CN101357228A - 静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，包括：通过低温乙醇分离方法，首先从免疫混合血浆中分离出FI+II+III沉淀，将FI+II+III沉淀放入注射用水中溶解进行二次分离，取上清液过滤，三次分离得FII沉淀；最后取一重量份FII沉淀放入5～6份注射用水中溶解，调节pH至4.00±0.05，用膜过滤，进行超滤脱醇、除菌过滤及病毒灭活，除菌分装。其采用低温乙醇法，应用低pH孵放病毒灭活和纳米膜病毒过滤双重病毒灭活/去除工艺，每一步骤都对目前血液中已知的可能病毒有减少、灭活或去除作用；与目前肌肉注射制品相比，制品的纯度、抗体效价，降低制品的多聚体的含量、蛋白质含量及抗补体活性等质量指标均有一定提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液制品的制备方法，具体是一种静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，它采用低温乙醇蛋白分离方法进行蛋白分离，应用低pH病毒孵放和纳米膜病毒过滤双重病毒灭活/去除方法，制备用于静脉注射的高纯度、高效价、低蛋白含量人乙型肝炎免疫球蛋白。
背景技术
肌肉注射人乙型肝炎免疫球蛋白用于乙型肝炎的预防已在我国广泛应用，但因其纯度低、蛋白浓度高而不能用于静脉注射，只能用于肌肉注射达到预防乙型肝炎病毒和阻断乙型肝炎病毒的母婴垂直传播，而无法大剂量应用于因乙肝病毒引起肝硬化的肝脏移植术中。乙肝病毒引起肝硬化的肝脏移植术中除要求有健康的供体外，清除受体在无肝期时周围血清中的乙肝病毒是患者最终是否存活的关键因素之一。肌注乙型肝炎免疫球蛋白受其自身特点和给药途径的制约，无法达到清除乙肝病毒的效果。
静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白解决了肌注的不足，能够实现大剂量的给药，其内在成份IgG保持了其分子的结构完整性、天然构型和生物活性，同时具有高纯度、高效价的特点，大大降低了制品的抗补体活性。由于是静脉直接给药，因此也提高了其有效性。目前，国外已有静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白产品上市，而国内还处于临床研究试验阶段，还未有厂家获得SFDA的生产批件，国内市场上也没有产品上市。
静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白多采用目前常用的低温乙醇蛋白分离方法，结合膜过滤分离技术，利用蛋白质的等电点和分子大小，通过改变溶液的pH、温度及乙醇浓度，进行蛋白分离提纯制得高纯度制品；该方法收获率为55～65％，相对于全层析法收获率偏低。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法及制品，它采用低温乙醇蛋白分离、低pH孵放病毒灭活与纳米膜病毒过滤双重病毒灭和/去除工艺，制备适用于静脉注射的特异性乙型肝炎免疫球蛋白，以解决国内目前乙型肝炎免疫球蛋白无法大剂量用于肝脏移植患者的问题，降低肝脏移植患者在肝脏移植后乙肝再复发的概率。
本发明的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白(pH4)的制备方法，包括以下步骤：
a、取合并后的免疫混合血浆，用生理盐水调节蛋白浓度至40～50g/L，用缓冲液调节悬液pH值至6.00±0.05，加-20℃以下95％乙醇使溶液的乙醇浓度为20％，并调节温度为-5±0.5℃，反应完全后，采用离心法分离获得组分FI+II+III沉淀；
b、将FI+II+III沉淀放入0.8～0.9倍血浆量的0～2℃注射用水中完全溶解，用缓冲液调节溶液的pH值至5.35±0.05，用0～2℃注射用水调节溶液电导率至1.15±0.1ms/cm，用-20℃以下的95％乙醇调节溶液的乙醇浓度至14％，调节反应最终温度至-3.5±0.5℃，反应完全后，采用离心法分离，取上清液，加入上清液体积0.5％重量的硅藻土搅拌、过滤；
