CN105968185A - 一种绒促性素纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。所述亲和层析的填料为capto blue（high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。本发明优化了纯化工艺，使纯化过程简单化，收率明显提高，效价高于现有工艺，另外设备占地面积缩小，车间耗能变小。本发明中，预处理后绒促性素的效价为200iu/mg左右，而经三次层析处理后绒促性素的效价可达10000iu/mg左右，效价显著提高。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种绒促性素纯化方法。
背景技术
绒促性素（Chorionic Gonadotrophin）系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。对女性可促进卵泡的成熟及排卵，并维持黄体的功能。对男性，能刺激睾丸间质细胞的发育，增加雄激素分泌，促使睾丸下降和男性第二性征发育。与尿促性素合用，可模拟生理性的促黄体生成素高峰，而触发排卵。临床上绒促性素至今仍是治疗月经失调、无排卵性不孕症、先兆流产和习惯性流产、隐睾症、男性性功能低下等的首选药物。
1928年，Zondek和Ascbheim首先用乙醇沉淀法，从孕妇尿中取得了活性物质，其他研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究。而现有的方法是粗品加溶剂提取后板框过滤，在用酒精沉淀，离心获得中间体，再进行一步上柱，沉淀，离心，干燥获得产品。但该过程复杂，收率低，效价最高只有5000iu/mg左右。如CN104497128A，提供了一种低盐抽提法从粗品中提取绒促性素的方法，但该方法效价也不理想。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种绒促性素纯化方法。该方法优化了纯化工艺，使纯化过程简单，收率明显提高，效价高于现有工艺。
本发明提供了如下的技术方案：
一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。
本申请的纯化方法，分三步层析，可使得到的绒促性素固体纯度高、效价高。
在上述方案中优选的是，所述亲和层析的填料为capto blue
（high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow （high
sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose
Fast Flow。
在上述任一方案中优选的是，包括以下各步骤：
（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液，所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，取沉淀得固体；
（2）第一步层析：步骤（1）得到的固体进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A；
（3）第二步层析：步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）疏水层析得蛋白溶液B；
（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C；
（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，沉淀后收集固体，即得绒促性素固体。
在上述任一方案中优选的是，步骤（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%，搅拌、沉淀后取上清液，所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体。
乙醇浓度为45-55%时可使杂质全部沉淀，蛋白质不沉淀，然后取上清液，再加入乙醇使其浓度为80-90%时，可使蛋白基本沉淀。乙醇浓度高时能把蛋白质沉淀，离心后得到固体，经乙醇处理，利于固体析出。如果直接用绒促性素粗品上柱，由于缓冲体系不一样，不容易吸附在柱子上。
在上述任一方案中优选的是，步骤（2）第一步层析：将步骤（1）得到的固体溶于平衡液1，进行capto blue
（high sub）亲和层析得蛋白溶液A，以平衡液1平衡、洗杂液1洗杂、洗脱液1洗脱；其中，
平衡液1：50 nmol tris缓冲液中加100nmol NaCl；
洗杂液1： 50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl，再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%；
洗脱液1：50 nmol tris缓冲液中加2 mol NaCl，再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。
在上述任一方案中优选的是，步骤（3）第二步层析：将步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high
sub）疏水层析得蛋白溶液B，以平衡液2平衡；其中，平衡液2: 10nmol Hepes缓冲液中加1.5 mol NaCl。
在上述任一方案中优选的是，步骤（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C，以平衡液3平衡，洗脱液3洗脱；其中，
平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液；
洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加 150 nmol NaCl。
在上述任一方案中优选的是，步骤（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%，沉淀过夜，再用3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。
80-90%的乙醇利于蛋白质沉淀。
在上述任一方案中优选的是，步骤（1）所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。
在上述任一方案中优选的是，步骤（2）还包括为蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液1中，其中缓冲液1：10nmol Hepes缓冲液中加1.5mol NaCl。其中，浓缩是为了进一步置换缓冲液，置换了缓冲液更利于下一步的蛋白在柱子上的吸附。
在上述任一方案中优选的是，所述置换时，所用所述缓冲液1的体积为蛋白溶液A浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液1的pH值用氢氧化钠或盐酸为7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
在上述任一方案中优选的是，步骤（3）还包括含蛋白溶液B的超滤步骤，将所述蛋白溶液B进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液2中，其中缓冲液2：10 nmol Tris缓冲液。
在上述任一方案中优选的是，所述置换时，所用所述缓冲液2的体积为蛋白溶液B浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
在上述任一方案中优选的是，步骤（3）中使用的填料Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）采用再生液2再生，所述再生液2:
10nmol Hepes缓冲液。
在上述任一方案中优选的是，所述再生液的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为pH7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，步骤（4）还包括含蛋白溶液C的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液C浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液3中，其中缓冲液3:
0.15 mol乙酸铵溶液。
所述置换时，所用所述缓冲液3的体积为蛋白溶液C浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
在上述任一方案中优选的是，所述缓冲液3的pH值用氨水或乙酸调节为 5.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
在上述任一方案中优选的是，步骤（4）中使用的填料DEAE Sepharose Fast Flow 采用再生液3再生，所述再生液3: 10 nmol Tris缓冲液中加1 mol NaCl。
