CN111848784B - 一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，属于生物制药领域。在静注人免疫球蛋白制备工艺过程中，采用高浓度尿素溶液进行预沉淀，然后采用辛酸盐沉淀法处理静注人免疫球蛋白制备工艺中的组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，去除组分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的杂蛋白，再进行层析工艺。本发明与现有相比，通过高浓度尿素溶液预沉淀工艺可效地降低静注人免疫球蛋白中IgA、多聚体的含量，提高了免疫球蛋白的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，属于生物制药领域。
背景技术
静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法或辛酸沉淀法分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。静注人免疫球蛋白含有广谱抗病毒、细菌或其它病原体的IgG抗体，具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床上主要用于原发性免疫球蛋白缺乏症、继发性免疫球蛋白缺陷病、自身免疫性疾病。IVIG的临床应用已成为过去20多年来免疫治疗发展最快的领域之一。迄今，FDA认可的IVIG适应症已增加到11 种，基于临床IVIG广泛应用效果和潜在作用机制理解方面的重大进展，使IVIG作为免疫调节剂和抗炎性因子的用途也得到了进一步的支持。
现有技术中，主要利用低温乙醇法和辛酸沉淀法提取人免疫球蛋白，但制剂中存在着活化的IX因子、IgA、多聚体等蛋白残余，制得的免疫球蛋白不能大剂量用于静脉注射，否则会引起严重的副反应。人免疫球蛋白类主要有IgA、IgG、IgM、IgD、IgE五种，每一种还包括多种亚类，其中IgA能够引起先天缺乏IgA患者输注静注人免疫球球蛋白后产生抗IgA，可能引起过敏反应，产生严重不良反应，成为一个风险因素。国内大部分厂家产品IgA的含量大多不超过200ug/ml，国外有IgA的含量不超过50ug/ml的要求。IgM为五聚休，分子大小为970KD，在进行20nm滤膜除病毒过滤时，容易导致滤膜的堵塞，造成除病毒工艺无法进行或导致滤膜使用面积成倍增加，容易造成病毒泄漏风险和生产成本升高。
传统的低温乙醇法和辛酸沉淀法IgA、多聚体含量较高，限制了静注人免疫球蛋白的使用，也增加了使用风险。为了降低静注人免疫球蛋白中IgA、多聚体的含量，缩短制备工艺时间，提高产品安全性、耐受性，现提供一种高浓度静注免疫球蛋白分离纯化的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，可以极大的降低静注人免疫球蛋白中的IgA、多聚体含量，提高静注人免疫球蛋白纯度，降低使用风险。
本发明的技术方案：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，它采用高浓度尿素溶液预沉淀、辛酸沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行层析工艺，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1~2倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－1～－3℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.3～4.5,加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量18～22mmol/L，然后调节pH至5.0～5.2，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.20～5.60，加1倍2～8℃注射用水透析至电导为0.8～1.6ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度1.5%～3.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析4～6遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5±0.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
进一步的，高浓度尿素溶液的配制方法为：在常温25℃环境下，按照质量比1:1在纯化水中加入药用尿素，搅拌溶解完全后过滤，即得。
进一步的，Macrocap-Q离子交换柱柱层析工艺参数为：
上样流速不超过100L/h/10L柱体积，上样总蛋白不超过200g/L凝胶。
进一步的，Macrocap-Q离子交换柱可以再生重复使用，再生的方法为：
用2～4倍柱体积1mol/L NaCL冲洗层析柱洗脱杂蛋白，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃；
用2～4倍柱体积0.5mol/L NaOH冲洗保存层析柱，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃；
超过1个月不用时，用4倍柱体积注射用水清洗层析柱，再用4倍柱体积20%乙醇冲洗保存层析柱，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃。
本发明具有积极的意义：
本发明采用高浓度尿素溶液预沉淀、辛酸沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行层析工艺，利用高浓度尿素溶液低温下结晶析出并吸附IgA与多聚体的工艺技术，去除IgA、多聚体的效率高，制得的静注人免疫球蛋白纯度更高，降低了使用时可能引发的过敏症风险。
本发明利用了尿素结晶时对IgA与多聚体的吸附能力远远高于对IgG的吸附的特征，在本发明第（2）步离心得到的尿素沉淀中，主要成分为多聚体与IgA，本步骤对多聚体的去除率≥98%，对IgA的去除率≥80%，而IgG的损耗则低于5%。以此去除了绝大部分的多聚体与IgA，为后续纯化步骤提供了优质的预处理原料，提升了产品的最终品质。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度4L/min/台，出液温度控制在0℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－3℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速4L/min/台，出液温度控制在－3℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.5, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量18mmol/L，调节pH至5.2，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.60，加1倍8℃注射用水透析至电导为1.6ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度1.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.8，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析6遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量11%，pH为4.4，蛋白含量5.0％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
