CN106349384A - 一种纯化重组白细胞介素12的方法 - Google Patents

一种纯化重组白细胞介素12的方法 Download PDF

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陈松彬
倪彦艳
李小翠
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Abstract

本发明涉及蛋白质的纯化技术领域，尤其涉及一种纯化重组白细胞介素12的方法。本发明提供的纯化重组白细胞介素12的方法为：将重组人白细胞介素12细胞培养液进行预处理，然后经阳离子柱交换层析、硫酸铵分级分离、疏水柱层析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析处理，即得。本发明提供的纯化方法中通过对细胞培养液的预处理，可以有效地减少蛋白酶对目的蛋白的降解。经阳离子柱层析处理时，用含20％无水乙醇的缓冲液洗涤，可去除因疏水作用力而与目的蛋白结合在一起的难去除的杂质和目的蛋白的部分非共价结合的降解片段，达到进一步纯化的目的。本发明提供一种蛋白质回收率高，操作简便、快速，成本低的纯化重组人白细胞介素12的方法。

Description

一种纯化重组白细胞介素12的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的纯化技术领域，尤其涉及一种纯化重组白细胞介素12的方法。
背景技术
白细胞介素(interleukin,IL)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。白细胞介素12(以下简称IL-12),由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中，特别是在细菌或寄生虫感染中，其主要由B细胞和巨噬细胞产生；其分子是一种异型二聚体，40kd(p40)和35kd(p35)的2个亚基通过二硫键相连接。
白细胞介素最初是指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子。现在白细胞介素是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子，两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
中国专利申请200410080518.7公开了一种纯化重组人白细胞介素12的方法，所述纯化方法为将重组人白细胞介素12的细胞培养液上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析，最后用分子尺寸排阻柱层析进一步纯化。该纯化重组人白细胞介素12的方法具有成本低、操作简单、周期短的优点，能广泛用于白细胞介素12的工业生产和制备。
黄进等发表了一篇题目为“人白细胞介素-12的纯化及鉴定”的论文，该论文的纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析，所述阴离子交换层析吸附过程的pH值为7.5，洗脱过程的pH值为7，阳离子交换层析洗脱过程的pH值为6.5，纯化得到的蛋白纯度为91％。
然而，目前白细胞介素-12的纯化工艺得到的目的蛋白纯度和蛋白回收率较低，无法到现代社会的要求。
发明内容
为了解决现有技术中白细胞介素-12纯化工艺的缺陷，本发明的目的在于提供一种蛋白质回收率高，操作简便、快速，成本低的纯化重组人白细胞介素12的方法。
本发明提供了一种纯化重组白细胞介素12的方法，包括下述步骤：
S1将重组人白细胞介素12的细胞培养液进行预处理；
S2将经步骤S1预处理后的细胞液进行阳离子柱交换层析；
S3将经步骤S2阳离子柱交换层析得到的蛋白样本进行硫酸铵分级分离；
S4将经步骤S3硫酸铵分级分离得到的上清液进行疏水柱层析；
S5将经步骤S4疏水柱层析得到的收集液进行阴离子交换柱层析；
S6将经步骤S5阴离子交换柱层析得到的蛋白样本进行凝胶过滤层析，即得。
进一步地，所述步骤S1中的重组人白细胞介素12的细胞培养液的预处理为：先取重组人白细胞介素12的细胞培养液在3000-5000rpm的条件下离心10-15min，收集上清液，将上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得滤液，将滤液进行超滤膜浓缩，即得。
进一步地，所述超滤膜为30KD滤膜。
进一步地，所述步骤S2中的阳离子柱交换层析的步骤如下：
选用CM Sepharose FF阳离子交换柱，以pH为6.4-6.6的浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡色谱柱，所述磷酸盐缓冲液的体积为2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后上样，上样结束后用由pH为6.4-6.6的浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液和体积百分比浓度为20％的乙醇组成的混合液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液由浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液与浓度为1mol/L的NaCl组成，pH为6.7-6.9；第一次用体积浓百分比度为25％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次体积百分比浓度为65％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积浓度为100％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳，即得。
进一步地，所述步骤S3中的硫酸铵分级沉淀的步骤为：
向经步骤S2中的阳离子柱交换层析处理得到的蛋白样本中加入1-3倍体积浓度为3mol/L的(NH4)2SO4溶液，立即混匀，4℃静置25-35min，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，得上清液。
进一步地，所述步骤S4中的疏水柱层析的步骤为：
选用Phenyl Sepharose High performance疏水层析柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液,平衡，所述平衡缓冲液由浓度为20mmol/L Tris-Cl缓冲液和浓度为1.5mol/L的(NH4)2SO4溶液组成，pH为7.9-8.2，待色谱柱平衡充分后将经步骤S3硫酸铵分级沉淀得到的上清液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液为浓度为20mmol/LTris-Cl的缓冲液，pH为7.8-8.2，第一次用体积百分比浓度为40％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次用体积百分比浓度为70％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积百分比浓度为40％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
进一步地，所述步骤S5中的阴离子柱层析的步骤为：
