ES2856967T3 - Método de fabricación de una composición desgasificada - Google Patents

Abstract

Un método de producción de viales que contienen una composición líquida que comprende una proteína recombinante, comprendiendo el método: a. proporcionar un recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante opcionalmente en donde el recipiente se ha almacenado bajo presión positiva; b. aplicar un vacío al recipiente; c. permitir que el vacío desgasifique la composición; y llenar los viales con la composición desgasificada que comprende una proteína recombinante, en donde un valor indicador de burbujas (BI, por sus siglas en inglés) es al menos 5,9 y se calcula usando la siguiente fórmula: en donde V= volumen de la solución (ml) P=vacío desgasificante (mbar) t=tiempo de la desgasificación (h) h1=altura del líquido (cm) (calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico) y ha=altura del aire/espacio libre (cm).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de fabricación de una composición desgasificada

CONTINUACIÓN DE LOS DATOS DE LA SOLICITUD

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de Serie 62/073.459, presentada el 31 de octubre de 2014.

CAMPO

Un método de producción de viales que contienen una composición que comprende una proteína recombinante.

ANTECEDENTES

Las proteínas recombinantes, tales como los anticuerpos, se han utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones y generalmente provienen del cultivo celular, usando bien líneas celulares eucariotas o procariotas. Las proteínas recombinantes, tales como los anticuerpos, utilizadas en aplicaciones farmacéuticas, deben tener un elevado nivel de pureza, especialmente en relación con contaminantes del cultivo celular, incluyendo contaminantes de proteínas celulares, contaminantes de ADN, virus y otros agentes transmisibles. Véase "WHO Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals: Requirements for Biological Substances N.° 50". N.° 878. Anexo 1, 1998. Muchas proteínas recombinantes, tales como los anticuerpos, se empaquetan en recipientes de un solo uso o en pequeños recipientes multiusos en la forma de viales. Cuando se producen en viales, tales como viales de vidrio transparente, el aspecto tanto de la composición que comprende la proteína recombinante como del propio vial en sí están óptimamente preservados. Cualquier defecto visual en el vial o en las composiciones puede provocar una ansiedad innecesaria en los pacientes y/o en los médicos. Aunque puede no haber degradación del producto y aunque puede ser médicamente aceptable, la compañía productora de los viales, las farmacias, los médicos tratantes o los pacientes pueden elegir rechazar los viales basándose únicamente en su aspecto.

D1 desvela un método para llenar recipientes con un líquido farmacéutico, en el que el método abarca la desgasificación del líquido utilizado para el llenado antes de someterse al proceso de llenado, en el que dicha desgasificación comprende proporcionar un recipiente a presión que encierra una bolsa blanda con el líquido, aplicando un vacío a dicho recipiente/envase a presión y desgasificando el líquido en la bolsa blanda, por lo que posteriormente el líquido desgasificado se usa para llenar un recipiente.

D2 desvela un método para llenar un recipiente, en forma de ampolla, con un líquido desgasificado, en el que el método comprende proporcionar un tanque con el líquido, aplicar vacío al tanque, permitir que el vacío desgasifique el líquido y llenar las ampollas con el líquido desgasificado, en el que el líquido es un medicamento inyectable.

D3 desvela un método en el que los viales se llenan con una composición que comprende una proteína recombinante, en el que dicho método comprende aplicar vacío para desgasificar la composición y los viales.

Por tanto, existe la necesidad de un proceso de fabricación farmacéutica mejorado para garantizar que no se formen anillos en los viales utilizados para envasar composiciones que comprenden una proteína recombinante.

SUMARIO

De acuerdo con la descripción, se proporciona un método de producción de viales que contienen una composición líquida que comprende una proteína recombinante, comprendiendo el método:

a. proporcionar un recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante en donde opcionalmente el recipiente se ha almacenado bajo presión positiva;

b. aplicar un vacío al recipiente;

c. permitir que el vacío desgasifique la composición; y

llenar viales con la composición desgasificada que comprende una proteína recombinante, en donde un valor de indicador de burbujas es al menos 5,9 y se calcula usando la siguiente fórmula:

en donde

V= volumen de la solución (ml)

P=vacío desgasificante (mbar)

t=tiempo de la desgasificación (h)

h1=altura del líquido (cm) (calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico) y ha=altura del aire/espacio libre (cm). En una realización, la proteína recombinante es palivizimab (Synagis®).

En una enseñanza, se enseña un método de aislamiento de Synagis® de una composición que comprende Synagis® que comprende:

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio iónico en la composición;

b. realizar un proceso de purificación por afinidad en la composición; y

c. realizar un proceso de filtración en la composición;

d. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición,

en donde un producto final que comprende Synagis® es resultado de (a), (b) y (c),

en donde el producto final es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg, y en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

En otras enseñanzas, se enseña un método de aislamiento de Synagis® de una composición que comprende Synagis® que comprende:

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición para formar un primer producto que comprende Synagis®;

b. añadir un tampón al primer producto para formar un producto tamponado;

c. realizar un proceso de purificación por afinidad en el producto tamponado para formar un segundo producto que comprende Synagis®;

d. realizar un proceso de filtración en el segundo producto para formar un tercer producto que comprende Synagis®; e. realizar un proceso de inactivación vírica en el tercer producto; y formular el tercer producto para formar un producto final que comprende Synagis®, en donde el producto final es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg; y

f. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición, en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

En otra realización, un método de aislar Synagis® de una composición que comprende Synagis® comprende al menos tres de (a)-(e) y en donde el método comprende además (f):

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición;

b. realizar un proceso purificación por afinidad en la composición;

c. realizar un proceso de ultrafiltración en la composición;

d. realizar un proceso de inactivación vírica en la composición; y

e. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición;

f. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición,

g. en donde el producto resultante de los al menos tres de (i)-(v) comprende Synagis® y es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg; y en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

En una enseñanza, la etapa de desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición comprende a. proporcionar un recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante en donde opcionalmente el recipiente se ha almacenado bajo presión positiva;

b. aplicar un vacío al recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante; c. permitir que el vacío desgasifique la composición; y

d. llenar los viales con la composición desgasificada que comprende una proteína recombinante.

En una realización, la proteína recombinante comprende:

a. una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 ;

b. una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera de la cadena ligera de la SEQ ID NO:6 ; o

c. una región determinante de complementariedad (CDR) de H1 que tiene la secuencia de aminoácidos TSGMSVG (SEQ ID NO: 3), una CDR de H2 que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO: 4), una CDR de H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SMITNWYFDV (SEQ ID NO: 5); una CDR de L1 que tiene la secuencia de aminoácidos KCQLSVGYMH (SEQ ID NO: 7), una CDR de L2 que tiene la secuencia de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO: 8), y una CDR de L3 que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 9).

En una realización, el recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante se ha almacenado bajo presión positiva.

En otra realización, se aplica un vacío durante desde 12 horas hasta 5 días. En otra realización, se aplica un vacío durante desde 1 día hasta 4 días. En una realización, se aplica un vacío desde 50 hasta 268 mbar. En otra realización, se aplica un vacío que es mayor de 50 y menor de o igual a 268 mbar. En otra realización, se aplica un vacío que es de 60 a 268 mbar. En un modo, se aplica un vacío a 99 o 268 mbar.

