CN109776675A - 两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，属于犬免疫球蛋白的制备领域。本发明首先公开了一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，该方法以健康犬血清或血浆为原料，首先用阴离子交换层析进行犬免疫球蛋白的粗分离，然后用阳离子交换层析进行犬免疫球蛋白精纯化。本发明方法制备的犬免疫球蛋白的纯度和回收率均大幅提高，犬免疫球蛋白的纯度达97％以上，而且降低了产品中的内毒素含量，提高了产品的安全性。本发明方法的操作步骤简便，而且综合生产成本低于常规低温乙醇法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，属于犬免疫球蛋白的制备领域。
背景技术
免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，普遍存在于动物的血液、组织液和外分泌液中，其中血清和初乳中的含量最高。免疫球蛋白是机体免疫系统的重要组成成分，在抗感染和免疫调节中发挥着重要的作用。经静脉注射吸收后，可迅速提高受者血液中免疫球蛋白的含量，通过其特异性中和作用和免疫调理等功能，起到预防和治疗各种病毒性、细菌性、真菌性、寄生虫性等疾病的作用。
犬血浆蛋白制品是宝贵的犬源性生物类药品。20世纪40年代，Cohn教授建立了工业化规模分离血浆蛋白的低温乙醇法分离工艺，自此以来，血液制品的开发，特别是临床应用、市场份额以及制品安全性和生产工艺均发生了质的飞跃。
在中国国内，人用免疫球蛋白多采用低温乙醇法的生产工艺。而兽用免疫球蛋白，目前可检索到的生产工艺专利也是采用低温乙醇法。用低温乙醇法工艺生产的产品纯度可达95％以上，但收率较低(只达到理论值的40％左右)。
随着离子交换介质的国产化和使用成本的不断降低，使离子交换层析在工业生产上的应用成为可能。在WO 89/05157中报导了直接对细胞培养基进行阳离子交换处理来纯化免疫球蛋白的方法；Mhatre R.等人(J.chrom.A 707(1995)225-231)探究了通过阳离子交换层析和pH梯度洗脱对抗体Fab片段进行纯化。在犬血浆原料紧缺的局势下，开发一种可以提高犬免疫球蛋白收率、降低产品中内毒素含量的离子交换层析方法，显得十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，该方法用阴离子交换层析进行犬免疫球蛋白的粗分离，然后用阳离子交换层析进行犬免疫球蛋白精纯化，不仅大幅度提高了免疫球蛋白产品的纯度和收率，而且降低了产品中内毒素的含量，提高产品的安全性。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明公开了一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将冷冻保存的健康犬血浆或血清在4℃融化，用醋酸盐缓冲液稀释，调pH值，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱用醋酸盐缓冲液平衡，将过滤澄清后的血浆或血清样品上样；
(3)待出现蛋白峰后(当流穿液A280吸收达到100mAU时)开始收集流穿液；上样结束后，用醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失(A280吸收回到基线水平为止)，所收集的流穿液即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱用醋酸盐缓冲液平衡，调节步骤(3)所收集流穿液的pH，上样；
(5)上样结束后，用醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含NaCl的醋酸盐缓冲液洗涤层析柱(以去除结合在阳离子柱上的杂蛋白)，当A280吸收回到基线水平后，用含NaCl的醋酸盐缓冲液洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，所收集的洗脱液即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将步骤(5)收集的洗脱液进行透析，然后在搅拌条件下缓慢加入麦芽糖，调节pH；进行低pH值孵化病毒灭活，配制分装，即得。
其中，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.9-5.2；优选的，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；更优选的，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L。
步骤(1)所述醋酸盐缓冲液的用量为犬血浆或血清体积的8-10倍量；所述调pH值为调pH值至4.9-5.2；优选的，调pH值至与所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；更优选的，用1.0mol/L醋酸调pH值。
步骤(2)所述阴离子层析柱为UniGel-80Q阴离子层析柱(购自苏州纳微科技有限公司)。步骤(2)所述平衡为平衡至流出液pH值为4.9-5.2；优选的，平衡至流出液pH值与步骤(2)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同。
步骤(4)所述阳离子层析柱为UniGel-80CM阳离子层析柱(购自苏州纳微科技有限公司)。
步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值为5.7-6.5；优选的，步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L。步骤(4)所述平衡为用醋酸盐缓冲液平衡至流出液pH值为5.7-6.5；优选的，平衡至流出液pH值与步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同。步骤(4)调节步骤(3)所收集流穿液的pH至5.7-6.5；优选的，调节步骤(3)所收集流穿液的pH与步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；更优选的，用NaOH调节流穿液的pH。
