CN116874555B - 一种置换液及其试剂盒和相关应用 - Google Patents

一种置换液及其试剂盒和相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种置换液及其试剂盒和相关应用，涉及蛋白纯化领域，具体而言，本发明提供了一种置换液，包括1～10mM HEPES、0.1～1M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.005%～0.1%的吐温，避免或减少了蛋白在置换过程中的损失，有效提高了蛋白回收率。

Description

一种置换液及其试剂盒和相关应用
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及一种置换液及其试剂盒和相关应用。
背景技术
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。对于采用复性液复性后的蛋白，需进行置换，去除复性液。
针对重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的复性蛋白，常用的置换液无法有效的置换，易导致蛋白沉淀、收率低，存在蛋白损失严重的问题，无法有效的对复性后对蛋白进行有效纯化回收。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种置换液及其试剂盒和相关应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种置换液，其包括的组分及其组分的终浓度为：1～10mM HEPES、0.1～1M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.005%～0.1%的吐温。
第二方面，本发明实施例提供了一种目标蛋白的纯化方法，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性后的产物；
对复性后的产物进行置换，所述置换采用的置换液为前述实施例所述的置换液；
所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
第三方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的置换液在制备用于纯化目标蛋白的产品中的应用，所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
第四方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述实施例所述的置换液。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对置换液配方进行研究，通过在置换液中添加特定浓度范围的吐温，避免或减少了目标蛋白在置换过程中的损失，有效提高了蛋白回收率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为纯化方法的流程图；
图2为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（一步纯化蛋白、二步纯化蛋白）SDS-PAGE图；
图3为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（一步纯化蛋白）SDS-PAGE图；其中，泳道1为Marker；
图4为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（二步纯化蛋白、三步纯化蛋白）SDS-PAGE图；其中，泳道1为Marker。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请的发明人经一系列创造性劳动，提供了一种能够置换重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的包涵体复性蛋白的置换液，该置换液减少了蛋白在置换过程中的损失，有效提高了蛋白的回收率。
一方面，本发明实施例提供了一种置换液，其包括的组分及其组分的终浓度为：1～10mM HEPES、0.1～1M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.005%～0.1%的吐温。
具体地，HEPES 在置换液中的终浓度具体可以为1、2、4、6、8、10mM中的任意一种或任意两种之间的范围。盐酸精氨酸在置换液中的终浓度具体可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1M中的任意一种或任意两种之间的范围。吐温在置换液中的终浓度（质量体积分数，g/mL）具体可以为0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%和0.10%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，在所述置换液中，所述吐温的质量体积分数为0.005%～0.05%。
在一些实施方式中，在所述置换液中，所述吐温的质量体积分数为0.01%～0.03%。
在一些实施方式中，所述吐温为聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯，具体可以包括；吐温20、吐温40、吐温60和吐温80中的任意一种或多种。
另一方面，本发明实施例提供了一种目标蛋白的纯化方法，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经菌液离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性后的产物；
对复性后的产物进行置换，所述置换采用的置换液为前述任意实施例所述的置换液；
所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，第37位和73位的半胱氨酸，第229位和265位的半胱氨酸形成2个二硫键：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVGDKCLKFYSKVSEYRYYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRGINCQKPLCPDEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLgsgsgsgsgsgsgMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLHDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPICSQKP。
在一些实施方式中，重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中，第31位和第67位的半胱氨酸，第235位和第271位的半胱氨酸形成2个二硫键；
ARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAGHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRGLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVgsgsgsgsgsgsgMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLGHGQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVGPWCASQQ。
需要说明的是，SEQ ID NO:1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和SEQ ID NO:2所示的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白是通过定点诱变产生突变，并根据人类基因中最优遗传密码子构建获得的。致癌性评估结果表明，构建获得的融合HPV16-E6-E7融合蛋白和HPV18-E6-E7融合蛋白在BALB/c裸鼠中失去了转化NIH 3T3细胞的能力和致瘤性，说明优化的突变基因融合不具有转化性。可用于制备抗肿瘤疫苗，具有较好的治疗活性或抗肿瘤活性，安全性更高。
将本发明实施例提供的目标蛋白的置换液应用于重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的置换，克服了现有置换方法对于这两种蛋白的置换过程中导致的蛋白沉淀、收率低和蛋白损失严重的问题，有效提高了这两种蛋白的蛋白回收率。
在一些实施方式中，所述置换的方式选自：超滤置换或透析置换。
在一些实施方式中，所述置换的次数为1～8次。
在一些实施方式中，每次在进行置换时，置换液和待置换的产物的体积比为1:（0.5～1.5），优选为1:1。
在一些实施方式中，所述纯化方法还包括：对置换前或置换后的产物进行超滤浓缩。所述超滤浓缩包括：浓缩产物至原体积的1/3～1/5。
在一些实施方式中，该超滤浓缩具体可以采用过滤器进行过滤。过滤器的过滤材质可以采用PEF滤膜。过滤精度可以选自：0.22μm、0.1μm、0.45+0.2μm、0.22+0.1μm中的任意一种。
在一些实施方式中，在进行所述置换前，所述纯化方法还包括：对大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白进行破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性中的至少一种步骤。
破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性的方法可采用本领域现有的步骤。本发明的发明点主要在于置换液配方的优化。
在一些实施方式中，当纯化蛋白为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白时，所述纯化步骤包括：破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、阴离子层析、疏水层析、复性和置换。
在一些实施方式中，当纯化蛋白为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白时，所述纯化步骤包括：破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、阳离子疏水复合层析、疏水层析、阴离子层析、复性和置换。
在一些实施方式中，所述复性包括将层析纯化后的蛋白产物与复性液混合，所述复性液包括的组分及其组分的浓度为：1～3M尿素，0.1～1M NaCl，0.1～1M盐酸精氨酸，0.01～0.5mM胱氨酸和0.1～5mM半胱氨酸。
在一些实施方式中，在所述复性液中，所述半胱氨酸和所述胱氨酸的摩尔比为9~11：1，该摩尔比具体可以为9：1、10：1和11：1中的任意一种或任意两种之间的范围。相对其他比例的半胱氨酸与胱氨酸而言，采用本申请的复性液复性后获得的蛋白含量更高，活性更高。
在一些实施方式中，所述复性液还包括用于调整复性液pH的pH调节剂，所述复性液的pH为7~9，具体地，复性液的pH具体可以为7、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0中的任意一种或任意两种之间的范围。若pH高于限定范围，则导致蛋白无法有效形成大粒径，同时也存在降解风险。在pH限定的情况下，pH调节剂可进行常规选择，包括但不限于NaOH。
在一些实施方式中，尿素在复性液中的浓度可以为1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。NaCl在复性液中的浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。盐酸精氨酸在复性液中的浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。胱氨酸在复性液中的浓度可以为0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mM中的任意一种或任意两种之间的范围。半胱氨酸在复性液中的浓度可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些优选实施方式中，所述复性液各组分在复性液中的浓度如下：1～3M尿素，0.4~0.6M NaCl，10~30mM盐酸精氨酸，0.01~0.3mM胱氨酸和0.1~3mM半胱氨酸，半胱氨酸和所述胱氨酸的摩尔比为9~11：1。该配方复性形成的蛋白粒径主要在10~20nm，活性更高。
在一些实施方式中，所述复性液还包括Tris；其中，Tris在复性液中的终浓度为15~30mM。
在一些实施方式中，Tris在复性液中的终浓度可以为15、20、25、30mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性液还可以包括：EDTA-Na2。EDTA-Na2在复性液中的终浓度为0.5～1mM。EDTA-Na2在复性液中的终浓度具体可以为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性液还可以包括：巯基乙醇。在复性液中存在半胱氨酸和胱氨酸作为氧化还原对的情况下，巯基乙醇的添加对复性无重要影响。巯基乙醇在复性液中的体积分数为0.1%～1%。巯基乙醇在复性液中的体积分数为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%中的任意一种或任意两种之间的范围。
EDTA-Na2和巯基乙醇在蛋白复性粒径形成上无显著影响。
在一些实施方式中，所述蛋白产物与复性液的体积比为1：50~70。该体积比具体可以为1:50、1:52、1:54、1:56、1:58、1:60、1:62、1:64、1:66、1:68和1:70中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性的条件包括：4～15℃，60～70h，静止复性或搅拌复性。具体地，复性的温度具体可以为4、8、12、15℃中的任意一种或任意两种之间的范围。复性的时间具体可以为60、62、64、66、68、70h中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性还包括对待复性的产物进行预处理，所述预处理包括超滤浓缩。该超滤浓缩包括：采用截留分子量为10kD的超滤膜包进行浓缩。
另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的置换液在制备用于纯化目标蛋白的产品中的应用，所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
此外，本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的置换液。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括前述任意实施例所述的复性液。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的纯化方法，流程图可参照图1，其包括以下步骤：
（1）HPV-16型（E6 E7）菌体：
获取重组HPV 16型E6-E7菌体，重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，其中，第37位和第73位的半胱氨酸，第229位和第265位的半胱氨酸形成2个二硫键。
（2）破菌离心：
1、按照菌体量：破菌缓冲液（20mM Tris-Cl pH8.0）=1：20（w/v），取适量的破菌缓冲液，加入2026g重组HPV-16 E6-E7菌体中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以磁力搅拌器悬浮，直至悬浮均匀。
2、将悬浮均匀后的菌悬液加入均质机中，控制破菌压力在800bar，开始进行菌体第一次破碎，待第一次菌体破碎结束前，将出料管放入料液桶内，让剩余料液循环，以达到菌体的充分破碎。
3、将破菌一次后料液重新装入均质机料液桶中，重复均质破菌步骤，再次进行两次破菌。
4、破菌完成后输入连续流离心机，将10±2℃冷却循环水接入连续流离心机，设置转速10000rpm，并控制料液进料速度在500ml/min，待上清液流出3L后测定浊度，离心完成后，加入6L破菌缓冲液顶洗。
5、完成后拆卸离心转鼓，扯出滤膜，以刮刀刮取沉淀，即为破菌离心沉淀，进行称重，放置于6℃暂存。
破菌后离心收集沉淀约382g，收率在15%以上。
（3）包涵体洗涤：
1、按破菌离心沉淀：洗涤液1=1:10（w/v），取适量的洗涤液1（65mM NaCl 1.8M尿素20mM Tris-Cl，pH8.0），加入382g破菌离心沉淀中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀；
2、以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（一次）；
3、加入与步骤1同样体积的洗涤液1，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（二次），放入-20℃进行冷冻，时间不低于4小时；
4、包涵体洗涤后离心沉淀（二次）：洗涤液2（0.5% TritonX-100 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:50（w/v），加入洗涤液2，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（三次），收集336g；
三次洗涤后，包涵体纯度从20%左右提高至30%左右。
（4）包涵体变性：
1、按包涵体洗涤后离心沉淀（三次）：变性液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇20mM Tris-Cl，pH10.5）=1:40（w/v），取13440ml变性液加入336g步骤（3）制备的包涵体洗涤后离心沉淀（三次）中。
2、以高剪切分散乳化机进行剪切分散，完成后测定pH应在10.5，不在范围内加入6M 盐酸或2M NaOH调节。
3、将调节pH后的剪切样品，于6℃下，搅拌变性24小时，变性溶解完成后以冷冻离心机11000g、30min、8℃离心取上清，即为变性蛋白液。
变性蛋白（重组HPV 16型E6-E7融合蛋白）回收率在10%左右。
（5）阴离子层析：
以步骤（4）制备的重组HPV 16型E6-E7变性蛋白液为基础材料，填料为Q-Bestarose FF，操作步骤如下：
1、样品预处理：取12500ml变性蛋白液（步骤（4）制备）加入1M 枸橼酸调节pH在10.2±0.1，再加入4M NaCl调节电导值至10.0±0.1mS/cm ,测定pH后，再加入1M 枸橼酸调节pH在10.0（图2中泳道1样品）。
2、流速设定：设置系统流速180cm/h，
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以B1液（8M尿素 1M NaCl 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0）冲洗层析柱2CV。
4、平衡：以A1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0（电导值10.0 mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用A1液冲洗5CV，并保证紫外吸收值降至稳定状态。
7、洗脱：用C1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0（电导值16.0 mS/cm））洗脱层析柱6CV（流穿液为图2中泳道2样品，非目的蛋白峰为图2中泳道4样品），UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白（图2中泳道3样品），即为一步纯化蛋白。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由40%左右提高到55%左右，该步骤收率在30%左右。
（6）疏水层析：
以步骤（5）制备的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白一步纯化的层析液为基础材料，填料为Diamond Butyl，操作步骤如下：
1、样品预处理：取5050ml一步纯化蛋白（步骤（5）制备）加入2M 氢氧化钠调节pH在11.0，再加入NaCl调节电导值至92.5mS/cm，测定pH后，再加入2M 氢氧化钠调节pH在11.0。最后以C01的0.45+0.2μm囊式滤器过滤（过滤后样品为图2中泳道5样品）。
2、层析流速设定：设置系统流速180cm/h，
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱3CV。
4、平衡：D1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠-NaOH，pH11.0（电导值90 mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用D1液冲洗不低于4CV，并保证紫外吸收值降至至稳定状态。
7、洗脱：用E1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠-NaOH，pH11.0（电导80 mS/cm））洗脱层析柱不低于6CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为二步纯化蛋白液（纯化样品为图2中泳道6样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由65%左右提高到90%左右，该步骤收率在40%左右。
（7）复性：
以步骤（6）制备的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白二步纯化的层析液为基础材料，操作步骤如下：
1、超滤浓缩：取步骤（6）制备的二步纯化蛋白以10kD PES超滤膜包进行浓缩，完成后使用F1液（8M尿素+1mM EDTA+Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠+NaOH，pH11.0）顶洗膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为浓缩蛋白，控制蛋白计算浓度为9±1mg/ml。
2、复性：取浓缩蛋白使用蠕动泵于医用冷藏柜内缓慢均一地加入复性液（2M 尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5M 盐酸精氨酸、0.15mM 胱氨酸、1.5mM 半胱氨酸，pH8.00，）中，控制复性蛋白计算终浓度在0.15mg/ml，复性液在搅拌状态缓慢滴加样品，样品滴加控制方法为：单个管道滴加速度为100±30ml/h，所有样品于1h左右完成滴加，所有管道滴液口应均匀分散在上方，并保证尽可能较小的液滴滴落。滴加完成后样品于6℃条件下搅拌65小时，即复性完成。
（8）超滤置换：
1、膜包处理：取0.46m2×2块10KD的PES的超滤膜包进行超滤，调节泵转速至液体流速在1500ml/min左右，排空超滤膜包；先以水冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于2L；再取清洗液1冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于1L，并暂停浸润不低于30min；以水冲洗超滤膜的，适当加压冲洗，保证pH恢复中性；以复性液进行润洗超滤膜。
2、超滤浓缩置换：复性完成后的蛋白液以0.45+0.2μm滤器过滤，取过滤后料液调节跨膜压力TMP在1bar，浓缩4倍后，并以置换液2（0.01%吐温80（w/v） 5mM HEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行连续置换8倍样品体积，置换完成后，再进一步浓缩至1/3体积。排空收集超滤置换蛋白液，并以350ml置换液2进行顶洗管道及超滤膜包，完成后与置换蛋白液合并，混匀，即为置换蛋白3溶液。即为置换后获得的复性蛋白。
该步骤复性收率在40%左右，蛋白由变性状态折叠成稳定的目的蛋白。
（9）原液制备：
置换后获得的复性蛋白以0.45+0.2μm滤器除菌过滤，即为原液。
上述纯化方法制备获得的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白在主要步骤的收率测定和中间体的纯度如下表。
表1 重组HPV 16型E6-E7融合蛋白在主要步骤的收率测定和中间体的纯度
实施例2
本实施例提供了一种重组HPV 18型E6-E7融合蛋白（SEQ ID No:2）的纯化方法，其包括以下步骤：
（1）破菌离心
1、按照菌体量：破菌缓冲液（20mM Tris-Cl pH8.0）=1：20（w/v），取适量的破菌缓冲液，加入1544.5g重组HPV18 E6-E7菌体中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以磁力搅拌器悬浮，直至悬浮均匀。
2、将悬浮均匀后的菌悬液加入均质机中，控制破菌压力在800bar，开始进行菌体第一次破碎，待第一次菌体破碎结束前，将出料管放入料液桶内，让剩余料液循环，以达到菌体的充分破碎。
3、将破菌一次后料液重新装入均质机料液桶中，重复均质破菌步骤，再次进行两次破菌。
4、破菌完成后输入连续流离心机，将10±2℃冷却循环水接入连续流离心机，设置转速10000rpm，并控制料液进料速度在500ml/min，待上清液流出3L后测定浊度，离心完成后，加入6L破菌缓冲液顶洗。
5、完成后拆卸离心转鼓，扯出滤膜，以刮刀刮取沉淀，即为破菌离心沉淀，进行称重，放置于2～8℃暂存。
破菌后离心收集沉淀约180g，收率在10%以上。
（2）包涵体洗涤
1、按破菌离心沉淀：洗涤液1（65mM NaCl 1.8M尿素 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:10（w/v），取适量的洗涤液1，加入179.31g破菌离心沉淀中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀；
2、以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（一次）；
3、加入与步骤1同样体积的洗涤液1，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（二次），放入-20℃进行冷冻，时间不低于4小时；
4、包涵体洗涤后离心沉淀（二次）：洗涤液2（0.5% TritonX-100 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:50（w/v），加入洗涤液2，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（三次）；
三次洗涤后，包涵体纯度从20%左右提高至40%左右。
（3）包涵体变性
1、按包涵体洗涤后离心沉淀（三次）：变性液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇20mM Tris-Cl，pH10.5）=1:40（w/v），取2120ml变性液加入53g步骤（2）制备的包涵体洗涤后离心沉淀（三次）中。
2、以高剪切分散乳化机进行剪切分散，完成后测定pH应在10.5，不在范围内加入6M 盐酸或2M NaOH调节。
3、将调节pH后的剪切样品，于6℃下，搅拌变性24小时，变性溶解完成后以冷冻离心机11000g、30min、8℃离心取上清，即为变性蛋白液。
变性蛋白（重组HPV 18型E6-E7融合蛋白）回收率在30%左右。
（4）阳离子疏水复合层析（Eshmuno CMX层析）
以前述步骤制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的变性溶液为基础材料，填料为Eshmuno CMX，操作步骤如下：
1、样品预处理：取2140ml变性蛋白液加入1M 枸橼酸调节pH在10.2±0.1，再加入4M NaCl调节电导值至7.5±0.1mS/cm ,测定pH后，再加入1M 枸橼酸调节pH在10.0（图3中泳道2样品）。
2、流速设定：设置系统流速160～200cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以B液（8M尿素+1M NaCl+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris-Cl，pH10.0）冲洗层析柱2CV。
4、平衡：A液（8M尿素+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris- Cl，pH10.0（电导值7.5mS/cm））平衡层析柱3CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取预处理后的变性蛋白上样。
6、再平衡：上样完成后，用A液平衡层析柱4CV，并冲洗至紫外吸收值降低至稳定状态。
7、洗脱：用C液（8M尿素+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris-Cl，pH10.0（电导值15mS/cm））洗脱层析柱3CV（流穿液为图3中泳道3样品，杂蛋白为图3泳道5样品），UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为一步纯化蛋白（洗脱蛋白为图3中泳道4样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由40%左右提高到80%左右，该步骤收率在47%左右。
（5）疏水层析（Polar MC60-HIC Phenyl层析）
以步骤（4）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白一步纯化的层析液为基础材料，填料为Polar MC60-HIC Phenyl，操作步骤如下：
1、样品预处理：
1.1、取0.46m2×1块10KD的PES的超滤膜包，清洗及0.5M NaOH浸泡后，以注射用水清洗至pH至中性，再以置换液1（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH:11.50，cond：90mS/cm）润洗超滤膜包。
1.2、取3000ml步骤（4）制备的一步纯化蛋白进行超滤，控制循环流速在600～1200ml/min，TMP在0.6～1bar，浓缩3倍后，以置换液1连续洗滤4倍，置换完成后，排空超滤膜包，取置换液1 400ml顶洗超滤膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为置换蛋白1溶液（图4中泳道2样品）。
1.3、置换蛋白1溶液加入4M NaCl，不断搅拌，调节电导值95mS/cm，测定pH，并加入2M NaOH调节pH至11.50。最后以0.45+0.2μm囊式滤器过滤。
2、层析流速设定：设置系统流速180cm/h，
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱2CV。
4、平衡：D液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导95mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样（图4中泳道3样品）
6、再平衡：上样完成后，用D液冲洗不低于2CV，并保证紫外吸收值降至至稳定状态。
7、洗脱：用E液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导80mS/cm））洗脱层析柱不低于5CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为二步纯化蛋白液（纯化蛋白为图4中泳道4样品，收集的杂峰为图4中泳道5样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由80%左右提高到90%左右，该步骤收率在70%左右。
（6）阴离子层析（Q-Bestarose FF）
以步骤（5）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白二步纯化的层析液为基础材料，填料为Q-Bestarose FF，操作步骤如下：
1、样品预处理：
1.1、取0.11m2×2块10KD的PES的超滤膜包，清洗及0.5M NaOH浸泡后，以注射用水清洗至pH至中性，再以F液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇，pH11.50）润洗超滤膜包。
1.2、取4100ml步骤（5）制备的二步纯化蛋白进行超滤，控制循环流速在1200ml/min，TMP在0.8bar，浓缩4倍后，以F液连续洗滤4倍，控制电导降低至11mS/cm以内，置换完成后，排空超滤膜包，取F液400ml顶洗超滤膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并。即为置换蛋白2溶液（图4中泳道6样品）。
2、流速设定：设置系统流速180cm/h，
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱2CV，后使用I液（20mMNa2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+1M NaCl，pH11.50）平衡层析柱3CV。
4、平衡：以G液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH:11.50（电导12.00mS/cm））平衡层析柱3CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用G液冲洗不低于2CV（流穿液为图4中泳道7样品），并保证紫外吸收值降至稳定状态。
7、洗脱：用H液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导15.00mS/cm））洗脱层析柱不低于3CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为三步纯化蛋白（图4中泳道8样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由80%左右提高到95%左右，该步骤收率在90%左右。
（7）复性
以步骤（6）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白三步纯化的层析液为基础材料，操作步骤如下：
1、超滤浓缩：取步骤（6）制备的三步纯化蛋白以10kD PES超滤膜包进行浓缩，完成后使用H液顶洗膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为浓缩蛋白，控制蛋白浓度在9mg/ml左右。
2、复性：取浓缩蛋白使用蠕动泵于医用冷藏柜内缓慢均一地加入复性液（2M 尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5M 盐酸精氨酸、0.15mM 胱氨酸、1.5mM 半胱氨酸，pH8.00）中，控制复性蛋白计算终浓度在0.15mg/ml，复性液在搅拌状态缓慢滴加样品，样品滴加控制方法为：单个管道滴加速度为100±30ml/h，所有样品于1h左右完成滴加，所有管道滴液口应均匀分散在上方，并保证尽可能较小的液滴滴落。滴加完成后样品于6℃条件下搅拌65小时，即复性完成。
（8）超滤置换
1、膜包处理：取0.46m2×2块10KD的PES的超滤膜包进行超滤，调节泵转速至液体流速在2000ml/min左右，排空超滤膜包；先以水冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于2L；再取清洗液1冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于1L，并暂停浸润不低于30min；以水冲洗超滤膜的，适当加压冲洗，保证pH恢复中性；以复性液进行润洗超滤膜。
