CN103554253A - 一种静注人免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种静注人免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）两步压滤：人血浆中，分离出II+III沉淀为起始原料，低温乙醇压滤去除组分III沉淀，收集上清液，将所述上清液进行超滤、透析，并调整蛋白浓度；（2）两步层析：用DEAF-Sepharose-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；将收集的所述第一步流穿液再进行超滤、透析，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进行层析纯化，收集第二步流穿液；（3）将收集得到的所述第二步流穿液进行超滤、透析和配液；（4）病毒灭活、除菌、过滤、分装，得到产品。本发明所述方法制备得到的产品生物活性、收率和纯度更高。

Description

一种静注人免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种静注人免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。通常生产方法为低温乙醇离心(压滤)法，产品收率低，纯度低，稳定性不好。

现有的低温乙醇法静注人免疫球蛋白工艺采用低温乙醇处理组分II+III沉淀，该工艺在制备过中通过对乙醇浓度、pH值等参数控制分离出组分III沉淀，再沉淀出组分II，然后进行一步层析工艺。该方法在分离出组分III沉淀和组分II沉淀过程中，使静注人免疫球蛋白沉淀到III沉淀中的量较大，产品得率只能够达到每升血浆5.5克左右，纯度只能够达到95%以上。

为了使静注人免疫球蛋白的产品收率及纯度进一步提高，开发出一种产品生物活性、收率和纯度更高的静注人免疫球蛋白的制备工艺显得十分必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产品生物活性、收率和纯度更高的静注人免疫球蛋白的制备方法。

一种静注人免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）两步压滤：从合格的人血浆中分离出组II+III沉淀为起始原料，经低温乙醇法压滤分离去除组分III沉淀，收集上清液，将所述上清液进行超滤、透析，并调整蛋白浓度；

（2）两步层析：将步骤（1）得到的液体用DEAF-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；将收集的所述第一步流穿液再进行超滤、透析，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进行层析纯化，收集第二步流穿液；

（3）将收集得到的所述第二步流穿液进行超滤、透析和配液；

（4）病毒灭活、除菌、过滤、分装，得到产品，即静注人免疫球蛋白。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤（1）具体包括如下步骤：

A从合格的人血浆中分离出组分II+III；

B将所述组分II+III沉淀，加入2±2℃的9～11倍量的0.01mol/LNaCl溶液溶解，加-15℃以下的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17±1%，压滤分离组分III沉淀和上清液，收集上清液；

C将收集到的所述上清液用0.25mol/L HCL溶液调节pH至4.0±0.2，进行浓缩、透析，将蛋白浓度调整至3%～6%。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤A具体包括如下步骤：将检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃;分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，收集蛋白液至分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过0.1L/min的流速加入pH4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为7.1～7.3;加-15℃以下95%乙醇，流速不超过50～70L/h，使乙醇体积比终浓度至8±1%，温度控制在-2～-3℃,继续搅拌3小时，静置3小时以上；

将静置后的液体进行离心，离心过程中出液流速不大于4L/min/台，出液温度控制在-2～-3℃，离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；

向所述组分I上清蛋白液中加入pH4.0的醋酸缓冲液，调节pH值为6.5±0.3，加入-15℃以下的95%乙醇至乙醇体积比浓度为20±1%，每升反应液加入20～40g硅藻土，温度控制在-4～-6℃；搅拌3小时，静置3小时以上，再开启搅拌，进行压滤，进液压力最高不超过0.2Mpa，压滤间温度应在10℃以下，压滤得组分II+III沉淀和组分II十III上清液；

步骤B具体包括如下步骤：将组分II+III沉淀，加入2±2℃的9～11倍量的0.01mol/LNaCl溶液溶解，搅拌溶解8小时以上，在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.1±0.2，加入-15℃以下的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17±1%，每升反应液加入20～40g硅藻土，温度控制在-2～-4℃，搅拌3小时，静置3小时以上，开启搅拌，进行压滤，进液压力不大于0.2Mpa，压滤间温度在10℃以下，过滤压力不大于0.2Mpa，压滤得组分III沉淀和上清液，收集所述上清液；

