BR112012004054B1

BR112012004054B1 - Método para produzir um anticorpo anti-her2

Info

Publication number: BR112012004054B1
Application number: BR112012004054-5A
Authority: BR
Inventors: Roberto Falkenstein; Klaus Schwendner
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2021-09-08
Also published as: HK1210183A1; SI3133083T1; JP5458183B2; JP2013505733A; PT2483305T; BR112012004054A2; AU2010302662B2; DK2483305T3; US20240132574A1; CN102574913A; MX2012003727A; PL2483305T3; AU2010302662A1; LT2483305T; MX342442B; IL255658A; KR101508044B1; CA2773674A1; ES2787403T3; HRP20161693T1

Abstract

métodos para produzir uma solução de imunoglobulina e kit. no presente documento é relatado um método para a filtração final de soluções de polipeptídeo concentrado que compreendem a combinação de duas etapas de filtração imediatamente consecutivas com um primeiro filtro com tamanho de poro de 3,0 (mi)m e de 0,8 (mi)m e um segundo filtro com tamanho de poro de 0,45 (mi)m e 0,22 (mi)m.

Description

[001] Neste documento é relatado um método para a filtração final de soluções de polipeptídeo concentradas que compreende a combinação de duas etapas de filtração imediatamente consecutivas com uma primeira etapa de filtração com uma pré-filtração com um filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e a filtração principal com a filtro com a tamanho de poro de 0,8 μm e uma segunda filtração com uma pré-filtração com um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e com uma filtração principal com um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Soluções de proteína com uma concentração de mais do que 100 g/l são passíveis de dificuldades durante a etapa de filtração final, por exemplo, por ter apenas fluxos de transmembranas baixos ou bloqueio do filtro empregado por agregar ou formar partículas durante a fórmula ou processo de concentração, ou devido a excipientes adicionados que resultam em uma viscosidade aumentada da solução concentrada.

[003] A combinação de viscosidade alta e conteúdo aumentado de partícula ou agregado resulta frequentemente no bloqueio dos poros de um filtro de filtração final de 0,22 μm empregado. Como uma consequência também, o filtro deve ser substituído durante a etapa de filtração, ou seja, antes do lote ser completamente processado, ou uma superfície de filtro aumentada deve ser usada.

[004] Adicionalmente, foi observado que uma combinação de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro com um tamanho de poro de 0,22 μm não tem nenhuma vantagem, por exemplo, proporcionada como o filtro Sartobran P 0,45/0,22 μm. Filtros com um tamanho de poro aumentado provável para evitar os problemas descritos anteriormente são empregados como filtros de profundidade ou pré-filtros, mas não filtros finais.

[005] No documento DE 4 204 444, uma combinação de um pré- filtro de 1,2 μm para remover gotas de água de uma corrente de gás anterior a uma filtração estéril de 0,2 μm é relatada. Uma unidade de filtro que compreende dois filtros de diferentes tamanhos de poro, pelo qual o filtro do tamanho de poro menor é flexível permitindo que a alteração da direção de fluxo do filtro curve para reduzir a resistência da unidade de filtro que é relatada no documento U.S. 4.488.961. No documento U.S. 5.643.566, uma combinação de uma pré-filtração com um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e uma filtração estéril com um filtro de um tamanho de poro de 0,22 μm é relatada. Um filtro de dois estágios construído com o uso de uma membrana com um forro interno liso uma fina e flexível membrana porosa suportada por um suporte de tela rígido com um tubo dilatador rígido é relatado no documento EP 0 204 836. Uma combinação de pelo menos duas unidades de filtros de membranas de diferentes materiais de membrana e diferentes tamanhos de poro de filtro e geometrias de poro de filtro é relatada no documento DE 3 818 860.

[006] Aldington et al. (J. Chrom. B 848 (2007) 64 a 78) relata um aumento de escala de processos de purificação de anticorpo monoclonal. No documento CS 247484 um método de preparar imunoglobulina contra linfócitos humanos é relatado.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] Foi revelado que uma combinação de dois filtros em que cada um compreende um pré-filtro e um filtro principal e cada um tem um tamanho especificamente selecionado de poro pode ser usada para filtrar soluções de imunoglobulina altamente concentradas durante a etapa de embalagem final sem o risco de bloqueio de poro e a necessidade de substituir o filtro durante o processo de filtração.

[008] Um aspecto relatado neste documento é um método para a preparação de uma solução de imunoglobulina que compreende as seguintes etapas:a) proporcionar uma solução de imunoglobulina com uma concentração de proteína de pelo menos 100 g/l,b) filtrar a solução de imunoglobulina através de uma combinação de um primeiro e segundo filtro, pelo qual o primeiro filtro compreende um pré- filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm e o segundo filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm, e com isso, preparar uma solução de imunoglobulina.

[009] Outro aspecto relatado neste documento é o uso de uma combinação de filtro conforme relatado neste documento de uma combinação de um primeiro e segundo filtro, pelo qual o primeiro filtro compreende um pré- filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm e o segundo filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm, para a filtração final de uma solução de imunoglobulina antes da preparação de ingrediente farmacêutico ativo.