c、在步骤b制得的过滤液中，加入过滤液体积5％的1mol/L NaCl溶液，加入过滤液体积1.5％±0.2％的1mol/L NaHCO3溶液，调节pH值至7.2±0.2，用-20℃以下的95％乙醇调节溶液乙醇浓度至25％，温度降至-9.0±1.0℃，反应完全后，可静置至少1天，采用离心法分离获得FII沉淀；
d、以重量份计，将一份FII沉淀物放入5～6份、2～8℃注射用水中溶解，用0.5mol/L盐酸调节溶液pH至4.00±0.05，用0.45μm膜过滤，进而进行超滤脱醇、除菌过滤及病毒灭活，除菌分装。
其中，超滤脱醇步骤包括：过滤后的FII溶解液用30KD超滤膜超滤至蛋白浓度为80～110g/L，用8倍浓缩液体积的2～8℃注射用水透析脱醇；脱醇后的制品，调节蛋白质浓度至40～60g/L，按制品体积9～11％的重量加入麦芽糖，最后调节制品pH至4.00±0.1；
除菌过滤步骤包括：超滤脱醇后的制品用无菌的10′柱式0.45μm滤芯串联5′柱式0.45+0.22μm组合滤芯过滤，过滤的压力为0.05～0.15Mpa；
病毒灭活步骤包括：确认除菌过滤后的制品pH为4.00±0.1，将制品存放在23～25℃，孵放22天进行低pH病毒灭活；孵放完后，用孔径为50纳米的病毒过滤膜过滤制品以除去病毒，过滤压力＜0.25Mpa。
本发明的免疫混合血浆采用高效价免疫血浆，该血浆的合并人份不得少于100，抗-HBs效价应≥10IU/ml。
在步骤b的上清液中，可加入上清液体积0.5％重量的硅藻土，搅拌均匀，通过孔径为0.63μm的NA12滤板过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
按照本发明上述方法制备的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白，具有下列特征：
纯度≥95％，IgG单体及二聚体含量之和不低于95％，糖含量90～110g/L，pH 3.8～4.4，蛋白浓度40～60g/L，不含防腐剂，抗体效价：单位抗体效价≥50IU/ml，总抗体效价不低于标示量。
本发明选用高效价免疫血浆，血浆的合并人份不少于100，抗-HBs效价应≥10IU/ml；采用低温乙醇蛋白分离方法，应用低pH孵放病毒灭活和纳米膜病毒过滤双重病毒灭活/去除工艺，整个工艺流程过程中，每一步都对目前血液中已知的可能病毒有减少、灭活或去除作用，本发明方法收获率为60～70％。与目前肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白相比，制品的纯度、抗体效价，降低制品的多聚体的含量、蛋白质含量及抗补体活性等质量指标均有较大提高，其能有效地预防和治疗因乙肝病毒引起肝硬化的肝脏移植术后乙型肝炎的再复发，有效率达95％以上。
本发明方法制备的制品与目前乙型肝炎免疫球蛋白产品，在产品关键质量指标、应用方面的对比如下表。
| 项目 | 静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白 | 乙型肝炎免疫球蛋白 |
| pH值 | 3.8～4.4 | 6.4～7.4 |
| 蛋白含量 | 40～60g/L | ≤180g/L |
| 纯度 | ≥95％ | ≥90％ |
| 分子分布大小 | IgG单体+二聚体≥95％ | IgG单体+二聚体≥90％ |
| 抗体效价 | 不低于50IU/ml | 不低于100IU/ml |
| 给药途径 | 静脉注射 | 肌肉注射 |
| 适应症 | 用于预防和治疗因乙肝病毒引起肝硬化的肝脏移植术后乙型肝炎的再复发 | 用于暴露性乙肝接触者的预防和阻断乙型肝炎的母婴垂直传播 |
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明。
