CN104004089A - 一种静注人免疫球蛋白生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种静注人免疫球蛋白生产方法，其技术方案要点是一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、组分Ⅱ的溶解过滤、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤，所述组分Ⅱ的溶解过滤的步骤中采用进行层析柱纯化分离和DEAESepharoseFastFlow离子交换层析柱纯化分离两步进行过滤得到层析纯化液，之后对层析纯化液进行超滤透析，超滤透析过程中调节pH值至3.9~4.3，并采用连续等倍透析法进行过滤，旨在提供一种静注人免疫球蛋白成品纯度高，低抗补体活性，产品质量好的静注人免疫球蛋白生产方法。

Description

一种静注人免疫球蛋白生产方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，更具体地说，它涉及一种静注人免疫球蛋白生产方法。

背景技术

静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人收集获得的原料血浆，经低温乙醇蛋白分离法（压滤分离法）分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。目前，静注人免疫球蛋白由于乙醇浓度、温度、PH值等工艺参数的选择不合理，所生产的静注人免疫球蛋白成品的纯度基本在97%~98%之间，抗补体活性在30%~40%之间，静注人免疫球蛋白成品纯度低，抗补体活性高，产品质量低下,且其各组分沉淀的过程中都需要静置并离心，使得现有的静注人免疫球蛋白成品生产工艺繁琐，加工效率低下。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种静注人免疫球蛋白成品纯度高，低抗补体活性，产品质量好的静注人免疫球蛋白生产方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤，所述层析的步骤中采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离得到层析纯化液，之后的超滤透析步骤中调节层析纯化液pH值至3.9~4.3，并采用连续等倍透析法对层析纯化液进行过滤。

通过采用上述技术方案，采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离，并在低pH值的环境下进行连续等倍透析使得静注人免疫球蛋白成品纯度高，具有低抗补体活性，提升了产品质量。

本发明进一步设置为：所述配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤中采用DV-50纳米膜过滤除病毒，并通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤。

通过采用上述技术方案，DV-50纳米膜过滤除病毒，提高了病毒安全性，通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤可去除脂蛋白和细菌提高产品稳定性。

本发明进一步设置为：所述组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤具体为：

（1）、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4℃得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00~7.40保持液温为-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至20%(V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分Ⅱ+Ⅲ溶液和组分I沉淀。

（2）、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液。

（3）、组分Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ沉淀加入注射用水并调节液温至3~7℃溶解，得到组分Ⅱ+Ⅲ溶解液，调节组分Ⅱ+Ⅲ溶解液pH值至5.10~5.20，保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分Ⅲ，取组分Ⅲ压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅲ上清液和组分Ⅲ沉淀。

（4）、组分Ⅱ的制作和离心，调节组分Ⅲ上清液pH值至7.30~7.50，保持液温-9.0~-10.0℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分Ⅱ，对组分Ⅱ进行压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ沉淀和组分Ⅱ上清液。

（5）、层析，取组分Ⅱ沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温3~7℃，得到组分Ⅱ溶解液，对组分Ⅱ溶解液进行澄清过滤后调节pH6.50~7.00,调节导电率至1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离，得到层析纯化液。

（6）、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9~4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.0~11.0%，蛋白含量50~65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25℃恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液。

（7）、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.0~11.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。

通过采用上述技术方案，在制作组分I沉淀、组分Ⅱ沉淀和组分Ⅲ沉淀再分离的过程中无需进行静置和离心的操作，简化了生产工艺，提升了加工效率。且各个步骤的乙醇浓度、温度、PH值等工艺参数更加科学合理保证了静注人免疫球蛋白成品的高纯度、低抗补体活性的特性，提升了产品质量。

附图说明

图1为本发明静注人免疫球蛋白生产方法实施例的流程图。

具体实施方式

参照图1对本发明静注人免疫球蛋白生产方法实施例做进一步说明。

一种静注人免疫球蛋白生产方法，依次包括组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤具体为：

（1）、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4℃得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00~7.40保持液温为-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至20%(V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分Ⅱ+Ⅲ溶液和组分I沉淀（可用于制作限位蛋白原）。

（2）、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液（可用于制作人血白蛋白）。

（3）、组分Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ沉淀加入注射用水并调节液温至3~7℃溶解，得到组分Ⅱ+Ⅲ溶解液，调节组分Ⅱ+Ⅲ溶解液pH值至5.10~5.20，保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分Ⅲ，取组分Ⅲ压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅲ上清液和组分Ⅲ沉淀。

（4）、组分Ⅱ的制作和离心，调节组分Ⅲ上清液pH值至7.30~7.50，保持液温-9.0~-10.0℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分Ⅱ，对组分Ⅱ进行压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ沉淀和组分Ⅱ上清液（废弃）。

（5）、层析，取组分Ⅱ沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温3~7℃，得到组分Ⅱ溶解液，对组分Ⅱ溶解液进行澄清过滤后调节pH6.50~7.00,调节导电率至1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离，得到层析纯化液。

（6）、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9~4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.0~11.0%，蛋白含量50~65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25℃恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液。

（7）、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.0~11.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。

依照上述步骤所生产的静注人免疫球蛋白成品其纯度可达99%以上，抗补体活性可低于30%，生产步骤科学合理，静注人免疫球蛋白成品的生产工艺更加简便，提升了企业生产效率。

上述步骤中所加入的乙醇为浓度为95%的乙醇溶液；上述步骤中调节pH值依靠无水醋酸钠的水溶液、冰醋酸的水溶液或氢氧化钠的水溶液。

上述组分Ⅰ，组分Ⅱ+Ⅲ，组分Ⅱ，组分Ⅲ为所属技术领域的通用分类方法，在本发明中是对特定物质的名称的命名，并不是指单纯的序号。

上述百分比中V/V为体积百分比，其他如无特殊说明均视为质量百分比。

Claims (3)

1.一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤，其特征是：所述层析的步骤中采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离得到层析纯化液，之后的超滤透析步骤中调节层析纯化液pH值至3.9~4.3，并采用连续等倍透析法对层析纯化液进行过滤。

2.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白生产方法，其特征是：所述配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤中采用DV-50纳米膜过滤除病毒，并通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤。

3.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白生产方法，其特征是所述组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤具体为：

（1）、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4℃得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00~7.40保持液温为-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至20%(V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分Ⅱ+Ⅲ溶液和组分I沉淀；

（2）、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液；

（3）、组分Ⅲ的制作和离心，取组分Ⅱ+Ⅲ沉淀加入注射用水并调节液温至3~7℃溶解，得到组分Ⅱ+Ⅲ溶解液，调节组分Ⅱ+Ⅲ溶解液pH值至5.10~5.20，保持液温为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分Ⅲ，取组分Ⅲ压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅲ上清液和组分Ⅲ沉淀；

（4）、组分Ⅱ的制作和离心，调节组分Ⅲ上清液pH值至7.30~7.50，保持液温-9.0~-10.0℃，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分Ⅱ，对组分Ⅱ进行压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm²，得到组分Ⅱ沉淀和组分Ⅱ上清液；

（5）、层析，取组分Ⅱ沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温3~7℃，得到组分Ⅱ溶解液，对组分Ⅱ溶解液进行澄清过滤后调节pH6.50~7.00,调节导电率至1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离，得到层析纯化液；

（6）、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9~4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.0~11.0%，蛋白含量50~65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25℃恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液；

（7）、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.0~11.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。