RU2742655C1

RU2742655C1 - Способ производства иммуноглобулина для внутривенного введения

Info

Publication number: RU2742655C1
Application number: RU2020125016A
Authority: RU
Inventors: Янь ЧЖЭН; Вэй Ван; Фэйгуань ЧЖАН; Тин БАЙ; Сяньцзяо ЧЖЭН
Original assignee: Сычуань Юаньда Шуян Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2021-02-09
Also published as: EP3741775A4; EP3741775A1; WO2019137435A1; CN108101981B; CN108101981A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения иммуноглобулинов, и может быть использовано в медицине. Способ, включающий разделение на фракции плазмы здорового человека с получением фракции и последующее пропускание последовательно через анионную хроматографию А, анионную хроматографию В и аффинную хроматографию C, позволяет получать иммуноглобулин, пригодный для внутривенного введения. 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 18 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биофармацевтических препаратов, в частности к способу получения иммуноглобулина для внутривенного введения.

Уровень техники

Иммуноглобулин (Ig) является важной частью иммунной системы человека и представляет собой тип животного протеина с активностью в отношении антител и выполняет в организме человека важную функцию по распознаванию бактерий и вирусов и активации комплемента. Иммуноглобулины в плазме человека можно подразделить на 5 категорий, включающих IgG, IgA, IgM, IgD и IgE, из которых IgG является основным. Наиболее примечательным признаком IgG является способность к специфическому распознаванию антигена и объединению с ним с образованием комплекса. После того как этот комплекс фагоцитирован фагоцитами, антиген утрачивает свою токсичность и патогенность. С тех пор как Кон (Cohn) разработал способ осаждения этанолом, плазма человека, обогащенная иммуноглобулинами, широко изучалась и использовалась для лечения различных инфекций или врожденных пороков развития.

В настоящее время, иммуноглобулины, полученные как внутри страны, так и за рубежом, в основном очищаются из плазмы или фракции II, и лишь некоторые извлекаются из фракции I+II+III или фракции II+III из-за сложного состава фракции I+II+III или фракции II+III, что затрудняет разделение и очистку и затрудняет анализ.

Иммуноглобулин, в частности концентрат IgG, может быть получен различными способами, помимо селективного осаждения белка этанолом, такими как осаждение полиэтиленгликолем, гидролиз протеазы и тому подобное. Как правило, способом получения концентрата IgG является низкотемпературное центрифугирование этанола (то есть фильтрация под давлением) с низким выходом продукта, низкой чистотой и плохой стабильностью.

Чтобы улучшить выход и чистоту продукта IgG, исследователи внутри страны и за рубежом провели ряд исследований, в основном используя двухстадийную фильтрацию под давлением в сочетании с двухстадийной хроматографией или одностадийной хроматографией, благодаря чему по существу достигается высокий выход и высокая чистота. В патенте КНР (CN 103554253 В) раскрыт способ получения человеческого иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий разделение фракции II+III путем двухстадийной фильтрации под давлением, удаление фракции III путем фильтрации под давлением с помощью низкотемпературного этанола и затем получение иммуноглобулина путем двухстадийной хроматографии, в котором полученный иммуноглобулин имеет высокую биологическую активность, высокий выход (не менее 6,5 г/л плазмы) и высокую чистоту (99% или выше). Однако в этом патенте не определяют анти-А и анти-В антитела. Таким образом, этот полученный продукт IgG имеет высокое содержание анти-А и анти-В антител, которое, без использования специальных гелей для удаления анти-А и анти-В антител, легко выходит за рамки ограничений, установленных Китайской фармакопеей. В другом патенте КНР (CN 103394084 В) предложен концентрат иммуноглобулина IgG, который содержит полиреактивный IgG и удаляет анти-А и анти-В антитела, проявляя благоприятный эффект удаления анти-А/анти-В антитела, в котором в концентрате IgG находится не более 23 нг/мг, в частности от 19 до 23 нг/мг, анти-А антитела, и в концентрате IgG находится не более 20 нг/мг, в частности от 12 до 20 нг/мг, анти-В антитела. Однако в этом патенте не изучали выход и чистоту продукта. Существующие результаты исследований показывают, что для получения продуктов IgG с высоким выходом и чистотой и прекрасным эффектом удаления анти-А/анти-В антител способ получения должен соответствовать высоким требованиям. Существующие способы не могут достичь хороших результатов ни по выходу, ни по чистоте, ни по удалению анти-А/анти-В антител.

Кроме того, существующие способы получения имеют также следующие недостатки, которые не могут быть устранены. Например, конечный продукт, полученный после двухстадийной хроматографии и фильтрации проточной жидкости через наномембрану показывает высокое содержание АСА несмотря на то, что индикаторы анти-А и анти-В уже достигли требований Китайской фармакопеи (2010). Таким образом, содержание АСА не соответствует стандарту после инкубации. Кроме того, осмолярность легко вызывает естественную кристаллизацию в процессе ультрафильтрации и образования смеси после осаждения октановой кислотой и двухстадийной хроматографии, что приводит к невозможности определения осмолярности продукта или неопределенной осмолярности, а также снижает выход, создает длинный хвост при промывании пиков и осложняет промывание хроматографической колонки. Следовательно, необходимо предложить способ получения IgG, который может решить указанные выше проблемы, с получением продуктов IgG, которые не только имеют высокие выход и чистоту, но также анти-А, анти-В и АСА индикаторы, которые соответствуют требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в решении технических задач, описанных выше. В частных воплощениях настоящего изобретения предложен способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения. Согласно предложенному способу, полученный иммуноглобулин для внутривенного введения имеет высокие выход и чистоту, и, что более важно, значительно сниженные индикаторы анти-А и анти-В и индикатор АСА, прекрасно соответствуя требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Для этого, в частных воплощениях настоящего изобретения предложен способ получения иммуноглобулин для внутривенного введения, включающий стадии:

(1) выделения из плазмы фракции I+II+III или фракции II+III,

(2) осаждения октановой кислотой: осаждение фракции I+II+III или фракции II+III октановой кислотой с последующей фильтрацией с получением прозрачной жидкости, в которой концентрация октановой кислоты предпочтительно составляет от 10 до 30 мМ, более предпочтительно от 22 до 25 мМ,

