KR20150084836A - 벤조나아제 부재 하의 시나지스 분리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조성물로부터 항체를 분리하는 방법을 대상으로 한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 시나지스(Synagis®, 팔리비주맙)를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 것을 포함하고, 이때, 이 방법은 (i) 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및 (iii) 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기를 포함하며, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.

Description

벤조나아제 부재 하의 시나지스 분리 방법{METHOD OF ISOLATING SYNAGIS® IN THE ABSENCE OF BENZONASE}
본 출원은 2013년 11월 4일 작성되고 10킬로바이트 크기의 "RSVAB-300P1_SequenceListing_ST25.txt"라는 제목으로 보관된 ASCII 텍스트 파일로서 미국 특허청에 EFS 웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 전자적으로 제출된 이러한 서열 목록은 37 CFR §1.821(c)에 의해서 요구된 서류 사본 및 §1.821(e)에 의해서 요구된 컴퓨터로 판독 가능한 형태로서 기능한다. 서열 목록에 포함된 정보는 본 출원에 참조로 포함된다.
본 발명은 조성물로부터 항체를 분리하는 방법을 대상으로 한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 시나지스(Synagis®, 팔리비주맙)를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 것을 포함하고, 이때, 이 방법은 (i) 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및 (iii) 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기를 포함하며, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
항체는 다양한 질병 및 병태의 치료에 이용되었으며, 일반적으로 진핵 또는 원핵 세포주를 이용한 세포 배양으로부터 유래된다. 그러나 약학적 응용 분야에 이용되는 항체는 특히 세포 단백질 오염물질, 세포 DNA 오염물질, 바이러스 및 기타 전염성 물질을 포함한 세포 배양으로부터의 오염물질과 관련하여, 높은 수준의 순도를 나타내야 한다. "WHO Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals: Requirements for Biological Substances No. 50." No. 878. Annex 1, 1998 참조.
오염물질에 대한 우려에 대해, 세계 보건 기구(WHO)는 다양한 오염물질의 수준에 대한 한계를 설정했다. 예를 들어, WHO는 단백질 제품에 대해 용량당 10 ng 미만의 DNA 한계를 권장했다. 마찬가지로, 미국 식품의약관리국(FDA)은 0.5 pg/mg 단백질 이하의 DNA 한계를 설정했다.
약학적으로 허용 가능한 항체에 필요한 원하는 순도 수준을 달성하기 위하여, 항체를 분리하는 다양한 방법들이 보고된 바 있다. 이러한 방법들은 전형적으로 여러 단계들을 수반하며, 정부의 규제 지침에 부합하는 순도 수준을 달성하기 위하여 다른 세포 생성물 및 오염물질 외에도 숙주 세포 DNA를 제거한다고 보고한다. 분리 단계는 분리되는 항체의 특징, 생성되는 양, 발현 시스템 및 성장 배지를 포함한 다양한 인자들에 따라 달라진다. 그러나 일반적으로 이러한 분리 공정은 몇 가지만 언급하자면, 항체를 발현시키는 데 이용된 세포의 초기 용해, DNA 분해 단계, 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 바이러스 제거 단계 및 여과 단계를 수반한다.
필요한 순도를 보장하는 공정들은 비싸고 시간 소모가 클 수 있다. 따라서 경제적으로 효율적인 정제 방법의 개발은 약학 및 생명공학 산업에서 중요도가 점점 커지고 있다.
본 발명은 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 대상으로 한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 시나지스(Synagis®, 팔리비주맙)를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 것을 포함하고, 이때, 이 방법은 (i) 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및 (iii) 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기를 포함하며, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 조성물에 외인성 뉴클레아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 것을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 조성물을 4.0 미만의 pH에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 단백질 A 정제 공정을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 공정은 양이온 교환 크로마토그래피 공정이다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 공정은 항체를 캡토(Capto) S, S-세파로오스(Sepharose) FF, 및 포로스(Poros) 50 HS로 이루어지는 군으로부터 선택된 양이온 수지 사이로 통과시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 제2의 이온 교환 공정을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 이온 교환 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 공정이다.
일부 구현예에서, 이러한 음이온 교환 공정은 항체를 수퍼(Super) Q, 나트릭스(Natrix) Q, 크로마조브(Chromasob) Q 및 머스탱(Mustang) Q로 이루어지는 군으로부터 선택된 음이온성 막 사이로 통과시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 최종 생성물은 >80% (몰/몰)의 항체 수율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 최종 생성물의 DNA 농도는 ≤ 200 ng/mg이다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 면역된 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상층액, 재조합 세포주 배양으로부터 유래된 적응용 배지 및 면역 글로불린 생산 세포의 세포 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 생물반응기로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 100리터를 초과하는 부피를 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 1000리터를 초과하는 부피를 나타낸다.
일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 이온 교환 공정 후에 일어난다. 일부 구현예에서, 여과 공정은 친화도 공정 후에 일어난다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 것을 포함하고, 이때, 이 방법은 (i) 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여, 항체를 포함하는 제1 생성물을 형성하기; (ii) 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충 생성물을 형성하기; (iii) 완충 생성물에 친화도 정제 공정을 수행하여, 항체를 포함하는 제2 생성물을 형성하기; (iv) 제2 생성물에 여과 공정을 수행하여, 항체를 포함하는 제3 생성물을 형성하기; (v) 제3 생성물에 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및 (vi) 제3 생성물을 제형화하여 최종 생성물을 형성하기를 포함하며, 이때, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 것을 포함하고, 이때, 이 방법은 아래 열거된 (i)~(v) 중 적어도 세 가지를 포함하며: (i) 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; (iii) 조성물에 대해 한외 여과 공정을 수행하기; (iv) 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및 (v) 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; 이때, (i)~(v) 중 적어도 세 가지로부터 발생된 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하며, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내고; 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
도 1은 실시예 1에 기술된 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 공정을 개략적으로 나타낸 것이다. 이러한 공정은 양이온 교환 크로마토그래피 공정, 트리스/염화 마그네슘 완충액 첨가, 단백질 A 크로마토그래피 공정, 나노 여과, 낮은 pH 처리 및 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 포함한다.
도 2는 실시예 2에 기술된 공정을 개략적으로 나타낸 것이다. 좌측 컬럼은 양이온 크로마토그래피 공정 후에 DNA가 첨가되거나 "소량 첨가된(spiked)" 분리 공정을 나타낸다. 우측 컬럼은 낮은 pH 처리 공정 후에 DNA가 소량 첨가된 분리 공정을 나타낸다.
본 발명은 부분적으로는, 벤조나아제의 부재 하에서, 항체 또는 이의 단편을 분리하는 방법의 개발을 기초로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이러한 방법은 분리된 항체를 제공하며, 이러한 방법은 (i) 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및 (iii) 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기를 포함하고, 이때, 최종 생성물이 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 8.0을 초과하는 등전점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 9.0을 초과하는 등전점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 비용을 감소시키거나, 방법 단계를 감소시키거나, 실수할 기회를 줄이거나, 안전하지 못하거나 부적절한 첨가제 등을 도입할 기회를 줄이거나, 벤조나아제 첨가를 생략하거나, 또는 일부 구현예에서는 임의의 외인성 뉴클레아제의 첨가를 생략하거나 하여, 제조업자가 더욱 효율적인 방식으로 인간에 투여하기에 적합한 항체 약학적 생성물을 제조할 수 있게 한다. 본 발명에서, 항체는 인간에 투여하기에 적합한 항체의 분리 공정 중에 이미 첨가되었던 벤조나아제의 첨가 없이 분리될 수 있다. 벤조나아제는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)로부터 유래된, 유전적으로 조작된 2개의 서브유닛(각각 30 kDA)의 엔도뉴클레아제인 벤조나아제(Benzonase®) 뉴클레아제(Merck KGaA, 영국)를 지칭하는데, 이는 모든 형태의 DNA와 RNA(단일 가닥, 이중 가닥, 선형 및 원형)를 분해한다. 예컨대, 본 출원에 전체가 포함되는, 벤조나아제 제품 시트 및 미국 특허 번호 5,173,418호 참조.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 분리 공정 중에 조성물에 외인성 뉴클라아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 외인성 뉴클레아제는 분리되는 항체를 포함하는 조성물의 외부로부터 유래되거나 생겨나는 임의의 뉴클레아제의 첨가를 지칭한다. 따라서 용어 외인성 뉴클레아제는 항체를 포함하는 조성물에 단백질 형태로 첨가된 임의의 뉴클레아제를 포함할 것이다. 외인성 뉴클레아제는 또한 조성물의 외부로부터 유래되거나 생겨나는 유전 물질, 예컨대, 유전자 변형된 생물체로부터 발현된 임의의 뉴클레아제를 포함할 것이며, 이때, 유전자 변형은 뉴클레아제를 암호화하고 발현시킬 수 있는 유전 물질의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기술된 방법은 엔도뉴클레아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기술된 방법은 엑소뉴클레아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
본 출원에 기술된 방법은 조성물로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하는 공정을 제공하는데, 이때, 이러한 조성물은 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함한다. 용어 "분리하다(isolate)" 및 "분리(isolating, isolation)"는 조성물 내의 불순물 또는 다른 오염물질로부터 항체를 분리하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%(w/w)의 불순물이 항체로부터 정제된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체, 예컨대, 시나지스의 정제는 조성물에 본래 존재하는 숙주 세포 단백질의 99%(w/w)로부터 항체를 분리하는 것을 포함할 것이다.
