CN102584934B - 一种静注人免疫球蛋白的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。在静注人免疫球蛋白制备工艺过程中，采用辛酸及氯化钙沉淀法处理静注人免疫球蛋白制备工艺中的组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，去除组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的杂蛋白，再进行两步层析工艺。本发明与通常辛酸沉淀法相比，加入了氯化钙有效地去除了组分Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液中的各种凝血因子，同时提高了免疫球蛋白的稳定性，产品得率显著提高，可至每升血浆7克以上；采用2种不同离子交换柱及层析技术进行上柱层析纯化，能够有效地去除杂蛋白，产品纯度达到99.5%以上。此外加入辛酸及采用DV20滤芯除病毒过滤，能够显著提高去除病毒的效果，提高临床用药的安全性。

Description

一种静注人免疫球蛋白的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。

背景技术

静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法或辛酸沉淀法分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。通常生产方法为低温乙醇离心（压滤）法和辛酸沉淀法，产品得率低，稳定性不好。

现有的低温乙醇法静注人免疫球蛋白工艺采用低温乙醇处理组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，该工艺在制备过程通过对乙醇浓度、pH值等参数控制分离出组分Ⅲ沉淀，再进行一步层析工艺。该方法在分离出组分Ⅲ沉淀过程中使静注人免疫球蛋白析出到Ⅲ沉淀中的量较大，产品得率只能够达到每升血浆5.5克左右，纯度只能够达到96%以上。

现有的辛酸沉淀法静注人免疫球蛋白工艺利用辛酸能够沉淀大部分非免疫球类蛋白，从而达到去除杂蛋白的目的。但该方法对去除凝血因子类物质效果不是佷明显，使产品纯度受到一定的影响。产品得率只能够达到每升血浆6.3克左右，纯度只能够达到98%以上。

为了使静注人免疫球蛋白的产品得率及纯度进一步提高，开发出一种产品生物活性、产品得率和产品纯度更高的静注人免疫球蛋白的制备工艺显得十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用辛酸与氯化钙沉淀法处理组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再进行两步层析工艺，产品得率可达每升血浆7克以上，产品纯度达到99.5%以上的静注人免疫球蛋白的制备工艺。

本发明的技术方案：

它采用辛酸及氯化钙沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行两步层析工艺，其制备工艺如下：

(1)、将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过1.0L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.80～7.00；加－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－1～－3℃，加完乙醇后pH值为6.80～7.20；

(2)、将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产；

(3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.60～6.65；加－15℃或更冷的95％乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－4～－6℃；搅拌120min以上后，静置60min以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18±0.5g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产；

(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入8±2℃的10～12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙,使溶解液钙离子浓度为0.2±0.01mol/L；加完搅拌30±5min；然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.5±0.2，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40±1毫升，加完搅拌60±5min后进行压缩过滤，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集压滤液；

 (5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为：

①对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用pH4.0醋酸缓冲液调pH至4.0～4.5，然后加磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.21 s / m～0.25s / m，所述的磷酸－NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为1mol/L，调节好后用Macrocap-Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；

②将收集的第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5±0.1mol/L的NaOH调pH至6.8～7.0，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.15 s / m～0.17s / m ，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液；

(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5+0.5％；

(7)、步骤(6)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；

所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。

组分Ⅰ上清液，组分I沉淀，组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，组分Ⅱ+Ⅲ上清液为所属技术领域的通用分类方法；在本发明中是也是按通用分类方法分类后物质的名称，并不是指单纯的序号。

通过人血浆经离心分离冷沉淀，分离后的离心上清蛋白液通过调节pH及温度，添加乙醇再离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；

通过对组分I上清蛋白液调节pH值及温度，添加乙醇再压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液；

组分Ⅰ沉淀主要含有纤原、FVⅢ、Ciq、Clr、Cls、和纤维结合蛋白等；

组分Ⅰ上清蛋白液主要含有：白蛋白、IgG、IgA、IgM、FⅡ、Ⅶ、Ⅸ、X、a、β球蛋白、铜蓝蛋白、α1一抗胰蛋白酶、IgM、AT-Ⅲ补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等；