En una realización, se aplica un vacío a un volumen de una composición que comprende una proteína recombinante de 20 litros a 250 litros. En otra realización, se aplica un vacío a un volumen de una composición de 40 litros, 50 litros, 65 litros o 125 litros. En una realización, el recipiente puede ser mayor que el volumen de la composición. En una realización, no están presentes más de 50 litros de composición en un tanque de 65 litros. En una realización, no están presentes más de 76 litros de composición en un tanque de 125 litros. En una realización, están presentes 46,5 litros de la composición en un tanque de 65 litros. En una realización, están presentes más de 68,1 litros de composición en un tanque de 125 litros.

De acuerdo con la invención, un valor indicador de burbujas es al menos aproximadamente 5,9 y se calcula usando la siguiente fórmula:

en donde

V= volumen de la solución (ml)

P=vacío desgasificante (mbar)

t=tiempo de la desgasificación (h)

h1=altura del líquido (cm) (calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico) y

ha=altura del aire/espacio libre (cm).

En otro modo, la composición que comprende la proteína recombinante no comprende un tensioactivo. En otro modo, no se añade un tensioactivo a la composición que comprende la proteína recombinante. En otro modo, la composición, cuando se llena en al menos un vial, no forma un anillo sobre la interfase aire-líquido-vidrio del vial. En otro modo adicional más, la composición, cuando se llena en al menos un vial, no forma un anillo sobre la superficie del vial. En una realización, la composición no comprende burbujas después de la desgasificación. En una realización adicional, la composición después de la desgasificación y cuando se llena en al menos un vial, no comprende burbujas en líneas de lleno de viales u otros tubos usados en la fabricación.

En un modo adicional, la concentración de proteína de la proteína recombinante en la composición que comprende una proteína recombinante es de 0,1 mg/ml a 1000 mg/ml. En un aspecto adicional, la concentración de proteína es de 100 mg/ml.

En un modo, la omisión de la etapa de desgasificación da como resultado una acumulación de burbujas en la composición. En otro modo, la omisión de la etapa de desgasificación da como resultado una acumulación de burbujas en la composición en las líneas de llenado. En una enseñanza adicional, la omisión de la etapa de desgasificación da como resultado una deposición de partículas en la interfase aire-líquido-vidrio de un vial que contiene la composición. En una enseñanza adicional, la deposición de las partículas cuando se omite la etapa de desgasificación es una deposición que comprende la proteína recombinante. En un modo adicional, la deposición de partículas forma un anillo en el vial.

Los objetos y ventajas adicionales se establecerán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvios a partir de la descripción, o se pueden aprender con la práctica. Los objetos y ventajas se realizarán y alcanzarán por medio de los elementos y combinaciones señalados particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son únicamente ilustrativas y explicativas y no limitan las reivindicaciones.

Los dibujos adjuntos ilustran una (varias) realizaciones y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios descritos en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A-B muestran un estudio del impacto del vacío en un proceso de desgasificación de 2 días. Las Figuras 1A y B muestran la línea de llenado, con la Figura 1A que muestra una imagen de la línea de llenado al comienzo del proceso de llenado para la composición desgasificada a 268 mbar y la Figura 1B muestra una imagen del final del proceso de llenado (8,4 kg de lleno) para la composición desgasificada a 268 mbar.

Las Figuras 2A-B muestran, en el mismo estudio del impacto del volumen en la desgasificación, y para la composición desgasificada a 268 mbar, las burbujas de la línea de llenado a un llenado de ~400 ml (panel A) y un llenado de ~1400 ml (panel B). Más burbujas son visualmente evidentes más adelante en el proceso de llenado para la composición desgasificada a 268 mbar.

Las Figuras 3A-B muestran, en un estudio del impacto del tiempo en la desgasificación, una fotografía de la línea de llenado para la composición desgasificada durante 1 día, con la Figura 3A mostrando una imagen de la línea de llenado a ~300 ml de llenado y la Figura 3B mostrando una imagen de la línea de llenado a ~650 ml de llenado. Se pueden visualizar más burbujas en el punto de llenado de ~650 ml.

La Figura 4 es una imagen de un anillo sustancialmente blanco que se muestra de forma horizontal en el vial de vidrio a la izquierda de la flecha indicadora.

La Figura 5 muestra los resultados de la inspección visual de lotes producidos a escala experimental a partir de la sustancia del fármaco desgasificada y no desgasificada.

La Figura 6 muestra los resultados de la evaluación de la estructura secundaria de la proteína aislada del anillo evaluado por el segundo análisis del derivado del pico de amida-I. La proteína en el aislado de anillo tiene una conformación natural tal como se determina mediante FTIR.

Las Figuras 7A-D muestran los resultados de las digestiones trípticas que se realizaron en la proteína en el anillo de viales que contienen Synagis®. Las digestiones trípticas muestran que la proteína en el anillo es Synagis®.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

La Tabla 1 proporciona un listado de determinadas secuencias a las que se hace referencia en el presente documento.

I. Preparación de una composición desgasificada que no forma un anillo en el vial

Se ha descubierto que se puede formar un anillo en el vial de ciertas composiciones que comprenden una proteína recombinante. Por "anillo", la presente solicitud se refiere a depósitos de partículas en la interfase aire-líquido-vidrio de un vial u otro recipiente que lleva a un defecto estético redondo u ovalado visualmente evidente en el vial u otro recipiente. En una realización, la composición que comprende una proteína recombinante no comprende un tensioactivo. En una realización, la composición que comprende una proteína recombinante no tiene un tensioactivo añadido durante su proceso de fabricación. En ciertos casos, la composición que comprende una proteína recombinante se ha almacenado bajo presión positiva durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, o al menos 48 horas, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 1 semana, al menos 1 mes, al menos 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años. Sorprendentemente, se ha determinado que la desgasificación de estas composiciones a través de la aplicación de un vacío evita la formación del anillo en el vial que contiene estas composiciones que comprenden una proteína recombinante. En una realización, la etapa de desgasificación se lleva a cabo después de que la composición se almacena bajo presión positiva durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, o al menos 48 horas, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 1 semana, al menos 1 mes, al menos 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años. En otra realización, la composición que comprende una proteína recombinante se puede almacenar bajo presión positiva después de la etapa de desgasificación durante no más de 16 horas, no más de 12 horas, no más de 8 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 3 horas, no más menos de 2 horas, no más de 90 minutos, no más de 60 minutos o no más de 30 minutos. En otra realización, la composición que comprende una proteína recombinante se puede almacenar bajo presión positiva después de la etapa de desgasificación durante no más de 1 día, no más de 2 días, no más de 3 días o durante menos de 4 días.

A. Aplicación del vacío

Una variedad de factores afectan a la capacidad de un vacío para desgasificar una composición que comprende una proteína recombinante, incluyendo, pero sin limitación, la fuerza del vacío, la duración del tiempo que se aplica el vacío, así como las propiedades del recipiente y la solución (tales como, pero sin limitación) el volumen de la solución, la altura del líquido, y la altura del aire/espacio libre. La cantidad del vacío y la duración del vacío se pueden determinar usando un cálculo del valor indicador de burbujas de acuerdo con la siguiente fórmula:

en donde

V= volumen de la solución (ml)

P=vacío desgasificante (mbar)

t=tiempo de la desgasificación (h)

h1=altura del líquido (cm) (calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico) y

ha=altura del aire/espacio libre (cm).