参照图1，本发明静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白(pH4)的制备方法具体步骤如下：
1)、合并后的血浆，用生理盐水调节蛋白浓度至40～50g/L，用pH4.00醋酸盐缓冲液将悬液调节最终pH至6.00±0.05，用-20℃以下95％乙醇调节溶液乙醇浓度至20％，调节反应温度至-5.0±0.5℃，继续搅拌、反应2小时，静置过夜，离心分离取沉淀得FI+II+III(即组分I+II+III)；
其中，pH4.00醋酸盐缓冲液每升缓冲液含醋酸钠108.08g，无水醋酸228.8ml；
乙醇量计算：V95％乙醇＝0.267×V悬液(L)
M95％乙醇＝0.83×V95％乙醇(Kg)。
2)、用0.8～0.9倍血浆量的0～2℃冷注射用水将FI+II+III沉淀完全搅拌溶解，溶液用缓冲液I调节到pH4.80±0.05，搅拌1小时；用缓冲液II调节到pH 5.30±0.05，补加冷注射用水至血浆量1.2倍，搅拌1小时，补加冷注射用水至最终电导率为1.15±0.1ms/cm，pH为5.30±0.05，蛋白浓度为15～25g/L，用-20℃以下95％乙醇调节溶液调节溶液乙醇浓度至14％，调节反应最终温度至-3.5±0.5℃，继续搅拌、反应2小时，静置过夜后离心分离保留上清夜；
其中，缓冲液I包括醋酸和磷酸氢二钠，每升缓冲液含磷酸氢二钠530g，醋酸280ml；缓冲液II包括醋酸和磷酸氢二钠，每升缓冲液含磷酸氢二钠160g，醋酸220ml；
乙醇量计算：V95％乙醇＝0.173×V悬液(L)
M95％乙醇＝0.83×V95％乙醇Kg)。
按上清夜体积0.5％重量可加入硅藻土搅拌均匀后用NA12滤板(孔径为0.63μm)过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
3)、按过滤夜体积5％加入1mol/L NaCl溶液，按过滤液体积1.5％±0.2％加入1mol/L NaHCO3溶液，调节pH至7.20±0.2，用-20℃以下的95％乙醇调节溶液乙醇浓度至25％，复测pH为7.20±0.2，调节反应液最终温度至-9.0±1.0℃，最终反应液蛋白浓度为2～5g/L，继续搅拌、反应2小时，静置至少1天，离心分离获得FII沉淀；
乙醇量计算：V95％乙醇＝0.157×V悬液+0.357×(VNaCl+VNaHCO3) (L)
M95％乙醇＝0.83×V95％乙醇(Kg)。
4)、将FII沉淀用沉淀重的5～6倍、0～4℃注射用水量溶解，完全溶解后用NA17滤板(孔径为0.45μm)过滤，滤液用0.5mol/L HCl调节pH至4.00±0.05。
5)、将过滤后的FII溶液用30KD的超滤膜浓缩到蛋白浓度为80～110g/L，按照浓缩后的溶液体积，用8倍浓缩液体积的2～8℃注射用水透析脱醇；透析完毕后，将制品总蛋白浓度用注射用水调节到50～60g/L，加入麦芽糖，麦芽糖的浓度保持在90～110g/L，调节制品的最终pH为4.0±0.1。
6)、除菌过滤步骤包括：制品用无菌的10′柱式0.45μm滤芯串联5′柱式0.45+0.22μm组合滤芯过滤，过滤的压力为0.05～0.15Mpa。
7)、病毒灭活/去除：确定除菌后的制品pH在4.0±0.1范围内，将制品在23～25℃环境下孵放22天进行低pH病毒灭活，孵放完后，用孔径为50纳米的病毒过滤膜过滤制品以除去病毒，过滤压力＜0.25Mpa。
8)、除菌分装。
上述免疫混合血浆采用高效价免疫血浆，该血浆的合并人份不得少于100，抗-HBs效价应≥10IU/ml。
上述离心分离中，通常离心机的转速为12000～14000转/分钟，优选14000转/分钟。
本发明方法收获率达60～70％。按照本发明方法制备的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白具有下列特征：
纯度≥95％，IgG单体及二聚体含量之和不低于95％，糖含量90～110g/L，pH 3.8～4.4，蛋白浓度40～60g/L，不含防腐剂，抗体效价：单位抗体效价≥50IU/ml，总抗体效价不低于标示量。