步骤(5)所述醋酸盐缓冲液或者含NaCl的醋酸盐缓冲液的pH值为5.7-6.5；优选的，步骤(5)所述醋酸盐缓冲液或者含NaCl的醋酸盐缓冲液的pH值与步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；更优选的，步骤(5)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L。步骤(5)洗涤层析柱所用的含NaCl的醋酸盐缓冲液为含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液；洗脱目标蛋白所用的含NaCl的醋酸盐缓冲液为含0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液。
本发明对步骤(1)-(5)所述醋酸盐缓冲液的醋酸盐种类没有特殊限定，醋酸铵、醋酸钠等本领域常用的醋酸盐缓冲液均适用于本发明。作为本发明的优选技术方案，所述醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
步骤(6)所述透析为将步骤(5)收集的洗脱液加入2-8℃注射用水进行透析；优选的，所述注射用水的用量为收集的洗脱液体积的6-8倍；所述透析为透析至蛋白浓度达到30mg/ml以上；可以用截留率为100kDa的超滤膜进行透析；步骤(6)按质量比计，加入麦芽糖使麦芽糖的含量为9％-11％；步骤(6)所述调节pH为调节pH至3.8-4.4；优选的，用0.5mol/L盐酸液调节pH至3.8-4.4。
步骤(6)所述低pH值孵化病毒灭活，包括：将浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH3.8-4.4、含9％-11％麦芽糖(质量比)的条件下进行低pH值病毒灭活。所述配制分装为使最终制品的犬免疫球蛋白的含量＞30mg/ml，纯度≥97％，内毒素含量＜16EU/ml。
本发明对两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的阴离子交换介质和阳离子交换介质进行了优化。通过对常见的阴离子交换介质和阳离子交换介质(例如，美国GEHearlthcare公司产品、美国Amberlite系列、德国Lewatit系列、日本Diaion系列、法国AllassionCS和Duolite系列)进行筛选，虽然上述产品都可用于犬免疫球蛋白的分离纯化，但效果有所差异。经过对分离效果、成本等因素进行综合评价，本发明选择使用苏州纳微科技有限公司的阴离子交换介质和阳离子交换介质。
本发明所述缓冲液的种类、浓度和pH值等参数均是针对苏州纳微科技有限公司的阴离子层析柱(UniGel-80Q)和阳离子层析柱(UniGel-80CM)经过反复优化所得。
本发明对所述离子交换层析法中调整pH值所用的试剂没有特殊限定。
本发明两步离子交换层析法所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为30-32mg/ml，蛋白纯度为97-98％，内毒素含量为2-8EU/ml，免疫球蛋白回收率为6.7-9.2g/L，所制备犬免疫球蛋白的质量和收率均优于传统低温乙醇法。
相对目前普遍采用的两步阴离子层析纯化免疫球蛋白方法，本发明采用阳离子交换层析法除了具有纯化效果好、收率高的优点外，还可除去大肠杆菌内毒素，大大降低产品中内毒素的含量，提高产品的安全性。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明所述两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，以健康犬血清或血浆为原料，先用阴离子交换层析进行犬免疫球蛋白的粗分离，然后用阳离子交换层析进行犬免疫球蛋白精纯化，大大简化了犬免疫球蛋白的纯化过程。与传统的低温乙醇多级分离工艺相比，本发明具有以下优势：①保持了犬免疫球蛋白天然的分子结构和特有的生物活性；②大幅度提高了免疫球蛋白产品的纯度，达到了97％以上；③大幅度提高了免疫球蛋白产品的收率，达到了70％以上；④大幅度降低了产品的不良反应，产品内毒素含量可控制在16EU/ml以内；⑤综合生产成本低于常规低温乙醇法，具有广阔的市场应用前景。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“内毒素”是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，也称为脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以称为内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1犬免疫球蛋白制剂的制备
1、实验方法
(1)将健康犬血浆或血清融化(4℃)，用10倍体积pH值为5.1的0.03mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液稀释，并用1.0mol/L醋酸调pH值至5.1，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱(UniGel-80Q，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.1的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(即醋酸-醋酸钠缓冲液，下同)平衡至出液pH值为5.1后，将稀释过滤后的血清或血浆样品上样；
(3)待出现蛋白峰后开始收集流穿液，上样结束后，用pH值为5.1的0.03mol/L醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失，此流穿液(Ⅰ)即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱(UniGel-80CM，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为5.9后，用NaOH调上述流穿液(Ⅰ)的pH至5.9，上样；