De acuerdo con la invención, el valor indicador de burbujas es al menos 5,9.

En una realización, se aplica un vacío desde 50 hasta 268 mbar. En otra realización, se aplica un vacío que es mayor de 50 y menor de o igual a 268 mbar. En otra realización, se aplica un vacío que es de 60 a 268 mbar. En un modo, se aplica un vacío a 99 o 268 mbar.

En una realización, se aplica un vacío a un volumen de una composición que comprende una proteína recombinante de 20 litros a 250 litros o de 40 litros a 70 litros. En otro aspecto, se aplica un vacío a un volumen de una composición de 40 litros, 50 litros, 65 litros o 125 litros. En una realización, el recipiente puede ser mayor que el volumen de la composición. En una realización, no están presentes más de 50 litros de composición en un tanque de 65 litros. En una realización, no están presentes más de 76 litros de composición en un tanque de 125 litros. En una realización, están presentes 46,5 litros de la composición en un tanque de 65 litros. En una realización, están presentes más de 68,1 litros de composición en un tanque de 125 litros.

En una realización, el vacío se aplica durante desde 46 horas hasta 5 días. En otra realización, el vacío se aplica durante desde 2 días hasta 4 días.

II. Beneficios seleccionados de la etapa de desgasificación

Se pueden describir una variedad de beneficios de la etapa de desgasificación tales como los siguientes; sin embargo, no todos los beneficios pueden estar presentes en todas las situaciones. En un aspecto, la etapa de desgasificación permite que la composición que comprende una proteína recombinante se almacene bajo presión positiva. En otra realización, la composición que comprende la proteína recombinante no comprende un tensioactivo. En otra realización, no se añade un tensioactivo a la composición que comprende la proteína recombinante.

En otra enseñanza, la etapa de desgasificación evita la acumulación de burbujas en la composición que comprende una proteína recombinante. Esto se puede evaluar omitiendo la etapa de desgasificación, lo que da como resultado una acumulación de burbujas en la composición que comprende una proteína recombinante. En otro aspecto, la etapa de desgasificación evita una acumulación de burbujas en líneas de llenado usadas para llenar los viales con la composición que comprende una proteína recombinante. Esto se puede evaluar omitiendo la etapa de desgasificación, lo que da como resultado una acumulación de burbujas en líneas de llenado usadas para llenar los viales con la composición que comprende una proteína recombinante.

En una realización, la etapa de desgasificación evita la deposición de partículas en la interfase aire-líquido-gas de un vial que contiene una composición que comprende una proteína recombinante. Esto se puede evaluar omitiendo la etapa de desgasificación, lo que da como resultado una deposición de las partículas en la interfase aire-líquido-vidrio de un vial que contiene una composición que comprende una proteína recombinante. En una enseñanza, la deposición de partículas comprende la proteína recombinante. En otra enseñanza, la deposición de partículas forma un anillo en el vial.

111. Composiciones que comprenden una proteína recombinante

Este proceso se puede aplicar a una pluralidad de composiciones que comprenden una proteína recombinante. En una realización, la proteína recombinante es un anticuerpo. En otra realización, la proteína recombinante es un anticuerpo contra RSV.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es Synagis® (Palivizumab) (Medlmmune). Synagis® es una glucoproteína de anticuerpo monoclonal IgG1kappa humanizado (quimérico murino-humano) con especificidad para un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F (fusión) del virus respiratorio sincicial (RSV). Synagis® se puede expresar a partir de una línea celular de mieloma murino (ratón) estable (NS0). En algunas realizaciones comerciales, Synagis® está compuesta de dos cadenas pesadas (50,6 kDa cada una) y dos cadenas ligeras (27,6 kDa cada una), contiene el 1-2 % de carbohidratos en peso y tiene un peso molecular de 147,7 kDa ± 1 kDa (MALDI-TOF).

En algunas realizaciones, un anticuerpo Synagis® tiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, un anticuerpo Synagis® incluye una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:1 o la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada FAB de la SEQ ID NO: 2 y la región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO:6. En algunas realizaciones, un anticuerpo Synagis® tiene región determinante de complementariedad (CDR) de cadena pesada H1 que tiene la secuencia de aminoácidos TSGMSVG (SEQ ID NO: 3), una CDR de cadena pesada H2 que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (Se Q ID NO: 4), una CDR de cadena pesada H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SMITNWYFDV (SEQ ID NO: 5); una CDR de cadena ligera L1 que tiene la secuencia de aminoácidos KCQLSVGYMH (SEQ ID NO: 7), una CDR de cadena ligera L2 que tiene la secuencia de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO: 8), y una CDR de cadena ligera L3 que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 9). El anticuerpo Synagis® y su secuencia de aminoácidos se desvela, por ejemplo, en Johnson et al., 1997, J. Infec. Dis 76:1215-1224,y en la Patente de EE.UU. 5.824.307, para la descripción del anticuerpo Synagis® y su secuencia de aminoácidos.

En una realización, la proteína recombinante es motavizumab (MEDI-524). Las secuencias de VH y VL para MEDI-524 se desvelan en el documento US 6.818.216, en donde las secuencias para MEDI-524 son tal como se proporcionan en el listado de secuencias del documento US 6.818.216 en las siguientes posiciones de secuencia: CDR1 de VH (SEQ ID NO. 10), CDR2 de VH (SEQ ID NO. 19), CDR3 de VH (SEQ ID NO: 20), CDR1 de VL (SEQ ID NO: 39); CDR2 de VL (SEQ ID NO: 5); CDR3 de VL (SEQ ID NO: 6).

En algunas realizaciones, el anticuerpo que se va a aislar es un anticuerpo diferente comercialmente disponible, elegido de adalimumab (Humira®, Abbott Laboratories), eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals), rituximab (Ritixan®, Roche/Biogen Idec/Chugai), infliximab (Remicade®, Johnson & Johnson/Schering-Plough/Tanabe), trastuzumab (Herceptin®, Roche/Chugai), bevacizumab (Avastin®, Chugai/Roche), palivizumab (Synagis®, MedImmune/Abbott), alemtuzumab (Campath®, Genzyme) y motavizumab (Numax®, MedImmune).

En algunas realizaciones, los anticuerpos que no son Synagis® se fabrican usando los presentes métodos. Los anticuerpos también pueden incluir anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados. Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir anticuerpos comercializados, tales como natalizmab (anticuerpo monoclonal humanizado anti-integrina a4), anticuerpo monoclonal humanizado anti-Alpha V Beta 6 , anticuerpo monoclonal humanizado anti-VLAI IgG1 kappa; huB3F6 (anticuerpo monoclonal humanizado IgG1 /kappa). En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal recombinante dirigido contra CD-3, CD-4, c D-8, CD-19, CD-20, CD-34, CD-52, HER-4, HER-3, HER-2, t Nf y/o VLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal recombinante dirigido contra un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F del RSV.

