CN104004091B - 一种人免疫球蛋白的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人免疫球蛋白的制备工艺，其步骤包括：1、从血浆中分离组分I+II+III；2、第一次层析；3、第一次分离；4、第二步层析；5、超滤；6、半成品配制；7、成品配制。本发明采用了一步分离加两步层析来提取提纯蛋白，与传统的乙醇多级分离工艺相比，本发明的工艺简便快捷，同时制备出的人免疫球蛋白收率高，纯度高，质量好。
Description
技术领域
本发明涉及一种人免疫球蛋白的制备工艺，属于血液制品领域。
背景技术
人血浆蛋白制品是宝贵的人源性生物类药品。自从20世纪40年代Cohn教授建立了工业化规模分离血浆蛋白的低温乙醇法分离工艺以来，血液制品的开发，特别是临床应用、市场份额以及制品安全性和生产工艺均发生了质的飞跃。
然而与发达国家相比，无论在高技术研发或临床应用研究方面，我国还有很大差距。国内现采用的生产工艺大部分是传统的乙醇多层分离法来提取免疫球蛋白，此工艺虽然得到的免疫球蛋白纯度较高，但也不可避免的造成了免疫球蛋白的流失。
在血浆原料紧缺的局势下，改进一种可以提高免疫球蛋白收率的制备工艺显得十分重要。
发明内容
本发明主要针对上述问题提供一种人免疫球蛋白的制备工艺。
本发明一种人免疫球蛋白的制备工艺，其制备工艺包括以下方面：
1、从血浆中分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：将血浆用0.1mol/L NaCl溶液稀释，稀释终点为蛋白质含量为4.5%~5.5%，然后用pH 4.0醋酸盐缓冲液调血浆pH 5.50~6.00，降温至0℃以下开始喷入-15℃以下95%乙醇，使反应液最终乙醇浓度达到25%（v/v)，制品最终温度控制在-2.0~-3.0℃，继续搅拌2小时后，加入硅藻土或珍珠岩用压滤机进行加压过滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ；
2、第一步层析：将步骤1得到的组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ用NaCl溶液溶解，调节溶解液中NaCl终浓度为4.7~5.0g/L，pH5.00~5.10，上DEAE-Spherodex柱，收集流出液；
3、第一步分离：调节步骤2中流出液的温度，保持温度在0~2℃，加入95%乙醇至反应液乙醇终浓度为18%，之后搅拌2小时压滤分离，得到压滤液；
4、第二步层析：将步骤3得到的压滤液调节pH为5.8，上SP-Spharose 4B柱，然后使用pH11的甘氨酸洗脱SP-Spharose 4B柱，收集洗脱液；
5、超滤：将步骤4收集的洗脱液5倍浓缩，用注射用水调节蛋白浓度为8%，调节pH为4.8，得到浓缩液；
6、半成品配制：将步骤5中得到的浓缩液加入麦芽糖，pH调节液，注射用水，除菌过滤，进行低pH病毒灭活得到半成品；
7、成品：将步骤6中的半成品用DV50纳米膜过滤进行病毒去除处理，除菌，调节pH6.4~7.4，分装得到成品。
其中步骤1中控制乙醇浓度为25%，能够将目标蛋白完全沉淀，除去了大部分白蛋白和杂蛋白。
步骤2中通过使用凝胶柱吸附蛋白液中不需要的蛋白，进一步达到去除杂蛋白的目的。
免疫球蛋白沉淀的条件为乙醇浓度为20%左右，在步骤3中调节乙醇浓度为18%，可以去掉部分杂蛋白，只留下较纯的免疫球蛋白。
步骤4中使用凝胶柱对蛋白液进行提纯，在pH为5.8时，SP-Spharose 4B柱特异性吸附免疫球蛋白，再通过洗脱液洗脱蛋白，得到了高纯度免疫球蛋白，最大限度的减少IgG浪费。
本发明工艺制备的人免疫球蛋白和现有技术相比，通过一步乙醇分离能够最大限度的降低免疫球蛋白活性的损失，步骤简便，收率更高，纯度更高，IgG单体与二聚体的含量高于同类产品，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
实施例1：通过本发明来制备狂犬病人免疫球蛋白
（1）血浆融化：将100人份狂犬病表面抗体效价≥8IU/mL的原料血浆在0~4℃中融化；
（2）从血浆中分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：将血浆用0.1mol/L NaCl溶液稀释，稀释终点为蛋白质含量为4.5%~5.5%，然后用pH 4.0醋酸盐缓冲液调血浆pH 5.50~6.00，降温至0℃以下开始喷入-15℃以下95%乙醇，使反应液最终乙醇浓度达到25%（v/v)，制品最终温度控制在-2.0~-3.0℃，继续搅拌2小时后，加入硅藻土用压滤机进行加压过滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ；