(5)上样结束后，用pH值为5.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.9)洗涤层析柱，以去除结合在阳离子柱上的杂蛋白，当A280吸收回到基线水平后，用含有0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.9)洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，此洗脱液(Ⅱ)即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将收集的洗脱液(Ⅱ)，用6倍体积的2～8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度30mg/ml以上，边搅拌边缓慢加入麦芽糖和0.5mol/L盐酸液，使麦芽糖质量比含量10％，调节pH至4.0。
(7)把浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH4.0、含10％麦芽糖的条件下进行低pH值病毒灭活。
(8)配制分装：使最终制品为犬免疫球蛋白的含量32mg/ml，纯度98％，内毒素含量2EU/ml的制品。
按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度、纯度和内毒素含量。
2、实验结果
所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为32mg/ml，蛋白纯度为98％，内毒素含量2EU/ml，pH为4.0。
实施例2犬免疫球蛋白制剂的制备
1、实验方法
(1)将健康犬血浆或血清融化(4℃)，用8倍体积pH值为5.2的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(即醋酸-醋酸钠缓冲液，下同)稀释，并用1.0mol/L醋酸调pH值至5.2，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱(UniGel-80Q，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.2的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为5.2后，将稀释过滤后的血清或血浆样品上样；
(3)待出现蛋白峰后开始收集流穿液，上样结束后，用pH值为5.2的0.03mol/L醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失，此流穿液(Ⅰ)即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱(UniGel-80CM，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.7的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为5.7后，用NaOH调上述流穿液(Ⅰ)的pH至5.7，上样；
(5)上样结束后，用pH值为5.7的0.03mol/L醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.7)洗涤层析柱，以去除结合在阳离子柱上的杂蛋白，当A280吸收回到基线水平后，用含有0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.7)洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，此洗脱液(Ⅱ)即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将收集的洗脱液(Ⅱ)，用7倍体积的2～8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度30mg/ml以上，边搅拌边缓慢加入麦芽糖和0.5mol/L盐酸液，使麦芽糖质量比含量9％，调节pH至3.8。
(7)把浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH3.8、含9％麦芽糖的条件下进行低pH值病毒灭活。
(8)配制分装：使最终制品为犬免疫球蛋白的含量30mg/ml，纯度97％，内毒素含量8EU/ml的制品。
按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度、纯度和内毒素含量。
2、实验结果
所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为30mg/ml，蛋白纯度为97％，内毒素含量8EU/ml，pH为3.8。
实施例3犬免疫球蛋白制剂的制备
1、实验方法
(1)将健康犬血浆或血清融化(4℃)，用8倍体积pH值为4.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(即醋酸-醋酸钠缓冲液，下同)稀释，并用1.0mol/L醋酸调pH值至4.9，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱(UniGel-80Q，苏州纳微科技有限公司)用pH值为4.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为4.9后，将稀释过滤后的血清或血浆样品上样；
(3)待出现蛋白峰后开始收集流穿液，上样结束后，用pH值为4.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失，此流穿液(Ⅰ)即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱(UniGel-80CM，苏州纳微科技有限公司)用pH值为6.5的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为6.5后，用NaOH调上述流穿液(Ⅰ)的pH至6.5，上样流穿液(Ⅰ)；