实施例2：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1.5倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－2℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.4, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量20mmol/L，调节pH至5.1，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.40，加1倍5℃注射用水透析至电导为1.2ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度2.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.9，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析5遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.0，蛋白含量5.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
实施例3：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度2L/min/台，出液温度控制在4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数2倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－1℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速2L/min/台，出液温度控制在－1℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.3, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量22mmol/L，调节pH至5.0，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.20，加1倍2℃注射用水透析至电导为0.8ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度3.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析4遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量9%，pH为3.8，蛋白含量6.0％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
实施例4：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度5L/min/台，出液温度控制在5℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数0.8倍加入常温下的质量分数45%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－10℃的95％乙醇，流速2.0L/min，使乙醇体积比终浓度至7％，最终温度控制在0℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速5L/min/台，出液温度控制在0℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.6,加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量16mmol/L，然后调节pH至5.4，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.80，加1倍10℃注射用水透析至电导为1.8ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度3.8%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.6，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析3遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.0，蛋白含量5.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
对比例1：
利用专利号为201210071691.5的专利《一种静注人免疫球蛋白的制备工艺》的技术：利用醋酸溶液调节pH值进行预沉淀的方法制备静注人免疫球蛋白，所得静注人免疫球蛋白浓度与实施例2相同。
对比例2：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，无添加尿素溶液沉降并离心的步骤，其余同实施例2.
对比例3：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1.5倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－2℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.0, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量16mmol/L，调节pH至5.3，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.40，加1倍5℃注射用水透析至电导为1.2ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度2.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.9，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析5遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.0，蛋白含量5.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
对比例4：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1.5倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－2℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.4, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量20mmol/L，调节pH至5.1，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.70，加0.8倍10℃注射用水透析至电导为1.8ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度4.0%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.9，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析5遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.0，蛋白含量5.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
对比例5：