(3) проведения хроматографии в соответствии с комбинацией хроматографии А, хроматографии В и хроматографии С, комбинацией хроматографии А и хроматографии С или комбинацией хроматографии В и хроматографии С, при этом

хроматография А: фильтрация с концентрированием прозрачной жидкости с получением первого раствора белка с содержанием белка от 2 до 20 г/л, предпочтительно от 5 до 15 г/л, более предпочтительно от 8 до 10 г/л, пропусканиг первого раствора белка через анионную хроматографическую колонку А в условиях первой хроматографии при рН от 4,50 до 5,50, от 5 до 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,5 до 2,0 мСм/см и линейной скорости от 60 до 150 см/ч для уравновешивания и загрузки, предпочтительно при рН от 4,70 до 5,30, от 8 до 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,8 до 1,8 мСм/см и линейной скорости от 70 до 120 см/ч для уравновешивания и загрузки, более предпочтительно при рН от 4,8 до 5,0, от 12 до 14 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 1,0 до 1,2 мСм/см и линейной скорости от 90 до 100 см/ч для уравновешивания и загрузки, причем анионная хроматографическая колонка А включает анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE, анионную хроматографическую колонку Capto Q или анионную хроматографическую колонку UNO sphere Q, предпочтительно анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE,

хроматография В: пропускание смеси первого проточного раствора и промывного раствора через анионную хроматографическую колонку В в условиях второй хроматографии при рН от 5,50 до 6,50, от 5 до 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,5 до 2,5 мСм/см и линейной скорости от 60 до 150 см/ч для уравновешивания и загрузки, предпочтительно при рН от 5,70 до 6,30, от 8 до 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,8 до 1,8 мСм/см и линейной скорости от 70 до 100 см/ч для уравновешивания и загрузки, более предпочтительно при рН от 6,0 до 6,2, от 12 до 14 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 1,0 до 1,2 мСм/см и линейной скорости от 90 до 100 см/ч для уравновешивания и загрузки, причем анионная хроматографическая колонка В включает анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ, анионную хроматографическую колонку CaptoQ ХР или анионную хроматографическую колонку Nuvia HR Q, предпочтительно анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ, хроматография С: концентрирование путем ультрафильтрации смеси второго проточного раствора и промывного раствора с буфером с получением второго раствора белка с содержанием белка от 20 до 60 г/л, предпочтительно от 30 до 50 г/л, более предпочтительно от 35 до 45 г/л, в котором буфер содержит ацетат, или цитрат, или фосфат, при рН от 4,50 до 7,30 и NaCl, предпочтительно от 5 до 20 мМ ацетата, или цитрата, или фосфата, при рН от 5,00 до 6,00 и от 80 до 150 мМ NaCl, более предпочтительно ацетата, или цитрата, или фосфата, при рН от 5,30 до 5,50 и от 100 до 120 мМ NaCl, диализ путем ультрафильтрации второго раствора белка с обеспечением рН, соответствующего буферу, получая таким образом третий раствор белка, пропускание третьего раствора белка через колонку С для аффинной хроматографии в условиях аффинной хроматографии, включающих линейную скорость от 60 до 150 см/ч в условиях буфера для уравновешивания и загрузки, предпочтительно линейную скорость от 70 до 130 см/ч для уравновешивания и загрузки, более предпочтительно линейную скорость от 90 до ПО см/ч для уравновешивания и загрузки, причем колонка С для аффинной хроматографии включает колонку для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix, колонку для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А или колонку для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-В, и

(4) концентрирования путем ультрафильтрации или разбавления, инактивации вирусов, составления композиции и наполнения с получением иммуноглобулина для внутривенного введения, в котором составление композиции предпочтительно проводят, используя глицин или пролин.

Согласно способу получения по настоящему изобретению, осаждение октановой кислотой и условия хроматографии являются ключевыми факторами, в частности концентрация октановой кислоты, содержание белка и индикаторы, включающие значение рН, проводимость и буфер, все из которых проявляют в хроматографии важное влияние на результаты хроматографии, а иммуноглобулин IgG после очистки демонстрирует большую разницу в некоторых индикаторах благодаря разным условиям хроматографии. На основании большого количества сравнительных испытаний, в настоящем изобретении показано, что условия хроматографии, описанные выше, могут гарантировать, что иммуноглобулин IgG имеет прекрасные индикаторы анти-А, анти-В и АСА. В частности, при использовании предпочтительной схемы настоящего изобретения, Анти-А=1: 4, Анти-В=1:4, АСА=2%, и осмолярность может достигать 285 мосмоль/кг, РКА<10 МЕ/мл, причем все соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010). Когда условия хроматографии выходят за рамки, предложенные в настоящем изобретении, индикаторы анти-А и анти-В не могут быть удалены с достижением прекрасного уровня настоящего изобретения, а также не может быть достигнут уровень выхода продукта, обеспечиваемый настоящим изобретением. В частности, буферные условия, используемые в настоящем изобретении, оказывают существенное влияние на индикаторы продукта, например, выход и осмолярность. Осмолярность продукта может прекрасно соответствовать стандарту в пределах буферных условий по настоящему изобретению, но осмолярность продукта не может достичь стандарта и легко вызывает естественную кристаллизацию за пределами буферных условий по настоящему изобретению.

В хроматографии А стадии (3) настоящего изобретения процесс хроматографии осуществляют с использованием анионной хроматографической колонки А, в основном включающей анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE, Capto Q или UNO sphere Q, и с любой из трех можно достичь хороших индикаторов анти-А и анти-В и индикатора АСА. Из них анионная хроматографическая колонка Fractogel EMD DEAE является наиболее предпочтительной, которая может обеспечить более высокий выход иммуноглобулина при использовании в условиях хроматографии настоящего изобретения, в то время как анионные хроматографические колонки Capto Q и UNO sphere Q обеспечивают более низкий выход иммуноглобулина по сравнению с анионной хроматографической колонкой Fractogel EMD DEAE.