Un anticuerpo producido por el método en el presente documento puede ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. En algunas realizaciones, el anticuerpo purificado por los métodos puede ser humano, murino (por ejemplo, de ratón y rata), de burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo. Tal como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.939.598 por Kucherlapati et al.

Un anticuerpo puede incluir, por ejemplo, anticuerpos naturales, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo que se unen a y/o reconocen uno o más antígenos), anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Pat. de EE.UU. N.° 5.591.669 y 5.545.807), anticuerpos y fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de fagos de anticuerpos (McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucl. Acids Res.

21:2265-2266 (1993)). Un anticuerpo puede estar fusionado de manera recombinante a un polipéptido heterólogo en el extremo N-terminal o C-terminal o conjugado químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) con péptidos u otras composiciones. Por ejemplo, un anticuerpo puede estar fusionado de manera recombinante o conjugado con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véase, por ejemplo, las publicaciones de PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Pat. de EE.UU. N.° 5.314.995; y el documento EP 396.387.

En otra realización, la concentración de la proteína de la proteína recombinante en la composición que comprende una proteína recombinante es de 0,1 mg/ml a 1000 mg/ml, de 10 mg/ml a 500 mg/ml, de 50 mg/ml a 250 mg/ml, de 75 mg/ml a 150 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína recombinante es de 100 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína recombinante es 10 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml, 1000 mg/ml.

IV. Incorporación en un proceso de producción

El presente método de desgasificación se puede incorporar en múltiples procesos de producción diferentes para composiciones que comprenden proteínas recombinantes. Aunque ciertos procesos de producción se describen en el presente documento, el presente método de desgasificación se puede incluir en otros procesos de fabricación para lograr los beneficios descritos en el presente documento. En una realización, están presentes burbujas en la línea de llenado si el método de desgasificación no se usa y/o un anillo está presente en el vial u otro recipiente si no se usa un método de desgasificación.

En una realización, está presente al menos un tensioactivo en la composición. En una realización, el proceso de producción no añade tensioactivo a la composición. En una realización, no hay tensioactivo presente en la composición.

En una realización, se describe un proceso de producción en el documento WO2014071344A2 para los métodos de aislamiento de Synagis® en ausencia de benzonasa.

En una enseñanza, un proceso de producción incluye un método de aislamiento de Synagis® a partir de una composición que comprende Synagis®, comprendiendo el método:

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio iónico en la composición;

b. realizar un proceso de purificación por afinidad en la composición; y

c. realizar un proceso de filtración en la composición;

d. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición,

en donde un producto final que comprende Synagis® es resultado de (a), (b), (c) y (d) en donde el producto final es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg, y en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

En otra enseñanza, un proceso de producción incluye un método de aislamiento de Synagis® a partir de una composición que comprende Synagis®, comprendiendo el método:

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición para formar un primer producto que comprende Synagis®;

b. añadir un tampón al primer producto para formar un producto tamponado;

c. realizar un proceso de purificación por afinidad en el producto tamponado para formar un segundo producto que comprende Synagis®;

d. realizar un proceso de filtración en el segundo producto para formar un tercer producto que comprende Synagis®; e. realizar un proceso de inactivación vírica en el tercer producto; y

f. formular el tercer producto para formar un producto final que comprende Synagis®, en donde el producto final es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg; y g. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición,

en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

En otra enseñanza, un proceso de producción incluye un método de aislamiento de Synagis® a partir de una composición que comprende Synagis®, comprendiendo el método al menos tres de (a)-(e) y comprendiendo además (f):

a. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición;

b. realizar un proceso purificación por afinidad en la composición;

c. realizar un proceso de ultrafiltración en la composición;

d. realizar un proceso de inactivación vírica en la composición; y

e. realizar un proceso de cromatografía de intercambio catiónico en la composición;

f. desgasificar la composición antes de llenar los viales con la composición,

en donde el producto resultante de los al menos tres de (i)-(v) y (vi) comprende Synagis® y es adecuado para la administración a un ser humano y tiene una concentración de ADN de < 0,5 pg/mg; y en donde el método no comprende añadir benzonasa a la composición.

Los métodos de aislamiento del anticuerpo pueden incluir diversos medios conocidos en la materia, por ejemplo, centrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración, y combinaciones de las anteriores, por nombrar solo unas pocas. El método de purificación generalmente se elige basándose en una característica del anticuerpo que lo distingue de una o más impurezas que coexisten con el anticuerpo en una composición.

Los métodos tal como se describen en el presente documento pueden utilizar un proceso de cromatografía por intercambio iónico para aislar el anticuerpo, por ejemplo, Synagis®, de una o más impurezas en la composición. La cromatografía por intercambio iónico se refiere tanto a la cromatografía por intercambio catiónico como a la cromatografía por intercambio aniónico. Para los fines del presente documento, "cromatografía por intercambio catiónico" se refiere a cualquier método mediante el cual se puede separar una composición que comprende el anticuerpo y una o más impurezas basándose en diferencias de carga usando una matriz de intercambio catiónico. Una matriz de intercambio catiónico generalmente comprende grupos cargados negativamente unidos covalentemente. Pueden emplearse resinas de intercambio catiónico débiles o fuertes. Habitualmente, las resinas de intercambio catiónico fuertes comprenden grupos orgánicos soportados que comprenden ácido sulfónico o grupos sulfonato, dependiendo del pH. Las resinas de intercambio catiónico débiles comúnmente comprenden grupos orgánicos soportados que comprenden ácido carboxílico o grupos carboxilato, en función del pH. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar resinas de intercambio catiónico multimodales, que incorporan mecanismos de unión adicionales, así como las interacciones iónicas, por ejemplo, una o más interacciones de enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas. Ejemplos de resinas de intercambio catiónico adecuadas son bien conocidas en la materia, y pueden incluir, pero sin limitación, Fractogel®, carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S), PROPAC WCX-10™ (Dionex), Capto™ S, S-Sepharose FF, Fractogel® ^e M^d SO3M, Toyopearl® Megacap® II SP 550C, Poros® 50 HS, y matriz de SP-sepharose. En algunas realizaciones, la resina catiónica se elige de Capto™ S, S-Sepharose FF, Fractogel® EMD SO3M, Toyopearl® Megacap® II SP 550C, Poros® 50 HS. En ciertas realizaciones, la resina catiónica es Poros® 50 HS. En algunas enseñanzas, más de un proceso de cromatografía de intercambio catiónico se puede emplear en la composición. En algunas enseñanzas, el proceso de cromatografía de intercambio catiónico se emplea en modo de unión con respecto al anticuerpo, es decir, se emplea de tal manera que el anticuerpo de interés se adsorbe a la matriz de intercambio catiónico, mientras que una o más impurezas no se adsorben, aislando así el anticuerpo de la impureza. En algunas enseñanzas, la matriz de intercambio catiónico se lava una o más veces con un tampón para eliminar impurezas adicionales antes de que el anticuerpo adsorbido se retire de la matriz de intercambio catiónico. Después de que una o más impurezas se han retirado de una composición empleando la cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión, en anticuerpo adsorbido se puede eluir de la matriz de intercambio catiónico. Los métodos de elución del anticuerpo de la matriz de intercambio catiónico dependen de la matriz y son conocidos por los expertos en la materia.

