CN109879930B

CN109879930B - 一种重组蛋白的纯化方法

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Publication number: CN109879930B
Application number: CN201910202871.4A
Authority: CN
Inventors: 林殿海; 余登科; 李旭; 罗玲; 何江楠
Original assignee: Zhejiang Yunuojin Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Eunokin Bioengineering (Suzhou) Co., Ltd
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109879930A

Abstract

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种重组蛋白的纯化方法，包括将重组蛋白的发酵液依次经过Blue Bestarose 6 Fast Flow层析、Phenyl Bestarose High Performance‑硫酸铵疏水层析、Bestarose Diamond MD层析、Phenyl Bestarose High Performance‑氯化钠疏水层析和Bestarose DEAE Fast Flow层析。本发明的重组蛋白的纯化方法，提供了具有连贯性好，操作性强且杂质去除和目的蛋白回收率好的一套完整纯化工艺方法；而且，纯化获得的原液经质量检定，检定结果均符合制造与检定规程的要求。

Description

一种重组蛋白的纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种重组蛋白的纯化方法。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是以具有585个氨基酸的蛋白质，它是血清中渗透压的一个重要组成部分，而且起内源和外源配体的载体的作用。白蛋白作为一种载体分子的作用及其惰性性质是它作为一种稳定剂和多肽的运载蛋白的必需特征。白蛋白作为融合蛋白的组份，已经广泛用于稳定其它蛋白质。HSA通过遗传操作的方法，使得编码HSA的DNA或其片段与编码所说的多肽的DNA连接。然后，用该融合核苷酸转化或转染合适的宿主，从而使得合适的质粒表达融合多肽。

重组蛋白是利用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质，即人工设计的蛋白分子。重组蛋白的制备过程中生成的产物，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等；这就要求将目标蛋白与其它成分分离，并得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。简言之，重组蛋白纯化就是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，在根据蛋白的差异性将目的蛋白分离出来。

重组蛋白的纯化处于重组蛋白表达的下游处理阶段，且与上游过程紧密相联。所以在对目的蛋白表达纯化时，要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游对下游的影响。其中，重组蛋白的分离纯化需要考虑以下两点：

一、应尽可能利用蛋白质不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同技术多次进行重组蛋白的纯化；

二、不同的蛋白在性质上有很大区别，每一步重组蛋白的纯化步骤都应当充分利用目的蛋白和杂质成分物理性质的差异。

现有技术中，针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型，包括离子交换法IEX、亲和层析AC、疏水和反相层析、凝胶过滤层析等。到目前为止，并没有一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一套综合的分离流程，以获得较高纯度的蛋白产品。

发明内容

基于现有技术中存在的上述不足，本发明提供一种重组蛋白的纯化方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种重组蛋白的纯化方法，包括将重组蛋白的发酵液依次经过Blue Bestarose6Fast Flow层析、Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析、BestaroseDiamond MD层析、Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析和BestaroseDEAE Fast Flow层析。

作为优选方案，所述Blue Bestarose 6Fast Flow层析的工艺条件包括：所述重组蛋白的发酵液的上样量为15～25mg/mL、流速为40～50cm/h、上样蛋白浓度≤15mg/mL；平衡液为20～30mM NaAC-2～3mM EDTA-0.25～0.4M NaCl，pH为5.0～5.5；第一步洗杂的洗杂液为0.25～0.35M NaCl-20～35mM Tris-2～3.5mM EDTA，pH为7.5～8.5；第二步洗杂的洗杂液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-5～10％乙醇，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-2～3M NaCl-20～30％乙醇，pH为7.5～8.5；在洗脱过程中收集第二个洗脱峰组份，以得到Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样。

作为优选方案，所述Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样经过稀释配制后直接进行Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析。

作为优选方案，所述Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的工艺条件包括：将稀释配制后的Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样进行上样，上样量为10～15mg/mL、流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.7～1M硫酸铵，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.2～1M硫酸铵。

作为优选方案，所述Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的过程包括多次洗脱处理，洗脱所用的洗脱液中的硫酸铵的浓度依次降低；当UV示数大于100时开始收集洗脱组份；其中，洗脱组份分段接样，根据相关蛋白及电泳结果进行合样处理，以得到Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的下样。

作为优选方案，所述Bestarose Diamond MD层析的工艺条件包括：将PhenylBestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的下样采用稀释液稀释至电导率为15～25mS/cm以进行上样，上样量为10～20mg/mL，流速为50～70cm/h；平衡液为20～30mM PB-0.3～0.4M NaCl，pH为7.5～8.5；洗杂液为20～30mM PB-0.6～0.8M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM NaAC-2～3mM EDTA-0.2～0.3M NaCl，pH为3～5。

作为优选方案，所述Bestarose Diamond MD层析的工艺条件还包括：洗脱样品采用去除洗脱峰首尾的方式进行收集，洗脱峰起始后开始接样至核酸蛋白检测仪吸收值降至约1/4峰高处停止接样，以得到Bestarose Diamond MD层析的下样。

作为优选方案，所述Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的工艺条件包括：将Bestarose Diamond MD层析的下样与4～6M NaCl溶液混合以进行上样，上样量为10～15mg/mL，流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mM PB-3～4M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM PB-0.8～1M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱组份从洗脱峰起始后开始接样至洗脱结束，以得到Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的下样。

