CN115779683A - 除病毒过滤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了除病毒过滤方法，是低浓度料液所采用的平板膜的垂直过滤，包括漂洗、平衡、上样、淋洗，上样为将经过纯化后的蛋白类料液加载在除病毒过滤膜装置，进行过滤，其中蛋白类料液包括盐酸精氨酸和盐酸组氨酸中的至少一种。本发明方案操作简单，适用性广，成本低廉，且不会对病毒去除率造成影响。
Description
技术领域
本发明是关于生物制药技术，特别是关于一种除病毒过滤方法。
背景技术
2020年版《中国药典》和“ICH Q5A”对于生物制品的病毒安全性有着明确要求，由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品，下游生产工艺中必须包含稳健的病毒清除步骤。最常用的病毒清除工艺包括病毒灭活和病毒过滤。除病毒过滤是基于粒径排阻原理，能够稳健清除各类病毒，且可进行工艺后完整性测试确保工艺的有效性，已被业界广泛接受。
除病毒膜过滤技术是物理拦截，故其对产品质量影响较小，它与其他病毒灭活技术互为补充，在治疗用生物制品生产中得到了广泛的应用，依据纳米级别孔径的膜对病毒颗粒的物理拦截作用而实现病毒去除的，除病毒膜过滤器通常含有纳米孔径的高分子聚合膜，主要依靠分子大小拦截作用，此外还有吸附机制：拦截作用在过滤时，大于膜孔径的物质(如病毒颗粒)被滤膜截留；而小于膜孔径的蛋白，可通过膜孔至滤膜下游。吸附机制部分小于膜孔径的物质也可能通过吸附作用(如静电吸附、范德华力、氢键等)而被吸附在膜表面或膜孔内部。
工艺开发中需要考察过滤器对于料液的处理速率、通量、收率及质量影响。除病毒过滤的载量、滤速和回收率受过滤样品缓冲液组成、电导、pH、样品纯度、样品浓度、样品蛋白特性等因素影响，这些因素在过滤的过程中会导致不同程度堵膜情况。
通过优化以上这些因素来开发除病毒过滤工艺是非常费时费力的，且效率较低，可能最后也很难达到理想的过滤效果，加之除病毒过滤器的成本昂贵，因此，一种通用性好，可以显著改善过滤通量和回收率的方法对蛋白类生物产品的除病毒过滤工艺开发是具有非常重要的意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种除病毒过滤方法，提供了一种提高除病毒过滤膜过滤通量的方法能够有效解决除病毒过滤的膜通量较低，同时蛋白损失较多的问题，提供的技术方案操作简单，适用性广，成本低廉，且不会对病毒去除率造成影响。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了除病毒过滤方法，是低浓度料液所采用的平板膜的垂直过滤，包括漂洗、平衡、上样、淋洗，上样为将经过纯化后的蛋白类料液加载在除病毒过滤膜装置，进行过滤，其中蛋白类料液包括盐酸精氨酸和盐酸组氨酸中的至少一种。
在本发明的一个或多个实施方式中，蛋白类料液中蛋白的浓度为小于15mg/ml。
在本发明的一个或多个实施方式中，蛋白类料液中添加的盐酸精氨酸的浓度为0.1-0.2M。
在本发明的一个或多个实施方式中，蛋白类料液中添加的盐酸组氨酸的浓度为0.05-0.1M。
在本发明的一个或多个实施方式中，蛋白类料液中同时添加0.1M盐酸精氨酸和0.05M盐酸组氨酸。
在本发明的一个或多个实施方式中，漂洗为用漂洗液对除病毒过滤膜装置进行冲洗。优选的漂洗液为注射水。
在本发明的一个或多个实施方式中，漂洗为恒压过滤：压力控制在29psi，漂洗液用量为大于等于100L/m2。
在本发明的一个或多个实施方式中，平衡为用平衡液对除病毒过滤膜装置进行平衡。优选的平衡液为20mM PB pH 7.0。
在本发明的一个或多个实施方式中，平衡为恒压平衡：压力控制在29psi，平衡液用量为大于等于50L/m2。
在本发明的一个或多个实施方式中，淋洗为用淋洗液对过滤膜进行顶洗。优选的淋洗液为20mM PB pH 7.0。
在本发明的一个或多个实施方式中，恒压淋洗：压力控制在29psi，淋洗液用量为大于等于30L/m2。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的除病毒过滤方法，适用于多数重组蛋白，抗体或其他蛋白类生物制品的除病毒过滤过程，操作简便，易于放大生产；促溶试剂的选择可以选用盐酸组氨酸和盐酸精氨酸，是常用试剂，安全性有保证；添加剂不会对蛋白本身质量产生影响，而且还会保护蛋白稳定；极大程度提升除病毒过滤膜的通量和样品的收率。
附图说明
图1是根据本发明一实施方式的抗体A添加不同添加剂除病毒过滤膜通量与载量关系；
图2是根据本发明一实施方式的抗体B添加辅助试剂除病毒过滤膜通量与载量关系；
图3是根据本发明一实施方式的抗体C除病毒过滤对照试验通量与载量关系；
图4是根据本发明一实施方式的抗体C添加不同浓度盐酸精氨酸除病毒过滤膜通量与载量关系。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