    组分Ⅱ+Ⅲ沉淀主要含有IgG、IgA、IgM、FⅡ、Ⅶ、Ⅸ、X、a、β球蛋白、和铜蓝蛋白等；

组分Ⅱ+Ⅲ上清液主要含有：白蛋白、a、β球蛋白、铜蓝蛋白、α1一抗胰蛋白酶、IgM、AT-Ⅲ补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等。

本发明具有积极的意义：

本发明方法采用辛酸与氯化钙沉淀法处理组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再进行两步层析工艺。此外本发明方法在处理组分Ⅱ+Ⅲ工艺过程中，没有添加乙醇，乙醇会影响蛋白结构易造成蛋白发生变性，从而使蛋白活性降低。具体为：

1、采用辛酸及氯化钙沉淀法去除组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的杂蛋白及凝血因子类物质，避免传统低温乙醇法制备过程中乙醇对基于pH4的静注人免疫球蛋白分子结构活性片段的不利影响，采用辛酸及氯化钙沉淀法能够使静注人免疫球蛋白分子结构活性片段完全得到保护，提高产品生物活性，产品质量能够得到进一步提高。

2、相比通常辛酸沉淀法，本发明增加了氯化钙对组分Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液进行了处理，能够显著提高去除凝血因子类杂质效果，提高了产品纯度。同时在溶解液中加入适量钙离子又利用提高免疫球蛋白稳定性，使球蛋白更加不易与辛酸发生沉淀，能够显著提高产品得率，产品得率可达每升血浆7克以上，常规的辛酸沉淀法方法得率只能够达到每升血浆6.3克左右，比传统方法产品得率提高11-14%。

3、采用先进二步层析法，用2种不同离子交换柱及层析技术进行上柱层析纯化；能够有效地去除杂蛋白，能够显著提高产品纯度，产品纯度达到99.5%以上，一般低温乙醇法为96%以上，通用的辛酸沉淀法也只能达99%以上。

4、在制备工艺中采用用DV20滤芯除病毒，能够有效去除B19细小病毒，传统方法采用DV50滤芯除病毒不能够有效去除B19细小病毒，按此工艺制备出的产品临床使用安全性有显著提高。

附图说明

图1是本发明对比实验第一组100升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图2是本发明对比实验第一组200升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图3是本发明对比实验第一组500升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图4是本发明对比实验第一组1000升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图5是本发明对比实验第二组100升人血浆为原料制备出产品纯度扫描图谱。

图6是本发明对比实验第二组200升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图7是本发明对比实验第三组500升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

图8是本发明对比实验第四组1000升人血浆为原料制备出产品的纯度扫描图谱。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1：制备工艺如下：

(1)、将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过1.0L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.80～7.00；加－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－1～－3℃，加完乙醇后pH值为6.80～7.20；所述pH4.0缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。

(2)、将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产。

(3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.60～6.65；加－15℃或更冷的95％乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－4～－6℃；搅拌120min以上后，静置60min以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产。

(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入8±2℃的10～12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙,使溶解液钙离子浓度为0.2±0.01mol/L；加完搅拌30±5min。然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.5±0.2，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40±1毫升，加完搅拌60±5min后进行压缩过滤，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集压滤液。

 (5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为：

①对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用pH4.0醋酸缓冲液调pH至4.0～4.5，然后加磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.21 s / m～0.25s / m，所述的磷酸－NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为1mol/L，调节好后用Macrocap-Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液。

②将收集的第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.8～7.0，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.15 s / m～0.17s / m ，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液。

(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5+0.5％。

(7)、步骤(6)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库。

所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

对比实验：分两组，第一组为本发明，第二组为通用的辛酸沉淀法：

一、产品得率对比

 第一组：分别取100升、200升、500升和1000升检疫期检疫合格的人血浆，采用本发明制备。

以100升人血浆为例，具体实验方法如下：

 (1)、将检疫期检疫合格的100升人血浆经离心，离心时，离心速度为3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，蛋白液的温度为2℃，按0.8L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.90；加－18℃95％乙醇，流速为1.2L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－2℃，混合液pH值为7.05。