作为优选方案，所述Bestarose DEAE Fast Flow层析的工艺条件包括：将PhenylBestarose High Performance-氯化钠疏水层析的下样超滤后进行上样，上样量为10～25mg/mL，流速为50～70cm/h，上样蛋白浓度≤10mg/mL；平衡液为5～15mM PB-50～60mMNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为5～15mM PB-0.1～0.3M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱峰起始后分段收集洗脱组份，将HCP含量不高于25ppm的洗脱组份进行合并，以得到纯化后的重组蛋白原液。

作为优选方案，每批次重组蛋白的发酵液均分两次进行Blue Bestarose 6FastFlow层析，单次Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样量匹配单次PA Phenyl BestaroseHigh Performance-硫酸铵疏水层析，单次PA Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的下样量匹配单次Bestarose Diamond MD层析、单次Bestarose Diamond MD层析的下样量匹配单次Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析，最后将两次Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的下样进行合并并超滤后的样品量匹配一次Bestarose DEAE Fast Flow层析，Bestarose DEAE Fast Flow层析后即得纯化后的重组蛋白原液。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

本发明的重组蛋白的纯化方法，提供了具有连贯性好，操作性强且杂质去除和目的蛋白回收率好的一套完整纯化工艺方法；而且，纯化获得的原液经质量检定，检定项目包括等电点、肽图、N端氨基酸序列、纯度、相关蛋白、高分子蛋白、外源性DNA残留量、宿主细胞蛋白质残留、活性、蛋白质含量、细菌内毒素等，检定结果均符合制造与检定规程的要求，表明本发明的纯化工艺生产的原液符合预期的质量要求，满足目前阶段生产临床试验用样品的需要。

附图说明

图1是本发明的重组蛋白的纯化方法的流程图；

图2是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例1中的色谱检测图；

图3是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例2中的色谱检测图；

图4是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例2中的电泳图；

图5是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例3中的色谱检测图；

图6是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例4中的色谱检测图；

图7是本发明的重组蛋白的纯化方法应用在具体实施例5中的色谱检测图；

图8是本发明的重组蛋白的纯化方法得到的原液与对照品的等电点图；

图9是本发明的重组蛋白的纯化方法得到的原液的高效液相分子筛检测色谱图；

图10是本发明的重组蛋白的纯化方法得到的原液的高效液相反相检测色谱图；

图11是本发明的重组蛋白的纯化方法得到的原液与对照品的肽图；

图12是本发明的重组蛋白的纯化方法在具体应用中的优选流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。

本发明的目的在于提供一个具有连贯性好，操作性强且杂质去除和目的蛋白回收率好的一套完整纯化工艺方法，以便解决重组人血清白蛋白(HSA)-生长激素(rhGH)的纯化提取问题。

一、粗纯化研究

本发明研究药物发酵液超滤浓缩脱盐后，进行层析纯化(本发明研究药物高浓度硫酸铵不能沉淀，故无蛋白质沉淀分离步骤)。以发酵超滤浓缩液作为样品试验了适用于粗纯化阶段的几种不同层析方法中常用的层析介质分离性能(如杂质去除效果、流速、载量、层析收率等)，如表一所示，根据分离性能筛选捕获介质和粗分离介质。试验的层析介质有疏水介质Phenyl HP、Phenyl FF，离子交换介质SP FF、Bestarose DEAE Fast Flow、Q，ANXFF亲和层析介质Blue Bestarose 6Fast Flow。分离性能如下：

表一不同层析介质分离纯化HSA-rhGH发酵液的性能及特点

因发酵液样品中含有的色素能够与阴离子交换介质牢固结合而污染层析介质，导致介质不能清洗彻底，影响介质的重复利用，故不选择Q FF、Bestarose DEAE Fast FlowFF、ANX FF等阴离子层析作为捕获层析。

疏水层析介质捕获目标蛋白时，Phenyl HP能高效去除样品中的杂质及色素，收率高，但是发酵液样品粘度较大、填料介质粒径小、反压大等缺点导致在层析过程中经常出现层析柱塌陷、裂开等情况，严重影响层析生产，不适合作为大批量生产的第一步捕获介质。Phenyl FF杂质去除效果和色素去除效果比Phenyl HP差，作为捕获介质效果不佳。

阳离子交换层析SP FF作为捕获层析时，有流速快，载量较高的优点，但是杂质去除效果不明显，对后续纯化要求更高，不是捕获层析的优选介质。

Blue Bestarose 6Fast Flow层析具有特异结合白蛋白性能而特异性捕获发酵液中目标蛋白，与配基结合弱的核酸物质、蛋白酶、杂蛋白、色素等被高效去除，且载量高、流速高、收率高，在高效捕获目标蛋白的基础上去除杂质及色素，是捕获层析的优选介质，经过试验确定HSA-rhGH纯化分离第一步捕获层析为Blue Bestarose 6Fast Flow层析。

Phenyl HP(Phenyl Bestarose High Performance)介质具有高效分离性能，在Blue Bestarose 6Fast Flow层析捕获后，样品粘度降低，选择Phenyl HP作为进一步分离介质。通过对比发现，Phenyl HP以硫酸铵为流动相的层析效果比氯化钠作为流动相具有更高的分辨率，杂质及色素去除更集中，因此选择了Phenyl HP硫酸铵疏水层析。硫酸铵疏水层析能够高效去除Blue Bestarose 6Fast Flow层析下样的杂蛋白、色素及相关蛋白。杂蛋白及相关蛋白的去除能够提高样品的稳定性，色素的进一步去除使得样品利于精纯化介质选择。同时Phenyl HP硫酸铵疏水层析特性(高盐浓度结合样品)使其能够与BlueBestarose 6Fast Flow层析自然连贯的衔接，省去了样品超滤/脱盐等处理步骤。因此选择Phenyl HP硫酸铵疏水层析为HSA-rhGH纯化分离的第二步层析。