步骤C具体包括如下步骤：对收集到的所述上清液进行超滤，用0.25mol/L HCl溶液调pH至4.0±0.2，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±1倍体积2～8℃的注射用水作为透析液（透析4次，将蛋白浓度调整至3%～6%，所述透析液用浓度为0.5mol/L的NaOH调节pH至7.0±0.2。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤C中所述透析液的pH为3.85±0.05、蛋白浓度为5.8±0.4%、麦芽糖含量为10±1%。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤（2）具体包括如下步骤：

加磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率，使其在T=20℃时测为1.2ms/cm～1.5ms/cm，调节好后用DEAF-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；

将收集的所述第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±1倍体积2～8℃注射用水进行透析，将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.25mol/L的HC1调节pH至6.2～6.8，然后加所述的磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率在T=20℃时测为1.5ms/cm～1.7ms/cm，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进行层析纯化，收集第二步流穿液；

其中，所述层析的填料为：DEAE-Sepharose-Fast-Flow和Fractogel-EMD-TMAE。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤（3）具体包括如下步骤：采用0.25mol/L的HC1调节收集到的所述第二步流穿液至pH为3.8～4.4，开启超滤机将流穿液蛋白浓度浓缩至5%以上，用等倍体积2～8℃注射用水作为透析液透析5次以上，然后将蛋白液浓缩至11%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用0.25mol/L的HC1调节pH值，使麦芽糖含量为10±0.5%，pH为3.8～4.4，蛋白含量为5.8±0.4%。

本发明所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其中步骤（4）具体包括如下步骤：

将步骤（3）的制得物经0.2u m除菌滤芯过滤，放置在孵放室，在24±1℃孵放21天，孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，0.2u m除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库。

本发明中组分I上清液，组分I沉淀，组分II+III沉淀，组分II+III上清液，组分II沉淀，组分III沉淀为所属技术领域的通用分类方法;在本发明中也是按通用分类方法分类后物质的名称，并不是指单纯的序号。

通过人血浆经离心分离冷沉淀，分离后的离心上清蛋白液通过调节pH及温度，添加乙醇再离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；

通过对组分I上清蛋白液调节pH值及温度，添加乙醇再压滤得组分II+III沉淀和组分II+III上清液；

组分I沉淀主要含有纤原、FVIII和纤维结合蛋白等；

组分I上清蛋白液主要含有:白蛋白、IgG、IgA、IgM、FI、V、IX、X、a1、β球蛋白、铜蓝蛋白、α1一抗胰蛋白酶、IgM、AT-III补体成分等；

组分II+III沉淀主要含有IgG、IgA、IgM、F II、Ⅶ、IX、X、a、β球蛋白等；组分II+III上清液主要含有;白蛋白、a、β球蛋白、铜蓝蛋白、al一抗胰蛋白酶、IgM等。

本发明静注人免疫球蛋白的制备方法与现有技术不同之处在于：

本发明静注人免疫球蛋白的制备方法采用两步压滤法代替三步压滤法去除杂蛋白，不再把组分II沉淀出来，直接浓缩透析进行两步层析工艺，缩短了生产周期，同时提高了产品收率，产品得率每升血浆不低于6.5克，产品纯度达到99%以上。

相比通常三步压滤法，本发明静注人免疫球蛋白的制备方法中减少了一步压滤，能够显著提高产品收率，产品收率可达每升血浆不低于6.5克，常规的压滤法收率只能够达到每升血浆5.5克左右，比传统方法产品得率提高18%。

另外，本发明采用先进二步层析法，用2种不同离子交换柱层析技术进行层析纯化，能够有效地去除杂蛋白（主要是IgA和IgM），能够显著提高产品纯度，产品纯度达到99.0%以上，一般低温乙醇法为95%以上。