在上述任一方案中优选的是，所述再生液3的pH值用氢氧化钠或盐酸为7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述平衡液1、所述洗杂液1 、所述洗脱液1 、所述平衡液2 、所述平衡液3 、所述洗脱液3 的PH均为 7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述平衡液1、所述洗杂液1和所述洗脱液1的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为 7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述平衡液2的pH用氢氧化钠或盐酸调节为 7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，所述平衡液3和所述洗脱液3 的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为 7.5±0.2。
在上述任一方案中优选的是，步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）进行层析的线性流速为150-250cm/h。优选200cm/h。
在上述任一方案中优选的是，所述方法进行纯化的温度为室温。
本发明优化了纯化工艺，使纯化过程简单化，收率明显提高，效价高于现有工艺，另外设备占地面积缩小，车间耗能变小。本发明中，预处理后绒促性素的效价为200iu/mg左右，而经三次层析处理后绒促性素的效价可达10000iu/mg左右，效价显著提高。
具体实施方式
为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。
本发明中使用填料均优选为GE公司生产、销售。绒促性素粗品购于沂南华欣生物制品有限公司。
本发明采用了以下技术，来解决现有技术的问题：
一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。
进一步地，所述亲和层析的填料为capto blue
（high sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose
Fast Flow。
更进一步地，包括以下各步骤：
（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，再加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液，所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，取沉淀得固体；
（2）第一步层析：步骤（1）得到的固体进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A；
（3）第二步层析：步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）疏水层析得蛋白溶液B；
（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C；
（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，沉淀后收集固体，即得绒促性素固体。
更进一步地，步骤（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%，搅拌、沉淀后取上清液，所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体。
更进一步地，步骤（2）第一步层析：将步骤（1）得到的固体溶于平衡液1，进行capto blue
（high sub）亲和层析得蛋白溶液A，以平衡液1平衡、洗杂液1洗杂、洗脱液1洗脱；其中，
平衡液1：50 nmol tris缓冲液中加100nmol NaCl；
洗杂液1： 50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl，再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%；
洗脱液1：50 nmol tris缓冲液中加2 mol NaCl，再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。
更进一步地，步骤（3）第二步层析：将步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）疏水层析得蛋白溶液B，以平衡液2平衡；
其中，平衡液2: 10nmol Hepes缓冲液中加1.5 mol NaCl。
更进一步地，步骤（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C，以平衡液3平衡，洗脱液3洗脱；其中，
平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液；
洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加150 nmol NaCl。
更进一步地，步骤（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%，沉淀过夜，再用3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。
更进一步地，步骤（1）中所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。
更进一步地，步骤（2）还包括蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液1中，其中缓冲液1：10nmol Hepes缓冲液中加1.5mol NaCl。
更进一步地，所述置换时，所用所述缓冲液1的体积为蛋白溶液A浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
更进一步地，所述缓冲液1的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
更进一步地，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
更进一步地，步骤（3）还包括含蛋白溶液B的超滤步骤，将所述蛋白溶液B进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液2中，其中缓冲液2：10 nmol Tris缓冲液。
更进一步地，所述置换时，所用所述缓冲液2的体积为蛋白溶液B浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
更进一步地，所述缓冲液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
更进一步地，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
更进一步地，步骤（3）中使用的填料Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow（high
sub）采用再生液2再生，所述再生液2:
10nmol Hepes缓冲液。
更进一步地，所述再生液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为pH7.5±0.2。
更进一步地，步骤（4）还包括含蛋白溶液C的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液C浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液3中，其中缓冲液3:
0.15 mol乙酸铵溶液。
更进一步地，所述置换时，所用所述缓冲液3的体积为蛋白溶液C浓缩后的8倍体积，置换后溶液体积不变。
更进一步地，所述缓冲液3的pH值用氨水或乙酸调节为 5.5±0.2。
更进一步地，所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
更进一步地，步骤（4）中使用的填料DEAE Sepharose Fast Flow采用再生液3再生，所述再生液3: 10 nmol Tris缓冲液中加1 mol NaCl。
更进一步地，所述再生液3的pH 值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
更进一步地，所述平衡液1、所述洗杂液1和所述洗脱液1的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为 7.5±0.2。
更进一步地，所述平衡液2的pH用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
更进一步地，所述平衡液3和所述洗脱液3 的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为 7.5±0.2。
更进一步地，进行层析的线性流速为150-250cm/h。
更进一步地，所述方法进行纯化的温度为室温。
实施例
1
：
一种绒促性素纯化方法，包括以下各步骤：
（1）绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液，搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%，搅拌沉淀后取上清，上清加100%酒精调节酒精浓度为85%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体，效价为200iu/mg左右。
（2）第一步层析：固体溶于平衡液1，经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液A。
平衡液1：50 nmol tris+ 100 nmol NaCl，pH 7.5；
洗杂液1：50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%，PH 7.5；
洗脱液1：50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%，PH 7.5；
平衡液1平衡，样品上柱，平衡液1再平衡，洗杂液1洗杂，洗脱液1洗脱收集。
（3）浓缩和超滤：
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液A进行液浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积的缓冲液1，置换后溶液体积不变。
缓冲液1： 10 nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl，pH7.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（4）第二步层析：超滤后样品溶液经Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow (high sub)获得蛋白溶液B。采用平衡液2，收集流份，在利用再生液2将填料再生。
平衡液2: 10nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl，pH7.5；
再生液2: 10nmol Hepes，pH7.5。
（5）超滤：将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后蛋白溶液B进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积的缓冲液2，置换后溶液体积不变。
缓冲液2: 10 nmol Tris,
pH 7.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（6）第三步层析：超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析，获得最终高纯度蛋白溶液C。采用平衡液3平衡，洗脱液3洗脱，再生液3再生。
平衡液3: 10 nmol Tris，pH 7.5；
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl，pH 7.5；
再生液3: 10 nmol Tris+ 1 mol NaCl，pH 7.5。
（7）浓缩和超滤：将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白C进行浓缩至1/5倍体积，浓缩后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液3，置换后溶液体积不变。
缓冲液3：0.15 mol 乙酸铵溶液，pH 5.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜
（8）沉淀、离心、干燥
将步骤（7）得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%，沉淀过夜，4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体，效价约为10000iu/mg。
实验环境室温，全程线性流速200cm/h。
实施例
2
：
一种绒促性素纯化方法，包括以下各步骤：
（1）绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液，搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%，搅拌沉淀后取上清，上清加100%酒精调节酒精浓度为85%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体，效价为200iu/mg左右。
（2）第一步层析：固体溶于平衡液1，经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液。
平衡液1：50 nmol tris+ 100 nmol NaCl，pH 7.5；
洗杂液1：50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%，pH 7.5；
洗脱液1：50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%，pH 7.5；
平衡液1平衡，样品上柱，平衡液1再平衡，洗杂液1洗杂，洗脱液1洗脱收集。
（3）浓缩和超滤：
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液进行液浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液1，置换后溶液体积不变。
缓冲液1：10 nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl，pH7.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（4）第二步层析：超滤后样品溶液经Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow (high sub)获得蛋白溶液。采用平衡液2，收集流份，在利用再生液2将填料再生。
平衡液2: 10nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl，pH7.5；
再生液2: 10nmol Hepes，pH7.5。
（5）超滤：将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后溶液蛋白进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液3，置换后溶液体积不变。
缓冲液3：0.15 mol 乙酸铵溶液，pH 5.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（6）沉淀、离心、干燥
将步骤（6）得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%，沉淀过夜，3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体，效价约为6000iu/mg。
实验环境室温，全程线性流速150cm/h。
实施例
3
：
一种绒促性素纯化方法，包括以下各步骤：
（1）绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液，搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%，搅拌沉淀后取上清，上清加100%酒精调节酒精浓度为85%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体，效价为200iu/mg左右。
（2）第一步层析：固体溶于平衡液1，经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液。
平衡液1：50 nmol tris+ 100 nmol NaCl，PH 7.5；
洗杂液1：50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%，PH 7.5；
洗脱液1：50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%，PH 7.5；
平衡液1平衡，样品上柱，平衡液1再平衡，洗杂液1洗杂，洗脱液1洗脱收集。
（3）浓缩和超滤：
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液进行液浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积的缓冲液2，置换后溶液体积不变。
缓冲液2：10 nmol Tris, pH 7.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（4）第二步层析：超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析，获得最终高纯度蛋白溶液。采用平衡液3平衡，洗脱液3洗脱，再生液3再生。
平衡液3: 10 nmol Tris，pH 7.5；
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl，pH 7.5；
再生液3: 10 nmol Tris+ 1 mol NaCl, pH 7.5。
（5）浓缩和超滤：将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白进行浓缩至1/5倍体积，浓缩后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液3，置换后溶液体积不变。
缓冲液3: 0.15 mol 乙酸铵溶液, pH