（3）第一步层析：将步骤（2）得到的组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ用NaCl溶液溶解，调节溶解液中NaCl终浓度为4.7~5.0g/L，pH 5.00，上DEAE-Spherodex柱，收集流出液；
（4）第一步分离：调节步骤（3）中流出液的温度，保持温度在0~2℃，加入95%乙醇至反应液乙醇终浓度为18%，之后搅拌2小时压滤分离，得到压滤液；
（5）第二步层析：将步骤（4）得到的压滤液调节pH为5.8，上SP-Spharose 4B柱，然后使用pH11的甘氨酸洗脱SP-Spharose 4B柱，收集洗脱液；
（6）超滤：将步骤（5）收集的洗脱液5倍浓缩，用注射用水调节蛋白浓度为8%，调节pH为4.8，得到浓缩液；
（7）半成品配制：将步骤（6）中得到的浓缩液加入注射用水，加入麦芽糖使麦芽糖含量为20~50g/L，用1mol/L盐酸调节pH6.4~7.4，除菌过滤，进行低pH病毒灭活得到半成品；
（8）成品：将步骤（7）中的半成品用DV50纳米膜过滤进行病毒去除处理，除菌，调节pH6.4~7.4，分装得到成品。狂犬病表面抗体效价≥100IU/ml，乙肝表面抗体效价≥1.0IU/（每g蛋白质）。
实施例2：采用本方法制备乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、抗D人免疫球蛋白的工艺步骤与实施例1相同。
实施例3：本发明制备工艺与传统乙醇多级分离制备工艺所得产品参数比较：
狂犬病人免疫球蛋白
乙型肝炎人免疫球蛋白
可以从表中看出本工艺制备的人免疫球蛋白的质量和收率要优于传统乙醇多级分离所制备的人免疫球蛋白。
Claims (3)
1.一种人免疫球蛋白的制备工艺，其特征是制备工艺如下：
（1）从血浆中分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：将血浆用0.1mol/L NaCl溶液稀释，稀释终点为蛋白质含量为4.5%~5.5%，然后用pH 4.0醋酸盐缓冲液调血浆pH 5.50~6.00，降温至0℃以下开始喷入-15℃以下95%乙醇，使反应液最终乙醇浓度达到25%（v/v)，制品最终温度控制在-2.0~-3.0℃，继续搅拌2小时后，用压滤机进行加压过滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ；
（2）第一步层析：将步骤（1）得到的组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ用NaCl溶液溶解，调节溶解液中NaCl终浓度为4.7~5.0g/L，pH5.00~5.10，上DEAE-Spherodex柱，收集流出液；
（3）第一步分离：调节步骤（2）中流出液的温度，保持温度在0~2℃，加入95%乙醇至反应液乙醇终浓度为18%，之后搅拌2小时压滤分离，得到压滤液；
（4）第二步层析：将步骤（3）得到的压滤液调节pH为5.8，上SP-Spharose 4B柱，然后使用pH 11的甘氨酸洗脱SP-Spharose 4B柱，收集洗脱液；
（5）超滤：将步骤（4）收集的洗脱液5倍浓缩，用注射用水调节蛋白浓度为8%，调节pH为4.8，得到浓缩液；
（6）半成品配制：将步骤（5）中得到的浓缩液加入麦芽糖，pH调节液，注射用水，除菌过滤，进行低pH病毒灭活得到半成品；
（7）成品：将步骤（6）中的半成品用DV50纳米膜过滤进行病毒去除处理，除菌、调节pH6.4~7.4，分装得到成品。
2.如权利要求1所述的一种人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于：步骤（1）和/或步骤（3）压滤时采用硅藻土或珍珠岩作为助滤剂。
3.如权利要求1所述的一种人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于：该工艺可用于制备乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、抗D人免疫球蛋白。
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