HSA-rhGH粗纯化阶段以Blue Bestarose 6Fast Flow(BL层析)为第一步捕获层析，以Phenyl Sepharose High Performance硫酸铵疏水层析(PA层析)为第二步层析进行粗分离。

二、精纯化研究

经过粗纯化后，样品中核酸物质、蛋白酶、杂蛋白、色素等被大量去除，残留少量宿主蛋白、高分子聚合物等杂质需进一步精纯化去除。试验了适用于精制纯化阶段的几种不同层析方法中常用的层析介质(表二)，以粗纯化下样作为样品，研究不同层析介质分离性能，根据分离性能及特点确定精纯化层析工艺。研究的层析介质有疏水介质Phenyl HP，离子交换介质ANX FF、Bestarose DEAE Fast Flow FF、复合离子交换介质MMC、BestaroseDiamond MD，分子筛介质S-100、S-300。分离性能结果如下：

表二不同层析介质分离纯化HSA-rhGH粗纯样品的性能及特点

根据试验结果，精纯化第一步层析选择Bestarose Diamond MD层析(MD层析)因为Bestarose Diamond MD介质能够有效去除硫酸铵疏水层析残留的低分子量杂质，层析下样电泳检测无明显低分子量杂带，且Bestarose Diamond MD填料一定程度耐盐，能够与硫酸铵疏水层析连贯地衔接，硫酸铵疏水层析下样样品不需要超滤或脱盐处理，稀释后即可上样。另外经实际检测，Bestarose Diamond MD去除HCP效率高达95％。

精细纯化第二步选择Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析(PS层析)，主要是因为Phenyl HP层析介质能进一步有效降低样品中色素含量且蛋白损失较少。因靠近原液步骤，所以不用硫酸铵而用NaCl为流动相。Phenyl Bestarose HighPerformance-氯化钠疏水层析高盐上样能够与Bestarose Diamond MD自然衔接，且PhenylBestarose High Performance-氯化钠疏水层析HCP去除效率达60％。

精细纯化第三步选择Bestarose DEAE Fast Flow层析，研究结果表明BestaroseDEAE Fast Flow和S-300都能很好去除高分子物质，经过前四步层析纯化后，高分子聚合物含量约2％，使用Bestarose DEAE Fast Flow和S-300都能够满足高分子的去除效果，保证原液质量。但分子筛层析分离效果依赖柱效，上样体积小、收率较低、工作周期长，而Bestarose DEAE Fast Flow层析不仅操作方便，载量高，且在去除高分子物质的基础上能进一步去除HCP、内毒素，层析稳定，收率高，因此最后一步选用Bestarose DEAE Fast Flow层析。

故HSA-rhGH精细纯化阶段层析步骤为：Bestarose Diamond MD(简称MD)为第一步层析，Phenyl HPNaCl疏水(简称PS)为第二步层析，Bestarose DEAE Fast Flow层析(简称DE)为第三步。

因此，如图1所示，本发明的重组蛋白的纯化方法，包括以下五个层析工艺步骤：

(1)Blue Bestarose 6Fast Flow层析(简称BL层析)；

(2)Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析(简称PA层析)；

(3)Bestarose Diamond MD层析(简称MD层析)；

(4)Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析(简称PS层析)；

(5)Bestarose DEAE Fast Flow层析(简称DE层析)。

本发明的纯化步骤(1)：BL层析在满足捕获目标蛋白的同时又能去除发酵液中的杂质和色素，层析收率约65％，BL层析下样经过稀释配制后可直接进行纯化步骤(2)：PA层析，该层析收率65％左右，洗脱组份分段接样进行相关蛋白(RP-HPLC)及SDS-PAGE非还原电泳检测，将总相关蛋白应不高于5％且电泳杂质合格的样品合并进行纯化步骤(3)：MD层析，MD层析进一步去除PA层析下样中的杂质及HCP，研究表明HCP去除效率高达95％，蛋白收率75％左右；特别是配制上样时只需将PA层析下样稀释至电导率为15-25mS/cm范围内即可，工艺衔接自然；纯化步骤(4)：PS层析能够进一步去除MD层析下样中的绿色色素，同时HCP的去除效果也高达60％，蛋白收率85％左右；纯化步骤(5)：DE层析可高效去除PS层析下样中的高分子聚合物，层析下样样品纯度99.5％以上，高分子含量低于0.5％，且DE层析进一步去除了样品中的HCP，去除效率可达60％以上，保证了原液质量。

本发明的纯化工艺中层析步骤间连贯性好，可操作性强，五步层析间只有一步超滤脱盐步骤，便于工艺放大，可自动化生产。

其中，纯化步骤(1)中提到的BL层析具有特异结合白蛋白性能而特异性捕获发酵液中目标蛋白，与配基结合弱的核酸物质、蛋白酶、杂蛋白、色素等被高效去除，且载量高、流速高、收率高，在高效捕获目标蛋白的基础上去除杂质及色素。层析收率约65％，且BL层析样品稀释后可直接进行下一步纯化层析。

BL层析优选的参数及条件为：上样量15～25mg/mL，流速40～50cm/h，上样蛋白浓度≤15mg/mL，平衡液为20～30mM NaAC-2～3mM EDTA-0.25～0.4M NaCl，pH为5.0～5.5；第一步杂质洗脱的条件为0.25～0.35M NaCl-20～35mM Tris-2～3.5mM EDTA，pH为7.5～8.5；第二步杂质洗脱条件为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-5～10％乙醇，pH为7.5～8.5；第三步的洗脱条件为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-2～3M NaCl-20～30％乙醇，pH为7.5～8.5；在第三步洗脱过程中收集第二个洗脱峰组份，以得到BL层析的下样；洗脱后用5.0M尿素处理层析柱。其中，总蛋白收率约65％，下样2～8℃保存，保存期限暂定4天。

其中，纯化步骤(2)中提到的PA层析具有高效分离性能，在Blue层析捕获后，样品粘度降低，硫酸铵疏水层析能够高效去除BL层析下样的杂蛋白、色素及相关蛋白。杂蛋白及相关蛋白的去除能够提高样品的稳定性，色素的进一步去除使得样品利于精纯化介质选择。同时PA层析特性(高盐浓度结合样品)使其能够与BL层析自然连贯的衔接，省去了样品超滤/脱盐等处理步骤。

PA层析优选的条件为：将稀释配制后的BL层析的下样进行上样，流速40～50cm/h，上样量范围10-15mg/mL；平衡液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.7～1M硫酸铵，pH为7.5～8.5；第一次的杂质洗脱条件为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.4～0.6M硫酸铵，pH为7.5～8.5(冲洗1/2CV，CV表示柱体积)；第二次的洗脱条件为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.1～0.3M硫酸铵，pH为7.5～8.5；洗脱后用注射用水处理层析柱。洗脱组份分段接样，根据相关蛋白(RP-HPLC)及电泳结果进行合样处理，层析收率60-70％，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。

其中，纯化步骤(3)中提到的MD层析能够有效去除硫酸铵疏水层析残留的低分子量杂质，层析下样电泳检测无明显低分子量杂带，且MD层析填料一定程度耐盐，能够与硫酸铵疏水层析连贯地衔接，硫酸铵疏水层析下样样品不需要超滤或脱盐处理，稀释后即可上样。另外经实际检测，MD层析去除HCP效率高达95％。

MD层析的优选条件为：将PA层析的下样采用20mM PB pH8.0稀释液稀释至电导率为15～25mS/cm以进行上样，上样量为10～20mg/mL，流速为50～70cm/h；平衡液为20～30mMPB-0.3～0.4M NaCl，pH为7.5～8.5；杂质洗脱条件为杂质洗脱液为20～30mM PB-0.6～0.8M NaCl(冲洗5CV)；样品洗脱液为洗脱液为20～30mM NaAC-2～3mM EDTA-0.2～0.3MNaCl，洗脱后用20mM NaAC pH4.0处理层析柱。洗脱样品采用去除洗脱峰首尾的方式进行收集，洗脱峰起始后约1/15CV开始接样至核酸蛋白检测仪吸收值降至约1/4峰高处停止接样。层析收率75％左右，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。

纯化步骤(4)中提到的PS层析，能进一步有效降低样品中色素含量且蛋白损失较少。PS层析高盐上样能够与MD层析自然衔接，且PS层析的HCP去除效率达60％。

PS层析的优选条件为：将MD层析下样中加入1.5倍体积的4～6M NaCl溶液即可作上样，流速40～50cm/h，上样量范围10-15mg/mL；平衡条件3.0M NaCl 20mM PB pH8.0，平衡液为20～30mM PB-3～4M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM PB-0.8～1M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱组份从洗脱峰起始后开始接样至洗脱结束，以得到PS层析的下样。然后用注射用水处理层析柱，洗脱牢固结合的色素。蛋白收率85％左右，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。

其中，在纯化步骤(5)中提到的DE层析，不仅操作方便，载量高，且在去除高分子物质的基础上能进一步去除HCP、内毒素，层析稳定，收率高。DE层析下样的质量属性研究发现DE层析高分子去除效率高达90％，洗脱下样高分子含量低于0.5％，SEC-HPLC纯度高于99.5％，HCP去除效率也在60％以上，层析下样HCP含量10ng/mg左右，层析效果符合预期，层析下样满足HSA-rhGH原液质量要求。

DE层析的优选条件为：将PS层析的下样超滤后进行上样，上样量为10～25mg/mL，流速为50～70cm/h，上样蛋白浓度≤10mg/mL；平衡液为5～15mM PB-50～60mM NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为5～15mM PB-0.1～0.3M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱峰起始后分段收集洗脱组份，将HCP含量不高于25ppm的洗脱组份进行合并，以得到纯化后的重组蛋白原液；洗脱后用1.0M NaCl 10mM PB pH8.0处理层析柱。其中，分段收集洗脱组份，洗脱峰起始约1/15CV(200mL)/瓶接两瓶，然后第三瓶集中收集，接收的样品进行HCP检测，为了满足原液的质量要求，将HCP含量较低的合格样品(不高于25ppm)合并，层析收率80％以上。

纯化获得的原液经质量检定，检定项目包括等电点、肽图、N端氨基酸序列、纯度、相关蛋白、高分子蛋白、外源性DNA残留量、宿主细胞蛋白质残留、活性、蛋白质含量、细菌内毒素等，检定结果均符合制造与检定规程的要求，表明本发明工艺生产的原液符合预期的质量要求，满足目前阶段生产临床试验用样品的需要。

将本发明的重组蛋白的纯化方法应用于20180802批次发酵的具体实例中，如下所示：

实施例1：Blue Bestarose 6Fast Flow层析(BL层析)

试验材料：核酸蛋白检测仪，蠕动泵，N3000数据采集系统，BXK层析柱，pH计，电子天平，不锈钢桶，血清瓶，量筒无菌手套等；配制检测所需的母液。

实施方案：配制BL亲和层析A、B、C、D、E液及清洗液。使用A液以线性流速40cm/h对层析柱(体积为6L)进行柱平衡操作，平衡时间≥2.5h，平衡体积≥5CV(CV表示柱体积)，检测流出液pH及电导率，检测结果应同A液基本一致。上样量15-25mg/mL，上样蛋白浓度≤15mg/mL，以流速40cm/h加载样品，注意核酸蛋白检测仪UV示数变化。以流速40cm/h依次使用BL亲和层析B、C、D液冲洗层析柱。D液冲洗1/2柱体积时出现第一个洗脱峰，当D液洗脱到1个柱体积时出现第二个洗脱峰，并在第二洗脱峰的起始位置开始收集该目标洗脱组分，如图2所示，图中的两个黑点表示收集目标洗脱组分的起始位置和结束位置。洗脱后用5.0M尿素处理层析柱。总蛋白收率约65％。样品经电泳分析并进行下一步层析，下样2～8℃保存，保存期限暂定4天。

实施例2：Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析(PA层析)

实施方案：配制PA亲和层析A、B、C液及清洗液。使用A液以线性流速40cm/h(体积流速约210ml/min)对层析柱(体积为6L)进行柱平衡操作，平衡时间≥2.5h，平衡体积≥5CV，检测流出液pH及电导率，检测结果应同A液基本一致。将BL层析收集的样品通过PA上样稀释液稀释后上样，上样量范围10-15mg/mL。以流速40cm/h加载样品到层析柱，依次使用A、B、C液冲洗层析柱，其中A液冲洗1-2柱体积，B液冲洗0.5柱体积后换C液冲洗层析柱，使用0.5柱体积的B液洗脱时，UV示数大于100开始收集样品。洗脱组份分段接样，根据相关蛋白(RP-HPLC)及电泳结果进行合样处理(附检测数据)，洗脱后用注射用水处理层析柱；层析收率60-70％，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。其中，洗脱组份分段接样，分段接样①、②、③、④、⑤的起止位置如图3所示，先接500mL、500mL、2L、1.5L、1.5L至峰落；分段接样①、②、③、④、⑤的相关蛋白(RP-HPLC)检测数据如下表三所示，以及电泳检测图如图4所示，泳道1：上样；泳道2：流穿；泳道3：洗杂；泳道4：PA-⑤；泳道5：PA-④；泳道6：PA-③；泳道7：PA-②；泳道8：PA-①；泳道9：对照品；泳道10：Marker。相关蛋白(RP-HPLC)检测大于90％及电泳检测无杂带的进行合样处理，以RP-HPLC为主；故而将分段接样①、②、③进行合样处理。

表三分段接样①、②、③、④、⑤的RP-HPLC检测数据

实施例3：Bestarose Diamond MD层析(MD层析)

实施方案：配制MD亲和层析A、B、C、D液及清洗液。使用A液以线性流速60cm/h(体积流速约150ml/min)对层析柱(体积为3L)进行柱平衡操作，平衡时间≥100min，平衡体积≥5CV，检测流出液pH及电导率，检测结果应同A液基本一致。将Phenyl HP硫酸铵疏水层析下样用20mM PB pH8.0稀释液稀释至电导率15-25mS/cm范围内上样，上样量范围10-20mg/mL。以流速60cm/h加载样品到层析柱，依次使用A液平衡、B液洗脱杂质、C液洗脱样品、D液冲洗层析柱。如图5所示，洗脱样品采用去除洗脱峰首尾的方式进行收集，洗脱峰起始后约1/15CV开始接样至核酸蛋白检测仪吸收值降至约1/4峰高处停止接样。层析收率75％左右，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。

实施例4：Phenyl NaCl疏水层析(PS层析)

实施方案：配制PS亲和层析A、B液及清洗液。使用A液以线性流速40cm/h(体积流速约100ml/min)对层析柱(体积为3L)进行柱平衡操作，平衡时间≥2.5h，平衡体积≥5CV，检测流出液pH及电导率，检测结果应同A液基本一致。将MD层析下样中加入1.5倍体积的5.0MNaCl溶液即可作上样，上样量范围10-15mg/mL，以流速40cm/h加载样品到层析柱。依次使用A液平衡、B液洗脱，洗脱组份可从洗脱峰起始后约1/20CV开始接样至洗脱结束(如图6所示)；然后用清洗液处理层析柱，洗脱牢固结合的色素。蛋白收率85％左右，下样样品2～8℃保存，保存期限暂定4天。

实施例5：Bestarose DEAE Fast Flow层析(DE层析)

