法，氨基酸选自精氨酸、甘氨酸或组氨酸，糖选自蔗糖、海藻糖或山梨糖醇，浓度为20％以上(w/v)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220921 Address after: 264670 No. 15 Pioneering Road, Yantai High-tech Zone, Shandong Province Patentee after: Yantai pinuo Biotechnology Co.,Ltd. Patentee after: Guangzhou Painuo Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No.15 Chuangye Road, hi tech Zone, Yantai City, Shandong Province Patentee before: Yantai pinuo Biotechnology Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A recombinant granular protein product suitable for industrial production and its preparation method Effective date of registration: 20221208 Granted publication date: 20220923 Pledgee: China Construction Bank Corporation Yantai Branch Pledgor: Yantai pinuo Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980025608 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20220923 Pledgee: China Construction Bank Corporation Yantai Branch Pledgor: Yantai pinuo Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980025608 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |