CN116874552B - 一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用 - Google Patents

一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用，涉及蛋白纯化领域。本发明提供了一种用于复性纯化目标蛋白的复性液，包括1～3M尿素，0.1～1M NaCl，0.1～1M盐酸精氨酸，0.01～0.5mM胱氨酸和0.1～5mM半胱氨酸，该复性液有效地提高了蛋白稳定性，确保蛋白不沉淀，实现了可定向形成均一的不同粒径蛋白聚集体，为重组生物制品提供了多种粒径蛋白选择的可能性。

Description

一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用。
背景技术
通常大肠杆菌以包涵体形式表达的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白缺乏生物学活性，在表达过程中，蛋白快速释放，无序缠绕形成不可溶蛋白。需要经过体外折叠复性才能获得生物活性。
现有常规的复性方法有分步透析法、高浓度变性剂逐渐稀释法、色谱层析法、大体积稀释法等，然而，重组的HPV蛋白在上述常规方法中，蛋白复性后不能稳定存在，容易聚集沉淀。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种目标蛋白的纯化方法，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经菌液离心、菌液破碎、包涵体洗涤、包涵体变性和层析纯化后的蛋白产物，对所述蛋白产物于进行复性；
所述复性包括将所述蛋白产物与复性液按照体积比为1:50~70混合，所述复性液包括的组分及其组分的浓度为：1～3M尿素，0.1～1M NaCl，0.1～1M盐酸精氨酸，0.01～0.5mM胱氨酸和0.1～5mM半胱氨酸；
所述目标蛋白包括：重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
第二方面，本发明实施例提供了一种复性液，其包括：前述实施例中所述的复性液。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括前述实施例所述的复性液。
第四方面，本发明实施例提供了复性液在制备用于纯化目标蛋白的试剂或试剂盒中的应用，所述复性液为前述实施例所述的复性液，所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用大体积稀释方法进行复性，对复性液配方中多种组分进行优化，有效地提高了蛋白稳定性，确保蛋白不沉淀，采用本发明优化的配方对蛋白进行复性，可定向形成均一的特定粒径蛋白聚集体，以提高重组蛋白在动物体内的蛋白活性和高药效持久性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为纯化方法的流程图；
图2为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（一步纯化蛋白、二步纯化蛋白）SDS-PAGE图；
图3为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（一步纯化蛋白）SDS-PAGE图；其中，泳道1为Marker；
图4为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化过程样品（二步纯化蛋白、三步纯化蛋白）SDS-PAGE图；其中，泳道1为Marker；
图5为浓缩后尿素终浓度对蛋白含量的影响；
图6为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白稀释复性后超滤浓缩样品1（20220718）；其中，1~10依次为Marker、Diamond Butyl洗脱浓缩后、组1浓缩前、组1浓缩4倍、组1浓缩8倍、组2浓缩前、组2浓缩4倍、组2浓缩8倍、组2浓缩8倍和N/A；
图7为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白稀释复性后超滤浓缩样品2（20220718）；其中，1~9依次为Marker、Diamond Butyl洗脱（已浓缩）、组3浓缩前、组3浓缩4倍、组3浓缩8倍、组3浓缩8倍、组4浓缩前、组4浓缩4倍、组4浓缩8倍；
图8为16组复性液的第一主峰粒径结果；
图9为将第一主峰粒径作为响应值进行拟合，确定形成粒径形成的主要影响因素；其中，A为效应的Pareto图，B为最大粒径峰平均粒径nm主效应图；
图10为最大粒径峰平均粒径nm与半胱氨酸与胱氨酸倍数（10：1），盐酸精氨酸（mol）的等值线；
图11为各因子主效应分析结果；其中，A为效应的Pareto图，B为除菌过滤后蛋白浓度mg/mL主效应图（拟合均值）；
图12为以盐酸精氨酸与氯化钠作为变量拟合等值图；其中，A为除菌过滤后蛋白浓度mg/mL与氯化钠（mol），盐酸精氨酸（mol）的等值线图（pH8.0组），B为除菌过滤后蛋白浓度mg/mL与氯化钠（mol），盐酸精氨酸（mol）的等值线图（pH10.0组）；
图13为以盐酸精氨酸与pH作为变量拟合等值图；
图14为SDS-PAGE检测结果；其中，A为复性蛋白样品1的结果，泳道1~7依次为：Marker、组3、组4、组5、组6、组7、组8；B为复性蛋白样品2的结果，泳道1~9依次为：Marker、组9、组10、组11、组12、组13、组14、组15和组16；C为浓缩4倍样品1的结果，泳道2、1、3~9依次为组1、Marker、组2、组3、组4、组5、组6、组7、组8；D为浓缩4倍样品2的结果，泳道2~3、1、4~9依次为组9、组10、Marker、组11、组12、组13、组14、组15和组16；E为置换4次样品1的结果，泳道2~3、1、4~9依次为组1、组2、Marker、组3、组4、组5、组6、组7、组8；F为置换4次样品2的结果，泳道2~4、1、5~9依次为组9、组10、组11、Marker、组12、组13、组14、组15和组16；
图15为SDS-PAGE检测结果；其中，A为置换8次样品1的结果，泳道2~4、1、5~9依次为：组1、组2、组3、Marker、组4、组5、组6、组7、组8；B为置换8次样品2的结果，泳道1~9依次为：Marker、组9、组10、组11、组12、组13、组14、组15和组16；C为置换后样品1的结果，泳道1~9依次为Marker、组1、组2、组3、组4、组5、组6、组7、组8；D为置换后样品2的结果，泳道2、1、3~9依次为组9、Marker、组10、组11、组12、组13、组14、组15和组16；E为浓缩过滤后样品1的结果，泳道2、1、3~9依次为组1、Marker、组2、组3、组4、组5、组6、组7、组8；F为浓缩过滤后样品2的结果，泳道2~3、1、4~9依次为组9、组10、Marker、组11、组12、组13、组14、组15和组16；
图16为SEC-HPLC检查结果；
图17为各峰纯度影响主效应因子分析结果1；其中，A为效应的Pareto图（相应为SEC-HPLC峰1，α=0.05），B为SEC-HPLC峰1主效应图；
图18为各峰纯度影响主效应因子分析结果2；其中，A为效应的Pareto图（相应为SEC-HPLC峰2，α=0.05），B为SEC-HPLC峰2主效应图；
图19为各峰纯度影响主效应因子分析结果3；其中，A为效应的Pareto图（相应为SEC-HPLC峰3，α=0.05），B为SEC-HPLC峰3主效应图；
图20为HPV-16型（E6 E7）复性蛋白过滤后，组1～组8（20221130）的电泳结果；其中，泳道1~10依次为N/A、Marker、组1、组2、组3、组4、组5、组6、组7、组8；
图21为HPV-16型（E6 E7）复性蛋白浓缩4倍后，组1～组8（20221130）的电泳结果；其中，泳道1~10依次为N/A、组1、Marker、组2、组3）、组4、组5、组6、组7、组8；
图22为HPV-16型（E6 E7）复性蛋白置换后，组1～组8（20221130）的电泳结果；其中，泳道1~10依次为N/A、组1、组2、Marker、组3、组4、组5、组6、组7、组8；
图23为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白原液，组1～组8（20221130）的电泳结果；
图24为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白原液，组1～组8的蛋白回收率；
图25为粒径光强分布数据结果；
图26为粒径体积分布数据结果；
图27为不同配方的抗原含量、蛋白浓度及比活值（抗原含量/蛋白浓度）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白进行复性时面临双重挑战：（1）强疏水性会导致复性时极易形成高分子聚集体或聚集沉淀；（2）重组HPV 16型E6-E7融合蛋白含有17个半胱氨酸，分子内可形成2对二硫键，重组HPV 18型E6-E7融合蛋白含有13个半胱氨酸，分子内可形成2对二硫键，容易出现错误配对氧化或部分氧化的折叠中间体。提高二硫键的正确氧化率、抑制复性时蛋白质聚集沉淀以及提高蛋白质浓度是重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白成功复性的关键。
本发明采用改进后的大体积稀释方法进行复性，对复性液配方中多种组分进行优化，有效地提高了蛋白稳定性，确保蛋白不沉淀，实现了可定向形成均一的不同粒径蛋白聚集体，为重组生物制品（大肠杆菌表达形成的包涵体类）提供了多种粒径蛋白选择的可能性。
一方面，本发明实施例提供了一种目标蛋白的纯化方法，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经菌液离心、包涵体洗涤、包涵体变性和层析纯化后的蛋白产物，对所述蛋白产物于进行复性；
所述复性包括将所述蛋白产物与复性液混合，所述复性液包括的组分及其组分的终浓度为：1～3M尿素，0.1～1M NaCl，0.1～1M盐酸精氨酸，0.01～0.5mM胱氨酸和0.1～5mM半胱氨酸。
所述目标蛋白包括：重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述组分的终浓度理解为复性液各组分在复性液与蛋白产物的混合溶液中的作用浓度。
在一些实施方式中，重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，第37位和73位的半胱氨酸，第229位和265位的半胱氨酸形成2个二硫键：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVGDKCLKFYSKVSEYRYYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRGINCQKPLCPDEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLgsgsgsgsgsgsgMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLHDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPICSQKP。
在一些实施方式中，重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中，第31位和第67位的半胱氨酸，第235位和第271位的半胱氨酸形成2个二硫键；
ARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAGHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRGLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVgsgsgsgsgsgsgMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLGHGQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVGPWCASQQ。
需要说明的是，SEQ ID NO:1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和SEQ ID NO:2所示的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白是通过定点诱变产生突变，并根据人类基因中最优遗传密码子构建获得的。致癌性评估结果表明，构建获得的融合HPV16-E6-E7融合蛋白和HPV18-E6-E7融合蛋白在BALB/c裸鼠中失去了转化NIH 3T3细胞的能力和致瘤性，说明优化的突变基因融合不具有转化性。可用于制备抗肿瘤疫苗，具有较好的治疗活性或抗肿瘤活性，安全性更高。
将本发明实施例提供的目标蛋白的纯化方法应用于重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的纯化，克服了现有纯化方法对于这两种蛋白的纯化存在的技术障碍，提高了这两种蛋白的纯化效率和蛋白稳定性，使得纯化后的蛋白具有更好的蛋白活性，能提高重组蛋白在动物体内的药效持久性。
在一些实施方式中，当纯化蛋白为重组HPV 16型E6-E7融合蛋白时，所述纯化步骤包括：破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、阴离子层析、疏水层析、复性和过滤（超滤浓缩）。
在一些实施方式中，当纯化蛋白为重组HPV 18型E6-E7融合蛋白时，所述纯化步骤包括：破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性、阳离子疏水复合层析、疏水层析、阴离子层析、复性和过滤（超滤浓缩）。
在一些实施方式中，所述纯化方法还包括：大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性和层析纯化的步骤。破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性和层析纯化的步骤可基于现有技术获得，本申请的发明点主要在于复性和置换的优化改进。
在一些实施方式中，在所述复性液或复性液与蛋白产物的混合溶液中，所述半胱氨酸和所述胱氨酸的摩尔比为9~11：1，相对其他比例的半胱氨酸与胱氨酸而言，采用本申请的复性液复性后获得的蛋白含量更高，活性更高。该摩尔比具体可以为9：1、10：1和11：1中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性液还包括用于调整复性液pH的pH调节剂，所述复性液的pH为7~9，具体地，复性液的pH具体可以为7、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0中的任意一种或任意两种之间的范围。若pH低于限定范围，则导致蛋白沉淀；若pH高于限定范围，则导致蛋白无法有效形成大粒径，同时也存在降解风险。在pH限定的情况下，pH调节剂可进行常规选择，包括但不限于NaOH和HCl中的任意一种。
在一些实施方式中，尿素在复性液中的终浓度可以为1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。NaCl在复性液中的终浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。盐酸精氨酸在复性液中的终浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M中的任意一种或任意两种之间的范围。胱氨酸在复性液中的终浓度可以为0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mM中的任意一种或任意两种之间的范围。半胱氨酸在复性液中的终浓度可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些优选实施方式中，所述复性液各组分在复性液中的浓度如下：1～3M尿素，0.4~0.6M NaCl，10~30mM盐酸精氨酸，0.01~0.3mM胱氨酸和0.1~3mM半胱氨酸，半胱氨酸和所述胱氨酸的摩尔比为9~11：1。该配方复性形成的蛋白粒径主要在10~20nm，活性更高。
在一些实施方式中，所述复性液还包括Tris；其中，Tris在复性液中的终浓度为15~30mM。
在一些实施方式中，Tris在复性液中的终浓度可以为15、20、25、30mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性液还可以包括：EDTA-Na2。EDTA-Na2在复性液中的终浓度为0.5～1mM。EDTA-Na2在复性液中的终浓度具体可以为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性液还可以包括：巯基乙醇。在复性液中存在半胱氨酸和胱氨酸作为氧化还原对的情况下，巯基乙醇的添加对复性无重要影响。巯基乙醇在复性液中的体积分数为0.1%～1%。巯基乙醇在复性液中的体积分数为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%中的任意一种或任意两种之间的范围。
EDTA-Na2和巯基乙醇在蛋白复性粒径形成上无显著影响。
在一些实施方式中，所述蛋白产物与复性液的体积比为1：50~70。该体积比具体可以为1:50、1:52、1:54、1:56、1:58、1:60、1:62、1:64、1:66、1:68和1:70中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性的条件包括：4～15℃，60～70h，静止复性或搅拌复性。具体地，复性的温度具体可以为4、8、12、15℃中的任意一种或任意两种之间的范围。复性的时间具体可以为60、62、64、66、68、70h中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述复性还包括对待复性的产物进行预处理，所述预处理包括超滤浓缩。该超滤浓缩包括：采用截留分子量为10kD的超滤膜包进行浓缩。
在一些实施方式中，所述纯化方法还包括对复性后的产物进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/3～1/8。具体可以浓缩至原体积的1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8中的任意一种或任意两种之间的范围。该超滤浓缩具体可以采用过滤器进行过滤。过滤器的过滤材质可以采用PES滤膜。过滤精度可以选自：0.22μm、0.1μm、0.45+0.2μm、0.22+0.1μm中的任意一种。
在一些实施方式中，在对复性后的产物进行超滤浓缩前或后，所述纯化方法还包括对产物进行置换；所述置换采用的置换液包含的组分及其组分的终浓度为：1～10mMHEPES、0.1～1M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.005%～0.05%的吐温。所述吐温为聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯，具体可以包括；吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的任意一种或多种。
具体地，HEPES在置换液中的终浓度具体可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM中的任意一种或任意两种之间的范围。盐酸精氨酸在置换液中的终浓度具体可以为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1M中的任意一种或任意两种之间的范围。吐温在置换液中的终浓度（质量体积分数，g/mL）具体可以为0、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009和0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%和0.05%中的任意一种或任意两种之间的范围。吐温浓度过低达不到对蛋白疏水基团聚集的抑制，从而无法有效防止蛋白聚集沉淀，不能保证蛋白的长期稳定保存的稳定性。
在一些实施方式中，吐温在置换液中的终浓度为0.01%～0.03%。
在一些实施方式中，所述置换的次数为1～8次，具体可以1、2、3、4、5、6、7、8次中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，每次在进行置换时，置换液和待置换的产物的体积比为1:（0.5～1.5），优选为1:1。
另一方面，本发明实施例还提供了一种复性液，其包括：前述任意实施例中所述的复性液。
另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括前述任意实施例所述的复性液。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括前述任意实施例所述的置换液。
此外，本发明实施例还提供了复性液在制备用于纯化目标蛋白的试剂或试剂盒中的应用，所述复性液为前述任意实施例所述的复性液，所述目标蛋白包括重组HPV 16型E6-E7融合蛋白和重组HPV 18型E6-E7融合蛋白中的任意一种或多种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的纯化方法，流程图可参照图1，其包括以下步骤：
（1）HPV-16型（E6 E7）菌体：
获取重组HPV 16型E6-E7菌体，重组HPV 16型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，其中，第37位和第73位的半胱氨酸，第229位和第265位的半胱氨酸形成2个二硫键。
（2）破菌离心：
1、按照菌体量：破菌缓冲液（20mM Tris-Cl pH8.0）=1：20（w/v），取适量的破菌缓冲液，加入2026g重组HPV-16 E6-E7菌体中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以磁力搅拌器悬浮，直至悬浮均匀。
2、将悬浮均匀后的菌悬液加入均质机中，控制破菌压力在800bar，开始进行菌体第一次破碎，待第一次菌体破碎结束前，将出料管放入料液桶内，让剩余料液循环，以达到菌体的充分破碎。
3、将破菌一次后料液重新装入均质机料液桶中，重复均质破菌步骤，再次进行两次破菌。
4、破菌完成后输入连续流离心机，将10±2℃冷却循环水接入连续流离心机，设置转速10000rpm，并控制料液进料速度在500ml/min，待上清液流出3L后测定浊度，离心完成后，加入6L破菌缓冲液顶洗。
5、完成后拆卸离心转鼓，扯出滤膜，以刮刀刮取沉淀，即为破菌离心沉淀，进行称重，放置于6℃暂存。
破菌后离心收集沉淀约382g，收率在15%以上。
（3）包涵体洗涤：
1、按破菌离心沉淀：洗涤液1=1:10（w/v），取适量的洗涤液1（65mM NaCl 1.8M尿素20mM Tris-Cl，pH8.0），加入382g破菌离心沉淀中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀；
2、以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（一次）；
3、加入与步骤1同样体积的洗涤液1，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（二次），放入-20℃进行冷冻，时间不低于4小时；
4、包涵体洗涤后离心沉淀（二次）：洗涤液2（0.5% TritonX-100 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:50（w/v），加入洗涤液2，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（三次），收集336g；
三次洗涤后，包涵体纯度从20%左右提高至30%左右。
（4）包涵体变性：
1、按包涵体洗涤后离心沉淀（三次）：变性液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇20mM Tris-Cl，pH10.5）=1:40（w/v），取13440ml变性液加入336g步骤（3）制备的包涵体洗涤后离心沉淀（三次）中。
2、以高剪切分散乳化机进行剪切分散，完成后测定pH应在10.5，不在范围内加入6M 盐酸或2M NaOH调节。
3、将调节pH后的剪切样品，于6℃下，搅拌变性24小时，变性溶解完成后以冷冻离心机11000g、30min、8℃离心取上清，即为变性蛋白液。
变性蛋白（重组HPV 16型E6-E7融合蛋白）回收率在10%左右。
（5）阴离子层析：
以步骤（4）制备的重组HPV 16型E6-E7变性蛋白液为基础材料，填料为Q-Bestarose FF，操作步骤如下：
1、样品预处理：取12500ml变性蛋白液（步骤（4）制备）加入1M 枸橼酸调节pH在10.2±0.1，再加入4M NaCl调节电导值至10.0±0.1mS/cm ,测定pH后，再加入1M 枸橼酸调节pH在10.0（图2中泳道1样品）。
2、流速设定：设置系统流速180cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以B1液（8M尿素 1M NaCl 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0）冲洗层析柱2CV。
4、平衡：以A1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0（电导值10.0 mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用A1液冲洗5CV，并保证紫外吸收值降至稳定状态。
7、洗脱：用C1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 甘氨酸-NaOH，pH10.0（电导值16.0 mS/cm））洗脱层析柱6CV（流穿液为图2中泳道2样品，非目的蛋白峰为图2中泳道4样品），UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白（图2中泳道3样品），即为一步纯化蛋白。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由40%左右提高到55%左右，该步骤收率在30%左右。
（6）疏水层析：
以步骤（5）制备的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白一步纯化的层析液为基础材料，填料为Diamond Butyl，操作步骤如下：
1、样品预处理：取5050ml一步纯化蛋白（步骤（5）制备）加入2M 氢氧化钠调节pH在11.0，再加入NaCl调节电导值至92.5mS/cm，测定pH后，再加入2M 氢氧化钠调节pH在11.0。最后以C01的0.45+0.2μm囊式滤器过滤（过滤后样品为图2中泳道5样品）。
2、层析流速设定：设置系统流速180cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱3CV。
4、平衡：D1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠-NaOH，pH11.0（电导值90 mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用D1液冲洗不低于4CV，并保证紫外吸收值降至至稳定状态。
7、洗脱：用E1液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠-NaOH，pH11.0（电导80 mS/cm））洗脱层析柱不低于6CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为二步纯化蛋白液（纯化样品为图2中泳道6样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由65%左右提高到90%左右，该步骤收率在40%左右。
（7）复性：
以步骤（6）制备的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白二步纯化的层析液为基础材料，操作步骤如下：
1、超滤浓缩：取步骤（6）制备的二步纯化蛋白以10kD PES超滤膜包进行浓缩，完成后使用F1液（8M尿素+1mM EDTA+Na20.1%巯基乙醇 20mM 磷酸氢二钠+NaOH，pH11.0）顶洗膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为浓缩蛋白，控制蛋白计算浓度为9±1mg/ml。
2、复性：取浓缩蛋白使用蠕动泵于医用冷藏柜内缓慢均一地加入复性液（2M 尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5M 盐酸精氨酸、0.15mM 胱氨酸、1.5mM 半胱氨酸，pH8.00，）中，控制复性蛋白计算终浓度在0.15mg/ml，复性液在搅拌状态缓慢滴加样品，样品滴加控制方法为：单个管道滴加速度为100±30ml/h，所有样品于1h左右完成滴加，所有管道滴液口应均匀分散在上方，并保证尽可能较小的液滴滴落。滴加完成后样品于6℃条件下搅拌65小时，即复性完成。
（8）超滤置换：
1、膜包处理：取0.46m2×2块10KD的PES的超滤膜包进行超滤，调节泵转速至液体流速在1500ml/min左右，排空超滤膜包；先以水冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于2L；再取清洗液冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于1L，并暂停浸润不低于30min；以水冲洗超滤膜的，适当加压冲洗，保证pH恢复中性；以复性液进行润洗超滤膜。
2、超滤浓缩置换：复性完成后的蛋白液以0.45+0.2μm滤器过滤，取过滤后料液调节跨膜压力TMP在1bar，浓缩4倍后，并以置换液2（0.01%吐温80（w/v） 5mM HEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行连续置换8倍样品体积，置换完成后，再进一步浓缩至1/3体积。排空收集超滤置换蛋白液，并以350ml置换液2进行顶洗管道及超滤膜包，完成后与置换蛋白液合并，混匀，即为置换蛋白3溶液。即为置换后获得的复性蛋白。
该步骤复性收率在40%左右，蛋白由变性状态折叠成稳定的目的蛋白。
（9）原液制备：
置换后获得的复性蛋白以0.45+0.2μm滤器除菌过滤，即为原液。
上述纯化方法制备获得的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白在主要步骤的收率测定和中间体的纯度如下表。
表1 重组HPV 16型E6-E7融合蛋白在主要步骤的收率测定和中间体的纯度
实施例2
本实施例提供了一种重组HPV 18型E6-E7融合蛋白（SEQ ID No:2）的纯化方法，其包括以下步骤：
（1）破菌离心
1、按照菌体量：破菌缓冲液（20mM Tris-Cl pH8.0）=1：20（w/v），取适量的破菌缓冲液，加入1544.5g重组HPV18 E6-E7菌体中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以磁力搅拌器悬浮，直至悬浮均匀。
2、将悬浮均匀后的菌悬液加入均质机中，控制破菌压力在800bar，开始进行菌体第一次破碎，待第一次菌体破碎结束前，将出料管放入料液桶内，让剩余料液循环，以达到菌体的充分破碎。
3、将破菌一次后料液重新装入均质机料液桶中，重复均质破菌步骤，再次进行两次破菌。
4、破菌完成后输入连续流离心机，将10±2℃冷却循环水接入连续流离心机，设置转速10000rpm，并控制料液进料速度在500ml/min，待上清液流出3L后测定浊度，离心完成后，加入6L破菌缓冲液顶洗。
5、完成后拆卸离心转鼓，扯出滤膜，以刮刀刮取沉淀，即为破菌离心沉淀，进行称重，放置于2～8℃暂存。
破菌后离心收集沉淀约180g，收率在10%以上。
（2）包涵体洗涤
1、按破菌离心沉淀：洗涤液1（65mM NaCl 1.8M尿素 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:10（w/v），取适量的洗涤液1，加入179.31g破菌离心沉淀中，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀；
2、以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（一次）；
3、加入与步骤1同样体积的洗涤液1，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（二次），放入-20℃进行冷冻，时间不低于4小时；
4、包涵体洗涤后离心沉淀（二次）：洗涤液2（0.5% TritonX-100 20mM Tris-Cl，pH8.0）=1:50（w/v），加入洗涤液2，以高剪切分离乳化机进行剪切分散，再以电动搅拌器悬浮，直至悬浮均匀，以落地式高速冷冻离心机11000g、30min、8℃离心，收集离心沉淀即为包涵体洗涤后离心沉淀（三次）；
三次洗涤后，包涵体纯度从20%左右提高至40%左右。
（3）包涵体变性
1、按包涵体洗涤后离心沉淀（三次）：变性液（8M尿素 1mM EDTA-Na20.1%巯基乙醇20mM Tris-Cl，pH10.5）=1:40（w/v），取2120ml变性液加入53g步骤（2）制备的包涵体洗涤后离心沉淀（三次）中。
2、以高剪切分散乳化机进行剪切分散，完成后测定pH应在10.5，不在范围内加入6M 盐酸或2M NaOH调节。
3、将调节pH后的剪切样品，于6℃下，搅拌变性24小时，变性溶解完成后以冷冻离心机11000g、30min、8℃离心取上清，即为变性蛋白液。
变性蛋白（重组HPV 18型E6-E7融合蛋白）回收率在30%左右。
（4）阳离子疏水复合层析（Eshmuno CMX层析）
以前述步骤制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白的变性溶液为基础材料，填料为Eshmuno CMX，操作步骤如下：
1、样品预处理：取2140ml变性蛋白液加入1M 枸橼酸调节pH在10.2±0.1，再加入4M NaCl调节电导值至7.5±0.1mS/cm ,测定pH后，再加入1M 枸橼酸调节pH在10.0（图3中泳道2样品）。
2、流速设定：设置系统流速160～200cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以B液（8M尿素+1M NaCl+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris-Cl，pH10.0）冲洗层析柱2CV。
4、平衡：A液（8M尿素+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris- Cl，pH10.0（电导值7.5mS/cm））平衡层析柱3CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取预处理后的变性蛋白上样。
6、再平衡：上样完成后，用A液平衡层析柱4CV，并冲洗至紫外吸收值降低至稳定状态。
7、洗脱：用C液（8M尿素+1mM EDTA-Na2+0.1%巯基乙醇+20mM Tris-Cl，pH10.0（电导值15mS/cm））洗脱层析柱3CV（流穿液为图3中泳道3样品，杂蛋白为图3泳道5样品），UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为一步纯化蛋白（洗脱蛋白为图3中泳道4样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由40%左右提高到80%左右，该步骤收率在47%左右。
（5）疏水层析（Polar MC60-HIC Phenyl层析）
以步骤（4）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白一步纯化的层析液为基础材料，填料为Polar MC60-HIC Phenyl，操作步骤如下：
1、样品预处理：
1.1、取0.46m2×1块10KD的PES的超滤膜包，清洗及0.5M NaOH浸泡后，以注射用水清洗至pH至中性，再以置换液1（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH:11.50，cond：90mS/cm）润洗超滤膜包。
1.2、取3000ml步骤（4）制备的一步纯化蛋白进行超滤，控制循环流速在600～1200ml/min，TMP在0.6～1bar，浓缩3倍后，以置换液1连续洗滤4倍，置换完成后，排空超滤膜包，取置换液1 400ml顶洗超滤膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为置换蛋白1溶液（图4中泳道2样品）。
1.3、置换蛋白1溶液加入4M NaCl，不断搅拌，调节电导值95mS/cm，测定pH，并加入2M NaOH调节pH至11.50。最后以0.45+0.2μm囊式滤器过滤。
2、层析流速设定：设置系统流速180cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱2CV。
4、平衡：D液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导95mS/cm））平衡层析柱2CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样（图4中泳道3样品）
6、再平衡：上样完成后，用D液冲洗不低于2CV，并保证紫外吸收值降至至稳定状态。
7、洗脱：用E液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导80mS/cm））洗脱层析柱不低于5CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为二步纯化蛋白液（纯化蛋白为图4中泳道4样品，收集的杂峰为图4中泳道5样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由80%左右提高到90%左右，该步骤收率在70%左右。
（6）阴离子层析（Q-Bestarose FF）
以步骤（5）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白二步纯化的层析液为基础材料，填料为Q-Bestarose FF，操作步骤如下：
1、样品预处理：
1.1、取0.11m2×2块10KD的PES的超滤膜包，清洗及0.5M NaOH浸泡后，以注射用水清洗至pH至中性，再以F液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M尿素+0.1% 巯基乙醇，pH11.50）润洗超滤膜包。
1.2、取4100ml步骤（5）制备的二步纯化蛋白进行超滤，控制循环流速在1200ml/min，TMP在0.8bar，浓缩4倍后，以F液连续洗滤4倍，控制电导降低至11mS/cm以内，置换完成后，排空超滤膜包，取F液400ml顶洗超滤膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并。即为置换蛋白2溶液（图4中泳道6样品）。
2、流速设定：设置系统流速180cm/h。
3、预处理：取1M NaOH冲洗层析柱2CV，再以水冲洗层析柱2CV，后使用I液（20mMNa2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+1M NaCl，pH11.50）平衡层析柱3CV。
4、平衡：以G液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH:11.50（电导12.00mS/cm））平衡层析柱3CV，调节紫外检测波长为280nm，并将吸光度值调零。
5、上样：取步骤1预处理后的蛋白溶液上样
6、再平衡：上样完成后，用G液冲洗不低于2CV（流穿液为图4中泳道7样品），并保证紫外吸收值降至稳定状态。
7、洗脱：用H液（20mM Na2HPO4-NaOH+1mM EDTA-Na2+8M 尿素+0.1% 巯基乙醇+NaCl，pH11.50（电导15.00mS/cm））洗脱层析柱不低于3CV，UV280值迅速升高后开始收集洗脱蛋白，即为三步纯化蛋白（图4中泳道8样品）。用SDS-PAGE及Bradford检测。
试验结果：目的蛋白纯度由80%左右提高到95%左右，该步骤收率在90%左右。
（7）复性
以步骤（6）制备的重组HPV 18型E6-E7融合蛋白三步纯化的层析液为基础材料，操作步骤如下：
1、超滤浓缩：取步骤（6）制备的三步纯化蛋白以10kD PES超滤膜包进行浓缩，完成后使用H液顶洗膜包，将顶洗液和浓缩后蛋白液合并，即为浓缩蛋白，控制蛋白浓度在9mg/ml左右。
2、复性：取浓缩蛋白使用蠕动泵于医用冷藏柜内缓慢均一地加入复性液（2M 尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5M 盐酸精氨酸、0.15mM 胱氨酸、1.5mM 半胱氨酸，pH8.00）中，控制复性蛋白计算终浓度在0.15mg/ml，复性液在搅拌状态缓慢滴加样品，样品滴加控制方法为：单个管道滴加速度为100±30ml/h，所有样品于1h左右完成滴加，所有管道滴液口应均匀分散在上方，并保证尽可能较小的液滴滴落。滴加完成后样品于6℃条件下搅拌65小时，即复性完成。
（8）超滤置换
1、膜包处理：取0.46m2×2块10KD的PES的超滤膜包进行超滤，调节泵转速至液体流速在2000ml/min左右，排空超滤膜包；先以水冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于2L；再取清洗液冲洗超滤膜，适当加压保证透过端液体流出体积不低于1L，并暂停浸润不低于30min；以水冲洗超滤膜的，适当加压冲洗，保证pH恢复中性；以复性液进行润洗超滤膜。
2、超滤浓缩置换：复性完成后的蛋白液以0.45+0.2μm滤器过滤，取过滤后料液调节跨膜压力TMP在1bar，浓缩4倍后，并以置换液2（0.01%吐温80 5mM HEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行连续置换8倍样品体积，置换完成后，再进一步浓缩至1/4体积。排空收集超滤置换蛋白液，并以400ml置换液2（0.01%吐温80+5mM HEPES+0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）进行顶洗管道及超滤膜包，完成后与置换蛋白液合并，混匀，即为置换后获得的复性蛋白。
（9）原液制备：
置换后获得的复性蛋白以0.45+0.2μm滤器除菌过滤，即为原液。
该步骤复性收率在40%左右，蛋白由变性状态折叠成稳定的目的蛋白。
重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化工艺主要步骤的收率测定和中间体的纯度见表2。
表2 重组HPV 18型E6-E7融合蛋白纯化工艺主要步骤的收率测定和中间体的纯度
验证例1
验证复性液中的尿素浓度对蛋白回收率的影响。
一、实验方案
（1）复性预处理：取180ml浓缩后的HPV-16型（E6 E7）变性蛋白（实施例1的步骤（6）疏水层析洗脱样品），先用0.22μm滤器过滤，再用200cm25KD超滤膜包浓缩至30ml，再次过滤，过滤后样品即为复性前样品，测定蛋白浓度为：3.79mg/ml，分别分装3.3ml/份×4份（1对照组和3实验组）。
（2）复性
对照组（组1）取预处理样品1份，用稀释液（见表3）稀释10倍，滴入复性液（组2），稀释至6倍体积；
实验组（组2～4）样品3份，分别滴加不同尿素浓度的复性液（组2～4）中，稀释至60倍体积，具体见表4。
组1～4的滴加过程均在6℃条件下搅拌进行，滴加完成后继续搅拌复性64h。
表3.稀释液的配方
表4.复性液的配方
备注：表格中各组分的浓度为其作用浓度或终浓度；
稀释液中，20mM Na2HPO4-NaOH为含20mM Na2HPO4的NaOH。
（3）超滤浓缩
待复性完成后，测定浊度，各组样品分别用0.22μm滤器过滤，过滤后样品用200cm2、5KD超滤膜包浓缩到30ml。分别在浓缩前、浓缩4倍、8倍时取样，测定蛋白浓度。
二、实验数据
检测结果如表5-表6所示，实验SDS-PAGE检测图如图5~图7所示。
表5.尿素终浓度对浊度的影响
表6.蛋白浓度及回收率
如表5可知，组3的浊度最高，达到1.12 NTU。
如图5可知，超滤浓缩4倍蛋白回收率明显高于浓缩8倍，表明随着浓缩倍数的增加，蛋白进一步损失。
如表6所示，浓缩4倍时，组4和组3尿素终浓度的复性液蛋白回收率差异较小；浓缩8倍时，组3尿素终浓度的复性液蛋白回收率高于组4尿素终浓度的复性液；由图6~图7结果显示，组3的复性蛋白中浓缩4倍及浓缩8倍的蛋白回收率均高于其他组。
验证例2
验证复性液中的各因子对于蛋白回收率的影响。
设置多组复性液，多组复性液的配制体积均为500ml。
用于配置复性液的原料组分及其组分的初浓度包括：10M尿素、4M氯化钠、2M盐酸精氨酸、2M Tris、0.1M半胱氨酸和0.1M胱氨酸，配方具体见表7。需要说明的是，表7中各组分的浓度为其在复性液中的终浓度，每组复性液根据配方中的各组分的终浓度配制完成后，加水定容至400mL，然后添加2M NaOH调节复性液至对应pH。
表7.复性液配制表
实验过程
复性：将16组复性液放置8℃遇冷，取HPV 16型E6-E7融合蛋白（实施例1中步骤（6）疏水层析的洗脱蛋白液），在3分钟条件下，缓慢滴加入在搅拌状态下的复性液。完成后放置8℃复性4天，为复性蛋白。
超滤浓缩：复性完成后，以10kD的0.11m2膜（已用置换液2（0.01%吐温80 5mMHEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）润洗）进行超滤浓缩4倍。
置换：以置换液2（0.01%吐温80 5mM HEPES 0.5M盐酸精氨酸 pH8.25）等体积换液8倍体积。完成后排空超滤膜包，加入置换液2顶洗，合并料液控制体积在125ml左右，即为置换蛋白。将置换蛋白进行除菌过滤后，即为过滤后置换蛋白。
对上述留样进行离心取上清后进行粒径、蛋白浓度（Bradford法）、SDS-PAGE及SEC-HPLC检测。计算蛋白回收率。
实验结果
1、外观
表8.外观
2、粒径检测结果
表9.平均粒径统计（nm）
对于16组复性液：同一组复性液，在不同超滤浓缩置换阶段（复性蛋白、浓缩4倍、置换4倍、置换8倍、置换蛋白、置换蛋白过滤后），粒径图谱基本一致，主峰未发生显著变化。
将第一主峰粒径作为响应值（图8），通过Minitab统计学软件进行拟合，确定形成粒径形成的主要影响因素，见图9。
由图9可知，以最大粒径峰平均粒径作为响应值，影响该值的因子效应高低排列如下：盐酸精氨酸＞半胱氨酸与胱氨酸（10:1）＞pH＞尿素＞氯化钠。
3、以盐酸精氨酸与半胱氨酸与胱氨酸（10:1）作为变量拟合等值图如图10。由图10可知，控制半胱氨酸、胱氨酸与盐酸精氨酸比例，可实现不同粒径的形成。
4、蛋白浓度检测结果（mg/ml）（Bradford法）见表10。
表10.蛋白浓度检测结果（mg/ml）
各组蛋白回收率在50%以上（除13组外）。
5、各因子主效应分析结果见图11。
由结果可知，以置换后蛋白（已过滤）浓度作为响应值，影响该值的因子效应高低排列如下：盐酸精氨酸＞pH=氯化钠＞尿素＞半胱氨酸与胱氨酸（10:1），并且半胱氨酸与胱氨酸（10:1）与响应值成负相关性。
6、以盐酸精氨酸与氯化钠作为变量拟合等值图如图12所示（控制尿素浓度为2M，不添加半胱氨酸和胱氨酸）。
由结果可知，pH8.0组图（图12中A）中，最终蛋白浓度最大不低于0.475mg/ml，优于pH10组（图12中B）。盐酸精氨酸与氯化钠均是越高，最终蛋白浓度越高。
7、以盐酸精氨酸与pH作为变量拟合等值图如图13所示。
由图13可知，在较高浓度的尿素和氯化钠条件下，pH越低，最终蛋白浓度越高。
8、SDS-PAGE检测结果
见图14~图15。由结果可知，不同组间，聚集体含量存在一定差异，同时也进一步验证说明在粒径检测结果中，第一主峰粒径越大，在SDS-PAGE结果上表现出聚集体含量越高，两者具有相关性。
9、SEC-HPLC检查结果
见图16。各峰纯度占比数据统计
表11. 各峰纯度占比数据统计
通过Mnitab软件对表11各峰纯度数据以纯度影响为主效应因子进行分析。分析结果如下：
见图17~图19。由结果可知，以SEC-HPLC检查各峰占比作为响应值，影响该值的因子效应高低排列如下：pH是影响聚集体形成的关键因素，其次为氯化钠和半胱氨酸、胱氨酸。
由验证例2的结果可知，SEC-HPLC检测结果与粒径具有对应关系，聚集体含量高的粒径同样偏大。控制复性液中半胱氨酸从5mM降低至0mM、胱氨酸从0.5mM降低至0mM，形成蛋白的粒径变化趋势为5~60nm；在不添加半胱氨酸和胱氨酸的前提下，控制盐酸精氨酸从0.1M增加至0.5M，形成蛋白的粒径变化趋势为60~400nm。
通过对关键工艺参数进行控制，后期能够生产不同粒径的蛋白。当复性液配方为2M 尿素、20mM Tris、0.5M NaCl、0.5M 盐酸精氨酸、0.15mM 胱氨酸和1.5mM 半胱氨酸，pH8.00时，蛋白形成的粒径主要在10～20nm，活性（抗原含量）更高。
验证例3
验证复性液的组分及其配比对于蛋白复性后的粒径和比活的影响。
实验方法：
取实施例1步骤（7）复性中浓缩蛋白（HPV-16型（E6 E7）），加入到8组不同配方的复性液里进行复性（实施例1步骤（7）复性的步骤2），进行复性、超滤置换和原液制备（同实施例1）。并对各步骤中间样品取样，完成SDS-PAGE、蛋白浓度（Bradford法）及粒径检测。
将组1～组8原液取样送检，检验项目：蛋白浓度(Lowry法2)、抗原含量（ELISA）。
表12. 8组复性液配方
实验结果
1、SDS-PAGE检测结果
电泳参数设置：（Loading Buffer为变性+还原上样缓冲液（5X，厂家为碧云天），制样体系为40ul样品+10ul loading Buffer，凝胶为SurePage Bis Tris 4-20%（厂家：GenScript），电泳液为Tris-MOPS-SDS Running Buffer（厂家：GenScript），电泳参数为150V，50min）。
电泳结果如图20~图23所示。
由图20~图23可知，复性蛋白浓缩4倍后，组1的小分子蛋白有明显增加，蛋白复性后先浓缩再置换，完成原液制备；组5～组8有明显堵孔现象，可能由产生多聚体导致，其余各组均无明显差异。
2、蛋白回收率结果见表13和图24。
表13. 复性后蛋白收率统计表
由结果可知，复性蛋白浓缩4倍后，组1～组5蛋白回收率明显高于组6、组7、组8，表明加入半胱氨酸和胱氨酸后有助于提高蛋白回收率。复性蛋白置换后及原液，各组蛋白回收率均无明显差异。
3、粒径检测结果
表14. 粒径光强分布峰均值数据统计表
粒径光强分布数据结果见图25。
表15. 粒径体积分布峰均值数据统计表
粒径体积分布数据结果见图26。
结果分析
粒径光强分布结果分析：
由如表14及图25可知，组1～组5均添加半胱氨酸和胱氨酸，随着氧化还原剂浓度依次降低，粒径有一定程度增加，但增加趋势较小。
组6～组8均不添加氧化还原剂，粒径明显增大。
粒径体积分布结果分析：
如表15及图26所示，置换前组1~组8粒径基本一致，置换后组1～组5均添加半胱氨酸和胱氨酸，随着氧化还原剂浓度依次降低，粒径有一定程度增加。
4、原液蛋白浓度（Lowry法）、抗原含量及比活数据
表16. 蛋白浓度（Lowry法）、抗原含量及比活数据统计表
原液数据见图27。
结果分析
组1～组8原液蛋白回收率无明显差异（因组1～组8原液体积均约70ml，在原液蛋白浓度相差甚微的情况下，故回收率无明显差异）。
添加半胱氨酸和胱氨酸的组1～5比活值明显高于未添加的6～8组。
组1和组4比活值较高（3.13，2.92），为保证蛋白复性的粒径形成及比活稳定性，中间组（组3：复性液配方：2M 尿素+20mM Tris+0.49M氯化钠+0.5M 盐酸精氨酸+1.5mM半胱氨酸+0.15mM胱氨酸 pH8.0 ）复性液配方效果较优，主峰粒径以光强分布来看，应维持在20～30nm，且光强分布面积不低于65%。以体积分布来看，应维持在15~20nm，且体积分布面积不低于99%。
验证例4
验证复性液中不同比例的半胱氨酸和胱氨酸对复性后原液蛋白的活性影响。
实验方法同验证例3，以验证例3的组3的复性液为基础，设置对照组，对照组与组3的区别在于半胱氨酸和胱氨酸的比例不同，具体见表17。检测结果见表18。
表17 复性液配方
表18 抗原含量
结论：半胱氨酸与胱氨酸的比例10：1显著优于2:1组。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种目标蛋白的纯化方法，其特征在于，其包括：
获取大肠杆菌以包涵体形式表达的目标蛋白经破菌离心、包涵体洗涤、包涵体变性和层析纯化后的蛋白产物，对所述蛋白产物进行复性；
所述复性包括将所述蛋白产物与复性液按照体积比为1:50~70混合，所述复性液的组分及其组分的浓度为：1～3M尿素，15~25 mM Tris，0.41～0.5M NaCl，0.34～0.5M盐酸精氨酸，0.018～0.5mM胱氨酸和0.18～5mM半胱氨酸；所述复性液的pH为8～10；所述半胱氨酸和所述胱氨酸的摩尔比为9~11：1；
所述目标蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的目标蛋白的纯化方法，其特征在于，所述复性液还包括用于调整复性液pH的pH调节剂，所述pH调节剂包括NaOH和HCl中的任意一种。
3.根据权利要求1~2任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述复性的条件包括：4～15℃，60～70h，静止复性或搅拌复性。
4.根据权利要求1~2任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括对复性后的产物进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/3～1/5。
5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，在对复性后的产物进行超滤浓缩前或后，所述纯化方法还包括对产物进行置换；所述置换采用的置换液的组分及其组分的浓度为：5mM HEPES、0.5M盐酸精氨酸和质量体积分数为0.01%的吐温，pH为8.25。
6.一种复性液，其特征在于，所述复性液为权利要求1～5任一项中所述的复性液。
7.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求6所述的复性液。
8.复性液在制备用于纯化目标蛋白的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述复性液为权利要求1～5任一项中所述的复性液，所述目标蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组HPV 16型E6-E7融合蛋白。
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