일부 구현예에서, 용어 "분리하다" 및 "분리"는 정부 기관, 예컨대, 세계 보건 기구 또는 미국 식품의약관리국의 지침에 부합하는 정도로 조성물 내의 불순물 또는 다른 오염물질로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "분리"는 최종 생성물이 ≤ 0.5 pg DNA/단백질 mg을 포함하는 정도까지 조성물로부터 DNA를 제거하는 것을 지칭할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "조성물"은 항체, 예컨대, 시나지스와 하나 이상의 화합물, 생물학적 물질 및 또는 관심 항체와는 별개인 임의의 다른 분자의 혼합물을 지칭한다. 편의의 목적상, 관심 항체 이외의 조성물의 모든 요소(예컨대, 화합물, 생물학적 물질, 및 또는 관심 항체와는 별개인 임의의 다른 분자)는 "불순물"로 일컬어질 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 생물학적, 세포성 숙주 생물체(예컨대, 포유동물 세포)와, 숙주 세포를 증식시키고 항체를 발현시키거나 생성하도록 하기에 충분한 성장 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 불순물은 관심 항체의 다합체(예컨대, 이합체, 삼합체 등)를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 불순물은 원치 않는 절단된 형태의 항체 또는 응집된 형태(예컨대, 잘못 접히거나 변성된 형태)의 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "조성물"은 본 발명의 방법 중에 다양한 변형을 거칠 수 있다. 예를 들어, 방법의 시작 시에 조성물은 상대적으로 낮은 농도의 항체를 고농도의 불순물과 함께 포함할 수 있다. 방법이 진행됨에 따라, 하나 이상의 불순물의 농도는 감소될 수 있고/있거나, 항체의 농도는 조성물 내에서 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 불순물은 온전한 포유동물 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포) 또는 쥐 골수 세포(NSO 세포)), 또는 부분적인 세포, 예컨대, 세포 파편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 불순물은 단백질(예컨대, 가용성 또는 불용성 단백질, 또는 숙주 세포 단백질로부터 유래된 것과 같은 단백질 단편), 지질(예컨대, 세포벽 물질), 핵산(예컨대, 염색체 DNA 또는 염색체외 DNA), 리보핵산(t-RNA 또는 mRAN), 또는 이의 조합, 또는 관심 항체와는 상이한 임의의 다른 세포 파편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 불순물은 관심 항체, 예컨대, 시나지스를 생산하거나 함유했던 숙주 생물체로부터 생겨날 수 있다. 예를 들어, 불순물은 관심 단백질을 발현했던 원핵 또는 진핵 세포의 세포 성분(예컨대, 세포벽, 세포 단백질, DNA 또는 RNA 등)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 불순물은 숙주 생물체로부터 유래되지 않는다. 예컨대, 불순물은 세포 배양 배지 또는 성장 배지, 완충액, 또는 배지 첨가물로부터 유래될 수 있다. 본 출원에 사용된 불순물은 단일한 원치 않는 성분, 또는 몇 가지 원치 않는 성분들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 면역된 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상층액, 재조합 세포주 배양으로부터 유래된 적응용 배지 및 면역 글로불린 생산 세포의 세포 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 항체는 성장 배지 및 다양한 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포를 포함하는 조성물로부터 분리될 수 있다. 당업자라면 관심 항체의 상세 사항에 따라 적절한 세포주를 선택할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 포유동물 세포를 포함한, 본 발명의 포유동물 세포는 배양액 내에서 성장할 수 있는 임의의 포유동물 세포이다. 예시적인 포유동물 세포는 예컨대, CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1, MDCK, 293, 3T3, C127, PC12, HEK-293, PER C6, Sp2/0, NSO, W138 세포 및 골수종 세포주(특히 쥣과)를 포함한다. 전술한 세포들 중 임의의 것으로부터 유래된 포유동물 세포 또한 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 배양 배지, 또는 배양 배지로부터 생겨나는 농축된 세포들을 포함한다. 배양 배지의 선택 및 이용은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 세포 배양 배지이다. 세포 배양 배지는 증식되는 세포 배양물의 유형에 따라 다르다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 상업적으로 이용 가능한 배지이다. 일부 구현예에서, 조성물은 무기 염, 탄수화물(예컨대, 글루코오스, 갈락토오스, 말토오스 또는 프룩토오스와 같은 당류) 아미노산, 비타민(예컨대, B군 비타민(예컨대, B12)), 비타민 A 비타민 E, 리보플라빈, 티아민 및 비오틴), 지방산 및 지질(예컨대, 콜레스테롤 및 스테로이드), 단백질 및 펩타이드(예컨대, 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴 및 페투인), 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 신생 송아지 혈청 및 말 혈청과 같이, 알부민, 성장 인자 및 성장 억제제를 포함하는 조성물), 미량 원소(예컨대, 아연, 구리, 셀레늄 및 트리카르복시산 중간물질) 및 이의 조합을 함유하는 배양 배지를 포함한다. 성장 배지의 예로는 기본 배지(예컨대, MEM, DMEM, GMEM), 복합 배지(RPMI 1640, 이스코브 DMEM, 레이보비츠 L-15, 레이보비츠 L-15, TC 100), 무혈청 배지(예컨대, CHO, Ham F10 및 유도체, Ham F12, DMEM/F12)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배양 배지에서 발견되는 흔한 완충액으로는 PBS, 행크 BSS, 얼 염(Earles salt), DPBS, HBSS 및 EBSS를 포함한다. 포유동물 세포를 배양하기 위한 배지는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 시그마 알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation, 미국 미주리 주 세인트루이스), 하이클론(HyClone, 미국 유타 주 로건), 인브트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아 주 칼스배드), 캠브렉스 코포레이션(Cambrex Corporation, 미국 뉴저지 주 E. 러더포드), JRH 바이오사이언스(JRH Biosciences, 미국 캔자스 주 렉세나), 어바인 사이언티픽(Irvine Scientific, 미국 캘리포니아 주 산타아나) 및 기타로부터 입수 가능하다. 배양 배지에서 발견되는 기타 성분들은 아스코르브산염, 시트르산염, 시스테인/시스틴, 글루타민, 엽산, 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 리포익산, 올레산, 팔미트산, 피리독살/피리독신, 리보플라빈, 셀레늄, 티아민, 트랜스페린을 포함할 수 있다. 당업자는 배양 배지에 대한 변형이 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 해당함을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 소 산물, 예컨대, 혈청 알부민, 트랜스페린, 지질단백질 분획 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소 해면상 뇌증(BSE) 전염 위험은 미국 농무부와 유럽 공동체가 BSE 불포함으로 간주한 공급원으로부터 소 산물을 입수함으로써 감소된다.