В хроматографии В стадии (3) настоящего изобретения процесс хроматографии осуществляют при использовании анионной хроматографической колонки В, в основном включающей анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ, CaptoQ ХР или Nuvia HR Q, и с любой из трех можно достичь хороших индикаторов анти-А и анти-В и индикатора АСА. Из них анионная хроматографическая колонка Fractogel EMD ТМАЕ является наиболее предпочтительной, которая может обеспечить более высокий выход иммуноглобулина при использовании в условиях хроматографии настоящего изобретения, в то время как анионные хроматографические колонки CaptoQ ХР и Nuvia HR Q достигают более низкого выхода иммуноглобулина по сравнению с анионной хроматографической колонкой Fractogel EMD ТМАЕ.

На стадии (3) настоящего изобретения хроматографию можно осуществлять с помощью следующих средств: 1) трехстадийная хроматография в следующей последовательности: хроматография А, хроматография В и хроматография С, 2) двухстадийная хроматография в следующей последовательности: хроматография А и хроматография С или 3) двухстадийная хроматография в следующей последовательности: хроматография В и хроматография С. Все способы хроматографии, описанные выше, могут в значительной степени удалять анти-А и анти-В.

В качестве воплощения настоящего изобретения, анионная хроматографическая колонка А в хроматографии А представляет собой хроматографическую колонку ХК50/30, наполненную соответствующими гелями для анионной хроматографии до высоты от 18 до 23 см, и имеет загрузку геля от 300 до 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, предпочтительно от 350 до 650 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, более предпочтительно от 450 до 550 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

В качестве воплощения настоящего изобретения анионная хроматографическая колонка В в хроматографии В представляет собой хроматографическую колонку ХК50/30, наполненную соответствующими гелями для анионной хроматографии до высоты от 18 до 23 см, и имеет загрузку геля от 300 до 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, предпочтительно от 350 до 650 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, более предпочтительно от 450 до 550 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

Загрузка геля может оказывать некоторое влияние на эффект хроматографии. В настоящем изобретении в итоге определили, что прекрасный эффект хроматографии может быть достигнут при загрузке геля, описанной выше, на основании большого количества экспериментов и изучения условий способа.

В качестве воплощения настоящего изобретения колонка для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix, колонка для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А или колонка для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-В в хроматографии С представляет собой хроматографическую колонку ХК 16/20, наполненную аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-А и/или аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-В до высоты от 5 до 25 см, предпочтительно до высоты от 6 до 20 см, при этом колонка для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix наполнена аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-А и аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-В в соотношении от 1 до 2 к от 2 до 3.

В хроматографии С можно получить продукт с высоким выходом иммуноглобулина независимо от того, использовать смешанную колонку для аффинной хроматографии или однородную колонку для аффинной хроматографии, кроме того, анти-А или анти-В индикатор в продукте может полностью соответствовать стандарту Китайской фармакопеи (2010).

Способ по настоящему изобретению также включает, что в хроматографии В смесь первого проточного раствора и промывного раствора подвергают регулированию рН буфером, выдержке при температуре от 2 до 8°С в течение 1 часа или более и фильтрации с получением надосадочной жидкости перед пропускание через анионную хроматографическую колонку В.

Кроме того, перед выделением фракции I+II+III или фракции II+III из плазмы на стадии (1) способ также включает обработку плазмы от здорового субъекта этанолом при низкой температуре с получением осаждения фракции I+II+III или фракции II+III.

Кроме того, после получения, фракцию I+II+III или фракцию II+III постадийно растворяют в 10-25 кратном количестве воды для инъекций (WFI) при температуре от 2 до 25°С и доводят до рН от 4,00 до 5,00 при перемешивании в течение 1 часа или более.

Кроме того, после постадийного растворения в воде для инъекций WFI способ также включает доведение разбавленного раствора с помощью NaOH до рН от 4,80 до 5,80, добавление по каплям октановой кислоты до конечной концентрации от 10 до 30 мМ и затем доведение с помощью NaOH опять до рН от 4,80 до 5,80 с последующим перемешиванием в течение 1 часа или более и фильтрацию с получением прозрачной жидкости после осаждения октановой кислотой.

Кроме того, концентрирование путем ультрафильтрации или разбавление на стадии (4) также включает концентрирование путем ультрафильтрации или разбавление смеси третьего проточного раствора и промывного раствора с получением четвертого раствора белка с содержанием белка от 5 до 100 г/л, добавление от 1 до 5% (масс/масс.) глицина или пролина и доведение рН до от 3,8 до 4,4 перед составлением композиции.

Кроме того, инактивация вирусов включает: фильтрацию через наномембрану 20 нм или 15 нм, объединение и стерилизацию отфильтрованного раствора, а затем инкубацию при 25°С при низком рН с последующим смешиванием и составлением композиции из полученного раствора и наполнение после стерилизации с получением иммуноглобулина для внутривенного введения, или инкубацию при 25°С при низком рН, фильтрацию через наномембрану 20 нм или 15 нм с последующим смешиванием и составлением композиции из отфильтрованного раствора и наполнение после стерилизации с получением иммуноглобулина для внутривенного введения.

Настоящее изобретение имеет следующие преимущества.

После обработки октановой кислотой, трехстадийной хроматографической обработки (хроматография А, хроматография В и хроматография С), или двухстадийной хроматографической обработки (хроматография А и хроматография С), или двухстадийной хроматографической обработки (хроматография В и хроматография С), и затем ультрафильтрации и составления композиции согласно настоящему изобретению, общий выход IgG может достигать 90,9% или выше, чистота составляет 99,9% или выше, общее содержание белка составляет 56,69 г, IgA, IgM и альбумин в конечном продукте полностью удалены, внешний вид и термостабильность имеют соответствующее требованиям качество, осмолярность составляет 285 мосмоль/кг, соответствуя стандартам Китайской фармакопеи (2010). После хроматографической обработки С Анти-А=1:4, Анти-В=1:4, АСА=2%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Описание чертежей

На фиг. 1 приведена схема способа производства иммуноглобулина для внутривенного введения по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на частные воплощения, описанные ниже, для пояснения назначения, технических решений и преимуществ настоящего изобретения. Необходимо отметить, что следующие частные воплощения используют только для пояснения и описания настоящего изобретения и не ограничивают ими настоящее изобретение. Некоторые несущественные улучшения и настройки, сделанные специалистами в данной области техники на основании сущности изобретения, описанной выше, входят в объем защиты настоящего изобретения.

Как известно специалисту в данной области техники, сокращение «WFI» означает «вода для инъекций».