试验材料：核酸蛋白检测仪，蠕动泵，N3000数据采集系统，INDEX层析柱，、CpH计，电子天平，不锈钢桶，血清瓶，量筒无菌手套等；配制检测所需的母液。

实施方案：配制DE亲和层析A、B、C液及清洗液。使用A液以线性流速60cm/h(体积流速约150mL/min)对层析柱(体积为3L)进行柱平衡操作，平衡时间≥2.5h，平衡体积≥5CV，检测流出液pH及电导率，检测结果应同A液基本一致。将PS下样超滤后的样品根据蛋白总量稀释，上样量10-25mg/mL，上样蛋白浓度≤10mg/mL，以流速60cm/h加载样品到层析柱。依次使用A液平衡、B液洗脱，分段收集洗脱组份，如图7所示，洗脱峰起始约1/15CV(200mL)/瓶接二瓶，然后第三瓶集中收集，接收的样品进行HCP检测，检测结果如表四所示。

表四接收的样品的HCP检测结果

名称	HCP检测数据(ppm)
		DE-①	18.37
DE-②	5.95
		DE-③	8.43

为了满足原液的质量要求，将HCP含量较低的合格样品(不高于25ppm)合并，层析收率80％以上。

依次经过上述实施例1-5的层析步骤后得到的原液经质量检定，检定项目包括等电点、肽图、N端氨基酸序列、纯度、相关蛋白、高分子蛋白、外源性DNA残留量、宿主细胞蛋白质残留、活性、蛋白质含量、细菌内毒素等，检定结果均符合制造与检定规程的要求。

以下为对依次经过上述实施例1-5的层析步骤后得到的原液(编号为原液C20180802)的检测指标，包括：

外源性DNA残留量为22.8pg/20mg(标准不高于10ng/20mg)，

宿主细胞蛋白质残留为6.18ppm(标准不高于50ppm)，

蛋白质含量为45.62mg/mL；

细菌内毒素为<2.5EU/mg(标准<2.5EU/mg)；

等电点图如图8所示(泳道1：Marker；泳道2：对照品；泳道3：原液C 20180802)，对照品与原液的PI＝5.1；原液C 20180802高效液相分子筛检测色谱图如图9所示，纯度：99.6％，高分子蛋白：0.4％；原液C 20180802高效液相反相检测色谱图如图10所示，相关蛋白含量：100％；原液C 20180802与对照品的肽图如图11所示，处于上方的曲线对应原液C20180802，处于下方的曲线对应对照品，可知原液C 20180802与对照品一致；其中，对照品按照《药典》要求进行标定，可作为标准样品，检测过程中通过与对照品对比来判断样品是否合格。

本发明利于管道化、可实现在线自动配液、稀释、洗脱、平衡一体化操作。

另外，作为本发明纯化工艺的另一实施方式，HSA-rhGH每批次发酵液收获总蛋白250g左右，综合各步层析的合适上样量及层析收率，以及收获样品量与后续层析上样量的衔接等方面考虑，生产过程中Blue-6L层析上样量范围在120-140g较合适，如图12所示，具体的层析策略如下：每批次发酵液均分两次进行BL层析，单次BL层析收获的样品量正适合进行一次PA层析，同理，单次PA层析下样量正适合一次MD层析、单次MD层析下样量正适合一次PS层析，然后将两次PS疏水层析下样进行合并超滤后收获的样品量正合适进行一次DE层析，经过超滤和过滤后为原液，一批原液蛋白量约55g。

其中，实施例1中提到的母液有：5.0M NaCl母液、1.0M NaAC-100mM EDTA母液、1.0M Tris-100mM EDTA pH8.0母液、5.0M尿素溶液。

实施例1中提到的A液：以1.0M NaAC-100mM EDTA和5.0M NaCl为母液配配制成终浓度为20mM NaAC-2mM EDTA-0.25M NaCl，pH5.0±0.1(使用冰乙酸调节pH)。

作为可替代的实施方式，实施例1中提到的A液的终浓度还可以为：25mM NaAC-2.5mM EDTA-0.4M NaCl，pH5.2；25mM NaAC-2.5mM EDTA-0.3M NaCl，pH5.3；30mM NaAC-3mMEDTA-0.25M NaCl，pH5.5；30mM NaAC-3mM EDTA-0.35M NaCl等。

实施例1中提到的B液：以1M Tris-100mM EDTA pH8.0和5M NaCl母液配制成终浓度为20M Tris-2mM EDTA-0.25M NaCl的B液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施例，实施例1中提到的B液的终浓度还可以为：20mM Tris-2mMEDTA-0.35M NaCl，pH7.5；20mM Tris-2mM EDTA-0.3M NaCl，pH8.5；30mM Tris-3mM EDTA-0.3M NaCl，pH8；30mM Tris-3mM EDTA-0.25M NaCl，pH8；35mM Tris-3.5mM EDTA-0.35MNaCl，pH8.3等。

实施例1中提到的C液：以1M Tris-100mM EDTA pH8.0和无水乙醇为母液配制成终浓度为20mM Tris-2mM EDTA、5％乙醇的C液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例1中提到的C液的终浓度还可以为：20mM Tris-2mMEDTA-10％乙醇，pH7.5；25mM Tris-2.5mM EDTA-8％乙醇，pH8.5；25mM Tris-2.5mM EDTA-5％乙醇，pH8；30mM Tris-3mM EDTA-5％乙醇，pH8；30mM Tris-3mM EDTA-7％乙醇，pH8.3；30mM Tris-3mM EDTA-10％乙醇，pH8等。