용어 항체는 다클론, 단일 클론, 다중 특이적, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항유전자형(항-Id) 항체 및 위의 것들 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 “항체”는 단일 클론성 항체를 지칭한다. 용어 “항체”는 또한 면역 글로불린 분자 및 면역 글로불린 분자들, 즉, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 자리를 함유하는 분자들의 면역적으로 활성을 나타내는 부분을 지칭한다. 본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 면역 글로불린 분자들은 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 하위 클래스의 면역 글로불린 분자일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 항체는 IgG 또는 IgA이고, 가장 바람직하게는 IgG이다.
일부 구현예에서, 분리되는 항체는 시나지스(Synagis®)이다. 시나지스(메디뮨(MedImmune))은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F(융합) 단백질의 A 항원성 자리의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 재조합 인간화(키메라 쥐-인간) IgG1카파 단일 클론성 항체 당단백질이다. 팔리비주맙은 안정적인 쥣과(마우스) 골수종 세포주(NSO)로부터 발현될 수 있다. 일부 상업적인 구현예에서, 시나지스는 두 개의 중쇄(각각 50.6 kDa)와 두 개의 경쇄(각각 27.6 kDa)로 이루어지며, 중량 기준 1~2%의 탄수화물을 함유하고,
Figure pct00001
의 분자량(MALDI-TOF)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1을 나타내는 중쇄와 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄를 가지고 있다. 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 중쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 부위 또는 중쇄 FAB 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO: 3)을 나타내는 중쇄 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO: 4)을 나타내는 중쇄 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO: 5)을 나타내는 중쇄 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO: 7)을 나타내는 경쇄 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO: 8)을 나타내는 경쇄 L2 CDR 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 경쇄 L3 CDR을 포함한다. 시나지스 항체 및 그 아미노산 서열은 예를 들어, Johnson 등(1997, J. Infec. Dis; 76:1215-1224) 및 미국 특허 5,824,307호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 분리되는 항체는 아달리무맙(휴미라(Humira®), 애보트래버러토리즈(Abbott Laboratories)), 에쿨리주맙(솔리리스(Soliris®), 알렉시온 파마큐티컬즈(Alexion Pharmaceuticals)), 리툭시맙(리티잔(Ritixan®), 로슈(Roche)/바이오젠 아이덱(Biogen Idec)/쥬가이(Chugai)), 인플릭시맙(레미케이드 (Remicade®), 존슨앤드존슨(Johnson & Johnson)/쉐링-플라우(Schering-Plough)/타나베(Tanabe)), 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin®), 로슈/쥬가이), 베바시주맙(아바스틴(Avastin®), 쥬가이/로슈), 팔리비주맙(시나지스(Synagis®), 메디뮨/애보트), 알렘투주맙(캠퍼스(Campath®), 젠자임(Genzyme)) 및 모타비주맙(뉴맥스(Numax®), 메디뮨)으로 이루어지는 군으로부터 선택된, 상이한, 상업적으로 이용 가능한 항체이다.
일부 구현예에서, 분리되는 항체는 8.0을 초과하는 등전점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 높은 등전점을 나타내는 항체들은 산성 핵산들과 공동 정제되는 경향이 있을 수 있다. 관심 있는 항체와 함께 공동 정제되는 DNA의 성향 때문에, 그리고 최종 생성물에서 미량의 DNA를 제거하기 위하여, 효소적 소화가 DNA 감소 단계로서 전통적으로 활용되었다. 본 발명자들은 본 출원에 기술된 방법들이 벤조나아제 사용 또는 일부 구현예에서 임의의 뉴클레아제의 사용을 생략하면서도 항체 조성물에서 DNA를 정부 규제에 부합하는 수준까지 제거하기에 충분하다는 점을 발견했다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 8.5 초과, 9.0 초과, 9.5 초과, 또는 10.0 초과의 등전점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 8.0~13.0, 8.5~12.0, 8.7~11.0 또는 9.0~10.0의 등전점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 약 9.0을 초과하는 등전점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 9.0을 초과하는 등전점을 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 방법은 항체를 포함하는 조성물로부터 9.0을 초과하는 등전점을 나타내는 항체를 분리하는 것을 포함하며, 이러한 방법은 (i) 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및 (iii) 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기를 포함하고, 이때, 최종 생성물은 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내고, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 시나지스 이외의 항체들이 분리된다. 항체들은 또한 키메라, 단일 사슬 및 인간화 항체를 포함한다. 항체의 예로는 나탈리주맙(인간화 항-a4 인테그린 단일 클론성 항체)과 같은 상업화된 항체, 인간화 항-알파 V 베타 6 단일 클론성 항체, 인간화 항-VLA1 IgG1 카파 단일 클론성 항체; huB3F6(인간화 IgG1/카파 단일 클론성 항체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 CD-3, CD-4, CD-8, CD-19, CD-20, CD-34, CD-52, HER-4, HER-3, HER-2, TNF 및/또는 VLA-4에 대한 재조합 단일 클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 RSV의 F 단백질의 A 항원성 자리의 에피토프에 대한 재조합 단일 클론성 항체이다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 항체는 인간, 쥐(예컨대, 마우스와 랫트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭이다. 본 출원에 사용된 “인간” 항체는 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 나타내는 항체를 포함하고, 인간 면역 글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 대해 이식 유전자를 가진 동물로부터 분리되며 내인성 면역 글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다. 예컨대, Kucherlapati 등의 미국 특허 번호 5,939,598 참조.
본 발명에 따라 생성되고 이용되는 항체는 예컨대, 고유 항체, 온전한 단일 클론성 항체, 다클론성 항체, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중 특이적인 항체(예컨대, 이중 특이적 항체), 항체 단편(예컨대, 하나 이상의 항체와 결합하고/결합하거나 인식하는 항체 단편), 인간화 항체, 인간 항체(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,591,669 and 5,545,807), 항체 파지 라이브러리로부터 분리된 항체 및 항체 단편(McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 정제된 항체는 N 말단 또는 C 말단의 이종 폴리펩티드에 재조합으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유적 및 비공유적 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 정제된 항체는 검출 분석법에서 라벨로서 유용한 분자들 및 이종 폴리펩티드, 약물, 또는 독소와 같은 주효체(effector) 분자들에 재조합으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예컨대, PCT 공개문 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 번호 5,314,995; 및 EP 396,387 참조.
본 발명에 따르면, 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 세포 배양물에서 성장시킨, 살아있는 세포에 의해 생산 또는 발현될 수 있다. 본 출원에 사용된 용어 "발현하다" 또는 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들어, 항체와 같은 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 발현은 제한 없이, 유전자 넉다운(knockdown)뿐만 아니라 일시적인 발현과 안정적인 발현을 포함하는, 세포 내에서의 유전자 기능 존재에 대한 임의의 발현을 포함한다. 발현은 제한 없이, 유전자의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사 및 그러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역을 포함할 수 있다. 따라서, 발현은 항체 및 임의의 전구 물질의 생성을 포함할 수 있다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산할 수 있는데, 이때, 유전자 산물은 핵산, 예컨대, 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본 출원에 기술된 유전사 산물은 전사 후 변형, 예컨대, 폴리아데닐화가 있는 핵산, 또는 예컨대, 메틸화, 글리코실화, 지질 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 단백질 가수분해성 절단 등의 번역 후 변형이 있는 폴리펩티드를 더 포함한다. 항체는 또한 세포에 의해, 예컨대, 세포의 대사 작용에 의해 생산된 대사물질, 예를 들어, 작은 분자에 의해 생산될 수 있다. 용어 "생산된"은 위에 기술된 바와 같이 "발현" 및 세포가 관심 있는 생물 물질을 생성하는 다른 방법을 포함한다.
항체의 분리 방법은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 수단, 예컨대, 몇 가지만 언급하자면, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 여과 및 위의 조합을 포함할 수 있다. 정제 방법은 일반적으로 조성물 내에 항체와 공존하는 하나 이상의 불순물로부터 항체를 구분하는 항체의 특징을 기초로 하여 선택된다. 그러나 본 출원에 제공된 방법에 따르면, 벤조나아제는 분리 공정에서 임의의 시점에 첨가되거나 발현되지 않는다.