(2)、将步骤(1)的制得物搅拌40min以上，进行离心，离心出液流速为3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库。

 (3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.62；加－18℃乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－5℃；搅拌150min，静置80min，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力为0.15Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产。

(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀9.5公斤，加入8℃的11倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙,使溶解液钙离子浓度为0.2mol/L；加完搅拌30min；然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.6，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40毫升，加完搅拌62min后压缩过滤，过滤压力为0.15Mpa，收集压滤液。

 (5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为：

①对步骤(4)的制得物压滤液110公斤进行超滤，将蛋白含量浓缩至6%，用5倍体积5℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至4%，用pH4.0醋酸缓冲液调pH至4.3，然后加磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.22 s / m，所述的磷酸－NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为1mol/L，调节好后用Macrocap-Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液。

②将收集第一步流穿液50公斤再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5.5%，用5倍体积5℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至4%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.9，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.16s / m ，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液40公斤。

(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.85，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5.5%, 用5倍体积5℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6.5%，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，最终蛋白溶液中麦芽糖含量为10.5%，pH为3.9，蛋白含量5.01％，溶液重量为14.2公斤。

(7)、步骤(6)的制得物14.2公斤经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装。分装装量为每瓶50ml。

根据以上试验可以看出，100升人血浆可得到14.2公斤蛋白浓度为5.01％的静注人免疫球蛋白产品，产品得率为每升血浆7.11克。

第一组产品得率实验数据：

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	7.11	7.15	7.13	7.16

产品得率单位：克/升

第二组：分别取100升、200升、500升和、1000升检疫期检疫合格的人血浆，采用通用的辛酸沉淀法，即在辛酸沉淀前，不放入氯化钙；采用一步层析工艺；

以100升人血浆为例，具体实验方法如下：

（1）、 将检疫期检疫合格的100升人血浆经离心，离心时，离心速度为3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，蛋白液的温度为2℃，按0.8L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.90；加－18℃95％乙醇，流速为1.2L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－2℃，混合液pH值为7.05。

(2)、将步骤(1)的制得物搅拌40min以上，进行离心，离心出液流速为3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库。

 (3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.62；加－18℃乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－5℃；搅拌150min，静置80min，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力为0.15Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产。

(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀9.5公斤，加入8℃的11倍量的注射用水溶解，然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.6，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40毫升，加完搅拌62min后压缩过滤，过滤压力为0.15Mpa，收集压滤液。

 (5)、对步骤(4)的制得物压滤液110公斤进行超滤，将蛋白含量浓缩至5.7%，用5倍体积4℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至4.5%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.7，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.16s / m ，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集流穿液40公斤。

(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得的流穿液，pH为3.85，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5.6%, 用5倍体积5℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6.6%，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，最终蛋白溶液中麦芽糖含量为10.5%，pH为3.9，蛋白含量5.02％，溶液重量为12.6公斤。

(7)、步骤(6)的制得物12.6公斤经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装。分装装量为每瓶50ml。

根据以上试验可以看出，100升人血浆可得到12.6公斤蛋白浓度为5.02％的静注人免疫球蛋白产品，产品得率为每升血浆6.33克。

第二组产品得率实验数据：

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	6.33	6.32	6.37	6.35

产品得率单位：克/升

二、纯度对比

纯度检测方法为：

（1）在英特雷勃GENIO S全自动电泳仪的样品盘上相应处加入一张吸水纸（72×24 mm），1ml超纯水，加入的试制的静注人免疫球蛋白样品30μl，同时以新鲜人血清作对照，加样器放入仪器相应位置。