具体实施方式

实施例1

本发明的血浆来源为符合《中华人民共和国药典》2010版中“生物制品生产用血浆”规定的人血浆。

为本发明的两步压滤法:分别取100升、200升、500升和1000升检疫合格的人血浆，以100升人血浆为例。

(1)将检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度为3L/min/台，出液温度控制在2℃;分离冷沉淀，收集蛋白液至反应罐，使蛋白液的温度控制在1℃，按0.1L/min的流速加入pH4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为7.2；加-17℃95%乙醇，流速60L/h，使乙醇体积比终浓度至8%，温度控制在-2.5℃，继续搅拌3小时，静置3小时；

将上述制得物进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在-2℃，离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；

第一次压滤：将组分I上清蛋白液加入pH4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.5，加-17℃的95%乙醇至乙醇体积比浓度为20%，按每升反应液加入20g硅藻土，温度控制在-4.5℃;搅拌3小时，静置3小时，再开启搅拌，进行压滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度应在6℃，压滤得组分II+III沉淀和组分II+III上清液；

第二次压滤：将组分II+III沉淀10公斤，加入2℃的10倍量的0.01mol/LNaCL溶液溶解，搅拌溶解8小时，然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.1，加-16℃的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17%，按每升反应液加入20g硅藻土，温度为-2.5℃，搅拌3小时，静置3小时，再开启搅拌，进行压滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度6℃，压滤得组分III沉淀和上清液，收集上清液；

对收集到的所述上清液145公斤进行超滤，用0.25mol/L的HCL溶液调pH至4.0，将蛋白含量浓缩至6%，用4倍体积6℃注射用水进行透析4次;将蛋白浓度调整至3.5%。透析液用0.5mol/LNaOH调pH至7.0。

（2）第一次层析：加磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率在T=20℃时测为1.3ms/cm，调节好后用DEAF-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；

第二次层析：将收集第一步流穿液60公斤再进行超滤，将蛋白含量浓缩至6%，用4倍体积6℃注射用水进行透析4次;将蛋白浓度调整至3.5%，用0.25mol/L的HC1调pH至6.5，然后加所述的磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率在T=20℃时测为1.5ms/cm，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进行层析纯化，收集第二步流穿液60公斤；

（3）用0.25mol/L的HC1调节收集的所述第二步流穿液，pH为4.1，开启超滤机将流穿液蛋白浓度浓缩至6%，用等倍体积6℃注射用水进行透析6次，然后将蛋白液浓缩至12%，将麦芽糖加入蛋白液内，用0.25mol/L的HC1调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.1,蛋白含量5.5%，蛋白液为12.8公斤;

（4）的制得物经0.2u m除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃士1℃孵放21天，孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，0.2u m除菌滤芯过滤分装，分装量为每瓶50ml；

试验结果见表1，可以看出，100升人血浆可得到12.8公斤蛋白浓度为5.5%的静注人免疫球蛋白产品，产品得率为每升血浆7.04克。

表1.实施例1产品收率实验数据

	100升	200升	500升	1000升
					产品收率	7.04	7.05	7.07	7.06

产品收率单位:克/升

对比例：

对比例为通用的压滤法:分别取100升、200升、500升和1000升检疫合格的人血浆。

以100升人血浆为例，具体实验方法如下:

（1）将检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度为3L/min/台，出液温度控制在2℃;分离冷沉淀，收集蛋白液至反应罐，使蛋白液的温度控制在1℃，按0.1L/min的流速加入pH4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为7.2;加-17℃95%乙醇，流速60L/h，使乙醇体积比终浓度至8%，温度控制在-2.5℃,继续搅拌3小时，静置3小时；

将上述制得物进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在-2℃，离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；

第一次压滤：向组分I上清蛋白液中加入pH4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.5；加-17℃的95%乙醇至乙醇体积比浓度为20%，按每升反应液加入20g硅藻土，温度控制在-4.5℃；搅拌3小时，静置3小时，再开启搅拌，进行压滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度应在6℃，压滤得组分II+III沉淀和组分II+III上清液；