본 출원에 기술된 방법은 조성물에서 하나 이상의 불순물로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피 공정을 활용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 모두를 지칭한다. 본 출원의 목적을 위하여, "양이온 교환 크로마토그래피"는 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물이 양이온 교환 매트릭스를 이용하여 전하 차이를 기초로 분리될 수 있는 임의의 방법을 지칭한다. 양이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유적으로 결합된, 음으로 하전된 기들을 포함한다. 약한 또는 강한 양이온 교환 수지가 이용될 수 있다. 흔히, 강한 양이온 교환 수지는 pH에 따라 설폰산 또는 설폰산염 기를 포함하는 지지된 유기성 기들을 포함한다. 약한 양이온 교환 수지는 흔히 pH에 따라 카르복시산 또는 카르복시산염 기를 포함하는 지지된 유기성 기들을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중 모드 양이온 교환 수지가 이용될 수 있는데, 이는 이온 상호작용뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호작용 및 소수성 상호작용을 통합한다. 적절한 양이온 교환 수지의 예는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 프랙토겔(Fractogel), 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 인산염(P) 및 황산염(S), PROPAC WCX-10TM(디오넥스(Dionex)), 캡토(Capto) S, S-세파로오스(Sepharose) FF, 프랙토겔(Fractogel) EMD SO3M, 토요펄(Toyopearl) 메가캡(Megacap) II SP 550C, 포로스(Poros) 50 HS 및 SP-세파로오스(sepharose) 매트릭스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 양이온 수지는 캡토 S, S-세파로오스 FF, 프랙토겔 EMD SO3M, 토요펄 메가캡 II SP 550C, 포로스 50 HS로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 포로스 50 HS이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 공정이 조성물에 대해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 공정은 항체에 대해 결합 모드로 이용된다. 즉, 양이온 교환 크로마토그래피 공정은 관심 있는 항체가 양이온 교환 매트릭스에 흡착되나, 하나 이상의 불순물은 흡착되지 않아, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 일부 구현예에서, 흡착된 항체가 양이온 교환 매트릭스로부터 제거되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 양이온 교환 매트릭스는 완충액으로 1회 이상 세척된다. 결합 모드로 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 하나 이상의 불순물이 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체를 양이온 교환 매트릭스로부터 용리시킬 수 있다. 양이온 교환으로부터 항체를 용리시키는 방법은 매트릭스에 따라 다르며, 당업자에게 공지되어 있다.
대안적으로, 일부 구현예에서, 양이온 교환 공정은 관류(flow-thru) 모드로 이용될 수 있다. 즉, 양이온 교환 공정은 관심 있는 항체가 양이온 교환 매트릭스에 흡착되지 않고, 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착되어, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 관류 모드에서는, 하나 이상의 불순물이 양이온 교환 매트릭스에 흡착(또는 양이온 교환 매트릭스에 의해 저지)되고, 항체는 매트릭스 사이를 통과하여 관류 용액으로 흐른다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 공정의 생성물, 예컨대, 포로스 50 HS 크로마토그래피 매트릭스로부터의 용리액은 표 1의 특징을 나타내는 생성물을 생성할 수 있다.
Figure pct00002
일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 공정이다. 본 출원의 목적을 위해, "음이온 교환 크로마토그래피"는 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물이 음이온 교환 매트릭스를 이용하여 전하 차이를 기초로 하여 분리될 수 있는 임의의 방법을 지칭한다. 음이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유적으로 결합된, 양으로 하전된 기들을 포함한다. 강한 또는 약한 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있다. 강한 음이온 교환 매트릭스의 예로는 예컨대, 4차 암모늄 이온을 가지고 있는 것들을 포함한다. 약한 음이온 교환 매트릭스의 예로는 예컨대, DEAE(디에틸아미노에틸)과 같은, 3차 또는 2차 아민 기능성 기를 가지고 있는 것들을 포함한다. 특정 구현예에서는, 다중 모드 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있는데, 이는 이온 상호작용뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호작용 및 소수성 상호작용을 통합한다. 적절한 음이온 교환 매트릭스의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 수퍼(Super) Q, 사르토바인드(Sartobind) Q, 나트릭스(Natrix) Q, 크로마조브(Chromasorb) Q 및 머스탱(Mustang) Q를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 매트릭스는 수퍼 Q이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 음이온 교환 공정이 조성물에 대해 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 공정은 항체에 대해 결합 모드로 이용된다. 즉, 음이온 교환 크로마토그래피 공정은 관심 있는 항체가 음이온 교환 매트릭스에 흡착되나, 하나 이상의 불순물은 결합하지 않아, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 일부 구현예에서, 흡착된 항체가 음이온 교환 매트릭스로부터 제거되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 음이온 교환 매트릭스는 완충액으로 1회 이상 세척된다. 결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 하나 이상의 불순물이 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체를 음이온 교환 매트릭스로부터 제거할 수 있다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 공정은 관류 모드로 이용된다. 즉, 음이온 교환 공정은 관심 있는 항체가 음이온 교환 매트릭스에 실질적으로 흡착되지 않고, 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착(또는 저지)되어, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 하나 이상의 불순물이 관류 모드의 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체는 음이온 교환 매트릭스의 관류로부터 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 둘 이상의 이온 교환 공정, 예컨대, 제2의 이온 교환 공정을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 이온 교환 공정은 양이온 교환 공정이고, 제2 이온 교환 공정은 음이온 교환 공정이다. 일부 구현예에서, 세 가지의 이온 교환 크로마토그래피 공정이 이용된다.
본 출원에 기술된 방법은 조성물 내의 하나 이상의 불순물로부터 항체를 분리하기 위하여 친화도 정제 공정을 활용할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "친화도 정제 공정" 또는 "친화도 크로마토그래피"는 항체에 대한 친화도 리간드와의 특이적인 결합 성질에 의해 항체가 정제되는 분리 방법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기능적인 친화도 리간드는 고체 또는 반고체 지지체 상에 고정될 수 있으며, 따라서 항체를 포함하는 조성물이 리간드 및 고체 지지체 위로 통과될 때, 리간드에 대해 특이적인 결합 친화도를 나타내는 항체는 리간드에 흡착되고, 조성물의 하나 이상의 다른 성분들은 흡착되지 않거나 낮은 친화도로 결합되어, 항체로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드를 포함하는 고체 지지체는, 흡착된 항체가 리간드 및 지지체로부터 제거되기 전에, 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 완충액으로 1회 이상 세척된다. 하나 이상의 불순물이 제거된 후에, 흡착된 항체는 리간드 및 지지체로부터 제거될 수 있으며, 그 결과, 본래의 조성물로부터 항체의 분리가 일어난다.
리간드 및 지지체로부터 항체를 제거하는 방법은 리간드에 따라 다르며, 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대, 환경, 예컨대, pH의 변화, 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 변성제의 첨가, 또는 상업적으로 이용 가능한 용리 완충액의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 친화도 정제 공정이 항체를 포함하는 조성물에 대해 이용될 수 있다.
다양한 친화도 정제 공정이 당해 분야에 공지되어 있으며, 리간드로서 단백질 A, 단백질 G, 또는 이의 조합을 이용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리간드는 다양한 지지체, 예컨대, 수지 상에 고정될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 예컨대, 단백질 A 정제 공정을 포함할 수 있는데, 이때, 항체는 단백질 A에 흡착되고, 단백질 A는 고정된 지지체, 예컨대, 수지와 결합된다. 다양한 단백질 A 친화도 시스템이 상업적으로 이용 가능하며, 맵셀렉트(MabSelect), 맵셀렉트 슈어(MabSelect SuRe), 맵셀렉트 엑스트라(MabSelect Xtra), 세파로오스(Sepaharose) CL-4B, 프로셉(ProSep) vA, 프로셉(ProSep) vA 울트라(Ultra), 세라믹(Ceramic) HyperD 및 포로스 맵셀렉트(Poros MabSelect)를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 예컨대, 단백질 G 정제 공정을 포함하는데, 이때, 항체는 단백질 G에 흡착되고, 단백질 G는 고정된 지지체, 예컨대, 수지에 결합된다. 즉시 사용 가능한 수지 및 정제 키트가 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 고정된 지지체에 결합된 항원, 예컨대, 펩타이드 또는 햅텐으로, 이때, 항체는 이러한 항원에 선택적으로 흡착된다. 활성화된 수지 및 다양한 화학을 통한 고정된 항원을 제조하는 완성 키트는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 다른 리간드가 이용될 수 있으며, 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 참고 교재 Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr (1997); 및 Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York (1997) 참고. 예를 들어, 친화도 리간드는 항체 및 항체 단편, (예컨대, 특정 수용체에 대한) 자연적인 리간드 또는 리간드 유사체 및 (예컨대, 다중 서브유닛 복합체에 대한) 자연적인 결합 상대 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 여러 사이클의 친화도 정제 공정을 거친다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정, 예컨대, 단백질 A 친화도 매트릭스 통과의 생성물은 표 2의 특징을 나타내는 생성물을 초래할 수 있다.
