CN102178952B - 一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品中的血液制品范畴，具体为一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白工艺方法。其特点是：其工艺分三大步骤，一是粗分离；二是层析纯化；三是病毒灭活。采用本发明的层析法工艺，对产品进行进一步纯化，纯度大大提高，使产品中的人免疫球蛋白的纯度达到98％以上，不仅远远高于2010年版《中国药典》的标准，也超过了《欧洲药典》标准，同时其他引起过敏反应的杂质成分也大为降低，如两项主要的过敏性物质-抗补体活性物质(ACA)和降压物质(PKA)均明显降低。本发明的病毒灭活工艺采用两种不同原理的病毒灭活工艺，即低pH孵放结合纳米膜过滤，对脂包膜病毒和非脂包膜病毒均能进行有效的灭活和去除。
Description
技术领域
本发明属于生物制品中的血液制品范畴，具体为一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法。
背景技术
破伤风是一种严重威胁人类健康的疾病，是由破伤风杆菌经伤口侵入人体所致，常见于开放性伤口及非科学接生的新生儿。由于该病治疗较为困难，其病死率高达20％～50％，而且全球都有破伤风病例的发生。所以开发具有预防和治疗破伤风的有效药物显得非常重要。长期以来人类主要采用马的破伤风抗血清(TAT)来预防和治疗破伤风。由于马血清中大量的马的蛋白质，常引起病人的过敏反应甚至发生休克，所以临床应用受到很大限制，采用人血浆中分离的破伤风人免疫球蛋白(TIG)来代替马的抗血清来预防和治疗破伤风，不仅可以减少过敏反应的发生，而且疗效更好，具有非常好的应用前景，但该制品在临床上使用后发现，仍然有一些过敏症状发生，据临床统计资料表明使用破伤风人免疫球蛋白(TIG)过敏反应的发生率为3％-5％，我公司经过研究发现：引起过敏反应的物质主要是产品中含有较多的杂质蛋白导致的。(2010版《中国药典》中要求破伤风人免疫球蛋白产品中人免疫球蛋白的纯度≥90％，即杂蛋白≤10％就合格)。经查询中国专利局检索光盘，关于破伤风人免疫球蛋白工艺方法专利，只有一项，专利号是200410077694.5，名称是一种破伤风免疫球蛋白的生产方法。它采用低温乙醇工艺生产，一步加热灭活病毒，根据该工艺生产的破伤风人免疫球蛋白的纯度较低。我公司经过大量的试验研究，发明了一种生产破伤风人免疫球蛋白的新工艺：首先采用低温乙醇工艺提取组分I+II+III沉淀，再将该沉淀溶解后，采用低温乙醇工艺分离出组分I+III沉淀，上清液再调节相关参数后，分离出II沉淀。溶解II沉淀后，用离子交换层析进行精制纯化，得到高纯度的破伤风人免疫球蛋白，使破伤风人免疫球蛋白的纯度达到98％～100％，破伤风人免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到98％～100％，破伤风抗体效价大于120IU/ml，每吨血浆能收获破伤风人免疫球蛋白约为420万单位～500万单位。
发明内容
本发明的目的就是提供一种生产更高纯度的破伤风人免疫球蛋白(TIG)的方法，是通过低温乙醇分离提取后再用层析法工艺对产品进一步提纯而实现的，具体技术方案如下：包括粗分离、层析纯化、病毒灭活。
A：粗分离：
将血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其PH值为5.8～6.2，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为18％～22％，调整温度在-4～-6℃，加入助滤剂后用压滤机进行过滤，得组分I+II+III沉淀，将组分I+II+III沉淀，溶解于5～8倍量0℃的注射用水中，使反应液温度维持在0℃，搅拌3小时以上，加入醋酸缓冲液，调节反应液pH值为5.15～5.35，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为17％～19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5～-5.5℃，加完乙醇后，加入助滤剂，用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节pH值为7.20～7.60，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为24％～26％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液的最终温度为-10～-12℃，用压滤机压滤，得组分II沉淀，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品；
B、层析纯化：
组分II沉淀用3～5倍量预冷至0℃的注射用水溶解，过滤澄清，加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值为6.5～6.7，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到5％～6％(g/ml)时，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.0，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为50～52g/L，麦芽糖含量为9％～11％(g/ml)。
C、病毒灭活
将上述制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为3.8～4.0，含9％～11％(g/ml)麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤。
D、配制分装
将病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度为95g/L～115g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度大于130g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整浓缩后蛋白液的pH值为6.6～7.0，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品人免疫球蛋白含量≤160g/L，麦芽糖含量≤50g/L，破伤风抗体效价≥120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。
步骤A中的助滤剂为硅藻土，加入量为药液量的0.5％～2.0％(g/ml)。步骤B中采用的层析介质为阴离子型的离子交换层析介质，是DEAE-琼脂糖或者DEAE-葡聚糖。