Como alternativa, en algunas enseñanzas, el proceso de intercambio catiónico se puede emplear en modo de flujo continuo, es decir, se emplea de tal manera que el anticuerpo de interés no se adsorbe a la matriz de intercambio catiónico, mientras que una o más impurezas se adsorben a la matriz, aislando así el anticuerpo de la impureza. En el modo de flujo continuo, se adsorben una o más impurezas a (o son impedidas por) la matriz de intercambio catiónico, y el anticuerpo pasa a través de la matriz hacia la solución de flujo continuo.

En algunas enseñanzas, el proceso de cromatografía de intercambio iónico es un proceso de cromatografía de intercambio aniónico. Para los fines del presente documento, "cromatografía por intercambio aniónico" se refiere a cualquier método mediante el cual se puede separar una composición que comprende el anticuerpo y una o más impurezas basándose en diferencias de carga usando una matriz de intercambio aniónico. Una matriz de intercambio aniónico generalmente comprende grupos cargados positivamente unidos covalentemente. Se pueden emplear matrices de intercambio aniónico fuertes o débiles. Ejemplos de matrices de intercambio aniónico fuertes incluyen, por ejemplo, aquellas que tienen un ion amonio cuaternario. Ejemplos de matrices de intercambio aniónico débil incluyen, por ejemplo, aquellas que tiene un grupo amino funcional terciario o secundario, tal como DEAE (dietilaminoetilo). En ciertas enseñanzas, se pueden utilizar matrices de intercambio aniónico multimodales, que incorporan mecanismos de unión adicionales, así como las interacciones iónicas, por ejemplo, una o más interacciones de enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas. En la materia se conocen ejemplos de matrices de intercambio aniónico, y pueden incluir, pero sin limitación, Super Q, Sartobind® Q, Natrix® Q, Chromasorb™ Q, y Mustang® Q. En algunas enseñanzas, la matriz de intercambio aniónico es Super Q. En algunas enseñanzas, se puede emplear más de un proceso de intercambio aniónico en la composición.

En algunas enseñanzas, el proceso de cromatografía de intercambio aniónico se emplea en modo de unión con respecto al anticuerpo, es decir, se emplea de tal manera que el anticuerpo de interés se adsorbe a la matriz de intercambio aniónico, mientras que una o más impurezas no se unen, aislando así el anticuerpo de la impureza. En algunas enseñanzas, la matriz de intercambio aniónico se lava una o más veces con un tampón para eliminar impurezas adicionales antes de que el anticuerpo adsorbido se retire de la matriz de intercambio aniónico. Después de que una o más impurezas se han retirado de una composición empleando la cromatografía de intercambio aniónico en modo de unión, en anticuerpo adsorbido se puede retirar de la matriz de intercambio aniónico.

En algunas enseñanzas, el proceso de intercambio aniónico se emplea en modo de flujo continuo, es decir, se emplea de tal manera que el anticuerpo de interés no se adsorbe de manera significativa a la matriz de intercambio aniónico, mientras que una o más impurezas se adsorben a (o se impiden por) la matriz, aislando así el anticuerpo de la impureza. Después de que una o más impurezas se han retirado de una composición empleando la cromatografía de intercambio aniónico en modo de flujo continuo, en anticuerpo adsorbido se puede obtener del flujo continuo de la matriz de intercambio aniónico.

En algunas enseñanzas, los métodos pueden comprender más de un proceso de intercambio iónico, por ejemplo, un segundo proceso de intercambio iónico. En algunas realizaciones, el primer proceso de intercambio iónico es un proceso de intercambio catiónico es un proceso de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, se usan tres procesos de cromatografía de intercambio iónico.

Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizar un proceso de purificación por afinidad para aislar el anticuerpo de una o más impurezas en la composición. Tal como se usa en el presente documento, "proceso de purificación por afinidad" o "cromatografía de afinidad" se refiere a un método de separación mediante el cual un anticuerpo se purifica en virtud de sus propiedades de unión específicas a un ligando de afinidad por un anticuerpo. En algunas enseñanzas, el ligando de afinidad funcional se puede inmovilizar en un soporte sólido o semisólido, para que cuando una composición que comprende el anticuerpo pase sobre el ligando y el soporte sólido, el anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica para el ligando se adsorbe al ligando, y uno o más componentes de la composición no se adsorben, o se unen a una menor afinidad, y se pueden separar del anticuerpo. En algunas realizaciones, el soporte sólido que comprende el ligando se lava una o más veces con un tampón para eliminar impurezas adicionales antes de que el anticuerpo adsorbido se elimine del ligando y el soporte. Después de que se han retirado una o más impurezas, el anticuerpo adsorbido se puede retirar del ligando y el soporte, dando como resultado un aislamiento del anticuerpo de la composición original.

Los métodos para retirar el anticuerpo del ligando y del soporte dependen del ligando y son conocidos por los expertos en la materia, y pueden incluir, por ejemplo, cambios en el ambiente, por ejemplo, pH, adición de agentes caotrópicos o desnaturalizantes, o adición de tampones de elución comercialmente disponibles. En algunas realizaciones, se pueden emplear más de un proceso de purificación por afinidad en la composición que comprende el anticuerpo.

En la materia se conocen diversos procesos de purificación por afinidad, e incluyen, pero sin limitación, el uso de Proteína A, Proteína G o combinaciones de las mimas como ligandos. Los ligandos se pueden inmovilizar en diversos soportes, por ejemplo, una resina. En algunas realizaciones, el proceso de purificación por afinidad comprende un proceso de purificación con Proteína A, por ejemplo, en donde el anticuerpo se adsorbe a la Proteína A, y la Proteína A se acopla a un soporte inmovilizado, por ejemplo, una resina. Diversos sistemas de afinidad por Proteína A están comercialmente disponibles, e incluyen MabSelect™, MabSelect™ SuRe™, MabSelect Xtra™, Sepaharose CL-4B, ProSep® vA, ProSep® vA Ultra, Ceramic HyperD®, y Poros® MabSelect™. En algunas enseñanzas, el proceso de purificación por afinidad comprende un proceso de purificación con Proteína G, por ejemplo, cuando el anticuerpo se adsorbe a la Proteína G, y la proteína G se acopla a un soporte inmovilizado, por ejemplo, una resina. Las resinas listas para usar y los kits de purificación son conocidos por los expertos en la materia.

En algunas enseñanzas, el ligando es un antígeno, por ejemplo, un péptido o hapteno, acoplado a un soporte inmovilizado, en donde el anticuerpo es selectivamente adsorbido al antígeno. Las resinas activadas y los kits completos para preparar antígenos inmovilizados mediante una variedad de químicas son conocidos por los expertos en la materia.

En algunas enseñanzas, se pueden usar otros ligandos, y se conocen en la materia. Véase, por ejemplo, los textos de referencia Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr (1997); y Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, Nueva York (1997). Por ejemplo, los ligandos de afinidad pueden incluir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, ligandos naturales o análogos de ligando (por ejemplo, para un receptor particular), y miembros de unión naturales o análogos de los mismos (por ejemplo, para un complejo multisubunidad).