Figure pct00003
본 발명의 방법은 조성물의 하나 이상의 불순물로부터 항체를 분리하기 위하여 여과 공정을 활용할 수 있다. 용어 "여과 공정" 및 "여과"는 조성물을 소정의 공극 직경의, 하나 이상의 반투과성 여과기(또는 막 또는 매체) 사이로 통과시켜 조성물로부터 부유 입자들을 제거하는 공정을 지칭하는데, 이때, 더 큰 분자들(일반적으로 >103-106 Da)은 여과기 상에 보유되지만, 물과 그보다 작은 분자량의 분자들은 여과기 사이를 통과한다.
일부 구현예에서, 여과 후, 본 발명의 항체는 실질적으로 투과물(permeate) 스트림에 있지만(즉, 본 발명의 항체는 여과기 공극 사이를 통과하여 수집된다), 불순물(예컨대, 세포 파편, DNA 및/또는 숙주 세포 단백질)은 실질적으로 투과유물(retentate) 스트림에 있다. 일부 구현예에서, 여과 후, 본 발명의 항체는 실질적으로 투과유물 스트림에 있지만, 불순물은 실질적으로 투과물 스트림에 있다. 여과를 지칭할 때 용어 "투과물 스트림"은 여과 중에 여과기 공극 사이로 통과하는 조성물의 분획을 지칭한다. 여과를 지칭할 때 용어 "투과유물 스트림"은 여과기 상에 남아있거나 여과 중에 여과기 공극 사이를 통과하지 않는 조성물의 분획을 지칭한다.
적절한 유형의 여과 장치가 당업자에게 공지되어 있으며, 다양한 요인, 예컨대, 여과되는 항체의 분자량, 여과되는 조성물의 성분들의 양과 크기, 여과되는 조성물의 부피 및 여과되는 조성물의 세포 밀도 및 생존 능력을 기초로 하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 막 한외여과기, 플레이트 한외여과기, 카트리지 한외여과기, 백(bag) 한외여과기 또는 진공 한외여과기와 같은 여과기가 이용될 수 있다. 이용될 수 있는, 상업적으로 이용 가능한 한외여과기는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation, 미국 매사추세츠 주 빌러리카), 폴 코포레이션(Pall Corporation, 미국 뉴욕 주 이스트힐), GE 헬스케어 사이언스(GE Healthcare Sciences, 미국 뉴저지 주 피스카타웨이) 및 사르토리우스 코포레이션(Sartorius Corporation, 독일 괴팅겐)과 같은 다양한 판매회사에 의해 제조된다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 불활성화 공정을 더 포함한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "바이러스 불활성화 공정"은 (1) 바이러스의 불활성화, (2) 바이러스의 물리적 제거 또는 (3) 이의 조합을 지칭한다. 바이러스의 불활성화를 지칭할 때, 이러한 바이러스는 최종 생성물에 남아 있을 수 있으나, 비감염형으로 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 예컨대, 바이러스를 불활성화하기에(예컨대, 변성시키에) 충분한 낮은 pH에, 조성물을 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 공정은 조성물의 pH를 약 5.0 이하, 약 4.5 이하, 약 4.0 이하 또는 약 3.5 이하의 pH까지 조정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 pH는 약 1.0 내지 약 5.0, 약 1.5 내지 약 4.5, 약 2.0 내지 약 4.0 또는 약 2.5 내지 약 3.5까지의 pH로 조정된다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 약 4.0, 약 2.8 내지 약 3.2 또는 약 3.0 미만의 pH에서 조성물을 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 4.0 미만의 pH에서 항체를 포함하는 조성물을 배양하는 것을 포함한다.
조성물의 pH는 바이러스 불활성화가 일어나기에 충분한 다양한 시간 길이, 예컨대, 1분 내지 2시간, 또는 10분 내지 90분, 바람직하게는 20분 내지 80분, 더욱 바람직하게는 25분 내지 35분, 훨씬 더 바람직하게는 약 30분 동안 낮춰질 수 있다. pH를 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 용매 또는 세제 처리, 방사선 조사 및/또는 바이러스를 불활성화하기에 충분히 높은 온도에 잠시 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 수단에 의한 바이러스 불활성화 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 당업자라면 본 발명에 따른 항체 분리 중에 이용될 적절한 처리법을 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 공정은 나노 여과를 이용하여 조성물로부터 바이러스를 물리적으로 제거하는 것을 포함할 수 있다. 용어 “나노 여과”는 조성물을 매트릭스, 예컨대, 여과기, 막 등 사이로 물리적으로 통과시켜, 조성물의 항체가 하나 이상의 바이러스로부터 분리되도록 하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 나노 여과는 조성물을 75 nm, 50 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm 또는 15 nm 미만의 공극 크기를 나타내는 매트릭스 사이로 통과시키는 것을 포함한다. 다양한 나노 여과기를 상업적으로 이용할 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 예컨대, (1) 조성물을 4.0 미만의 pH에 배양하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 공정 및 (2) 조성물을 나노 여과 공정의 대상으로 하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 공정의, 두 가지의 별도의 바이러스 불활성화 공정이 활용된다. 일부 구현예에서, 세 가지 이상의 별도의 바이러스 제거 공정이 활용된다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기술된 방법은 항체, 예컨대, 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 초래할 수 있는데, 이때, 이러한 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 “인간에 투여하기에 적합한”은 세계 보건 기구("Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals (Requirements for Biological Substances No. 50)," World Health Organization, WHO Technical Report Series, No. 878, 1998)에 의해 확립된 바와 같이 항체 생성물 용량당 10 ng DNA 미만의 한계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용어 "인간에 투여하기에 적합한"은 항체 생성물에 따라, 더욱 엄중한 한계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "인간에 투여하기에 적합한"은 체중 kg당 15 mg 항체의 투여량을 기초로 최대 105 mg의 단백질 용량을 가정할 때, 52.5 pg/용량 미만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "인간에 투여하기에 적합한"은 혼성화 방법에 의해 결정된 바에 따라, 0.5 pg DNA/mg 단백질 이하를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "인간에 투여하기에 적합한"은 혼성화 방법에 의해 결정된 바에 따라, 0.4 pg DNA/mg 단백질 이하, 0.3 pg DNA/mg 단백질 이하, 0.2 pg DNA/mg 단백질 이하, 0.1 pg DNA/mg 단백질 이하를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 용어 "인간에 투여하기에 적합한"은 피코그린(PicoGreen) 방법에 의해 결정된 바에 따라, 25 ng DNA/mg 단백질 이하를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "인간에 투여하기에 적합한"은 혼성화 방법에 의해 결정된 바에 따라, 0.2 pg DNA/mg 단백질 이하를 포함할 수 있다.
본 출원에 기술된 항체 분리 방법은 최종 생성물의 형성을 가져오는데, 이때, 이러한 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 최종 생성물은 표 3에 기술된 매개변수를 충족시킨다.