实施例1：
1)、合并血浆285L，加0.9％NaCl 64L，用pH4.00醋酸盐缓冲液调节溶液pH为5.88，-22℃、95％乙醇94L调节溶液乙醇最终浓度为20％，复测溶液最终pH为6.00，最终溶液温度为-4.5℃，搅拌2小时，静置过夜，离心分离得FI+II+III沉淀18.3kg。
2)、用0.5℃注射用水230L完全溶解FI+II+III沉淀18.3kg，用上述缓冲液I调节溶解液pH为4.85，补加注射用水215L，搅拌1小时，用上述缓冲液II调节溶解液pH为5.30，补加冷注射用水220L，电导率为1.05ms/cm，-21.5℃、95％乙醇120.2L调节溶液乙醇最终浓度为14％，最终pH为5.35，温度-3.5℃，搅拌2小时静置过夜，离心分离，得体积为785L的上清夜。
该上清液中可以加入硅藻土3.925kg，搅拌均匀，通过孔径为0.63μm的NA12滤板过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
3)、785L过滤液中加入1mol/L NaCl 39.3L，1mol/L NaHCO3 11.7L，-21℃、95％乙醇142L调节溶液乙醇最终浓度为25％，最终pH为7.25，温度-8.5℃，搅拌2小时静置2天，离心分离得FII沉淀5.7kg。
4)、33L 0.4℃注射用水溶解5.7kg FII沉淀，完全溶解后用NA17滤板过滤，过滤后的滤液总量为43L，加0.5mol/L HCl 1.4L调节滤液pH为3.99，最终溶液体积为44.4L。
5)、44.4L过滤液用30KD的超滤膜浓缩至20L，用160L 4℃注射用水等体积透析，透析完毕后加注射用水至30L，加入麦芽糖3kg，加0.2mol/L HCl0.83L调节溶液pH为3.99，制品最终体积为32L。
6)、配制后的制品32L，用经灭菌后的10′0.45um滤芯串联5′0.45+0.22um的组合滤芯在0.05～0.15Mpa压力范围内过滤除菌，过滤除菌后的体积为32L，pH为3.99。
7)、除菌过滤后的制品，在23.2～24.5℃孵放间内孵放22天，孵放完毕后用灭菌的DV50滤器进行病毒过滤，过滤压力为0.05～0.25Mpa，过滤后体积为31.8L。
8)、除菌分装用具及内包装材料灭菌，制品用5′0.45+0.22um的组合滤器过滤，按1000IU/瓶规格分装，分装体积为20ml/瓶，分装数为1590瓶。
实施例2：
1)、合并血浆337.1L，加0.9％NaCl 81.5L，用pH4.00醋酸盐缓冲液调节溶液pH为5.85，-22℃、95％乙醇112.8L调节溶液乙醇最终浓度为20％，复测溶液最终pH为6.05，最终溶液温度为-5.0℃，搅拌2小时，静置过夜，离心分离得FI+II+III沉淀23kg。
2)、用0.5℃注射用水300L完全溶解FI+II+III沉淀23kg，用上述缓冲液I调节溶解液pH为4.80，补加注射用水300L，搅拌1小时，用上述缓冲液II调节溶解液pH为5.25，补加冷注射用水221L，电导率为1.15ms/cm，-21℃、95％乙醇145.3L调节溶液乙醇最终浓度为14％，最终pH为5.30，温度-4.0℃，搅拌2小时静置过夜，离心分离，上清体积为970L。
该上清液中加入硅藻土4.85kg，搅拌均匀，可通过孔径为0.63μm的NA12滤板过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
3)、970L过滤液中加入1mol/L NaCl 48.5L，1mol/L NaHCO3 12.6L，-23℃、95％乙醇175.4L调节溶液乙醇最终浓度为25％，最终pH为7.15，温度-10.0℃，搅拌2小时静置2天，离心分离得FII沉淀7.0kg。
4)、42L3.4℃注射用水溶解7.0kg FII沉淀，完全溶解后用NA17滤板过滤，过滤后的滤液总量为50L，加0.5mol/L HCl 1.5L调节滤液pH为4.05，最终溶液体积为51.5L。