选用SOURCE Q阴离子交换柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液平衡，所述平衡缓冲液由浓度为20mmol/L Tris-Cl缓冲液和浓度为1.5mol/L(NH4)2SO4溶液组成，pH为7.9-8.2，待色谱柱平衡充分后将步骤S4疏水柱层析得到的收集液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液为浓度为20mmol/L Tris-Cl的缓冲液，pH为7.8-8.2，第一次用体积百分比浓度为10％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次用体积百分比浓度为28％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积百分比浓度100％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
进一步地，所述步骤S6中的凝胶过滤层析柱为丙烯葡聚糖凝胶S-100 HR(Sephacryl S-100HR)，对阴离子层析收集的目标蛋白洗脱峰进一步纯化，得到高纯度的目标蛋白rhIL-12，经HPLC等方法检测目标蛋白纯度。
本发明采用的阳离子柱交换层析的整个洗脱过程中流速控制在线性流速为75-120cm/h；目的蛋白存在于65％洗脱峰中，在以25％的洗脱液流洗色谱柱时要注意流洗充分。最后色谱柱使用完毕后以0.2mol/LNaOH流洗2倍柱体积，去离子水洗至pH＜8.0后，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
本发明采用的疏水柱层析的整个洗脱过程中流速控制在线性流速75-120cm/h，流速不宜过快，目的蛋白存在于70％洗脱峰中，在以40％洗脱液流洗色谱柱时要注意流洗充分。最后色谱柱使用完毕后以0.2mol/L NaOH流洗2倍柱体积，去离子水洗至pH＜8.0后，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
本发明采用的阴离子柱交换层析的整个洗脱过程中流速控制在线性流速为75-120cm/h，流速不宜过快。目的蛋白存在于28％洗脱峰中，在以10％洗脱液流洗色谱柱时要注意流洗充分。最后色谱柱使用完毕后以0.2mol/L NaOH流洗1～1.5倍柱体积，去离子水洗至pH＜8.0后，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
本发明采用凝胶过滤层析柱的整个过程流速控制在线性流速18-21cm/h。最后色谱柱使用完毕后以0.5‰叠氮钠浸泡保存。
本发明是针对rhIL-12的生物理化特性设计的完整的纯化工艺，其中对关键步骤的特殊调整保证了最终产品的得率，去除了培养过程中由目的蛋白降解产生的难分离型杂蛋白，提高rhIL-12纯度，并缩短生产周期，降低生产成本。
本发明提供的纯化重组白细胞介素12的方法通过对rhIL-12细胞培养液的预处理，可以有效地减少蛋白酶对目的蛋白的降解；同时通过超滤浓缩可大大缩小样品体积，同时可降低样品离子强度，并更换样品缓冲环境，能大量节约阳离子柱层析的上样时间，保证结合效率。通过超滤膜包/管截留分子量的选择，可使部分分子量低于30KD的杂质透膜去除。另外阳离子柱层析时，用含20％无水乙醇的缓冲液洗涤，可去除因疏水作用力而与目的蛋白结合在一起的难去除的杂质和目的蛋白的部分非共价结合的降解片段，达到进一步纯化的目的。
与现有技术相比，本发明提供的纯化重组白细胞介素12的方法在特定的条件下采用阳离子柱交换层析，硫酸铵分级分离，疏水柱层析，阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析对重组白细胞介素12进行纯化，其蛋白纯度达99.5％以上，蛋白回收率高达84.2％以上，是一种较为理想的重组白细胞介素12的纯化方法。
具体实施方案
以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本领域技术人员应当知晓本发明的具体实施例并不以任何方式限制本发明，且在本发明基础上所作出的任何等同替换均落入本发明的保护范围。
实施例1、重组白细胞介素12的纯化方法
1.1样品预处理
重组人白细胞介素12的细胞培养液，4000rpm离心12min，收集上清液。所述重组人白细胞介素12细胞购于北京同立海源生物科技有限公司。
1.2超滤浓缩换液
设备：Millipore截留分子量为30KD的超滤膜包/管
方法：对离心后的培养液进行超滤浓缩,所述滤膜的孔径为0.45μm，所述超滤膜为30KD滤膜，当体积缩小1/2，以20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)对浓缩液进行倍比稀释，继续超滤浓缩，待体积减小后再次进行倍比稀释，按此方法共稀释4次，收集超滤浓缩液。
1.3阳离子柱层析
1.3.1分离介质：CM Sepharose FF
流动相：
A液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)
B液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5),20％无水乙醇
C液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.8)，1mol/L NaCl。
1.3.2色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速75cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱2个柱体积；b.以B液流洗色谱柱3个柱体积后，再以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线；c.以体积百分比浓度为25％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为65％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；e.以体积百分比浓度为100％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.4硫酸铵分级分离
往目的蛋白样本中加入2倍体积的3mol/L(NH4)2SO4，立即混匀，4℃静置30分钟，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，上清备用。
1.5疏水柱层析
分离介质：Phenyl Sepharose High performance
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.0)，1.5mol/L(NH4)2SO4
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.0)
色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速75cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为40％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为70％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.6阴离子柱层析