Figure pct00004
일부 구현예에서, 최종 생성물은 표 4에 기술된 매개변수를 충족시킨다:
Figure pct00005
본 발명의 방법으로부터 발생되는 최종 생성물의 항체 농도는 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항체가 약 10 mg/ml 내지 약 500 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 75 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 농도인 최종 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 항체가 약 90 mg/ml 내지 약 120 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL인 최종 생성물을 생성한다.
항체를 분리할 때, 일부 구현예에서는, 예컨대, 상업적인 제조 공정 도중에, 대용량의 조성물이 존재할 수 있다. 분리될 항체를 발현하는 세포 배양물은 생물반응기와 같은, 대규모 제조에 적합한 규모의 용기 내에서 성장시킬 수 있다. 대용량은 분리 공정에 몇 가지 과제를 제시한다. 예를 들어, 여과기를 통과한 유량의 작은 변화가 분리된 항체의 회수율에 미치는 영향은 대용량이 이용될 때 증폭된다. 마찬가지로, 대용량을 이용할 때, 단계, 공정 또는 성분의 규모로 인하여 단일 단계, 공정, 또는 성분의 효과는 확대된다. 예를 들어, 실험실 규모로 단일 성분을 첨가하는 경제적 비용은 무시할 만할 수 있으나, 동일한 성분을 대용량으로 첨가하는 경제적 비용은 상당할 수 있다. 본 출원에 기술된 방법은 벤조나아제 생략, 또는 일부 구현예에서 뉴클레아제의 생략이 실험실 규모의 생산에서는 평가되지 않는 경제적 효율을 초래할 수 있기 때문에 대용량에 대해 장점을 제공할 수 있다. 따라서, 대용량의 조성물은, 소량 이용에 비해 더 큰 파문을 가져오며, 증폭되는 독특한 문제를 제시한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 항체를 분리하는 방법을 대상으로 하는데, 이때, 조성물은 생물반응기로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 대용량으로 존재한다. 용어 "대용량"은 항체의 상업적 및/또는 산업적 생산과 관련된 부피를 지칭한다. 일부 구현예에서, 조성물은 100리터를 초과하는 부피를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물은 1000리터를 초과하는 부피를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 500리터, 적어도 750리터, 적어도 1,000리터, 적어도 1,250리터, 적어도 1,500리터, 적어도 2,000리터, 적어도 5,000리터 또는 적어도 10,000리터의 부피를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 다양한 순서의 단계를 이용하여 최종 생성물의 형성을 초래하는 항체의 단계별 분리를 제공한다. 일부 구현예에서, 친화도 교환 공정은 이온 교환 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 여과 공정은 친화도 정제 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 이온 교환 공정은 친화도 교환 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 여과 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 항체를 포함하는 조성물로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하는 방법은 (i) 항체를 포함하는 조성물에 대하여 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제1 생성물을 형성하기; (ii) 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하기; (iii) 완충된 생성물에 대하여 친화도 정제 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제2 생성물을 형성하기; (iv) 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제3 생성물을 형성하기; (v) 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및 (vi) 제3 생성물을 제형화하여 최종 생성물을 형성하기를 포함하며, 이때, 항체를 포함하는 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 항체를 포함하는 조성물로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하는 방법은 아래 열거된 (i)~(v) 중 적어도 세 가지를 포함한다: (i) 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정 수행하기; (ii) 조성물에 대해 친화도 정제 공정 수행하기; (iii) 조성물에 대해 한외 여과 공정 수행하기; (iv) 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정 수행하기; 및 (v) 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정 수행하기; 이때, (i)~(v) 중 적어도 세 가지로부터 생성되는 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
본 출원에 기술된 바와 같은 방법으로부터 생성되는 최종 생성물은 >80% (몰/몰)의 항체 수율을 나타낼 수 있다. 본 출원에 기술된 항체 수율은 항체의 분리가 일어나기 전에 본래의 조성물에 존재하는 항체의 양에 대한, 최종 생성물 내의 항체의 수율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기술된 바와 같은 방법으로부터 생성되는 최종 생성물은 >85% (몰/몰), >90% (몰/몰), 또는 >95% (몰/몰)의 항체 수율을 나타낼 수 있다.
분리 공정 중에 다양한 완충액 시스템이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 완충액은 MES 완충액, 트리스(Tris) 완충액, 인산나트륨 완충액, 프탈산염 완충액, 시트르산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이러한 완충액은 트리스 완충액, 바람직하게는 트리스/마그네슘 완충액이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 출원에 기술된 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 항체, 예컨대, 시나지스를 대상으로 한다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 또는 본 출원에 기술된 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 항체를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능하다. “약학적으로 허용 가능한”은 타당한 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성 또는 타당한 유익/유해 비율에 적합한 기타 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉시키기에 적합한 항체 또는 조성물을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 분리된 항체는 대상자의 치료에 이용될 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "대상자"는 인간과, 가축 및 경작용 동물, 동물원 동물, 스포츠용 동물 및 애완동물과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 비 인간을 포함하는 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상자는 인간을 지칭한다. 본 발명은 "인간에 투여하기에 적합한" 항체를 분리하는 방법을 대상으로 하지만, 분리된 항체를 이용하는 치료는 오로지 인간 치료에만 한정되지 않는다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치 및 예방 모두, 유지, 또는 방지적 수단을 지칭하며, 이때, 목적은 원치 않는 생리적 병태, 장애 또는 질병을 방지하거나 둔화(경감)시키거나, 유익한 또는 원하는 임상적 결과를 획득하는 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 증상 또는 징후의 경감; 병태, 장애 또는 질병 정도의 약화; 병태, 장애 또는 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 병태, 장애 또는 질병 진행의 개시 지연 또는 둔화; 검출 가능하거나 검출 불가능한, 병태, 장애 또는 질병 상태의 개선, (부분적인 또는 전체적인) 차도; 또는 병태, 장애 또는 질병의 증진 또는 향상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의미한 반응을 유발하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체가 시나지스인 일부 구현예에서, 치료는 호흡기 세포융합 바이러스 감염과 관련된 증상의, 예방, 발병 감소, 치료, 감소 또는 경감을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 본 출원에 기술된 방법에 의해 제조된 항체를 포함하는 최종 생성물은 치료적으로 유효한 양으로 대상자에 투여된다. 용어 “치료적으로 유효한 양”은 대상자의 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화시키는(즉, 질병 또는 장애를 치료하는) 항체의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "치료적으로 유효한 양"은 원하는 생리적 상태를 달성하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. 치료적으로 유효하도록 되는 데 필요한 항체의 정확한 치료적 투여량은 (예컨대, 대상자의 연령, 체중, 상태, 치료되는 장애 또는 질병의 성질 및 중증도 등 때문에) 대상자 간에 서로 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "치료적으로 유효한 양"은 원하는 생리적 상태를 달성하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 양은 미리 특정될 수 없으며, 다양한 수단, 예를 들어, 용량 적정을 이용하여, 보호자에 의해, 예를 들어, 의사 또는 다른 의료인에 의해, 결정될 수 있다. 또한, 적절한 치료적으로 유효한 양은 예를 들어, 동물 모델을 이용하는, 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법의 분리된 항체 생성물의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소적 투여 방식을 통해서일 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 예컨대, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 분리된 항체는 시나지스이고, 투여 경로는 근육 내 주사이다. 모든 이러한 형태의 투여가 명백히 본 발명의 범위 내인 것으로 고려되지만, 바람직한 투여 형태는 주사용 용액, 특히, 정맥 내 또는 동맥 내 주사 또는 점적용 용액이다. 일반적으로, 주사용의 적절한 약학적 조성물은 완충액(예컨대, 아세트산염, 인산염 또는 시트르산염 완충액), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예컨대, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 항체를 함유하는 약학적 조성물은 예컨대, 이온 교환기, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산, 물, 황산 프로타민, 인산수소 이나트륨, 인산수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염과 같은 염 또는 전해질의 부분적인 글리세라이드 혼합물, 콜로이드성 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스 계열 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴산염, 폴리에틸렌-폴리프로필렌-블록 공중합체 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기술된 방법은 시나지스를 분리하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 (i) 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제1 생성물을 형성하기; (ii) 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하기; (iii) 완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제2 생성물을 형성하기; (iv) 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 항체를 포함하는 제3 생성물을 형성하기; (v) 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및 (vi) 제3 생성물을 제형화하여 최종 생성물을 형성하기를 포함하고, 이때, 최종 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하며, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내고, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 투여하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하며, 이러한 방법은