En algunas enseñanzas, la composición experimenta múltiples ciclos de los procesos de purificación por afinidad.

Los métodos pueden utilizar un proceso de filtración para aislar el anticuerpo de una o más impurezas en la composición. Las expresiones "proceso de filtración" y "filtración" se refieren al proceso de retirada de partículas suspendidas de una composición pasando la composición a través de uno o más filtros semipermeables (o membrana o medio) de un diámetro de tamaño de poro específico, en donde se retienen moléculas más grandes (generalmente >103-106 Da) en el filtro, mientras que el agua y las moléculas de menos peso molecular pasan a través del filtro.

En algunas enseñanzas, después de la filtración, el anticuerpo está sustancialmente en el flujo del permeado (es decir, pasa a través de los poros del filtro y se recolecta), mientras que una impureza (por ejemplo, restos celulares, ADN y/o proteína de la célula hospedadora) está sustancialmente en el flujo del retenido. En algunas enseñanzas, después de la filtración, el anticuerpo está sustancialmente en el flujo del retenido, mientras que una impureza está sustancialmente en el flujo del permeado. La expresión "flujo del permeado", cuando se refiere a la filtración, se refiere a la fracción de la composición que pasa a través de los poros del filtro durante la filtración. La expresión "flujo del retenido", cuando se refiere a la filtración, se refiere a la fracción de la composición que permanece en el filtro o que no pasa a través de los poros del filtro durante la filtración.

Los tipos adecuados de los equipos de filtración son conocidos por los expertos en la materia y se pueden seleccionar basándose en diversos factores, por ejemplo, el peso molecular del anticuerpo que se va a filtrar, la cantidad y el tamaño de los componentes de la composición que se va a filtrar, el volumen de la composición que se va a filtrar y la densidad y viabilidad celular de la composición que se va a filtrar. En algunas enseñanzas, se pueden usar filtros, tales como los ultrafiltros de membrana, los ultrafiltros de placa, los ultrafiltros de cartucho, los ultrafiltros de bolsa o los ultrafiltros de vacío. Los ultrafiltros comercialmente disponibles que se pueden emplear se fabrican por diversos proveedores tales como Millipore Corporation (Billerica, Mass.), Pall Corporation (East Hills, N.Y.), GE Healthcare Sciences (Piscataway, N.J.), y Sartorius Corporation (Goettingen, Alemania).

En otro modo, un proceso de ultrafiltración comprende un proceso de conservar la proteína recombinante en la composición y concentrarla permitiendo que fluya el soluto a través del dispositivo de ultrafiltración.

En algunas enseñanzas, el método comprende además un proceso de inactivación del virus. Tal como se usa en el presente documento, "proceso de inactivación del virus" se refiere a (1) la inactivación de un virus, (2) la retirada física de un virus, o (3) combinaciones de las mismas. Cuando se refiere a la inactivación de virus, los virus pueden permanecer en el producto final, pero en una forma no infecciosa. En algunas enseñanzas, el proceso de inactivación del virus comprende incubar la composición, por ejemplo, a un pH bajo suficiente como para inactivar (por ejemplo, desnaturalizar) un virus. En algunas enseñanzas, el proceso de inactivación del virus comprende ajustar el pH de la composición a un pH de 5,0 o menos, 4,5 o menos, 4,0 o menos, o 3,5 o menos. En algunas realizaciones, el pH de la composición se ajusta a un pH de 1,0 a 5,0, 1,5 a 4,5, 2,0 a 4,0, o 2,5 a 3,5. En algunas realizaciones, el proceso de inactivación del virus comprende incubar la composición a un pH de menos de 4,0, 2,8 a 3,2, o 3,0. En algunas enseñanzas, el proceso de inactivación del virus comprende incubar la composición que comprende el anticuerpo a un pH de menos de 4,0.

El pH de la composición se puede reducir durante diversas duraciones de tiempo suficientes para que tenga lugar la inactivación vírica, por ejemplo, de 1 minuto a 2 horas, o de 10 minutos a 90 minutos, de 20 minutos a 80 minutos, de 25 minutos a 35 minutos o 30 minutos. Los métodos de alteración del pH son conocidos por los expertos en la materia.

En algunas enseñanzas, el proceso de inactivación vírica puede incluir el tratamiento con disolventes o detergentes, irradiación y/o breves exposiciones a altas temperaturas suficientes para inactivar un virus. Los métodos de inactivación vírica por estos medios son conocidos por los expertos en la materia, y un experto en la materia puede seleccionar un tratamiento apropiado que se va a usar durante el aislamiento del anticuerpo.

En algunas enseñanzas, el proceso de inactivación vírica puede incluir la retirada física del virus de la composición por medio de nanofiltración. El término "nanofiltración" se refiere al paso físico de la composición a través de una matriz, por ejemplo, un filtro, membrana, etc., de tal manera que el anticuerpo en la composición se separa de uno o más virus. En algunas enseñanzas, la nanofiltración comprende pasar la composición a través de una matriz que tiene un tamaño de poro de menos de 75 nm, 50 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm o 15 nm. Diversos nanofiltros están comercialmente disponibles y se conocen en la materia.

En algunas enseñanzas, se utilizan dos procesos de inactivación del virus, por ejemplo, (1) un proceso de inactivación del virus que comprende incubar la composición a un pH de menos de 4.0, y (2) un proceso de inactivación del virus que comprende someter la composición a un proceso de nanofiltración. En algunas realizaciones, se utilizan tres o más procesos de retirada del virus separados.

Se pueden usar diversos sistemas de tampón durante el proceso de aislamiento. En algunas realizaciones, el tampón se selecciona de tampón MES, tampón Tris, tampón de fosfato de sodio, tampón de ftalato, tampón citrato, tampón acetato y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón es un tampón Tris, opcionalmente un tampón Tris/magnesio.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Un experimento de desgasificación en tanque de 65 litros

Se realizaron estudios para determinar el impacto del vacío, del volumen y del tiempo sobre la desgasificación. Usando un tanque de 65 litros, se filtró la sustancia de fármaco en un tanque limpio y presurizado a 20 psig y se almacenó a 2-8°C durante 1 semana para aumentar el oxígeno disuelto. Para la desgasificación, se aplicó un vacío para lograr un vacío diana, se cerró la válvula y se desgasificó durante una duración especificada.

La salida del tanque estaba conectada directamente a la entrada de una bomba de pistón. Una línea de tubería transparente se extendía desde la salida de la bomba hasta una boquilla que llenaría un recipiente para simular el llenado de viales. La línea se configuró en forma de U invertida. La línea de tubería se purgó al comienzo del llenado para asegurar que no había burbujas en la línea. El llenado comenzó y se controló la formación de burbujas en el bucle y en la salida de la bomba. También se registró el tiempo y el volumen de la sustancia farmacéutica dispensada en el primer caso de formación de burbujas.

Ejemplo 2. Impacto del vacío sobre la desgasificación de una solución de 40 litros en un tanque de 65 litros

Tras el protocolo del Ejemplo 1, se evaluó el impacto del vacío sobre la desgasificación de una composición que comprende 1 mg/ml de MEDI-524. Se varió la presión de desgasificación, con valores a 99, 268 y 505 mbar. El tiempo de desgasificación fue de 1 a 4 días, tal como se indica en la si uiente tabla.