(5)上样结束后，用pH值为6.5的0.03mol/L醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 6.5)洗涤层析柱，以去除结合在阳离子柱上的杂蛋白，当A280吸收回到基线水平后，用含有0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 6.5)洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，此洗脱液(Ⅱ)即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将收集的洗脱液(Ⅱ)，用8倍体积的2～8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度30mg/ml以上，边搅拌边缓慢加入麦芽糖和0.5mol/L盐酸液，使麦芽糖质量比含量11％，调节pH至3.9。
(7)把浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH3.9、含11％麦芽糖的条件下进行低pH值病毒灭活。
(8)配制分装：使最终制品为犬免疫球蛋白的含量31mg/ml，纯度98％，内毒素含量4EU/ml的制品。
按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度、纯度和内毒素含量。
2、实验结果
所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为31mg/ml，蛋白纯度为98％，内毒素含量4EU/ml，pH为3.9。
实施例4犬免疫球蛋白制剂的制备
1、实验方法
(1)将健康犬血浆或血清融化(4℃)，用9倍体积pH值为5.1的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(即醋酸-醋酸钠缓冲液，下同)稀释，并用1.0mol/L醋酸调pH值至5.1，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱(UniGel-80Q，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.1的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为5.1后，将稀释过滤后的血清或血浆样品上样；
(3)待出现蛋白峰后开始收集流穿液，上样结束后，用pH值为5.1的0.03mol/L醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失，此流穿液(Ⅰ)即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱(UniGel-80CM，苏州纳微科技有限公司)用pH值为5.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液平衡至出液pH值为5.9后，用NaOH调上述流穿液(Ⅰ)的pH至5.9，上样；
(5)上样结束后，用pH值为5.9的0.03mol/L醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.9)洗涤层析柱，以去除结合在阳离子柱上的杂蛋白，当A280吸收回到基线水平后，用含有0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.9)洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，此洗脱液(Ⅱ)即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将收集的洗脱液(Ⅱ)，用6倍体积的2～8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度30mg/ml以上，边搅拌边缓慢加入麦芽糖和0.5mol/L盐酸液，使麦芽糖含量10％(质量比)，调节pH至4.4。
(7)把浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH4.4、含10％麦芽糖的条件下进行低pH值病毒灭活。
(8)配制分装：使最终制品为犬免疫球蛋白的含量32mg/ml，纯度98％，内毒素含量3EU/ml的制品。
按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度、纯度和内毒素含量。
2、实验结果
所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为32mg/ml，蛋白纯度为98％，内毒素含量3EU/ml，pH为4.4。
对比例1传统低温乙醇法犬免疫球蛋白制剂的制备
1、实验方法
(1)将血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，调整pH至7.5，加入预冷乙醇至终浓度10％(g/100ml)，离心去除杂蛋白；
(2)对上清液进行处理，调整pH至4.0，逐渐加入乙醇至终浓度20％，静置过夜后，离心保留沉淀；
(3)上述沉淀加入10倍量的0℃注射用水，用0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，搅拌4小时，静置过夜；
(4)上述溶解液用连续离心机离心，用0.45um滤板过滤上清，用0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调整pH至5.0，加入乙醇至20％，搅拌4小时，静置过夜；
(5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6.0，加入乙醇至25％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀即为免疫球蛋白。
(6)用0℃水溶解沉淀，采用截留分子量为30kD的超滤器，用10倍体积的0℃水进行透析去除乙醇。透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度25mg/ml以上，边搅拌边缓慢加入麦芽糖和0.5mol/L盐酸液，使麦芽糖质量比含量10％，调节pH至3.9。
(7)把浓缩后的免疫球蛋白制品过滤除菌，置于无菌容器中，在21℃库中放置21天，使制品在pH3.9、含10％麦芽糖的条件下进行低pH值病毒灭活。
(8)配制分装：使最终制品为犬免疫球蛋白的含量25mg/ml，纯度95％，内毒素含量32EU/ml的制品。