（2）在试剂并放置于仪器中相应的位置。

3号位——透明液加入55ml，液面位于上线。

4号位——吸水纸2张（88×48mm）

5号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。

6号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。

7号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。

8号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。

9号位——染色液加入50ml，液面位于下线。

10号位——缓冲液加入55ml，液面位于上线。

11号位——吸水纸2张（88×48mm）

（3）在电泳槽的两侧边各放入一张纸电极，向槽内加入电泳缓冲液，加到刚好两条红线之间的位置即可，盖上电泳槽盖子，并放置于仪器中相应的位置。

（4）将膜片毛面朝上，侧对着膜片固定器把膜片固定在膜片器上，并放置于仪器中相应的位置。

（5）进入电泳软件操作系统对样品进行操作，并打印出如下纯度扫描图谱。

第一组纯度检测结果：根据静注人免疫球蛋白纯度扫描图谱得到产品纯度如下：

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	7.11	7.15	7.13	7.16
产品纯度	99.8％	99.7%	99.8%	99.8%

第二组纯度检测结果：根据静注人免疫球蛋白纯度扫描图谱得到产品纯度如下：

	100升	200升	500升	1000升
					产品得率	6.33	6.32	6.37	6.35
产品纯度	99.2％	99.1%	99.0%	99.2%

附：本发明实施中所使用的主要设备及仪器：

序号	名   称	数量	规格或型号
				1	反应罐	5	300L
2	超滤罐	2	150L
				3	超滤机	1	CUF100
4	管式分离机	2	GQ142
				5	板框压滤机	1	400*400
6	收集罐	1	150L
				7	层析柱	1	SP-370
8	层析柱	1	T00148
				9	移动罐	1	150L
10	病毒灭活罐	2	50L
				11	全自动分装线	1	伊马F972K-TOB
12	全自动电泳分析仪	1	GENIO S
				13	pH计	1	PHS—3C
14	FOSS定氮仪	1	8100型
				15	紫外分光光度计	1	UV-2450

Claims (2)

1.一种静注人免疫球蛋白制备工艺，它采用辛酸及氯化钙沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行两步层析工艺，其特征在于制备工艺如下：

(1)、将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，使蛋白液的温度控制在1～3℃之间，按不超过1.0L/min的流速加入pH 4.0醋酸缓冲液调节蛋白液pH值为6.80～7.00；加－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－1～－3℃，加完乙醇后pH值为6.80～7.20；

(2)、将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清蛋白液；组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产；

(3)、将步骤(2)的制得物组分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸缓冲液调节pH值为6.60～6.65；加－15℃或更冷的95％乙醇至乙醇体积比浓度为22％，温度控制在－4～－6℃；搅拌120min以上后，静置60min以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18±0.5g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ上清液用于人血白蛋白生产；

(4)、将步骤(3)的制得物组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，加入8±2℃的10～12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化钙,使溶解液钙离子浓度为0.2±0.01mol/L；加完搅拌30±5min；然后在搅拌过程中缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为4.5±0.2，缓慢加入辛酸，按每升溶解液中加入浓度为98.5%辛酸40±1毫升，加完搅拌60±5min后进行压缩过滤，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集压滤液；

 (5)、再进行两步层析工艺，两步层析工艺为：

①对步骤(4)的制得物压滤液进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用pH4.0醋酸缓冲液调pH至4.0～4.5，然后加磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.21 s / m～0.25s / m，所述的磷酸－NaOH缓冲液中磷酸与NaOH均为1mol/L，调节好后用Macrocap-Q离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第一步流穿液；

②将收集的第一步流穿液再进行超滤，将蛋白含量浓缩至5%以上，用5±0.5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5±0.1mol/L的NaOH调pH至6.8～7.0，然后加所述的磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.15 s / m～0.17s / m ，调节好后用DEAE-FF离子交换柱进行上柱层析纯化，收集第二步流穿液；

(6)、用1mol/L的HCl调节步骤(5)的制得物第二步流穿液，pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5+0.5％；

(7)、步骤(6)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；

所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

2.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白制备工艺，其特征在于：所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。

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