В следующих примерах в таблице 1 приведены показатели качества индикаторов в продуктах иммуноглобулина для внутривенного введения.

Пример 1

Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения осуществляли согласно пути I на схеме способа получения на фиг. 1, включая, в частности, следующие стадии:

(1) обработку образца плазмы от здорового субъекта этанолом при низкой температуре с получением фракции I+II+III, постадийное растворение фракции I+II+III в 10 кратном количестве воды для инъекций (WFI) при температуре 2°С и доведение рН до 4,00 уксусной кислотой при перемешивании в течение 1 часа;

(2) осаждение октановой кислотой: доведение разбавленного раствора с помощью NaOH до рН 4,80, добавление октановой кислоты по каплям до конечной концентрации 10 мМ в течение 40 минут и затем снова доведение с помощью NaOH до рН 4,80 с последующим перемешиванием в течение 1 часа и фильтрацией с помощью рамки с получением прозрачной жидкости после осаждения октановой кислотой;

(3) хроматографию А: подготовка анионной хроматографической колонки Fractogel EMD DEAE путем заполнения анионных гелей Fractogel EMD DEAE в хроматографическую колонку ХК50/30 до высоты 18 см, с загрузкой геля 300 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, концентрирование путем фильтрации прозрачной жидкости, полученной на стадии (2), с получением первого раствора белка с содержанием белка 2 г/л, пропускание первого раствора белка через анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE в условиях хроматографии при рН 4,50, 5 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости 0,5 мСм/см и линейной скорости 60 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(4) хроматографию В: подготовка анионной хроматографической колонки Fractogel EMD ТМАЕ путем заполнения анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ в хроматографическую колонку ХК50/30 до высоты 18 см, с загрузкой геля 300 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, пропускание смеси первого проточного раствора и промывного раствора, полученной на стадии (3), через анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ в условиях второго хроматографии при рН 5,50, 5 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости 0,5 мСм/см и линейной скорости 60 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(5) хроматографию С: подготовка колонки для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix путем заполнения аффинных гелей Eshmuno Ρ Анти-А и аффинных гелей Eshmuno Ρ Анти-В в соотношении 1:2 до высоты 6 см, концентрирование путем ультрафильтрации смеси второго проточного раствора и промывного раствора, полученного на стадии (4), буфером, содержащим ацетат натрия с рН 4,50 и 60 мМ NaCl, с получением второго раствора белка с содержанием белка 20 г/л, диализ путем ультрафильтрации второго раствора белка с обеспечением рН 4,50 с получением таким образом третьего раствора белка, пропускание третьего раствора белка через колонку для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix для аффинной хроматографии с линейной скоростью 60 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(6) составление композиции: проведение диализа путем ультрафильтрации смеси третьего проточного раствора и промывного раствора, полученного на стадии (5), с получением четвертого раствора белка с содержанием белка 5 г/л, добавление 1% (масс./масс.) глицина и доведение до рН 3,8 соляной кислотой с последующей фильтрацией через наномембрану 20 нм со скоростью фильтрации 80,63 г/24 часа, объединение и стерилизация отфильтрованного раствора, а затем инкубация при 25°С при низком рН (рН 3,8) в течение 21 дня с последующим смешиванием и составлением композиции инкубированного раствора, и наполнение после стерилизации с получением концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения.

Всего было получено примерно 56,67 г общего содержания белка и выход продукта составлял 7,06 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции общий выход IgG составлял 88,3%, чистота составляла 99,8%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 281 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составило 99,2%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:8, АСА=10%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 2

Продукт иммуноглобулина для внутривенного введения получали согласно пути II на схеме способа получения на фиг. 1, и стадии были следующими:

(1) обработка образца плазмы от здорового субъекта этанолом при низкой температуре с получением фракции II+III, постадийное растворение фракции II+III 25 кратным количеством воды для инъекций (WFI) при температуре от 25°С и доведение до рН 5,00 соляной кислотой при перемешивании в течение 3 часов;

(2) осаждение октановой кислотой: доведение разбавленного раствора с помощью NaOH до рН 5,80, добавление по каплям октановой кислоты до конечной концентрации 30 мМ в течение 60 минут и затем снова доведение с помощью NaOH до рН 5,80 с последующим перемешиванием в течение 3 часов и фильтрация с помощью рамки с получением прозрачной жидкости после осаждения октановой кислотой;

(3) хроматография А: подготовка анионной хроматографической колонки Fractogel EMD DEAE путем заполнения анионных гелей Fractogel EMD DEAE в хроматографическую колонку ХК50/30 до высоты 23 см, с загрузкой геля 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, концентрирование путем фильтрации прозрачной жидкости, полученной на стадии (2), с получением первого раствора белка с содержанием белка 20 г/л, пропускание первого раствора белка через анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE в условиях первой хроматографии при рН 5,50, 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости 2,0 мСм/см и линейной скорости 150 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(4) хроматография В: подготовка анионной хроматографической колонки Fractogel EMD ТМАЕ путем заполнения анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ в хроматографическую колонку ХК50/30 до высоты 23 см, с загрузкой геля 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей, пропускание смеси первого проточного раствора и промывного раствора, полученного на стадии (3), через анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ в условиях второй хроматографии при рН 6,50, 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости 2,5 мСм/см и линейной скорости 150 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(5) хроматография С: подготовка колонки для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix путем заполнения аффинных гелей Eshmuno Ρ Анти-А и аффинных гелей Eshmuno Ρ Анти-В в соотношении 1:3 до высоты 25 см, концентрирование путем ультрафильтрации смеси второго проточного раствора и промывного раствора, полученной на стадии (4), с буфером, содержащим фосфат натрия при рН 7,30 и 180 мМ NaCl, с получением второго раствора белка с содержанием белка 60 г/л, диализ путем ультрафильтрации второго раствора белка с обеспечением рН 7,30 с получением таким образом третьего раствора белка, пропускание третьего раствора белка через колонку для аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В mix для аффинной хроматографии с линейной скоростью 150 см/ч для уравновешивания и загрузки,

(6) составление композиции: концентрирование путем ультрафильтрации смеси третьего проточного раствора и промывного раствора, полученной на стадии (5), с получением четвертого раствора белка с содержанием белка 100 г/л, добавление 5% (масс./масс.) пролина и доведение до рН 4,4 фосфорной кислотой с последующей инкубацией при 25°С при низком рН (рН 4,4) в течение 19 дней, фильтрация через наномембрану 15 нм со скоростью фильтрации 140 г/24 часа, смешивание и составление композиции из полученного путем нанофильтрации раствора, и наполнение после стерилизации с получением концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения.