第二次压滤：向组分II+III沉淀10公斤中加入2℃的10倍量的0.01mol/LNaCL溶液溶解，搅拌溶解8小时。然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.1，加-16℃的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17%，按每升反应液加入20g硅藻土，温度为-2.5℃;搅拌3小时，静置3小时。再开启搅拌，进行压滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度6℃，压滤得组分III沉淀和上清液，收集上清液；

第三次压滤：收集所述上清液145公斤，每升所述上清液加50ml的1mol/LNaCL溶液，在搅拌过程中缓慢加入1mol/LNaHCO₃到反应液中，调整pH为7.0，加-17℃的50%乙醇至乙醇体积比浓度为25%，流速100L/h，按每升反应液加入20g硅藻土，温度为-4.5℃;搅拌3小时，静置3小时。再开启搅拌，进行压滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度6℃，压滤得组分II沉淀和上清液，收集组分II沉淀2.4公斤；

向组分II沉淀2.4公斤，加入0℃的10倍量的注射用水溶解，搅拌溶解8小时，每升反应液加入5g硅藻土，温度为-1℃，进行深滤，进液压力为0.1Mpa，压滤间温度6℃，收集过滤液23公斤；

层析：加磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率在T=20℃时测为1.3ms/cm，调节好后用DEAF-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液23公斤；

用0.25mol/L的HC1调节所述第一步流穿液，用0.25mol/L的HC1调节pH值为4.1，开启超滤机将流穿液蛋白浓度浓缩至6%，用等倍体积6℃注射用水进行透析6次，然后将蛋白液浓缩至12%，将麦芽糖加入蛋白液内，用0.25mol/L的HC1调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.1，蛋白含量5.5%，蛋白液为10公斤；

将层析后得到的所述蛋白液经0.2u m除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天，孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，0.2u m除菌滤芯过滤分装，分装量为每瓶50ml；

根据以上试验可以看出，100升人血浆可得到10公斤蛋白浓度为5.5%的静注人免疫球蛋白产品，产品得率为每升血浆5.5克。

表2.对比例产品收率实验数据:

	100升	200升	500升	1000升
					产品收率	5.50	5.56	5.67	5.55

产品收率单位:克/升

纯度对比

纯度检测方法为:（GENIO全自动电泳仪），根据静注人免疫球蛋白纯度扫描图谱得到产品纯度见表3和表4，本发明实施例1中所使用的主要设备及仪器见表5。

检测结果及活性数据如下：

⑴按照《中华人民共和国药典》2010版三部附录ⅧC、ⅧD进行鉴别试验，主要沉淀线为IgG；

⑵按照《中华人民共和国药典》2010版三部附录ⅥB、ⅥA进行活性测定，IgG总量不低于99%（原规定：不低于90%）；

⑶按照《中华人民共和国药典》2010版三部附录ⅥR进行纯度测定，IgG单体及二聚体含量之和不低于99%（原规定：不低于95%）。

表3.实施例1所述方法得到的产品纯度检测结果

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	7.04	7.05	7.07	7.06
产品纯度	99.1%	99.3%	99.5%	99.4%

表4.对比例纯度检测结果

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	5.50	5.56	5.67	5.55
产品纯度	97.5%	98.1%	98.0%	97.6%

表5.本发明实施例中所使用的主要设备及仪器

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）两步压滤：从人血浆中分离出II+III沉淀为起始原料，再通过低温乙醇工艺，采用压滤分离去除组分III沉淀，收集上清液，将所述上清液进行超滤、透析，并调整蛋白浓度；

（2）两步层析：将步骤（1）得到的液体经DEAF-Sepharose-FF离子交换层析进行纯化，收集第一步流穿液；将收集的所述第一步流穿液再进行超滤、透析，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进一步纯化，收集第二步流穿液；

（3）将收集得到的所述第二步流穿液进行超滤、透析和配液；

（4）病毒灭活、除菌、过滤、分装，得到产品，即静注人免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）具体包括如下步骤：