样品制备过程：通过基因合成制备带有编码抗体A(结合CD3和CD20靶点的双抗)基因的质粒，将此质粒导入到哺乳动物细胞中，本实例选择CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞Chinese Hamster Ovary)，通过细胞扩增得到一定数量的生产细胞，在3L的发酵罐中进行无血清细胞悬浮培养，带有特定基因的细胞会表达双特异性抗体，并排出到培养液中，14天发酵后，得到双特异性抗体A的发酵液，双特异性抗体A发酵液经过深层过滤去除细胞和细胞碎片等一些大颗粒物质，深层滤器采用Millipore的D0HC和A1HC串联，面积比2：1，通用进口流速150LMH，压力控制<14.5psi，收获后的细胞培养液采用ProteinA亲和层析进行捕获，所用填料为Mabselect SuRe LX，亲和层析步骤采用填料推荐的条件。亲和后样品采用LowpH病毒灭活，灭活结束后回调pH到5.5，进行中间品深层过滤，去除一些宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA，采用阴离子流穿进一步去除过程相关杂质，阴离子填料为Q FF，收集流穿液。下一步采用Capto S Impact进行精纯，去除产品相关杂质，主要去除聚体和碎片，制备出高纯度的样品，进行除病毒过滤。
除病毒过滤步骤：搭建除病毒过滤装置，在上样中加入20mM PB、1MArg-HCl pH7.0至Arg-HCl终浓度为0.2M，作为样品01；在上样中加入20mMPB、1M His-HCl pH 7.0至His-HCl终浓度为0.1M，作为样品02；在上样中加入20mM PB、1M His-HCl pH 7.0至His-HCl终浓度为0.05M，作为样品03；在上样中加入20mM PB、1M His-HCl pH 7.0至His-HCl终浓度为0.08M，作为样品04；对照实验上样样品中不添加辅助试剂分别进行除病毒过滤，纳滤膜均为Millipore的Viresolve Pro Device，操作步骤如表1所示，三者的过滤效果如图1所示。
表1.纯病毒过滤步骤
| 步骤 | 缓冲液 | 体积(L/m<sup>2</sup>) | 进口压力(Psi) |
| 漂洗 | 纯化水 | 100 | ≤29 |
| 平衡 | 20mM PB pH 7.0 | 50 | ≤29 |
| 上样 | N/A | N/A | ≤29 |
| 淋洗 | 20mM PB pH 7.0 | 30 | ≤29 |
表2.除病毒过滤实验数据汇总
表3.除病毒过滤后样品质量数据汇总
从图1中可以看出，样品中分别加入盐酸精氨酸或盐酸组氨酸可以极大提高过滤载量，使其可以从263L/m2到大于560L/m2，且随着实验进行通量衰减幅度较小(衰减10％左右)。并且添加后经过除病毒过滤，对样品质量参数没有影响，此方法提高了纳滤膜载量，过程保持较高的通量水平，同时保证的样品回收率＞98％。方法简单，不需要大量探索实验，高效便捷，效果显著。
实施例2
样品制备过程：通过基因合成制备编码抗体B(结合PD1和CD47靶点的双抗)的质粒，将含有编码双特异性抗体B基因的质粒导入到哺乳动物细胞中，本实例选择CHO-S(中国仓鼠卵巢细胞Chinese Hamster Ovary)，通过细胞扩增得到一定数量的CHO细胞，在3L的发酵罐中进行无血清细胞悬浮培养，带有特定基因的细胞会表达双特异性抗体，并排出到培养液中，经14天发酵后，得到双特异性抗体B的发酵液，双特异性抗体B发酵液经过深层过滤去除细胞和细胞碎片等一些大颗粒物质，深层滤器采用Millipore的D0HC和X0HC串联，面积比2：1，通用进口流速150LMH，压力控制<14.5psi，收获后的细胞培养液采用ProteinA亲和层析进行捕获，所用填料为Mabselect SuRe LX，亲和层析步骤采用填料推荐的条件。亲和后样品采用LowpH病毒灭活，灭活结束后回调pH到5.5，进行中间品深层过滤，去除一些宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA，采用阴离子流穿进一步去除过程相关杂质，阴离子填料为CaptoQ，收集流穿液。下一步采用CHT II进行精纯，去除产品相关杂质，主要去除聚体和碎片，制备出高纯度的样品，进行除病毒过滤。
在除病毒过滤上样样品中加入20mM PB、1MArg-HClpH 7.0和20mMPB、1M His-HClpH 7.0，至体系中终浓度为0.1MArg-HCl、0.05M His-HCl，作为样品11；对照实验不添加辅助试剂。
表4.除病毒过滤实验数据汇总
表5.除病毒过滤后样品质量数据汇总