本发明的优点是：由于在工艺中采用了层析法工艺对产品进行进一步纯化，使制品中人免疫球蛋白的纯度大大提高，人免疫球蛋白的纯度达到98％以上，不仅高于《中国药典》的标准，也超过《欧洲药典》的标准(2010版《中国药典》要求≥90％，《欧洲药典》要求≥95％)，同时其他引起过敏反应的杂质成分也大为降低，如两项主要的过敏性物质-抗补体活性物质(ACA)和降压物质(PKA)均明显降低，见附表1。本发明的病毒灭活工艺采用两种不同原理的病毒灭活工艺，即低PH孵放和纳米膜过滤，对脂包膜病毒和非脂包膜病毒均能进行有效的灭活和去除。该病毒灭活工艺与加热灭活工艺相比灭活条件较为温和，不仅有效的灭活了病毒，而且对破伤风抗体活性的影响比较小。另外，本发明不仅提高了破伤风人免疫球蛋白的纯度，也提高了破伤风人免疫球蛋白的收率，每吨血浆能收获破伤风人免疫球蛋白约为420万单位～500万单位。
表一：产品的主要质量指标
| 技术指标 | 纯度(％) | PKA(IU/ml) | 抗补体活性％ | IgG单体和二聚体 | 回收率IU |
| 中国药典 | ≥90 | 无要求 | 无要求 | ≥90 | |
| 实施例一 | 99.0 | 未检出 | 7 | 99.5 | 456万 |
| 实施例二 | 99.2 | 3 | 5 | 99.2 | 480万 |
| 实施例三 | 99.2 | 3 | 5 | 99.6 | 450万 |
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的工艺流程方框示意图。
具体实施方式
实施例1：
A：粗分离：
将1000L血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其PH值为5.80，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达18％，调整温度在-4℃，加入0.5％(g/ml)硅藻土助滤剂后用压滤机进行过滤，得组分I+II+III沉淀，将组分I+II+III沉淀，溶解于5倍量的0℃注射用水中，搅拌3小时，开启制冷使反应液温度维持在0℃，加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.15，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达17％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-4.5℃，加毕乙醇后，加入0.5％(g/ml)的硅藻土助滤剂后用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节反应液的pH值为7.20，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达24％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-10℃，用压滤机过滤，得沉淀为组分II，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品；
B、层析纯化：
组分II沉淀用3倍量0℃的注射用水溶解，滤芯澄清，加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值为6.5，用5％氯化钠溶液调节溶解液的电导率为1.30ms/m，使用层析介质为阴离子型的离子交换层析介质DEAE-琼脂糖进行层析，将层析柱用pH值为6.5的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩使蛋白浓度达5％后，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为50g/L，麦芽糖含量为10％(g/ml)。
C、病毒灭活
将上述制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为3.8，含10％(g/ml)麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤.
D、配制分装
将经病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度为95g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度为140g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整制品pH值为6.6，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品破伤风人免疫球蛋白的含量为120g/L，麦芽糖含量为50g/L，破伤风抗体效价为120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。
实施例2：
A：粗分离：
将1000L血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其PH值为6.00，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达20％，调整温度在-5℃，加入1.0％(g/ml)硅藻土助滤剂后用压滤机进行过滤，得组分I+II+III沉淀，将组分I+II+III沉淀，溶解于6倍量的0℃注射用水中，搅拌3小时，开启制冷使反应液温度维持在0℃，加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.25，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-5.0℃，加毕乙醇后，加入1.0％(g/ml)的硅藻土助滤剂后用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节反应液的pH值为7.40，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-11℃，用压滤机过滤，得沉淀为组分II，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品；
B、层析纯化：
组分II沉淀用4倍量0℃的注射用水溶解，滤芯澄清，加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值为6.6，用5％氯化钠溶液调节溶解液的电导率为1.40ms/m，使用层析介质为阴离子型的离子交换层析介质DEAE-琼脂糖进行层析，将层析柱用pH值为6.6的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.6后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩使蛋白浓度达6％后，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为3.9，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为52g/L，麦芽糖含量为9％(g/ml)。
C、病毒灭活
将上述制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为3.9，含9％(g/ml)麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤.