实施例1中提到的D液：以1M Tris-100mM EDTA pH8.0、5MNaCl及无水乙醇为母液配制成终浓度为20mM Tris-2mM EDTA、2M NaCl、20％乙醇的D液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例1中提到的D液的终浓度还可以为：20mM Tris-2mMEDTA-25％乙醇，pH8.3；25mM Tris-2.5mM EDTA-27％乙醇，pH7.7；25mM Tris-2.5mM EDTA-30％乙醇，pH8.5；30mM Tris-3mM EDTA-21％乙醇，pH7.5；30mM Tris-3mM EDTA-28％乙醇，pH8.4；30mM Tris-3mM EDTA-30％乙醇，pH8.4等。

实施例1中提到的清洗液：4M NaOH母液稀释配制至0.1M NaOH。

实施例2中提到的母液有：3.2M硫酸铵母液、1.0M Tris-100mM EDTA pH8.0母液。

实施例2中提到的A液：以1M Tris-100mM EDTA和3.2M为母液配制成终浓度为20mMTris-2mM EDTA-0.7M硫酸铵的A液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例2中提到的A液的终浓度还可以为：20mM Tris-2mMEDTA-0.9M硫酸铵，pH7.5；20mM Tris-2mM EDTA-1M硫酸铵，pH8.0；25mM Tris-2.5mM EDTA-0.8M硫酸铵，pH8.5；30mM Tris-3mM EDTA-0.8M硫酸铵，pH7.8等。

实施例2中提到的B液：以1M Tris-100mM EDTA和3.2M为母液配制成终浓度为20mMTris-2mM EDTA-0.5M硫酸铵的B液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例2中提到的B液的终浓度还可以为：20mM Tris-2mMEDTA-0.7M硫酸铵、25mM Tris-2.5mM EDTA-0.8M硫酸铵、30mM Tris-3mM EDTA-1M硫酸铵等。

实施例2中提到的C液：以1M Tris-100mM EDTA和3.2M为母液配制成终浓度为20mMTris-2mM EDTA-0.2M硫酸铵的B液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例2中提到的C液的终浓度还可以为：20mM Tris-2～3mM EDTA-0.3M硫酸铵、25mM Tris-2.5mM EDTA-0.4M硫酸铵、30mM Tris-3mM EDTA-0.5M硫酸铵等。

实施例2中提到的清洗液：4M NaOH母液稀释配制至0.5M NaOH。

实施例3中提到的母液有：5.0M NaCl母液、0.2M PB pH8.0母液、1.0M NaAC-100mMEDTA母液、0.5M Na2HPO4母液。

实施例3中提到的A液：以0.2M PB pH8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为20mMPB 0.35M NaCl的A液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例3中提到的A液的终浓度还可以为：20mM PB-0.3MNaCl，pH7.5；25mM PB-0.4M NaCl，pH8.5；25mM PB-0.35M NaCl，pH8；30mM PB-0.3M NaCl，pH7.5等。

实施例3中提到的B液：以0.2M PB pH8.0和5M NaCl为母液配配制成终浓度为20mMPB 0.7M NaCl的B液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例3中提到的B液的终浓度还可以为：20mM PB-0.6MNaCl，pH7.5；25mM PB-0.8M NaCl，pH8.5；25mM PB-0.65M NaCl，pH8；30mM PB-0.75M NaCl，pH7.5等。

实施例3中提到的C液：以1M NaAC-100mM EDTA和5M NaCl为母液配配制成终浓度为20mM NaAC，0.25M NaCl，pH4.0±0.1(使用冰乙酸调节pH)。

作为可替代的实施方式，实施例3中提到的C液的终浓度还可以为：20mM NaAC-2mMEDTA-0.2M NaCl，pH3；25mM NaAC-2.5mM EDTA-0.3M NaCl，pH5；25mM NaAC-2.5mM EDTA-0.25M NaCl，pH4等。

实施例3中提到的D液：以1M NaAC-100mM EDTA为母液配配制成终浓度为20mMNaAC，pH4.0(使用冰乙酸调节pH)。

实施例3中提到的清洗液：4M NaOH母液稀释配制至0.5M NaOH。

实施例4中提到的母液有：5.0M NaCl母液、0.2M PB pH8.0母液。

实施例4中提到的A液：以0.2M PB PH8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为20mMPB，3M NaCl的A液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例4中提到的A液的终浓度还可以为：20mM PB-3.5MNaCl，pH7.5；25mM PB-4M NaCl，pH8.5；30mM PB-3M NaCl，pH8；30mM PB-4M NaCl，pH7.5等。

实施例4中提到的B液：以0.2M PB PH＝8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为20mMPB，0.8M NaCl的A液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例4中提到的B液的终浓度还可以为：20mM PB-1MNaCl，pH7.5；25mM PB-0.9M NaCl，pH8.5；30mM PB-0.8M NaCl，pH8；30mM PB-0.9M NaCl，pH7.5等。

实施例4中提到的清洗液：4M NaOH母液稀释配制至0.5M NaOH。

实施例5中提到的母液有：5.0M NaCl母液、0.2M PB pH8.0母液。

实施例5中提到的A液：以0.2M PB pH 8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为10mMPB，50mM NaCl的A液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例5中提到的A液的终浓度还可以为：15mM PB-60mMNaCl，pH7.5；5mM PB-55mM NaCl，pH8.5；10mM PB-50mM NaCl，pH8；5mM PB-50mM NaCl，pH7.5等。