分离介质：SOURCE Q
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.0)
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.0)，1mol/L NaCl
样品预处理：对疏水层析所获得的目的蛋白收集峰以A液进行10倍稀释备用。
色谱条件：
A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速75cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速75cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为28％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.7凝胶过滤
分离介质：Sephacryl S-100High Resolution
流动相：
120mmol/L NaCl，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)
色谱条件：
先以200mL 0.2mol/L NaOH流洗凝胶柱，然后以上述流动相对凝胶柱平衡2个柱体积，上样(单次上样量控制在柱体积的5％以内)，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰，即得。
实施例2、重组白细胞介素12的纯化方法
1.1样品预处理
重组人白细胞介素12的细胞培养液，4000rpm离心10min，收集上清液。所述重组人白细胞介素12细胞购于北京同立海源生物科技有限公司。
1.2超滤浓缩换液
设备：Millipore截留分子量为30KD的超滤膜包/管
方法：对离心后的培养液进行超滤浓缩,所述滤膜的孔径为0.45μm，所述超滤膜为30KD滤膜，当体积缩小1/2，以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)对浓缩液进行倍比稀释，继续超滤浓缩，待体积减小后再次进行倍比稀释，按此方法共稀释4次，收集超滤浓缩液。
1.3阳离子柱层析
1.3.1分离介质：CM Sepharose FF
流动相：
A液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.4)
B液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.4),20％无水乙醇
C液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.7)，1mol/L NaCl。
1.3.2色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速100cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速100cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱2个柱体积；b.以B液流洗色谱柱3个柱体积后，再以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线；c.以体积百分比浓度为25％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为65％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；e.以体积百分比浓度为100％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.4硫酸铵分级分离
往目的蛋白样本中加入2倍体积的3mol/L(NH4)2SO4，立即混匀，4℃静置30分钟，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，上清备用。
1.5疏水柱层析
分离介质：Phenyl Sepharose High performance
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝7.9)，1.5mol/L(NH4)2SO4
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝7.8)
色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速100cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速100cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为40％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为70％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.6阴离子柱层析
分离介质：SOURCE Q
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝7.9)
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝7.8)，1mol/L NaCl
样品预处理：对疏水层析所获得的目的蛋白收集峰以缓冲液A进行10倍稀释备用。
色谱条件：
A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速100cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速100cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为28％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.7凝胶过滤
分离介质：Sephacryl S-100High Resolution
流动相：
120mmol/L NaCl，20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)
色谱条件：
先以200mL 0.2mol/L NaOH流洗凝胶柱，然后以上述流动相对凝胶柱平衡2个柱体积，上样(单次上样量控制在柱体积的5％以内)，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰，即得。
实施例3、重组白细胞介素12的纯化方法
1.1样品预处理
重组人白细胞介素12的细胞培养液，4000rpm离心10min，收集上清液。所述重组人白细胞介素12细胞购于北京同立海源生物科技有限公司。
1.2超滤浓缩换液
设备：Millipore截留分子量为30KD的超滤膜包/管
方法：对离心后的培养液进行超滤浓缩,所述滤膜的孔径为0.45μm，所述超滤膜为30KD滤膜，当体积缩小1/2，以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)对浓缩液进行倍比稀释，继续超滤浓缩，待体积减小后再次进行倍比稀释，按此方法共稀释4次，收集超滤浓缩液。
1.3阳离子柱层析
1.3.1分离介质：CM Sepharose FF
流动相：