i. 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
ii. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및
iii. 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기;를 포함하고, 이때, 시나지스를 포함하는 최종 생성물이 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 투여하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명은 시나지스를 가지고 있는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하며, 이러한 방법은
i. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제1 생성물을 형성하기;
ii. 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하기;
ii.완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제2 생성물을 형성하기;
iv. 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제3 생성물을 형성하기;
v. 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및
vi. 제3 생성물을 제형화하여 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 형성하기;를 포함하고, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명은 시나지스를 가지고 있는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하며, 이때, 이러한 방법은 (i)~(v) 중 적어도 세 가지를 포함하며:
i. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
ii. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기;
iii. 조성물에 대해 한외 여과 공정을 수행하기;
iv. 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및
v. 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
이때, (i)~(v) 중 적어도 세 가지로부터 기인하는 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하며, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며; 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 이러한 방법은 조성물에 외인성 뉴클레아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 불활성화 공정을 더 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 조성물을 4.0 미만의 pH에서 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 항체는 IgG이다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 단백질 A 정제 공정을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 공정은 양이온 교환 크로마토그래피 공정이다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 공정은 캡토 S, S-세파로오스 FF 및/또는 포로스 50 HS로부터 선택된 양이온 수지에 항체를 흡착시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 이러한 방법은 제2의 이온 교환 공정을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제2의 이온 교환 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 공정이다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 공정은 항체를 수퍼 Q, 나트릭스 Q, 크로마조브 Q 및/또는 머스탱 Q로부터 선택된 음이온성 막 사이로 통과시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 최종 생성물은 약 >80%(몰/몰)의 항체 수율을 나타낸다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 최종 생성물의 DNA 농도는 약 ≤ 200 ng/mg이다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 면역된 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상층액, 재조합 세포주 배양으로부터 유래된 적응용 배지 및/또는 면역 글로불린 생산 세포의 세포 추출물이다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 생물반응기로부터의 제제를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 약 100리터를 초과하는 부피를 나타낸다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 약 1000리터를 초과하는 부피를 나타낸다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, (ii)의 공정은 (i)의 공정 후에 일어난다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, (iii)의 공정은 (ii)의 공정 후에 일어난다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1을 나타내는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 2의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO: 3)을 나타내는 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO: 4)을 나타내는 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO: 5)을 나타내는 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO: 7)을 나타내는 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO: 8)을 나타내는 L2 CDR 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 L3 CDR을 포함한다.
본 개시 전반에 걸쳐, 백분율, 비율 등의 모든 표현은 달리 표현되지 않는 한 "중량 기준"이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "중량 기준"은 용어 "질량 기준"과 같은 것을 의미하며, 본 출원에 정의된 비율 또는 백분율이 부피, 두께 또는 다른 척도라기 보다는 중량에 따라 이루어짐을 표시한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 백분율 또는 기타 수치 양과 함께 사용될 때 그러한 백분율 또는 기타 수치 양의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 예를 들어, 용어 "약 80%"는 80% 플러스 또는 마이너스 8%를 아우른다.
실시예
실시예 1
벤조나아제 첨가 및 무첨가 시 시나지스 분리
1. 세포 배양물 상층액 준비
호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 단백질 F를 표적으로 하는 인간화 단일 클론성 IgG1 항체인 시나지스를 무혈청 DMNSO-4 배지를 이용하여 NSO 세포에서 발현시키고, "벤조나아제" 실행 및 "벤조나아제 불포함" 실행이라 지칭된 두 번의 별도의 실행을 하여 생산용 생물반응기로부터 수확하였다. 각 실행으로부터의 NSO 세포 및 세포 파편들을 원심 분리 및 여과에 의해 제거하였다. 그 결과로 생성된, 각 실행에 대한 정제된 수확 물질의 pH 및 전도율을 6.0의 부하 pH와 6.0 mS/cm의 전도율까지 조정하였고, 공정 스트림을 직접적으로 포드(Pod) 유사형 심층 여과기(depth filter) 사이로 진행시켰다. 시나지스를 아래 2~8단계에서 기술한 바와 같이, 그리고 도 1에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 수확된 세포 조성물로부터 분리하였다.
2. 양이온 교환 크로마토그래피
1단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행의 수확 물질을 별도의 포로스 50 HS 컬럼(180 cm)에 로딩하고, 세척하고, 컬럼으로부터 용리시켰다. 로딩, 세척 및 용리 공정을 동적 결합 용량(부하: ≤ 20 g/L 수지/사이클) 및 체적 유량(선형 유량: ≤ 330 cm/hr)에 대해 조절하였고, 여러 사이클로 완료하여 전체 부피를 수용하였다. 포로스 50 HS 컬럼 생성물의 산출 매개변수를 표 5로 정의하였다.
Figure pct00006
3. 트리스/염화 마그네슘(TM) 완충액 첨가
2단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행으로부터의 양이온 교환 크로마토그래피 생성물의 pH를 1M 트리스 염기 용액을 이용하여 8.5 ± 0.2까지 조정하였다. 트리스 염기 용액 첨가 후의 생성물 풀의 pH는 8.5였다. TM 완충액(20 mM 트리스, 102 mM MgCl2, pH 8.5)를 pH 조정된 풀에 첨가하여, 2 ± 0.2 mM(0.018 L/L 내지 0.022 L/L) 농도의 최종 MgCl2 농도를 달성시켰다. "벤조나아제" 분획에 12,000단위의 벤조나아제를 첨가하고, 18~48시간 동안 배양하였다. "벤조나아제 불포함" 분획에는 벤조나아제를 첨가하지 않았다. "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 분획 모두를 대상으로 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 수행하였다.
4. 단백질 A 친화도 크로마토그래피
3단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행으로부터의 완충된 분획을 단백질 A 컬럼(r단백질 A 세파로오스(Sepharose®) 고속 유량 수지; 140 cm) 상으로 로딩하고, 세척한 다음, 컬럼으로부터 용리시켰다. 로딩, 세척 및 용리 공정을 다섯 사이클로 완료하여 완충된 생성물 전체 부피를 수용하였다. 이러한 공정을 동적 결합 용량(부하: ≤ 18 g/L 수지/사이클) 및 체적 유량(35 ± 4 L/분)에 대해 조절하였다. 각 실행으로부터 용리된 생성물을 두 개의 상이한 탱크에 수집하였다. 용리된 생성물은 표 6에 기술된 바와 같은 다음의 특징들을 나타냈다.
Figure pct00007
5. 나노 여과
4단계의 단백질 A 친화도 크로마토그래피로부터의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행의 생성물을 아사히 카세이(Asahi Kasei) 플래노바(Planova) 15N 중공 필터 카트리지(규모: 8~10 x 4 ㎡; 막간차압: < 13 psi; 부하: ≤ 800 g/㎥ 필터 면적)를 이용하여 여과시켰다. 나노 여과 후, 필터를 평형 완충액을 흘려 씻어내어 회수율을 최대화하였다. 사용 후에는 나노 여과기 무결성을 확인하였다. 나노 여과시킨 생성물을 실온에서 저장하기 위하여 0.2 μm 막 여과기 사이로 여과시켜 저장 탱크에 저장하였다. 수율은 94~99%였으나, “벤조나아제 불포함” 실행의 한 로트만 예외였는데, 생성물 시료의 의도치 않은 취급 부주의로 인해 더 낮은 수율을 나타냈다.
6. 낮은 pH 처리
나노 여과 후, 5단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행으로부터의 생성물 스트림을 글리신 용액을 이용하여 pH 3 ± 0.1로 적정하고, 실온에서 대략 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 생성물을 7.6 ± 0.4의 pH로 중화시켰다.