Se observaron burbujas en la composición desgasificada a 505 mbar. Esto muestra que una combinación de vacío y tiempo se puede emplear para desgasificar una solución y que incluso en tiempos más largos, un vacío débil puede no ser eficaz en la desgasificación.

Ejemplo 3. Impacto del vacío sobre la desgasificación de una solución de 40 litros en un tanque de 65 litros durante un período de dos días

Tras el protocolo del Ejemplo 1, se evaluó el impacto del vacío sobre la desgasificación de una composición que comprende 1 mg/ml de MEDI-524. Se varió la presión de la desgasificación con valores a 99 y 268 mbar. La desgasificación se llevó a cabo durante un período de 2 días, aunque el número preciso de horas varió ligeramente entre las muestras, tal como se muestra a continuación.

No se vieron burbujas en la composición desgasificada a 99 mbar, pero se observó una cantidad significativa de burbujas en la composición desgasificada a 268 mbar. Las Figuras 1A y B muestran la línea de llenado, con la Figura 1A que muestra una imagen de la línea de llenado al comienzo del proceso de llenado para la composición desgasificada a 268 mbar y la Figura 1B muestra una imagen del final del proceso de llenado (8,4 kg de lleno) para la composición desgasificada a 268 mbar. Las burbujas en la línea de llenado aguas abajo de la bomba de pistón pueden dar como resultado variación del peso del llenado en una fabricación comercial y un proceso de llenado de viales, puede requerir la interrupción del llenado y la purga de la línea. Esto puede dar como resultado una pérdida significativa del producto.

Ejemplo 4. Impacto del volumen en la desgasificación

Tras el protocolo del Ejemplo 1, también se evaluó el impacto del volumen sobre la desgasificación de una composición que comprende 1 mg/ml de MEDI-524. Se varió la presión de desgasificación, con valores a 99 y 268 mbar. El tiempo de desgasificación fue de 72 horas (para la presión de desgasificación de 268 mbar) y 46 horas (para la presión de desgasificación de 99 mbar .

Para la solución de 60 litros, se observaron las burbujas de la línea de llenado desde el comienzo del llenado para ambas muestras de 99 y 268 mbar. Las burbujas también aumentaron con un volumen dispensado en aumento. Los datos muestran que el volumen puede afectar a la capacidad para desgasificar una solución.

Las Figuras 2A y B muestran las burbujas de la línea de llenado a un llenado de ~400 ml (Figura 2A) y a un llenado de ~1400 ml (Figura 2B). Más burbujas son visualmente evidentes más adelante en el proceso de llenado para la composición desgasificada a 268 mbar.

Ejemplo 5. : Impacto del tiempo en la desgasificación

Tras el protocolo del Ejemplo 1, también se evaluó el impacto del tiempo en la desgasificación de una composición que comprende 1 mg/ml de m Ed I-524 a un volumen fijado de 40 litros para la solución y una presión fijada de 99 mbar. El tiempo de ifi i n v ri n n i i n l 24 h r 4 h r im l n r xim m n 1 2 días).

En las Figuras 3A y B se muestra una fotografía de la línea de llenado para la composición desgasificada durante 1 día, con la Figura 3A mostrando una imagen de la línea de llenado a ~300 ml de llenado y la Figura 3B mostrando una imagen de la línea de llenado a ~650 ml de llenado. Se pueden visualizar más burbujas en el punto de llenado de ~650 ml. Ejemplo 6. Impacto de la concentración de proteína en la desgasificación

Después del protocolo del Ejemplo 1, también se evaluó el impacto de la concentración de proteína en la desgasificación de una composición, a un volumen de solución fijado de 40 litros, una presión fijada de 99 mbar, y durante un tiempo de 2 días (con el número real de horas que varía ligeramente tal como se muestra a continuación). Se evaluó tanto una concentración de 1 mg/ml (MEDI-524) como una de 100 mg/ml (Synagis®). No se observaron burbujas en ninguna de las condicione r . L r l m r n n l T l .

Esto muestra que la concentración de proteína no tiene o tiene el mínimo impacto en la formación de burbujas en las líneas de llenado.

Ejemplo 7. Predicciones de desgasificación de aplicar el indicador de burbujas

Para predecir el incidente de la formación de burbujas, se consideraron los siguientes parámetros y se aplicaron a la fórmula del indicador de burbujas:

Volumen de solución (V en ml)

Vacío de desgasificación (P en mbar)

Tiempo de desgasificación (t en h)

Altura del líquido (h1 en cm) - calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico

Altura de aire/ espacio libre (ha en cm)

El valor del indicador de burbujas se calculó para diversas condiciones experimentales y se comparó con las observaciones empíricas reales de si las burbujas estaban presentes en las líneas de llenado después de la desgasificación. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Excepto cuando se indicó, la desgasificación se realizó en un tanque de 65 litros.

Basándose en estos datos, un valor indicador de burbujas de al menos 5,9 probablemente dará como resultado que no haya burbujas en las líneas de llenado.

Ejemplo 8. Investigación del anillo de Synagis®

Se observaron anillos en los viales de Synagis®, principalmente por ejemplo en los viales de 50 y 100 mg. Esto aparece como un anillo blanco muy tenue ubicado en la interfaz aire-líquido que se adhiere firmemente al costado de la pared de vidrio, como se muestra en la Figura 4 como un anillo blanco que se muestra sustancialmente horizontalmente en el vidrio del vial a la izquierda de la flecha indicadora.

En investigaciones, se han determinado los siguientes factores:

• los gases disueltos y las burbujas son inherentes al proceso de la sustancia de fármaco para Synagis®;

• la presencia de burbujas y no tensioactivo lleva a la formación del anillo en los viales;

• el proceso de acabado del llenado del producto farmacéutico no influye en la formación de anillos, con anillos formados en el fármaco que se llena a mano directamente desde los tanques;

• la presencia del anillo no afecta a la calidad del producto, pero puede ser un defecto estético visualmente molesto;

• el aislamiento del anillo por digestión tríptica muestra que la proteína en el anillo es Synagis®;

• la formación del anillo es reproducible a pequeña escala.

Sin embargo, no se esperaba que la formación de burbujas y el problema de las burbujas en línea estuvieran conectados a la formación del anillo porque las burbujas en línea se ven con más moléculas que las que presentan la formación del anillo.

Sorprendentemente, se ha demostrado que la desgasificación evita la formación del anillo. La Figura 5 muestra los resultados de la inspección visual de lotes producidos a escala experimental a partir de la sustancia del fármaco desgasificada y no desgasificada. Para el estudio se usaron dos tanques de acero inoxidable de 65 litros, que contienen cada uno aproximadamente 20 litros de SF palivizumab. Uno de los tanques se almacenó bajo presión positiva (sustancia de fármaco no desgasificada) y el segundo tanque se almacenó al vacío (sustancia de fármaco desgasificada). Tanto la SF desgasificada como la no desgasificada se usaron para llenar una línea de viales de vidrio transparente de 3 cc usando el filtro M&O Perry con una bomba de pistón giratoria de acero inoxidable. Aproximadamente se llenaron 387 viales de SF desgasificada y 389 viales se llenaron con SF no desgasificada. Todos los viales se inspeccionaron visualmente a las 48 horas, 7 días, y 2 meses tras el llenado frente a un fondo negro y blanco para detectar anillos.