A液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.6)
B液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.6),20％无水乙醇
C液：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.9)，1mol/L NaCl。
1.3.2色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速120cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速120cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱2个柱体积；b.以B液流洗色谱柱3个柱体积后，再以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线；c.以体积百分比浓度为25％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为65％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；e.以体积百分比浓度为100％C液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.4硫酸铵分级分离
往目的蛋白样本中加入2倍体积的3mol/L(NH4)2SO4，立即混匀，4℃静置30分钟，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，上清备用。
1.5疏水柱层析
分离介质：Phenyl Sepharose High performance
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.2)，1.5mol/L(NH4)2SO4
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.2)
色谱条件：
以A液平衡色谱柱2个柱体积，线性流速120cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速120cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为40％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为70％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.6阴离子柱层析
分离介质：SOURCE Q
流动相：
A液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.2)
B液：20mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH＝8.2)，1mol/L NaCl
样品预处理：对疏水层析所获得的目的蛋白收集峰以缓冲液A进行10倍稀释备用。
色谱条件：
A液平衡色谱柱3个柱体积，线性流速120cm/h。待色谱柱平衡充分后，上样，线性流速120cm/h(柱压＜0.3MPa)。上样结束后：a.以A液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；b.以体积百分比浓度为10％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；c.以体积百分比浓度为28％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳；d.以体积百分比浓度为100％B液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
1.7凝胶过滤
分离介质：Sephacryl S-100 High Resolution
流动相：
120 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)
色谱条件：
先以200mL 0.2mol/L NaOH流洗凝胶柱，然后以上述流动相对凝胶柱平衡2.5个柱体积，上样(单次上样量控制在柱体积的5％以内)，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰，即得。
试验例一、重组白细胞介素12的纯度测定试验
1、试验材料：实施例1、实施例2和实施例3纯化得到的重组白细胞介素12。
2、试验方法：
采用高效液相色谱法(HPLC)对实施例1、实施例2和实施例3纯化得到的重组白细胞介素12进行纯度测定。
所述高效液相色谱(HPLC)的检测条件为：
色谱系统：Waters HPLC系统
色谱柱：Ultrahydrogel 500 7.8×300mm
流动相：200 mmol/L NaCl，25 mmol/L Na2HPO4(pH＝9.4)
色谱条件：
流动相流洗，流速0.8ml/min，平衡色谱柱，上样，流动相流洗检测215，280nm处光吸收。另外，相同条件下进行溶剂吸收检测，作为背景扣除。
3、试验结果：
结果如表1所示。
表1重组白细胞介素12的纯度测定试验
组别 实施例1 实施例2 实施例3
纯度(％) 99.9 99.5 99.6
由表1可知，使用本发明提供的重组白细胞介素12的纯化方法得到的重组白细胞介素12的纯度大于99.5％，是一种较为理想的重组白细胞介素12的纯化方法。
试验例二、重组白细胞介素12的回收率测定试验
1、试验方法：
采用酶联免疫吸附实验法(ELISA法)测定实施例1、实施例2和实施例3个纯化阶段收集的上清液或洗脱液中的重组白细胞介素12的含量，从而计算重组白细胞介素12的回收率。所述采用双抗体夹心ELISA方法为：去标有重组白细胞介素12单抗的酶标板，每孔加入100μl样品，37℃孵育90min。想酶标板各孔中加入340μl洗涤液静置30s后甩尽液体，拍干，连续手工洗板4次。除空白孔外每孔加入100μl生物素抗体工作液，37℃孵育60min，洗板4次。除空白孔外每孔加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min，洗板4次。每孔加入100μl显示剂，37℃孵育15min。每孔加入100μl终止液，混匀后5min内读取波长450nm出A值。根据标准品浓度，制作标准曲线，并求出样品中的重组白细胞介素12的含量，计算重组白细胞介素12的回收率。
2、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2重组白细胞介素12的回收率测定试验
组别 实施例1 实施例2 实施例3
回收率(％) 86.6 84.2 84.9
由表2可知，使用本发明提供的重组白细胞介素12的纯化方法得到的重组白细胞介素12的回收率大于84.2％，是一种较为理想的重组白细胞介素12的纯化方法。

Claims (8)

1.一种纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1将重组人白细胞介素12的细胞培养液进行预处理；
S2将经步骤S1预处理后的细胞液进行阳离子柱交换层析；
S3将经步骤S2阳离子柱交换层析得到的蛋白样本进行硫酸铵分级分离；
S4将经步骤S3硫酸铵分级分离得到的上清液进行疏水柱层析；
S5将经步骤S4疏水柱层析得到的收集液进行阴离子交换柱层析；