A）从混合的浆中分离提取II+III沉淀为起始原料；；

B）将所述组分II+III沉淀，加入2±2℃的9～11倍量的0.01mol/LNaCl溶液溶解，加-15℃以下的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17±1%，压滤分离组分III沉淀和上清液，收集上清液；

C）将收集到的所述上清液用0.25mol/L HCL溶液调节pH至4.0±0.2，进行浓缩、透析，将蛋白浓度调整至3%～6%。

3.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：

步骤A）具体包括如下步骤：将检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，收集蛋白液至分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过0.1L/min的流速加入pH4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为7.1～7.3;加-15℃以下95%乙醇，流速不超过50～70L/h，使乙醇体积比终浓度至8±1%，温度控制在-2～-3℃，继续搅拌3小时，静置3小时以上；

将静置后的液体进行离心，离心过程中出液流速不大于4L/min/台，出液温度控制在-2～-3℃，离心得组分I沉淀和组分I上清蛋白液；

向所述组分I上清蛋白液中加入pH4.0的醋酸缓冲液，调节pH值为6.5±0.3，加入-15℃以下的95%乙醇至乙醇体积比浓度为20±1%，每升反应液加入20～40g硅藻土，温度控制在-4～-6℃；搅拌3小时，静置3小时以上，再开启搅拌，进行压滤，进液压力最高不超过0.2Mpa，压滤间温度应在10℃以下，压滤得组分II+III沉淀和组分II十III上清液；

步骤B）具体包括如下步骤：将组分II+III沉淀，加入2±2℃的9～11倍量的0.01mol/LNaCl溶液溶解，搅拌溶解8小时以上，在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.1±0.2，加入-15℃以下的50%乙醇至乙醇体积比浓度为17±1%，每升反应液加入20～40g硅藻土，温度控制在-2～-4℃，搅拌3小时，静置3小时以上，开启搅拌，进行压滤，进液压力不大于0.2Mpa，压滤间温度在10℃以下，过滤压力不大于0.2Mpa，压滤得组分III沉淀和上清液，收集所述上清液；

步骤C）具体包括如下步骤：对收集到的所述上清液进行超滤，用0.25mol/L HCl溶液调pH至4.0±0.2，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±1倍体积2～8℃的注射用水作为透析液，透析4次，将蛋白浓度调整至3%～6%，所述透析液用浓度为0.5mol/L的NaOH调节pH至7.0±0.2。

4.根据权利要求3所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤C）中所述透析液的pH为7.0±0.05、蛋白浓度为5.8±0.4%。

5.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）具体包括如下步骤：

加磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率，使其在T=20℃时为1.2ms/cm～1.5ms/cm，调节好后经DEAE-Sepharose-Fast-Flow凝胶进行离子交换层析纯化，收集第一步流穿液；

将收集的所述第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±1倍体积2～8℃注射用水进行透析，将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.25mol/L的HC1调节pH至6.2～6.8，然后加所述的磷酸二氢钠-NaOH缓冲液调节电导率在T=20℃时为1.5ms/cm～1.7ms/cm，调节好后用Fractogel-EMD-TMAE离子交换柱进行二次纯化，收集第二步流穿液。

6.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）具体包括如下步骤：采用0.25mol/L的HC1调节收集到的所述第二步流穿液至pH为3.8～4.4，开启超滤机将流穿液蛋白浓度浓缩至5%以上，用等倍体积2～8℃注射用水作为透析液透析5次以上，然后将蛋白液浓缩至11%以上，将麦芽糖加入蛋白液内作为病毒灭活保护剂，用0.25mol/L的HC1调节pH值，使麦芽糖含量为10±0.5%，pH为3.8～4.4，蛋白含量为5.8±0.4%。

7.根据权利要求6所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）具体包括如下步骤：

将步骤（3）的制得物经0.2u m除菌滤芯过滤，放置在孵放室，在24±1℃孵放21天，孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，0.2u m除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库。