Всего было получено примерно 55,56 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,89 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 87,8%, чистота составляла 99,7%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 277 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,1%, Анти-А=1:8, Анти-В=1:16, АСА=12%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 3

Концентрат IgG получали с использованием фракции I+II+III в качестве сырьевого материала согласно пути I на схеме способа получения на фиг. 1 и специфическим стадиям в Примере 1, при этом разница описана ниже.

На стадии (1) фракцию I+II+III постадийно растворяли в 18 кратном количестве воды для инъекций (WFI) при температуре 15°С и доводили рН до 4,35 уксусной кислотой при перемешивании в течение 2 часов.

На стадии (2) разбавленный раствор доводили с помощью NaOH до рН 5,20, по каплям добавляли октановую кислоту до конечной концентрации 22 мМ и перемешивали смесь в течение 2 часов перед фильтрацией.

На стадии (3) загрузка анионных гелей Fractogel EMD DEAE составляла 350 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; прозрачную жидкость концентрировали путем фильтрации до содержания белка 5 г/л; и условия хроматографии на Fractogel EMD DEAE были рН 4,70, 8 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 0,8 мСм/см и линейная скорость 70 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (4) загрузка анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ составляла 350 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; и условия хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ были рН 5,70, 8 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости 0,8 мСм/см и линейная скорость 70 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (5) аффинные гели Eshmuno Ρ Анти-А и аффинные гели Eshmuno Ρ Анти-В заполняли в соотношении 1:1 до высоты 6 см; смесь второго проточного раствора и промывного раствора концентрировали путем ультрафильтрации с буфером, содержащим цитрат натрия при рН 5,0 и 80 мМ NaCl, до содержания белка 30 г/л с последующим диализом путем ультрафильтрации с обеспечением рН, составляющим 5,0; и линейная скорость для уравновешивания и загрузки составляла 70 см/час.

На стадии (6) смесь третьего проточного раствора и промывного раствора концентрировали путем ультрафильтрации до содержания белка 80 г/л, добавляли 3% (масс./масс.) глицина и доводили рН соляной кислотой до 4,1.

Всего было получено примерно 57,21 г общего содержания белка и выход продукта составлял 7,12 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 89,4%, чистота составляла 99,8%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 285 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 98,9%, Анти-А=1:8, Анти-В=1:8, АСА=9%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 4

Концентрат IgG получали с использованием фракции II+III в качестве сырьевого материала согласно пути II на схеме способа получения на фиг. 1 и специфическим стадиям в Примере 2, при этом разница описана ниже.

На стадии (1) фракцию II+III постадийно растворяли в 12 кратном количестве воды для инъекций (WFI) при температуре 6°С и доводили до рН 4,80 уксусной кислотой при перемешивании в течение 2,5 часов.

На стадии (2) разбавленный раствор доводили с помощью NaOH до рН 5,60 и по каплям добавляли октановую кислоту до конечной концентрации 25 мМ.

На стадии (3) загрузка анионных гелей Fractogel EMD DEAE составляла 650 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 22 см; прозрачную жидкость концентрировали путем фильтрации до содержания белка 15 г/л; и условия хроматографии на Fractogel EMD DEAE были рН 5,30, 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,8 мСм/см и линейная скорость 120 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (4) загрузка анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ составляла 650 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 22 см; и условия хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ были рН 6,30, 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,8 мСм/см и линейная скорость 100 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (5) аффинные гели Eshmuno Ρ Анти-А и аффинные гели Eshmuno Ρ Анти-В наполняли в отношении 2:3 до высоты 20 см; смесь второго проточного раствора и промывного раствора концентрировали путем ультрафильтрации с буфером, содержащим 20 мМ цитрата натрия при рН 6,0 и 150 мМ NaCl, до содержания белка 50 г/л с последующим диализом путем ультрафильтрации для обеспечения рН, составляющего 6,00; и линейная скорость для уравновешивания и загрузки составляла 130 см/час.

На стадии (6) смесь третьего проточного раствора и промывного раствора разбавляли до содержания белка 20 г/л, добавляли 4% (масс./масс.) пролина и рН доводили соляной кислотой до 3,9.

Всего было получено примерно 57,27 г общего содержания белка и выход продукта составлял 7,12 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 96% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции общий выход IgG составлял 89,32%, чистота составляла 99,8%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 287 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,5%, Анти-А=1:4, Анти-В=1:8, АСА=7%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 5

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 1, при этом разница описана ниже.

После завершения анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE на стадии (3) напрямую осуществляли аффинную хроматографию на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В на стадии (5).

Всего было получено примерно 55,46 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,94 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 93% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 86,3%, чистота составляла 99,1%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 268 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 98,5%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:8, АСА=12%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 6

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции I+II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 2, при этом разница описана ниже.

После завершения осаждения октановой кислотой на стадии (2) напрямую осуществляли операции хроматографии на стадии (4) и стадии (5).

Всего было получено примерно 54,35 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,85 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 94% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 89,1%, чистота составляла 99,4%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 263 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,2%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:8, АСА=14%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 7

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 3, при этом разница описана ниже.

На стадии (1) получали фракцию II+III и затем растворяли.

На стадии (6) добавляли 3% (масс./масс.) глицина и рН доводили соляной кислотой до 4,1. После этого раствор белка инкубировали при 25°С при низком рН (рН 4,1) в течение 21 дня, отфильтровывали через наномембрану 20 нм с последующим смешиванием и составлением композиции из отфильтрованного раствора и наполнением после стерилизации с получением концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения.

Всего было получено примерно 57,73 г общего содержания белка и выход продукта составлял 7,11 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 97% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 91,3%, чистота составляла 99,9%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, осмолярность составляла 287 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,8%, Анти-А=1:4, Анти-В=1:4, АСА=3%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 8

Концентрат IgG получали с использованием фракции I+II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 4, при этом разница описана ниже.