5)、51.5L过滤液用30KD的超滤膜浓缩至25L，用200L 8℃注射用水等体积透析，透析完毕后加注射用水至34.5L，加入麦芽糖3.45kg，加0.2mol/LHCl 0.995L调节溶液pH为4.05，制品最终体积为37L。
6)、配制后的制品37L，用经灭菌后的10′0.45um滤芯串联5′0.45+0.22um的组合滤芯在0.05～0.15Mpa压力范围内过滤除菌，过滤除菌后的体积为36.6L，pH为4.05。
7)、除菌过滤后的制品，在23.0～24.2℃孵放间内孵放22天，孵放完毕后用灭菌的DV50滤器进行病毒过滤，过滤压力为0.05～0.25Mpa，过滤后体积为36L。
8)、除菌分装用具及内包装材料灭菌，制品用5′0.45+0.22um的组合滤器过滤，按2500IU/瓶规格分装，分装体积为45ml/瓶，分装数为787瓶。
实施例3：
1)、合并血浆169.4L，加0.9％NaCl 41.4L，用pH4.00醋酸盐缓冲液调节溶液pH为5.80，-22℃、95％乙醇56.82L调节溶液乙醇最终浓度为20％，复测溶液最终pH为5.95，最终溶液温度为-5.5℃，搅拌2小时，静置过夜，离心分离得FI+II+III沉淀11kg。
2)、用0.5℃注射用水150L完全溶解FI+II+III沉淀11kg，用上述缓冲液I调节溶解液pH为4.75，补加注射用水120L，搅拌1小时，用上述缓冲液II调节溶解液pH为5.25，补加冷注射用水158L，电导率为1.15ms/cm，-21.5℃、95％乙醇74.4L调节溶液乙醇最终浓度为14％，最终pH为5.25，温度-3.5℃，搅拌2小时静置过夜，离心分离，上清体积为496.5L。
该上清液中可以加入硅藻土2.48kg，搅拌均匀，通过孔径为0.63μm的NA12滤板过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
3)、496.5L过滤液中加入1mol/L NaCl 24.8L，1mol/L NaHCO3 8.3L，-21℃、95％乙醇89.8L调节溶液乙醇最终浓度为25％，最终pH为7.40，温度-8.0℃，搅拌2小时静置2天，离心分离得FII沉淀3.1kg。
4)、18L0.4℃注射用水溶解3.1kg FII沉淀，完全溶解后用NA17滤板过滤，过滤后的滤液总量为25L，加0.5mol/L HCl 0.85L调节滤液pH为3.95，最终溶液体积为25.85L。
5)、25.85L过滤液用30KD的超滤膜浓缩至10L，用80L 8℃注射用水等体积透析，透析完毕后加注射用水至16.5L，加入麦芽糖1.65kg，加0.2mol/LHCl 0.48L调节溶液pH为3.95，制品最终体积为18L。
6)、配制后的制品18L，用经灭菌后的10′0.45um滤芯串联5′0.45+0.22um的组合滤芯在0.05～0.15Mpa压力范围内过滤除菌，过滤除菌后的体积为17.7L，pH为3.95。
7)、除菌过滤后的制品，在23.8～25.0℃孵放间内孵放22天，孵放完毕后用灭菌的DV50滤器进行病毒过滤，过滤压力为0.05～0.25Mpa，过滤后体积为17.4L。
8)、除菌分装用具及内包装材料灭菌，制品用5′0.45+0.22um的组合滤器过滤，按1000IU/瓶规格分装，分装体积为20ml/瓶，分装数为870瓶。
Claims (9)
1、一种静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a、取合并后的免疫混合血浆，用生理盐水调节蛋白浓度至40～50g/L，用缓冲液调节悬液pH值至6.00±0.05，加-20℃以下95％乙醇使溶液的乙醇浓度为20％，并调节温度为-5±0.5℃，反应完全后，采用离心法分离获得FI+II+III沉淀；