5.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜
（6）沉淀、离心、干燥
将步骤（5）得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%，沉淀过夜，3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体，效价约为6000iu/mg。
实验环境室温，全程线性流速250cm/h。
实施例
4
：
一种绒促性素纯化方，包括以下各步骤：
（1）绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液，搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%，搅拌沉淀后取上清，上清加100%酒精调节酒精浓度为85%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体，效价为200iu/mg左右。
（2）第一步层析：固体溶于平衡液2，经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)获得蛋白溶液。采用平衡液2，收集流份，在利用再生液2将填料再生。
平衡液2: 10nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl, pH7.5；
再生液2: 10nmol Hepes, pH7.5。
（3）超滤：将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后蛋白溶液进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液2，置换后溶液体积不变。
缓冲液2: 10 nmol Tris,
pH 7.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜。
（4）第二步层析：超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析，获得最终高纯度蛋白溶液。采用平衡液3平衡，洗脱液3洗脱，再生液3再生。
平衡液3: 10 nmol Tris, pH 7.5；
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl, pH 7.5；
再生液3: 10 nmol Tris+ 1 mol NaCl，pH 7.5。
（5）浓缩和超滤：将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白进行浓缩至1/5倍体积，浓缩后进行超滤，置换缓冲液，即使用8倍体积缓冲液3，置换后溶液体积不变。
缓冲液3: 0.15 mol 乙酸铵溶液, pH
5.5；
超滤夹具：密理博；
膜：10KD的聚醚砜膜
（6）沉淀、离心、干燥
将步骤（5）得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%，沉淀过夜，3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体，效价约为6000iu/mg。
实验环境室温，全程线性流速150-250cm/h。
Claims (10)
1.一种绒促性素纯化方法，采用三次层析进行纯化，所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析，最终得到高纯度绒促性素固体。
2.根据权利要求1所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：所述亲和层析的填料为capto blue （high
sub）、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose
6 Fast Flow（high sub）、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。
3.根据权利要求2所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：包括以下各步骤：
（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，再加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液，所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，取沉淀得固体；
（2）第一步层析：步骤（1）得到的固体进行capto blue （high sub）亲和层析得蛋白溶液A；
（3）第二步层析：步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose
6 Fast Flow （high sub）疏水层析得蛋白溶液B；
（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast
Flow离子交换层析得蛋白溶液C；
（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇，沉淀后收集固体，即得绒促性素固体。
4.根据权利要求3所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（1）预处理：绒促性素粗品溶于溶解液中，加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%，搅拌、沉淀后取上清液，所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%，取沉淀，离心，常温减压干燥，得固体。
5.根据权利要求4所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（2）第一步层析：将步骤（1）得到的固体溶于平衡液1，进行capto blue （high
sub）亲和层析得蛋白溶液A，以平衡液1平衡、洗杂液1洗杂、洗脱液1洗脱；其中，
平衡液1：50 nmol tris缓冲液中加100nmol NaCl；
洗杂液1：50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl，再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%；
洗脱液1：50 nmol tris缓冲液中加2 mol NaCl，再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。
6.根据权利要求5所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（3）第二步层析：将步骤（2）得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high sub）疏水层析得蛋白溶液B，以平衡液2平衡；
其中，平衡液2: 10nmol Hepes缓冲液中加1.5 mol NaCl。
7.根据权利要求6所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（4）第三步层析：将步骤（3）得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C，以平衡液3平衡，洗脱液3洗脱；其中，
平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液；
洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加150 nmol
NaCl。
8.根据权利要求7所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（5）后处理：步骤（4）得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%，沉淀过夜，再用3500-4000rpm离心20min收集固体，减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。
9.根据权利要求3所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（1）中所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。
10.根据权利要求5所述的绒促性素纯化方法，其特征在于：步骤（2）还包括蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤，将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5，然后进行超滤，置换缓冲液，至于缓冲液1中，其中缓冲液1：10nmol Hepes缓冲液中加1.5mol NaCl。
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- 2016-07-20 CN CN201610572482.7A patent/CN105968185A/zh active Pending
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