7. 음이온 교환(수퍼 Q) 크로마토그래피
6단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행으로부터의 낮은 pH 처리된 생성물을 수퍼 Q 650M 수지 컬럼(규모: 140 cm) 사이로 통과시켰다. 공정을 컬럼 부하 pH, 전도율, 동적 결합 용량(부하: ≤ 79 g/L 수지/사이클) 및 체적 유량(선형 유량 ≤ 330 cm/hr)에 대해 조절하였다. 각 로트에 대한 수율은 95~99% 범위였다. 음이온 교환 크로마토그래피의 생성물의 오염물질 DNA 수준을 표 7에 제시된 바와 같은 혼성화 방법으로 결정하였다.
Figure pct00008
8. 한외 여과/정용 여과
음이온 교환 크로마토그래피 후, 7단계의 "벤조나아제" 및 "벤조나아제 불포함" 실행으로부터의 생성물을 한외 여과/정용 여과(규모: 450~600 ft2; 부하: ≤ 60 g/ft2 여과기 면적)에 의해 최소 5회의 완충액 교환을 이용한 제형 완충액으로 농축시켰다. 정용 여과를 완료한 후, 한외 여과 시스템을 제형 완충액을 흘려 씻어내어 회수율을 최대화하였다. 제형 완충액으로 생성물 농도를 103 ± 6 g 시나시즈/L의 목표까지 조정하였다. 생성물 pH는 약 6이었고, 최종 투과물 전도율은 약 1.1 mS/cm였다. 각 로트의 수율은 100% 내지 103% 범위였다. 그에 따른 최종 생성물을 -/2 μm 여과기 사이로 통과시키고, 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다.
실시예 2
벤조나아제 첨가 및 무첨가 시 시나지스 분리
과량의 외인성 DNA를 소량 첨가한 조성물로부터 항체를 분리하는 본 출원에 기술된 방법의 효율 및 견고성을 조사하였다. 외인성 DNA를 2개의 공정 단계에서 첨가했다는 점을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 벤조나아제 불포함 조성물로부터 항체를 생성하고, 수확하고, 분리하였다. 500 ng/mg의 마우스 게놈 DNA(노바젠(Novagen))를 (i) 양이온 크로마토그래피 공정(실시예 1, 2단계) 후 또는 (ii) 낮은 pH 처리 공정(실시예 1, 6단계) 후 중 어느 하나에서 벤조나아제 불포함 시료에 첨가하였다. 그런 다음, 과량의 외인성 DNA 첨가를 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 항체 분리를 진행하였다. 분리 공정 전반에 걸쳐 용리 부피, 용리 역가 및 단계 수율을 모니터링하였고, 제조 경향에 일치시켰다. 실험 개요를 도 2에 제시하였다. "소량 첨가된" 시료의 DNA 농도를 혼성화 방법 및 NSO PCR 방법으로 결정하였다. 양이온 크로마토그래피 공정 후에 소량 첨가된 시료의 경우, DNA 농도는 <0.1 pg/mg(혼성화 방법) 및 < 0.044 pg/mg(NSO PCR 방법)이었고, 낮은 pH 처리 후 소량 첨가된 시료의 경우, <0.3 pg/mg(혼성화 방법) 및 < 0.041 pg/mg(NSO PCR 방법)이었다. 이러한 결과는 추가적인 양의 DNA가 조성물에 첨가될 때에도 본 출원에 기술된 방법이 DNA를 제거하는 데에 충분히 효율적이며 견고하다는 점을 나타낸다.
본 출원에 기술된 다양한 구현예 또는 선택사항 전부는 임의의 변형 및 모든 변형들로 조합될 수 있다. 본 발명은 특히 이의 일부 구현예를 참조로 하여 나타내어지고 기술되었지만, 당업자라면 그것들이 오로지 예시로서 제시되었으며, 그리고 제한이 아님을 이해할 것이고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고도 그 안의 형태 및 세부 사항의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범위는 위에 기술된 임의의 예시적인 구현예에 의해 제한되어서는 안 되고, 오로지 다음의 청구항 및 그것들의 균등물과 일치되게 정의되어야 한다.
저널 기사 또는 요약서, 공개되었거나 상응하는 미국 또는 외국의 특허 출원, 등록된 또는 외국 특허, 또는 임의의 다른 문헌들을 포함하는, 본 출원에 인용된 모든 문헌은 각각, 인용된 문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면 및 본문을 포함하는, 전체가 본 출원에 참조로써 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, LLC <120> METHODS OF ISOLATING SYNAGIS IN THE ABSENCE OF BENZONASE <130> RSVAB-300P1 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Heavy chain of SYNAGIS humanized antibody <400> 1 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N-terminal antigen binding fragment (Fab) of SYNAGIS heavy chain humanized antibody <400> 2 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His 225 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) H1 of SYNAGIS heavy chain humanized antibody <400> 3 Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) H2 of SYNAGIS heavy chain humanized antibody <400> 4 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) H3 of SYNAGIS heavy chain humanized antibody <400> 5 Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 6 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Light chain of SYNAGIS humanized antibody <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) L1 of SYNAGIS light chain humanized antibody <400> 7 Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) L2 of SYNAGIS light chain humanized antibody <400> 8 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Complementary determining region (CDR) L3 of SYNAGIS light chain humanized antibody <400> 9 Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5

Claims (20)

  1. 시나지스(Synagis®)를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서, 이러한 방법은
    i. 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
    ii. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기; 및
    iii. 조성물에 대해 여과 공정을 수행하기;
    를 포함하고, 이때, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 기인하며, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내고, 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
  2. 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서, 이러한 방법은
    i. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제1 생성물을 형성하기;
    ii. 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하기;
    iii. 완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제2 생성물을 형성하기;
    iv. 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제3 생성물을 형성하기;
    v. 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및
    vi. 제3 생성물을 제형화하여 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 형성하기;를 포함하고, 이때, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며,
    이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 투여하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
  3. 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서, 이러한 방법은 (i)~(v) 중 적어도 세 가지를 포함하며:
    i. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
    ii. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하기;
    iii. 조성물에 대해 한외 여과 공정을 수행하기;
    iv. 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하기; 및
    v. 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하기;
    이때, (i)~(v) 중 적어도 세 가지로부터 기인하는 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하며, ≤ 0.5 pg/mg의 DNA 농도를 나타내며; 이때, 이러한 방법은 조성물에 벤조나아제를 투여하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 이러한 방법은 조성물에 외인성 뉴클레아제를 첨가하는 것을 포함하지 않는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 바이러스 불활성화 공정을 더 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스 불활성화 공정은 조성물을 4.0 미만의 pH에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항체는 IgG인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 친화도 정제 공정은 단백질 A 정제 공정을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피 공정은 양이온 교환 크로마토그래피 공정인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 양이온 교환 공정은 캡토(Capto) S, S-세파로오스(Sepharose) FF 및 포로스(Poros) 50 HS로 이루어지는 군으로부터 선택된 양이온 수지에 항체를 흡착시키는 것을 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제2의 이온 교환 공정을 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제2의 이온 교환 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 공정인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 음이온 교환 공정은 항체를 수퍼(Super) Q, 나트릭스(Natrix) Q, 크로마조브(Chromasorb) Q 및 머스탱(Mustang) Q로 이루어지는 군으로부터 선택된 음이온성 막 사이로 통과시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 최종 생성물은 >80%(몰/몰)의 항체 수율을 나타내고/나타내거나 최종 생성물의 DNA 농도는 ≤ 200 ng/mg인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 조성물은 면역된 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상층액, 재조합 세포주 배양으로부터 유래된 적응용 배지, 면역 글로불린 생산 세포의 세포 추출물 및 생물반응기 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 조성물은 100리터를 초과하는 부피를 나타내는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 조성물은 1000리터를 초과하는 부피를 나타내는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, (ii)의 공정은 (i)의 공정 후에 일어나는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, (iii)의 공정은 (ii)의 공정 후에 일어나는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 시나지스는
    아미노산 서열 SEQ ID NO: 1을 나타내는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄;
    SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 2의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위; 또는
    아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO: 3)을 나타내는 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO: 4)을 나타내는 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO: 5)을 나타내는 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO: 7)을 나타내는 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO: 8)을 나타내는 L2 CDR 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 L3 CDR을 포함하는 것인 방법.
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