2、超滤浓缩置换：复性完成后的蛋白液以0.45+0.2μm滤器过滤，取过滤后料液调节跨膜压力TMP在1bar，浓缩4倍后，并以置换液2（0.01%吐温80 5mM HEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行连续置换8倍样品体积，置换完成后，再进一步浓缩至1/4体积。排空收集超滤置换蛋白液，并以400ml置换液2（0.01%吐温80+5mM HEPES+0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行顶洗管道及超滤膜包，完成后与置换蛋白液合并，混匀，即为置换后获得的复性蛋白。
（9）原液制备：
置换后获得的复性蛋白以0.45+0.2μm滤器除菌过滤，即为原液。
该步骤复性收率在40%左右，蛋白由变性状态折叠成稳定的目的蛋白。
重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化工艺主要步骤的收率测定和中间体的纯度见表2。
表2 重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化工艺主要步骤的收率测定和中间体的纯度
验证例1
超滤浓缩和置换的前后顺序对蛋白回收率影响。
实验方案
本实施例进行超滤浓缩与置换先后顺序对蛋白回收率影响的实验。
实验步骤如表3所示，实验信息如表4所示。
表3.超滤浓缩置换顺序实验步骤
表4.超滤浓缩和置换的顺序实验信息
实验数据如表5所示。
表5.超滤浓缩和置换的顺序对蛋白回收率的影响
由结果可知，先浓缩后置换：待浓缩完成后，分别置换4倍体积和8倍体积，4倍体积蛋白回收率高于置换8倍，随着置换次数增加，蛋白损失增加；
先置换后超滤浓缩：置换后蛋白回收率低于5%，浓缩后蛋白几乎全部损失。
整体上分析，先浓缩后置换，此种超滤方式较好。
验证例2
置换方式对蛋白回收率影响。
实验具体操作过程如表6所示，实验信息如表7所示。
表6.置换方式选择实验步骤
表7.置换方式选择实验信息
置换方式选择实验相关数据如表8所示。
表8.置换方式选择实验结果
上述实验过程，搅拌复性和静置复性的样品，均采用先浓缩后置换的方法，如表8所示，浓缩8倍后蛋白回收率分别为52.56%和50.00%，故在相同浓缩倍数下，复性方式在浓缩过程中对蛋白回收率无显著影响。
超滤置换8次和透析置换后，蛋白回收率分别为26.7%和2.74%。
透析置换组中，浓缩4倍蛋白回收率高于浓缩8倍，故随着浓缩倍数的增加，蛋白损失增加。
验证例3
置换液对蛋白回收率对影响。
实验过程如表9所示，样品信息如表10所示，溶液及置换液配制信息分别如表11、表12所示。
表9.验证置换液添加剂的实验过程
表10.样品信息
表11.置换液配方信息
备注：各组分的浓度为其在置换液中的浓度。不同置换液配方的结果如表12所示。
表12.置换液配方筛选实验结果
由结果可知，实验组1，2，5，6，7较易离心，出现明显絮状沉淀。实验组3，4、8、9，10置换5次后，实验过程中未见明显絮状沉淀。
置换液中添加吐温-80置换8次后，浓缩4倍体积，蛋白回收率达36%；其余添加剂组经置换后，蛋白损失严重，蛋白浓度低于检测限。
在置换液（5mM HEPES+0.5M盐酸精氨酸）中，添加吐温-80至终浓度为0.025%，浓缩4倍后样品回收率约为36%，其中pH的高低（pH8.20、pH9.20）对样品回收率无明显影响；其余组别添加保护剂后，蛋白依然丢失严重。
随着吐温浓度添加，在添加吐温-80终浓度至0.01%后，回收率已达到较高的水平，为了保证生产工艺批间一致，回收率稳定，可以选择吐温-80添加浓度为0.025%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种置换液，其特征在于，其组分及其组分的终浓度为：2.5~5mM HEPES、0.4~0.6M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.005%～0.1%的吐温80，pH为8.20、8.24、8.25或9.20。
2.根据权利要求1所述的置换液，其特征在于，在所述置换液中，所述吐温的质量体积分数为0.005%～0.05%。
3.根据权利要求1所述的置换液，其特征在于，在所述置换液中，所述吐温的质量体积分数为0.01%～0.03%。
4.一种目标蛋白的纯化方法，其特征在于，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性后的产物；
对复性后的产物进行置换，所述置换采用的置换液为权利要求1～3任一项所述的置换液；
所述目标蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述置换的方式选自：超滤置换或透析置换。
6.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述置换的次数为1～8次。
7.根据权利要求4～6任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括：对置换前或置换后的产物进行超滤浓缩。
8.根据权利要求4～6任一项所述的纯化方法，其特征在于，在进行所述置换前，所述纯化方法还包括：对大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白进行破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、层析纯化和复性中的至少一种步骤。
9.权利要求1～3任一项所述的置换液在制备用于纯化目标蛋白的产品中的应用，所述目标蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1～3任一项所述的置换液。
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