D、配制分装
将经病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度为105g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度为135g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整制品pH值为6.8，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品破伤风人免疫球蛋白的含量为115g/L，麦芽糖含量为50g/L，破伤风抗体效价为120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。
实施例3：
A：粗分离：
将1000L血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其PH值为6.20，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达22％，调整温度在-6℃，加入1.5％(g/ml)硅藻土助滤剂后用压滤机进行过滤，得组分I+II+III沉淀，将组分I+II+III沉淀，溶解于8倍量的0℃注射用水中，搅拌3小时，开启制冷使反应液温度维持在0℃，加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.35，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-5.5℃，加毕乙醇后，加入1.5％(g/ml)的硅藻土助滤剂后用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节反应液的pH值为7.60，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达26％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液最终温度为-12℃，用压滤机过滤，得沉淀为组分II，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品；
B、层析纯化：
组分II沉淀用5倍量0℃的注射用水溶解，滤芯澄清，加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值为6.7，用5％氯化钠溶液调节溶解液的电导率为1.50ms/m，使用层析介质为阴离子型的离子交换层析介质DEAE-琼脂糖进行层析，将层析柱用pH值为6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩使蛋白浓度达5.5％后，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为4.0，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为50g/L，麦芽糖含量为11％(g/ml)。
C、病毒灭活
将上述制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为4.0，含11％(g/ml)麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤.
D、配制分装
将经病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度为115g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度为145g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整制品pH值为7.0，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品破伤风人免疫球蛋白的含量为125g/L，麦芽糖含量为50g/L，破伤风抗体效价为120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。
Claims (8)
1.一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，包括：
(a)从血浆中用低温乙醇法制备组分I+II+III沉淀；具体步骤为：将血浆解冻并混合后，加入醋酸缓冲液调节其pH值为5.8～6.2，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为18％～22％，调整温度在-4～-6℃，加入助滤剂后用压滤机进行过滤，得到组分I+II+III沉淀；
(b)从组分I+II+III沉淀中制备组分II沉淀，具体步骤为：将组分I+II+III沉淀溶解于5～8倍量0℃的注射用水中，使反应液温度维持在0℃，搅拌3小时以上，加入醋酸缓冲液，调节反应液pH值为5.15～5.35，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为17％～19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达到-4.5～-5.5℃，加完乙醇后，加入助滤剂，用压滤机过滤，收集过滤上清液，向上清液中加入1M碳酸氢钠缓冲液，调节其pH值为7.20～7.60，加入预冷的95％乙醇，使反应液的乙醇浓度为24％～26％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使反应液的最终温度为-10～-12℃，用压滤机过滤，得到组分II沉淀，即为破伤风人免疫球蛋白的粗品；
(c)溶解组分II沉淀，对溶解液进行离子交换层析；溶解组分II沉淀，是用3～5倍量预冷的0℃的注射用水溶解，过滤澄清，在组分II溶解液中加入3％盐酸，调节其pH值为6.5～6.7，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
(d)对层析液进行超滤，透析；
(e)病毒灭活；
(f)配制分装。
2.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于其所述的步骤(d)中是按以下步骤进行的：将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到5％～6％时，加入7倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％盐酸适量，透析结束后，用3％盐酸调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.0，加入麦芽糖，补加注射用水，使制品人免疫球蛋白含量为50～52g/L，麦芽糖含量为9％～11％。
3.根据权利要求1或2所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，上述步骤中所用的助滤剂为硅藻土，加入量为药液量的0.5％～2.0％。
4.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，上述步骤(c)中的离子交换层析是采用阴离子型的离子交换层析介质。
5.根据权利要求4所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析介质是二乙氨乙基交联琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(e)中所述的病毒灭活包括低pH孵放和纳米膜过滤两个步骤。
7.根据权利要求6所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(e)中所述低pH孵放和纳米膜过滤是按以下步骤进行的：把透析后的免疫球蛋白制品从反应罐经滤筒除菌于无菌容器中，置于21℃库放置21天，使制品在pH为3.8～4.0，含9～11％麦芽糖的条件下进行低pH病毒灭活，然后用纳米膜滤芯进行除病毒过滤。
8.根据权利要求1所述的一种层析法提取破伤风人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(f)中所述的配制分装是按以下步骤进行的：将病毒灭活后的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩，待蛋白浓度为95g/L～115g/L时，用注射用水恒体积透析2倍，透析结束后将制品浓缩至蛋白浓度大于130g/L，抽入洁净不锈钢桶内用0.1M NaOH调整浓缩后蛋白液的pH值为6.6～7.0，根据破伤风人免疫球蛋白的效价，补加注射用水，加入麦芽糖，使最终制品人免疫球蛋白含量115～125g/L，麦芽糖含量50g/L，破伤风抗体效价为120IU/ml，分装，为破伤风人免疫球蛋白成品。
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