На стадии (1) получали фракцию I+II+III и затем растворяли.

На стадии (3) загрузка анионных гелей Fractogel EMD DEAE составляла 450 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; прозрачную жидкость концентрировали путем фильтрации до содержания белка 8 г/л; и условия хроматографии на Fractogel EMD DEAE были рН 4,80, 12 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,0 мСм/см и линейная скорость 90 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (4) загрузка анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ составляла 450 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; и условия хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ составляли рН 6,00, 12 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,0 мСм/см и линейная скорость 90 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (5) смесь второго проточного раствора и промывного раствора концентрировали путем ультрафильтрации с буфером, содержащим 10 мМ цитрата натрия с рН 5,30 и 100 мМ NaCl, до содержания белка 35 г/л с последующим диализом путем ультрафильтрации с обеспечением рН, составляющим 5,30; и линейная скорость для уравновешивания и загрузки составляла 90 см/час.

Всего было получено примерно 56,69 г общего содержания белка и выход продукта составлял 7,09 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В и выход IgG после одной стадии составлял 97% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 90,9%, чистота составляла 99,9%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 285 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,9%, Анти-А=1:4, Анти-В=1:4, АСА=2%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 9

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 4, при этом разница описана ниже.

На стадии (3) загрузка анионных гелей Fractogel EMD DEAE составляла 550 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; прозрачную жидкость концентрировали путем фильтрации до содержания белка 10 г/л; и условия хроматографии на Fractogel EMD DEAE составляли рН 5,00, 14 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,2 мСм/см и линейная скорость 100 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (4) загрузка анионных гелей Fractogel EMD ТМАЕ составляла 450 г сыпучего вещества на 400 мл гелей; колонку наполняли анионными гелями до высоты 20 см; и условия хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ были рН 6,00, 12 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 1,0 мСм/см и линейная скорость 90 см/ч для уравновешивания и загрузки.

На стадии (5) смесь второго проточного раствора и промывного раствора концентрировали путем ультрафильтрации с буфером, содержащим 15 мМ цитрата натрия с рН 5,50 и 120 мМ NaCl, до содержания белка 45 г/л с последующим диализом путем ультрафильтрации с обеспечением рН, составляющим 5,50; и линейная скорость для уравновешивания и загрузки составляла 110 см/час.

Всего было получено примерно 55,51 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,96 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 90,1%, чистота составляла 99,8%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 271 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,8%, Анти-А=1:4, Анти-В=1:4, АСА=5%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 10

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 5, при этом разница описана ниже.

На стадии (6) после добавления глицина и регулирования рН, раствор белка инкубировали при 25°С при низком рН (рН 4,4) в течение 20 дней, отфильтровывали через наномембрану 15 нм с последующим смешиванием и составлением композиции из отфильтрованного раствора, и наполнением после стерилизации с получением концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения.

Всего было получено общее содержание белка 55,13 г и выход продукта составлял 6,91 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 93% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 87,5%, чистота составляла 99,2%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 267 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 98,3%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:8, АСА=12%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Всего было получено примерно 53,85 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,81 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 89,6%, чистота составляла 99,7%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 268 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,4%, Анти-А=1:8, Анти-В=1:16, АСА=11%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 11

Конечный продукт концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения получали с использованием фракции I+II+III из плазмы человека в качестве сырьевого материала согласно способу в Примере 6, при этом разница описана ниже.

На стадии (6) после добавления глицина и регулирования рН раствор белка инкубировали при 25°С при низком рН (рН 4,4) в течение 21 дня, отфильтровывали через наномембрану 20 нм с последующим смешиванием и составлением композиции из отфильтрованного раствора, и наполнением после стерилизации с получением концентрата иммуноглобулина IgG для внутривенного введения.

Всего было получено примерно 54,15 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,84 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD ТМАЕ альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 94% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции общий выход IgG составлял 88,7%, чистота составляла 99,6%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 271 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,5%, Анти-А=1:8, Анти-В=1:8, АСА=14%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 12

На стадии (5) использовали одну колонку Eshmuno Ρ Анти-А для аффинной хроматографии, при этом колонку наполняли аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-А до высоты 6 см.

Всего было получено примерно 56,32 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,98 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 88,4%, чистота составляла 99,7%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 277 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,3%, Анти-А=1:8, Анти-В=1:32, АСА=15%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 13

На стадии (5) использовали одну колонку Eshmuno Ρ Анти-В для аффинной хроматографии, при этом колонку наполняли аффинными гелями Eshmuno Ρ Анти-В до высоты 25 см.

Всего было получено примерно 56,11 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,92 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-В, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 88,9%, чистота составляла 99,6%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 272 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,1%, Анти-А=1:32, Анти-В=1:8, АСА=11%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 14

Стадию (5) напрямую осуществляли после завершения стадии (3), на которой использовали одну колонку Eshmuno Ρ Анти-А для аффинной хроматографии и наполняли гели Eshmuno Ρ Анти-А до высоты 6 см.

Всего было получено примерно 55,67 г общего содержания белка и выход продукта составлял 6,88 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А, и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-А, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 89,2%, чистота составляла 99,6%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 278 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,1%, Анти-А=1:4, Анти-В=1:32, АСА=14%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 15

Стадию (4) и стадию (5) напрямую осуществляли после завершения стадии (2), на которой использовали одну колонку Eshmuno Ρ Анти-В для аффинной хроматографии и заполняли гели Eshmuno Ρ Анти-В до высоты 25 см.

Всего было получено примерно 56,31 г общего содержания белка, и выход продукта составлял 6,98 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-В и выход IgG после одной стадии составлял 95% или выше. После хроматографии на DEAE, ТМАЕ, Анти-В, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 89,2%, чистота составляла 99,7%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, и осмолярность составляла 266 мосмоль/кг, соответствуя требованиям стандартов. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 99,2%, Анти-А=1:32, Анти-В=1:4, АСА=9%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 16

Концентрат IgG получали с использованием сырьевого материала и специфического способа, описанного в Примере 1, при этом разница описана ниже.

В хроматографии А на стадии (3) использовали гели Capto Q для подготовки анионной хроматографической колонки, и условия хроматографии были такими же, как в Примере 1.