按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度、纯度和内毒素含量。
2、实验结果
所制备的犬免疫球蛋白的蛋白浓度为25mg/ml，蛋白纯度为95％，内毒素含量32EU/ml，pH为3.9。
试验例1本发明制备工艺与传统低温乙醇制备工艺所得产品参数比较
本发明制备工艺与传统低温乙醇制备工艺(对比例1)所得产品参数比较结果见表1。
表1本发明制备工艺与传统低温乙醇制备工艺所得产品参数比较
从表1中可以看出，本发明方法制备的犬免疫球蛋白的质量和收率均优于用传统低温乙醇法制备的犬免疫球蛋白。
Claims (10)
1.一种两步离子交换层析法制备犬免疫球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将冷冻保存的健康犬血浆或血清在4℃融化，用醋酸盐缓冲液稀释，调pH值，过滤澄清；
(2)将阴离子层析柱用醋酸盐缓冲液平衡，将过滤澄清后的血浆或血清样品上样；
(3)待出现蛋白峰后，开始收集流穿液；上样结束后，用醋酸盐缓冲液继续冲洗，直至蛋白峰消失，所收集的流穿液即为犬免疫球蛋白粗品；
(4)将阳离子层析柱用醋酸盐缓冲液平衡，调节步骤(3)所收集流穿液的pH，上样；
(5)上样结束后，用醋酸盐缓冲液充分洗涤，直到A280吸收至基线水平，然后用含NaCl的醋酸盐缓冲液洗涤层析柱，当A280吸收回到基线水平后，用含NaCl的醋酸盐缓冲液洗脱目标蛋白，收集蛋白峰，所收集的洗脱液即为纯化后的犬免疫球蛋白；
(6)将步骤(5)收集的洗脱液进行透析，然后加入麦芽糖，调节pH值；进行低pH值孵化病毒灭活，配制分装，即得。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.9-5.2；
优选的，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；
进一步优选的，步骤(1)、步骤(2)或步骤(3)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述醋酸盐缓冲液的用量为犬血浆或血清体积的8-10倍量；
步骤(1)所述调pH值为调pH值至4.9-5.2；优选的，调pH值至与所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；
更优选的，用1.0mol/L醋酸调pH值。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述阴离子层析柱为UniGel-80Q阴离子层析柱。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述平衡为平衡至流出液pH值为4.9-5.2；优选的，平衡至流出液pH值与所述醋酸盐缓冲液的pH值相同。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述阳离子层析柱为UniGel-80CM阳离子层析柱。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值为5.7-6.5；
优选的，步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述平衡为用醋酸盐缓冲液平衡至流出液pH值为5.7-6.5；优选的，平衡至流出液pH值与醋酸盐缓冲液的pH值相同；
步骤(4)调节步骤(3)所收集流穿液的pH至5.7-6.5；优选的，调节步骤(3)所收集流穿液的pH与步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；更优选的，用NaOH调节流穿液的pH。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述醋酸盐缓冲液或者含NaCl的醋酸盐缓冲液的pH值为5.7-6.5；优选的，步骤(5)所述醋酸盐缓冲液或者含NaCl的醋酸盐缓冲液的pH值与步骤(4)所述醋酸盐缓冲液的pH值相同；
更优选的，步骤(5)所述醋酸盐缓冲液的浓度为0.03mol/L；
步骤(5)洗涤层析柱用的含NaCl的醋酸盐缓冲液为含0.1mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液；洗脱目标蛋白用的含NaCl的醋酸盐缓冲液为含0.4mol/L NaCl的0.03mol/L醋酸盐缓冲液。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述透析为将步骤(5)收集的洗脱液加入2-8℃注射用水进行透析；优选的，所述注射用水的用量为收集的洗脱液体积的6-8倍；所述透析为透析至蛋白浓度达到30mg/ml以上；
步骤(6)按质量比计，加入麦芽糖使麦芽糖的含量为9％-11％；步骤(6)所述调节pH为调节pH至3.8-4.4；优选的，用0.5mol/L盐酸液调节pH至3.8-4.4。
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|---|---|---|---|---|
| CN112480246A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-03-12 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种犬免疫球蛋白的分离纯化方法及其应用 |
| CN112521485A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-03-19 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种犬血白蛋白的制备方法、利用其得到的犬血白蛋白和应用 |
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| CN1311797A (zh) * | 1998-06-09 | 2001-09-05 | 斯塔滕斯血清研究所 | 生产用于静脉给药的免疫球蛋白和其他免疫球蛋白产品的方法 |
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