Ejemplo 9. Composición del anillo de Synagis®

Se realizó una evaluación para determinar la composición del anillo que se forma en la pared de los viales de Synagis®. Se usó FTIR para identificar el aislado del anillo recolectado en una superficie del filtro. La muestra, preparada tal como se describe anteriormente, se analizó usando un microscopio FTIR. La sustancia recolectada mostró características distintivas al IR consistentes con proteína (banda amida-I; 1600-1700 cm-1 y banda amida-II; 1510-1580 cm-1) y polidimetil siloxano (1260 cm-1). Un segundo derivado de la banda de amida II mostró una banda dominante a 1638 cm-1 que se corresponde con estructuras beta laminares naturales típicamente observadas en moléculas de IgG naturales. Estos resultados indican que la proteína del anillo está compuesta de estructuras beta laminares naturales. El estrés por calor o cizalladura de IgG1 desplazaría el pico principal del segundo derivado a 1628 cm-1, lo que indica interacciones intermoleculares mostradas con la agregación (bien soluble o insoluble). FTIR muestra que el anillo contiene proteína y aceite de silicona.

La estructura secundaria de la proteína aislada del anillo se evaluó mediante un segundo análisis del derivado del pico de amida-I. La proteína en el aislado de anillo tiene una conformación natural tal como se determina mediante FTIR. Los resultados de muestran en la Figura 6.

Las digestiones trípticas se realizaron en la proteína en el anillo. Los viales se lavaron cuidadosamente con tampón de formulación y se usó una alícuota separada para aislar el anillo mediante agitación y pipeteo enérgico. La sustancia recolectada se filtró después a través de un filtro de 0,2 |jm, se lavó y se secó. Los filtros se incubaron en una solución de guanidina a 37 °C, y la solución se redujo y se alquiló antes de la digestión con tripsina. La digestión tríptica se separó usando una columna C18 controlando los rayos UV (Abs 220 nm) y la masa (por espectrometría de masas, MS). Los péptidos trípticos se identificaron en relación con un estándar de referencia por masa (que se corresponde a la composición de los aminoácidos) y por patrón de fragmentación (usando MS/MS). Se aplicó solo tampón al filtro como control. Los resultados de muestran en la Figura 7. Las digestiones trípticas muestran que la proteína en el anillo es Synagis®.

Ejemplo 10. El tensioactivo puede evitar la formación del anillo

La sustancia de fármaco con y si tensioactivo PS-80 (0.02 %) se presurizó para aumentar los gases disueltos y las burbujas. Los viales se llenaron usando un filtro M&O Perry con una bomba de pistón giratoria de acero inoxidable. Se filtraron aproximadamente 160 ml de SF palivizumab en cada uno de los dos recipientes de PETG de 250 ml. A uno de los recipientes se le añadió polisorbato 80 (PS-80) al 0,02 %. Ambos recipientes PETG se colocaron en un tanque de acero inoxidable hecho a medida y se presurizaron con aire hasta 20 psig. Los tanques se almacenaron a 2-8°C en el agitador orbital durante aproximadamente 43 horas para aumentar los gases/burbujas disueltas. Aproximadamente 112 viales se llenaron con cada uno de los recipientes PETG en viales de 3 cc usando el llenado con M&O Perry con bomba de pistón giratorio de B&S. Los viales se dividieron en dos conjuntos de 56 viales cada uno y se inspeccionaron visualmente a los 2 días y a los 7 días tras el llenado frente a un fondo negro y blanco para detectar los anillos. Todos los viales de control tenían anillos y ninguno de los viales a los que se les añadió PS-80 tenían anillos. Se observaron burbujas en la línea de llenado tanto en la sustancia de fármaco de control como a la que se le añadió PS-80. Esto apoya la hipótesis de que PS-80 evita la absorción de proteína a la interfase aire-líquido (burbujas).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de producción de viales que contienen una composición líquida que comprende una proteína recombinante, comprendiendo el método:

a. proporcionar un recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante opcionalmente en donde el recipiente se ha almacenado bajo presión positiva;

b. aplicar un vacío al recipiente;

c. permitir que el vacío desgasifique la composición; y

llenar los viales con la composición desgasificada que comprende una proteína recombinante,

en donde un valor indicador de burbujas (BI, por sus siglas en inglés) es al menos 5,9 y se calcula usando la siguiente fórmula:

en donde

V= volumen de la solución (ml)

P=vacío desgasificante (mbar)

t=tiempo de la desgasificación (h)

h1=altura del líquido (cm) (calculada asumiendo que el tanque es cilíndrico) y

ha=altura del aire/espacio libre (cm).

2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante es palivizumab.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante comprende:

una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante comprende:

una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 2 y una región variable de cadena ligera de la cadena ligera de la SEQ ID NO:6.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante comprende:

una región determinante de complementariedad (CDR) de H1 que tiene la secuencia de aminoácidos TSGMSVG (SEQ ID NO: 3), una CDR de H2 que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO: 4), una CDR de H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SMITNWYFDV (SEQ ID NO: 5); una CDR de L1 que tiene la secuencia de aminoácidos KCQLSVGYMH (SEQ ID NO: 7), una CDR de L2 que tiene la secuencia de aminoácidos DTSKLAS (SEQ ID NO: 8), y una CDR de L3 que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 9).

6. El método de la reivindicación 1, en donde el recipiente que contiene una composición que comprende una proteína recombinante se ha almacenado bajo presión positiva.

7. El método de la reivindicación 1, en donde se aplica un vacío durante desde 12 horas hasta 5 días, o

durante desde 1 día hasta 4 días.

8. El método de la reivindicación 1, en donde se aplica un vacío a desde 50 mbar o 60 mbar hasta 268 mbar.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el vacío aplicado es mayor de 50 mbar y menos de o igual a 268 mbar.

10. El método de la reivindicación 1, en donde se aplica un vacío a un volumen de la composición que comprende una proteína recombinante de 20 litros a 250 litros o de 40 litros a 70 litros.

11. El método de la reivindicación 1, en donde se aplica un vacío a un volumen de la composición de 40 litros, 65 litros o 125 litros.

12. El método de la reivindicación 1, en donde no más de 50 litros de la composición están presentes en un tanque de 65 litros, o

en donde no más de 76 litros de la composición están presentes en un tanque de 125 litros.

13. El método de la reivindicación 1, en donde 45,1 litros de la composición están presentes en un tanque de 65 litros, o en donde 68,1 litros de la composición están presentes en un tanque de 125 litros.

14. El método de la reivindicación 1, en donde la composición que comprende la proteína recombinante no comprende un tensioactivo, o en donde no se añade un tensioactivo a la composición que comprende la proteína recombinante.

15. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de la proteína recombinante en la composición que comprende una proteína recombinante es de 0,1 mg/ml a 1000 mg/ml, o

en donde la concentración de la proteína recombinante en la composición que comprende una proteína recombinante es de 100 mg/ml.