В хроматографии В на стадии (4) использовали гели CaptoQ ХР для подготовки анионной хроматографической колонки, и условия хроматографии были такими же, как в Примере 1.

Всего было получено примерно 51,16 г общего содержания белка, и выход продукта составлял 6,06 г/л плазмы. После анионной хроматографии на Capto Q альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 90% или выше. После хроматографии на Capto Q, CaptoQ ХР и Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 78,5%, чистота составляла 96,7%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 98,1%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:16, АСА=14%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 17

Концентрат IgG получали с использованием сырьевого материала и специфического способа, описанного в Примере 2, при этом разница описана ниже.

В хроматографии А стадии (3) гели UNO sphere Q использовали для приготовления анионной хроматографической колонки, и условия хроматографии были такими же, как в Примере 2.

В хроматографии В на стадии (4) гели Nuvia HR Q использовали для приготовления анионной хроматографической колонки, и условия хроматографии были такими же, как в Примере 2.

Всего было получено примерно 50,83 г общего содержания белка, и выход продукта составлял 5,98 г/л плазмы. После анионной хроматографии на UNO sphere Q альбумин, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора были полностью удалены. После аффинной хроматографии на Eshmuno Ρ Анти-А/Анти-В продукт демонстрировал прекрасный эффект удаления анти-А и анти-В, и выход IgG после одной стадии составлял 90% или выше. После хроматографии на UNO sphere Q, Nuvia HR Q и Анти-А/Анти-В mix, ультрафильтрации и составления композиции выход IgG составлял 77,6%, чистота составляла 95,9%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены. Соотношение молекул мономера и димера IgG составляло 98,2%, Анти-А=1:16, Анти-В=1:16, АСА=13%, РКА<10 МЕ/мл, что соответствует требованиям Китайской фармакопеи (2010).

Пример 18

Конечный продукт концентрата IgG получали в масштабе пилотной установки, используя фракцию I+II+III согласно пути на схеме способа производства на фиг. 1 и специфические операции стадий в Примере 1. Статистика выхода показана в таблице 2.

Сравнительный пример 1

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 1, при котором содержание белка возрастало до 30 г/л и загрузка геля увеличивалась до 800 г сыпучего вещества на 400 мл гелей. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора не были удалены полностью, составляя от 2 до 5% остатка IgM и IgA в продукте.

Сравнительный пример 2

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 2, при котором условия хроматографии на стадии (3) были рН 6,50, 25 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость 3,0 мСм/см и линейная скорость 170 см/ч для уравновешивания и загрузки. После анионной хроматографии на Fractogel EMD DEAE, IgA и IgM в смеси проточного раствора и промывного раствора не были удалены полностью, составляя от 3 до 6% остатка IgM и IgA в продукте.

Сравнительный пример 3

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 5, при котором на стадии (5) смесь второго проточного раствора и промывного раствора, полученную на стадии (4), концентрировали путем ультрафильтрации с буфером, содержащим ацетат натрия с рН 4,20 и 60 мМ NaCl, до содержания белка 80 г/л. Общий выход IgG составил 68,3%; A1b, IgA и IgM были полностью удалены; Анти-А=1:32, Анти-В=1:16; и осмолярность не может соответствовать требованиям Китайской фармакопеи (2010) при наличии естественной кристаллизации, видимой невооруженным глазом.

Сравнительный пример 4

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 6, при котором на стадии (5) смесь второго проточного раствора и промывного раствора, полученную на стадии (4), разбавляли буфером, содержащим фосфат натрия с рН 4,10 и 180 мМ NaCl, до содержания белка 10 г/л. Общий выход IgG составил 57,1%; A1b, IgA и IgM были полностью удалены; Анти-А=1:32, Анти-В=1:16; и осмолярность не может соответствовать требованиям Китайской фармакопеи (2010) при наличии естественной кристаллизации, видимой невооруженным глазом.

Сравнительный пример 5

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 1, при котором стадию (6) составления композиции конечного продукта осуществляли напрямую после завершения стадии (4), без стадии (5). Общий выход IgG составил 87,5%, A1b, IgA и IgM были полностью удалены, а Анти-А=1:64, Анти-В=1:128 не соответствовали стандарту Китайской фармакопеи (2010).

Сравнительный пример 6

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 7, при котором на стадии (5) буфер для хроматографии представлял собой 10 мМ раствор фосфатного буфера (PBS) с рН 4,00 и 80 мМ NaCl. Общий выход IgG составил 87,5%; A1b, IgA и IgM были полностью удалены; Анти-А=1:4, Анти-В=1:4; и осмолярность не может соответствовать требованиям Китайской фармакопеи (2010) при наличии естественной кристаллизации, видимой невооруженным глазом.

Сравнительный пример 7

Конечный продукт IgG концентрата для внутривенного введения получали с использованием сырьевого материала и способа в Примере 8, при котором на стадии (2) по каплям добавляли октановую кислоту в разбавленный раствор до конечной концентрации 5 мМ в течение 40 минут с последующей фильтрацией под давлением и последующей обработкой, приводящей к уплотнению слоя гелей Fractogel EMD DEAE.

Claims

1. Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий стадии:

(2) осаждения октановой кислотой: осаждение фракции I+II+III или фракции II+III октановой кислотой с последующей фильтрацией с получением прозрачной жидкости,

хроматография А: концентрирование путем фильтрации прозрачной жидкости с получением первого раствора белка с содержанием белка от 2 до 20 г/л, затем пропускание первого раствора белка через анионную хроматографическую колонку А в условиях первой хроматографии при рН от 4,50 до 5,50, от 5 до 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,5 до 2,0 мСм/см и линейной скорости от 60 до 150 см/ч для уравновешивания и загрузки,

хроматография В: пропускание смеси первого проточного раствора и промывного раствора через анионную хроматографическую колонку В в условиях второй хроматографии при рН от 5,50 до 6,50, от 5 до 20 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимости от 0,5 до 2,5 мСм/см и линейной скорости от 60 до 150 см/ч для уравновешивания и загрузки,

хроматография С: концентрирование путем ультрафильтрации смеси второго проточного раствора и промывного раствора с буфером, содержащим ацетат, или цитрат, или фосфат с рН от 4,50 до 7,30 и NaCl, с получением второго раствора белка с содержанием белка от 20 до 60 г/л, диализ путем ультрафильтрации второго раствора белка с обеспечением рН, соответствующего буферу, с получением таким образом третьего раствора белка, пропускание третьего раствора белка через колонку С для аффинной хроматографии в условиях аффинной хроматографии, включающих линейную скорость от 60 до 150 см/ч в условиях буфера для уравновешивания и загрузки,

причем анионная хроматографическая колонка А включает анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE, анионную хроматографическую колонку Capto Q или анионную хроматографическую колонку UNO sphere Q,

анионная хроматографическая колонка В включает анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ, анионную хроматографическую колонку Capto Q ХР или анионную хроматографическую колонку Nuvia HR Q и

колонка С для аффинной хроматографии включает колонку для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-А/Анти-В mix, колонку для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-А или колонку для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-В, и

(4) концентрирования путем ультрафильтрации или разбавления, инактивации вирусов, составления композиции и наполнения с получением иммуноглобулина для внутривенного введения.