b、将FI+II+III沉淀放入0.8～0.9倍血浆量的0～2℃注射用水中完全溶解，用缓冲液调节溶液的pH值至5.35±0.05，用0～2℃注射用水调节溶液电导率至1.15±0.1ms/cm，用-20℃以下的95％乙醇调节溶液的乙醇浓度至14％，调节反应最终温度至-3.5±0.5℃，反应完全后，采用离心法分离，取上清液，加入上清液体积0.5％重量的硅藻土搅拌、过滤；
c、在步骤b制得的过滤液中，加入过滤液体积5％的1mol/L NaCl溶液，加入过滤液体积1.5％±0.2％的1mol/L NaHCO3溶液，调节pH值至7.2±0.2，用-20℃以下的95％乙醇调节溶液乙醇浓度至25％，温度降至-9.0±1.0℃，反应完全后，采用离心法分离获得FII沉淀；
d、以重量份计，将一份FII沉淀放入5～6份、2～8℃注射用水中溶解，用0.5mol/L盐酸调节溶液pH至4.00±0.05，用0.45μm膜过滤，进而进行超滤脱醇、除菌过滤及病毒灭活，除菌分装。
2、根据权利要求1的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：在步骤d中，所述超滤脱醇步骤包括：过滤后的FII溶解液用30KD超滤膜超滤至蛋白浓度为80～110g/L，用8倍浓缩液体积的2～8℃注射用水透析脱醇；脱醇后的制品，调节蛋白质浓度至40～60g/L，按制品体积9～11％的重量加入麦芽糖，最后调节制品pH至4.0±0.1。
3、根据权利要求1或2的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：在步骤d中，所述除菌过滤步骤包括：超滤脱醇后的制品用无菌的10′柱式0.45μm滤芯串联5′柱式0.45+0.22μm组合滤芯过滤，过滤的压力为0.05～0.15Mpa；
所述病毒灭活步骤包括：确认除菌过滤后的制品pH为4.00±0.1，将制品存放在23～25℃环境下孵放22天进行低pH病毒灭活；孵放完后，用孔径为50纳米的病毒过滤膜过滤制品以除去病毒，过滤压力＜0.25Mpa。
4、根据权利要求3的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：所述免疫混合血浆采用高效价免疫血浆，该血浆的合并人份不得少于100，抗-HBs效价应≥10IU/ml。
5、根据权利要求1的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：在步骤b的上清液中，加入上清液体积0.5％重量的硅藻土搅拌均匀，通过孔径为0.63μm的NA12滤板过滤，过滤压力＜0.2Mpa。
6、根据权利要求1或5的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：在步骤b中，采用缓冲液I和缓冲液II先后调节溶液的pH值，缓冲液I包括醋酸和磷酸氢二钠，每升缓冲液含磷酸氢二钠530g，醋酸280ml；缓冲液II包括醋酸和磷酸氢二钠，每升缓冲液含磷酸氢二钠160g，醋酸220ml。
7、根据权利要求1的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：所述免疫混合血浆采用高效价免疫血浆，该血浆的合并人份不得少于100，抗-HBs效价应≥10IU/ml。
8、根据权利要求1的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白的制备方法，其特征是：在离心分离中离心机的转速为12000～14000转/分钟。
9、按照权利要求1-8任何一项权利要求所述方法制备的静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白，其具有下列特征：
纯度≥95％，IgG单体及二聚体含量之和不低于95％，糖含量90～110g/L，pH 3.8～4.4，蛋白浓度40～60g/L，抗体效价：单位抗体效价≥50IU/ml。
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