一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度3L/min/台，出液温度控制在2℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1.5倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－2℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速3L/min/台，出液温度控制在－2℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.4, 加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量20mmol/L，调节pH至5.1，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.40，加1倍5℃注射用水透析至电导为1.2ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度2.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.6，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析3遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%，pH为4.0，蛋白含量5.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
测试方法：
静注人免疫球蛋白纯度与IgA、多聚体含量检测方法为：
（1）在英特雷勃GENIO S全自动电泳仪的样品盘上相应处加入一张吸水纸（72×24mm），1mL超纯水，加入的试制的静注人免疫球蛋白样品30μL，同时以新鲜人血清作对照，加样器放入仪器相应位置。
（2）在试剂并放置于仪器中相应的位置。
3号位——透明液加入55ml，液面位于上线。
4号位——吸水纸2张（88×48mm）
5号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。
6号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。
7号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。
8号位——脱色液加入55ml，液面位于上线。
9号位——染色液加入50ml，液面位于下线。
10号位——缓冲液加入55ml，液面位于上线。
11号位——吸水纸2张（88×48mm）
（3）在电泳槽的两侧边各放入一张纸电极，向槽内加入电泳缓冲液，加到刚好两条红线之间的位置即可，盖上电泳槽盖子，并放置于仪器中相应的位置。
（4）将膜片毛面朝上，侧对着膜片固定器把膜片固定在膜片器上，并放置于仪器中相应的位置。
测试实施例1-4和对比例1-5的静注人免疫球蛋白的收率、纯度（以蛋白总量进行计量），以及IgA、多聚体的含量，其结果如下：
从上述结果可见，实施例1-3静注人免疫球蛋白的收率、纯度、IgA和多聚体的含量均优于实施例4（工艺参数不在保护范围内），并且相比于对比例1（现有技术201210071691.5的工艺方法）有全面的提升，相比于对比例2（未添加尿素溶液沉降并离心）有巨大的提升，相比于对比例3（辛酸盐沉淀步骤工艺不同）、对比例4（层析工艺不同）、对比例5（超滤参数不同）略有提升。
并将实施例1-4 高浓度尿素溶液预沉淀处理后上清蛋白液①IgA、多聚体含量与对比例1醋酸沉淀处理后IgA、多聚体含量进行对比，以及比较沉淀物IgG含量，其结果如下：
| 预处理液 | IgA含量百分比（%） | 多聚体（%） | 沉淀物IgG含量（%） |
| 实施例1 | 0.12 | 0.09 | 1.2 |
| 实施例2 | 0.10 | 0.06 | 1.1 |
| 实施例3 | 0.10 | 0.08 | 1.1 |
| 实施例4 | 0.31 | 0.36 | 1.6 |
| 对比例1（醋酸沉淀处理） | 0.51 | 1.8 | 1.5 |
可见，实施例1-3对IgA、多聚体的去除效率高于实施例4（工艺参数不在保护范围内）和对比例1（现有技术201210071691.5的工艺方法），同时IgG损耗量低，说明本发明是一种新型的、优良的静注人免疫球蛋白的分离纯化方法。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，它采用高浓度尿素溶液预沉淀、辛酸沉淀法去除杂蛋白及凝血因子类物质，再进行层析工艺，其特征在于：
制备工艺如下：
(1)高浓度尿素溶液预沉淀：将检疫期检疫合格的人血浆经离心，离心时，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0～4℃；分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产，将离心上清蛋白液输送至蛋白分离反应罐，按其质量倍数1~2倍加入常温下的质量分数50%的尿素溶液，流速不超过1.0L/min，分散均匀后加入－15℃或更冷的95％乙醇，流速不超过1.5L/min，使乙醇体积比终浓度至8％，最终温度控制在－1～－3℃；
(2)将步骤(1)的制得物搅拌30min以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4L/min/台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得上清蛋白液①；
(3)辛酸盐沉淀: 向步骤(2) 制得的上清蛋白液①中滴加0.5mol/L NaOH调节pH至4.3～4.5,加入质量分数为10%的辛酸钠溶液至上清蛋白液①中辛酸钠含量18～22mmol/L，然后调节pH至5.0～5.2，搅拌2小时，然后进行压滤，收集上清蛋白液②；
(4)层析工艺：将步骤(3) 制得的上清蛋白液②调节pH为5.20～5.60，加1倍2～8℃注射用水透析至电导为0.8～1.6ms/cm，超滤浓缩至蛋白浓度1.5%～3.5%，用Macrocap-Q离子交换柱进行柱层析，收集流穿液；
(5)将步骤(4) 制得的流穿液用1mol/L的HCl调节至pH为3.8～4.0，开启超滤机将流穿液蛋白浓度调整至5%以上, 使用注射用水等体积透析4～6遍，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10%±1%，pH为3.8～4.4，蛋白含量5.5±0.5％；
(6)步骤(5)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃孵放21天；孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；
所述的百分数除有限定之外，其余为质量百分数。
2.如权利要求1所述的一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其特征在于：
所述高浓度尿素溶液的配制方法为：在常温25℃环境下，按照质量比1:1在纯化水中加入药用尿素，搅拌溶解完全后过滤，即得。
3.如权利要求1所述的一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其特征在于：
所述Macrocap-Q离子交换柱柱层析工艺参数为：
上样流速不超过100L/h/10L柱体积，上样总蛋白不超过200g/L凝胶。
4.如权利要求1-3任意一项所述的一种高浓度静注人免疫球蛋白的分离纯化方法，其特征在于：
所述Macrocap-Q离子交换柱可以再生重复使用，再生的方法为：
用2～4倍柱体积1mol/L NaCL冲洗层析柱洗脱杂蛋白，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃；
用2～4倍柱体积0.5mol/L NaOH冲洗保存层析柱，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃；
超过1个月不用时，用4倍柱体积注射用水清洗层析柱，再用4倍柱体积20%乙醇冲洗保存层析柱，流速不超过100L/h/10L柱体积，流穿液废弃。
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