2. Способ по п. 1, в котором анионная хроматографическая колонка А в хроматографии А наполнена анионными гелями до высоты от 18 до 23 см и имеет загрузку геля от 300 до 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

3. Способ по п. 1, в котором анионная хроматографическая колонка В в хроматографии В наполнена анионными гелями до высоты от 18 до 23 см и имеет загрузку геля от 300 до 700 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

4. Способ по п. 1, в котором колонка для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-А/Анти-В mix, колонка для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-А или колонка для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-В в хроматографии С наполнена аффинными гелями Eshmuno P Анти-А и/или аффинными гелями Eshmuno P Анти-В до высоты от 5 до 25 см, причем

колонка для аффинной хроматографии Eshmuno P Анти-А/Анти-В mix наполнена аффинными гелями Eshmuno P Анти-А и аффинными гелями Eshmuno P Анти-В в соотношении от 1 до 2 к от 2 до 3.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором в хроматографии В смесь первого проточного раствора и промывного раствора подвергают регулированию рН с помощью буфера, выдерживают при температуре от 2 до 8°С в течение 1 часа или более и отфильтровывают с получением надосадочной жидкости перед пропусканием через анионную хроматографическую колонку В.

6. Способ по любому из пп. 1-4, в котором перед выделением из плазмы фракции I+II+III или фракции II+III на стадии (1) способ также включает обработку плазмы здорового человека этанолом при низкой температуре с получением фракции I+II+III или фракции II+III.

7. Способ по п. 6, в котором после получения фракцию I+II+III или фракцию II+III постадийно растворяют в 5-25-кратном количестве воды для инъекций (WFI) при температуре от 2 до 25°С и доводят до рН от 4,00 до 5,00, после чего перемешивают в течение 1 часа или более.

8. Способ по п. 7, в котором после постадийного растворения в WFI способ также включает доведение разбавленного раствора с помощью NaOH до рН от 4,80 до 5,80, добавление по каплям октановой кислоты до конечной концентрации от 10 до 30 мМ и затем доведение рН с помощью NaOH снова до от 4,80 до 5,80 с последующим перемешиванием в течение по меньшей мере 1 часа и фильтрацию с получением прозрачной жидкости после осаждения октановой кислотой.

9. Способ по п. 1, в котором концентрирование путем ультрафильтрации или разбавление на стадии (4) также включает концентрирование путем ультрафильтрации или разбавление смеси третьего проточного раствора и промывного раствора с получением четвертого раствора белка с содержанием белка от 5 до 100 г/л, добавление от 1 до 5% масс./масс. глицина или пролина и доведение до рН от 3,8 до 4,4 перед составлением композиции.

10. Способ по п. 1, в котором инактивация вирусов на стадии (4) включает: фильтрацию через наномембрану 20 нм или 15 нм, объединение и стерилизацию отфильтрованного раствора и после этого инкубацию при 25°С при низком рН с последующим смешиванием и составлением композиции из полученного раствора и наполнение после стерилизации с получением иммуноглобулина для внутривенного введения или

инкубацию при 25°С при низком рН, фильтрацию через наномембрану 20 нм или 15 нм с последующим смешиванием и составлением композиции из отфильтрованного раствора и наполнение после стерилизации с получением иммуноглобулина для внутривенного введения.

11. Способ по п. 1, в котором концентрация октановой кислоты на стадии (2) составляет от 10 до 30 мМ.

12. Способ по п. 11, в котором концентрация октановой кислоты на стадии (2) составляет от 22 до 25 мМ.

13. Способ по п. 1, в котором

в хроматографии А на стадии (3):

первый раствор белка имеет содержание белка от 5 до 15 г/л,

анионная хроматографическая колонка А представляет собой анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD DEAE,

условия первой хроматографии включают: рН от 4,70 до 5,30, от 8 до 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость от 0,8 до 1,8 мСм/см и линейную скорость от 70 до 120 см/ч для уравновешивания и загрузки;

в хроматографии В на стадии (3):

анионная хроматографическая колонка В представляет собой анионную хроматографическую колонку Fractogel EMD ТМАЕ,

условия второй хроматографии включают: рН от 5,70 до 6,30, от 8 до 16 мМ натрий-ацетатного буфера, проводимость от 0,8 до 1,8 мСм/см и линейную скорость от 70 до 100 см/ч для уравновешивания и загрузки;

в хроматографии С на стадии (3):

второй раствор белка имеет содержание белка от 30 до 50 г/л,

буфер содержит от 5 до 20 мМ ацетата, или цитрата, или фосфата с рН от 5,00 до 6,00 и от 80 до 150 мМ NaCl и

условия аффинной хроматографии включают линейную скорость от 70 до 130 см/ч для уравновешивания и загрузки в условиях буфера.

14. Способ по п. 1, в котором составление композиции на стадии (4) проводят при использовании глицина или пролина.

15. Способ по п. 2, в котором в хроматографии А на стадии (3) загрузка геля составляет от 450 до 550 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

16. Способ по п. 3, в котором в хроматографии В на стадии (3) загрузка геля составляет от 450 до 550 г сыпучего вещества на 400 мл гелей.

17. Способ по п. 4, в котором в колонке для аффинной хроматографии С аффинные гели Eshmuno P Анти-А и/или аффинные гели Eshmuno P Анти-В наполнены до высоты от 6 до 20 см.