由图2可以看到，样品中加入同时加入盐酸精氨酸和盐酸组氨酸也可以极大提高过滤载量，可以使其从111L/m2到739L/m2，且随着实验进行通量衰减幅度较小，提高纳滤膜载量，同时保证样品回收率＞99％。添加试剂后经过除病毒过滤，对样品质量参数没有影响，方法简单，不需要大量探索实验，高效便捷。
实施例3
样品制备过程：通过基因合成制备编码抗体C(结合CD3和VEGF靶点的双抗)的质粒，将含有编码双特异性抗体C基因的质粒导入到哺乳动物细胞中，本实例选择CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞Chinese Hamster Ovary)，通过细胞扩增得到一定数量的CHO细胞，在3L的发酵罐中进行无血清细胞悬浮培养，带有特定基因的细胞会表达双特异性抗体，并排出到培养液中，经14天发酵后，得到双特异性抗体C的发酵液，双特异性抗体C发酵液经过深层过滤去除细胞和细胞碎片等一些大颗粒物质，深层滤器采用Millipore的D0HC和A1HC串联，面积比2：1，通用进口流速150LMH，压力控制<14.5psi，收获后的细胞培养液采用ProteinA亲和层析进行捕获，所用填料为Praesto Jetted A50，亲和层析步骤采用填料推荐的条件，洗脱液为50mM Gly-HCl pH3.5。亲和后样品采用Low pH病毒灭活，灭活结束后回调pH到5.5，进行中间品深层过滤，去除一些宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA，采用阴离子流穿进一步去除过程相关杂质，阴离子填料为GigaCap Q-650(M)，收集流穿液。下一步采用CHT II进行精纯，去除产品相关杂质，主要去除聚体和碎片，制备出高纯度的样品，进行除病毒过滤。
除病毒过滤步骤：在上样中加入20mM PB、1M Arg-HCl pH 7.0至Arg-HCl终浓度为0.2M，作为样品21；在上样中加入20mM PB、1MArg-HCl pH 7.0至Arg-HCl终浓度为0.1M，作为样品22；在上样中加入20mM PB、1MArg-HCl pH 7.0至Arg-HCl终浓度为0.15M，作为样品23；对照实验上样样品中不添加辅助试剂进行除病毒过滤，纳滤膜均为Millipore的Viresolve Pro Device，操作步骤如表1所示。
表6.除病毒过滤实验数据汇总
表7.除病毒过滤后样品质量数据汇总
由图3和4可以看到，样品中加入不同浓度的盐酸精氨酸可以极大提高过滤载量，可以使其从15L/m2到870L/m2，且随着实验进行通量衰减幅度较小，同时保证样品回收率＞95％。添加试剂后经过除病毒过滤，对样品质量参数没有影响，方法简单，不需要大量探索实验，高效便捷。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (8)
1.一种除病毒过滤方法，是低浓度料液所采用的平板膜的垂直过滤，包括漂洗、平衡、上样、淋洗，其特征在于，所述上样为将经过纯化后的蛋白类料液加载在除病毒过滤膜装置，进行过滤，其中所述蛋白类料液包括盐酸精氨酸和盐酸组氨酸中的至少一种。
2.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述蛋白类料液中蛋白浓度小于15mg/ml。
3.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述蛋白类料液中添加的盐酸精氨酸的浓度为0.1-0.2M。
4.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述蛋白类料液中添加的盐酸组氨酸的浓度为0.05-0.1M。
5.如权利要求1任一所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述蛋白类料液中同时添加0.1M盐酸精氨酸和0.05M盐酸组氨酸。
6.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述漂洗为恒压过滤：压力控制在29psi，漂洗液用量为大于等于100L/m2。
7.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述平衡为恒压平衡：压力控制在29psi，平衡液用量为大于等于50L/m2。
8.如权利要求1所述的除病毒过滤方法，其特征在于，所述恒压淋洗：压力控制在29psi，淋洗液用量为大于等于30L/m2。
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2022
- 2022-12-16 CN CN202211627037.8A patent/CN115779683B/zh active Active
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