S6将经步骤S5阴离子交换柱层析得到的蛋白样本进行凝胶过滤层析，即得。
2.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S1中的重组人白细胞介素12的细胞培养液的预处理为：先取重组人白细胞介素12的细胞培养液在3000-5000rpm的条件下离心10-15min，收集上清液，将上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得滤液，将滤液进行超滤膜浓缩，即得。
3.根据权利要求2所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述超滤膜为30KD滤膜。
4.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S2中的阳离子柱交换层析的步骤如下：
①选用CM Sepharose FF阳离子交换柱，以pH为6.4-6.6的浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡色谱柱，所述磷酸盐缓冲液的体积为2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后上样，上样结束后用由pH为6.4-6.6的浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液和体积百分比浓度为20％的乙醇组成的混合液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；
②用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液由浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液与浓度为1mol/L的NaCl组成，pH为6.7-6.9；第一次用体积浓百分比度为25％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次体积百分比浓度为65％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积浓度为100％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳，即得。
5.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S3中的硫酸铵分级沉淀的步骤为：向经步骤S2中的阳离子柱交换层析处理得到的蛋白样本中加入1-3倍体积浓度为3mol/L的(NH4)2SO4溶液，立即混匀，4℃静置25-35min，待其充分沉淀后，12000rpm离心30min，去沉淀，得上清液。
6.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S4中的疏水柱层析的步骤为：①选用Phenyl Sepharose High performance疏水层析柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液,平衡，所述平衡缓冲液由浓度为20mmol/L Tris-Cl缓冲液和浓度为1.5mol/L的(NH4)2SO4溶液组成，pH为7.9-8.2，待色谱柱平衡充分后将经步骤S3硫酸铵分级沉淀得到的上清液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；②用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液为浓度为20mmol/L Tris-Cl的缓冲液，pH为7.8-8.2，第一次用体积百分比浓度为40％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次用体积百分比浓度为70％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积百分比浓度为40％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
7.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S5中的阴离子柱层析的步骤为：①选用SOURCE Q阴离子交换柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液平衡，所述平衡缓冲液由浓度为20mmol/LTris-Cl缓冲液和浓度为1.5mol/L(NH4)2SO4溶液组成，pH为7.9-8.2，待色谱柱平衡充分后将步骤S4疏水柱层析得到的收集液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；②用洗脱液对色谱柱进行流洗3次，所述洗脱液为浓度为20mmol/L Tris-Cl的缓冲液，pH为7.8-8.2，第一次用体积百分比浓度为10％洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第二次用体积百分比浓度为28％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；第三次用体积百分比浓度100％的洗脱液对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳。
8.根据权利要求1所述的纯化重组白细胞介素12的方法，其特征在于，所述步骤S6中的凝胶过滤层析柱为丙烯葡聚糖凝胶S-100HR。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967166A (zh) * 2017-05-11 2017-07-21 合肥知恩生物技术有限公司 一种人TNF‑α蛋白的新型纯化方法
CN109879930A (zh) * 2019-03-18 2019-06-14 浙江优诺金生物工程有限公司 一种重组蛋白的纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1616489A (zh) * 2004-09-30 2005-05-18 中国科学技术大学 纯化重组人白细胞介素12的方法
CN101033254A (zh) * 2007-02-09 2007-09-12 广州市恺泰生物科技有限公司 一种纯化重组人白细胞介素12的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1616489A (zh) * 2004-09-30 2005-05-18 中国科学技术大学 纯化重组人白细胞介素12的方法
CN101033254A (zh) * 2007-02-09 2007-09-12 广州市恺泰生物科技有限公司 一种纯化重组人白细胞介素12的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967166A (zh) * 2017-05-11 2017-07-21 合肥知恩生物技术有限公司 一种人TNF‑α蛋白的新型纯化方法
CN109879930A (zh) * 2019-03-18 2019-06-14 浙江优诺金生物工程有限公司 一种重组蛋白的纯化方法

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