实施例5中提到的B液：以0.2M PB pH 8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为10mMPB，0.16M NaCl的B液，配制后无需调节pH。

作为可替代的实施方式，实施例5中提到的B液的终浓度还可以为：15mM PB-0.1MNaCl，pH7.5；5mM PB-0.3M NaCl，pH8.5；10mM PB-0.2M NaCl，pH8；5mM PB-0.3M NaCl，pH7.5等。

实施例5中提到的C液：以0.2M PB pH 8.0和5M NaCl为母液配制成终浓度为10mMPB，1M NaCl的C液，配制后无需调节pH。用来清洗层析柱中残留的样品。

实施例5中提到的清洗液：4M NaOH母液稀释配制至0.5M NaOH。

应当说明的是，以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，包括将重组人血清白蛋白-生长激素的发酵液依次经过Blue Bestarose 6Fast Flow层析、Phenyl BestaroseHigh Performance-硫酸铵疏水层析、Bestarose Diamond MD层析、Phenyl BestaroseHigh Performance-氯化钠疏水层析和Bestarose DEAE Fast Flow层析。

2.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Blue Bestarose 6Fast Flow层析的工艺条件包括：所述重组人血清白蛋白-生长激素的发酵液的上样量为15～25mg/mL、流速为40～50cm/h、上样蛋白浓度≤15mg/mL；平衡液为20～30mM NaAC-2～3mM EDTA-0.25～0.4M NaCl，pH为5.0～5.5；第一步洗杂的洗杂液为0.25～0.35M NaCl-20～35mM Tris-2～3.5mM EDTA，pH为7.5～8.5；第二步洗杂的洗杂液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-5～10％乙醇，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-2～3M NaCl-20～30％乙醇，pH为7.5～8.5；在洗脱过程中收集第二个洗脱峰组份，以得到Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样。

3.根据权利要求2所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样经过稀释配制后直接进行Phenyl BestaroseHigh Performance-硫酸铵疏水层析。

4.根据权利要求3所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的工艺条件包括：将稀释配制后的Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样进行上样，上样量为10～15mg/mL、流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.7～1M硫酸铵，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM Tris-2～3mM EDTA-0.2～1M硫酸铵。

5.根据权利要求4所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Phenyl Bestarose High Performance-硫酸铵疏水层析的过程包括多次洗脱处理，洗脱所用的洗脱液中的硫酸铵的浓度依次降低；当UV示数大于100时开始收集洗脱组份；其中，洗脱组份分段接样，根据相关蛋白及电泳结果进行合样处理，以得到Phenyl BestaroseHigh Performance-硫酸铵疏水层析的下样。

6.根据权利要求4所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Bestarose Diamond MD层析的工艺条件包括：将Phenyl Bestarose HighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样采用稀释液稀释至电导率为15～25mS/cm以进行上样，上样量为10～20mg/mL，流速为50～70cm/h；平衡液为20～30mM PB-0.3～0.4M NaCl，pH为7.5～8.5；洗杂液为20～30mM PB-0.6～0.8M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMNaAC-2～3mM EDTA-0.2～0.3M NaCl，pH为3～5。

7.根据权利要求6所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Bestarose Diamond MD层析的工艺条件还包括：洗脱样品采用去除洗脱峰首尾的方式进行收集，洗脱峰起始后开始接样至核酸蛋白检测仪吸收值降至约1/4峰高处停止接样，以得到Bestarose Diamond MD层析的下样。

8.根据权利要求7所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的工艺条件包括：将Bestarose Diamond MD层析的下样与4～6M NaCl溶液混合以进行上样，上样量为10～15mg/mL，流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mM PB-3～4M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mM PB-0.8～1M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱组份从洗脱峰起始后开始接样至洗脱结束，以得到Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的下样。

9.根据权利要求8所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，所述Bestarose DEAE Fast Flow层析的工艺条件包括：将Phenyl Bestarose HighPerformance-氯化钠疏水层析的下样超滤后进行上样，上样量为10～25mg/mL，流速为50～70cm/h，上样蛋白浓度≤10mg/mL；平衡液为5～15mM PB-50～60mM NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为5～15mM PB-0.1～0.3M NaCl，pH为7.5～8.5；洗脱峰起始后分段收集洗脱组份，将HCP含量不高于25ppm的洗脱组份进行合并，以得到纯化后的重组人血清白蛋白-生长激素原液。

10.根据权利要求1-9任一项所述的一种重组人血清白蛋白-生长激素的纯化方法，其特征在于，每批次重组人血清白蛋白-生长激素的发酵液均分两次进行Blue Bestarose6Fast Flow层析，单次Blue Bestarose 6Fast Flow层析的下样量匹配单次PA PhenylBestarose High Performance-硫酸铵疏水层析，单次PA Phenyl Bestarose HighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样量匹配单次Bestarose Diamond MD层析、单次Bestarose Diamond MD层析的下样量匹配单次Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析，最后将两次Phenyl Bestarose High Performance-氯化钠疏水层析的下样进行合并并超滤后的样品量匹配一次Bestarose DEAE Fast Flow层析，Bestarose DEAEFast Flow层析后即得纯化后的重组人血清白蛋白-生长激素原液。