[010] Outro aspecto relatado neste documento é um método para produzir uma imunoglobulina que compreende as seguintes etapas:c) proporcionar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina,d) cultivar a célula,e) recuperar a imunoglobulina da célula ou o meio de cultivo,f) purificar a imunoglobulina com uma ou mais etapas de cromatografia e proporcionar uma solução de imunoglobulina, eg) filtrar a solução de imunoglobulina da etapa d) através de uma combinação de um primeiro e segundo filtro, pelo qual o primeiro filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm e o segundo filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm, e com isso, produzir uma imunoglobulina.

[011] Um aspecto adicional relatado neste documento é um kit que compreende um primeiro filtro que compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm e o segundo filtro que compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm.

[012] Em uma realização, o primeiro filtro tem uma área que está em no máximo duas vezes a área do segundo filtro. Em outra realização, o primeiro e segundo filtro têm cerca da mesma área de filtro total. Em uma realização, a solução de imunoglobulina compreende um açúcar, e/ou um aminoácido, e/ou um tensoativo, e/ou um sal. Em uma realização adicional, a solução de imunoglobulina tem uma concentração de 100 g/l a 300 g/l. Ainda em outra realização, a solução de imunoglobulina tem um volume de 3 litros a 100 litros. Em uma realização adicional, o filtro está com uma pressão aplicada de 10 kPa a 400 kPa (0,1 a 4,0 bar). Em uma realização, a solução de imunoglobulina tem uma concentração de 160 g/l ou mais e o filtro está com uma pressão aplicada de 145 kPa (1,45 bar) ou mais. Em uma realização adicional, de 150 kPa (1,50 bar) ou mais. Em outra realização a solução de imunoglobulina compreende um açúcar e um tensoativo e tem uma concentração de 125 mg/ml ou mais e o filtro está com uma pressão aplicada de 75 kPa (0,75 bar) ou menos. Em uma realização adicional, de 70 kPa (0,7 bar) ou menos.

[013] Em uma realização, a imunoglobulina é um anticorpo alfa receptor de anti-IL13 ou um anticorpo anti-HER2. Em uma realização adicional, a purificação ocorre em uma etapa de cromatografia de afinidade com proteína A e pelo menos uma etapa selecionada de cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica, e cromatografia por interação hidrofóbica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[014] Foi revelado que, uma combinação de dois filtros ou unidade de filtros em que cada um compreende um pré-filtro e um filtro principal e em que cada um tem um tamanho de poro especificamente selecionado, pode ser usada para filtrar soluções altamente concentradas e viscosas, bem como soluções de imunoglobulinas formuladas, ou seja, que compreende um açúcar e um tensoativo, durante a etapa de embalagem final. Especialmente, a combinação de um primeiro filtro que compreende um pré- filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e um segundo filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente, é altamente vantajosa. Com uma única unidade de filtro dessa combinação, foi possível filtrar soluções altamente concentradas que contêm em total, por exemplo, 1 kg de um anticorpo anti-IL-13Ra1 ou 6 kg de um anticorpo anti- HER2 e para embalar essa quantidade com apenas uma perda mínima de substâncias. Em uma realização, uma relação de área de superfície de filtro para volume de solução foi determinada.

[015] Em uma realização, a solução de imunoglobulina compreende a imunoglobulina e um excipiente. Em outra realização, o excipiente compreende uma ou mais substâncias selecionadas a partir de açúcares, como glicose, galactose, maltose, sacarose, trealose e rafinose, aminoácidos, como arginina, lisina, histidina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, glicina, e metionina, sais, como cloreto de sódio, cloreto de potássio, citrato de sódio, citrato de potássio,fosfato de sódio, fosfato de potássio, e tensoativos, como polissorbatos, epolímeros poli (oxietileno-polioxipropileno).

[016] A filtração, como relatado neste documento, é usada como a etapa de filtração na produção de um anticorpo terapêutico. Ele pode ser executado após os excipientes exigidos, estabilizadores e/ou antioxidantes serem adicionados à solução de anticorpo altamente concentrada. Em uma realização, a relação de quantidade de anticorpo em kg para a área total do filtro é de 1.000 g/m2 a 10.000 g/m2 Em outra realização, a relação é de 1.000 g/m2 a 6.000 g/m2. Ainda em outra realização, a relação é de 4.000 g/m2 a 6.000 g/m2.

[017] Um "polipeptídeo" é um polímero que consiste em aminoácidos unidos por ligações de peptídeo, se produzido naturalmente ou sinteticamente. Polipeptídeos de menos do que cerca de 20 resíduos de aminoácido podem ser referidos como "peptídeos", enquanto moléculas que consistem em dois ou mais polipeptídeos ou que compreendem um polipeptídeo de mais do que 100 resíduos de aminoácido podem ser referidas como "proteínas". Um polipeptídeo pode também compreender componentes de não aminoácido, como grupos carboidrato, íons de metal, ou ésteres de ácidos carboxílicos. Os componentes de não aminoácido podem ser adicionados pela célula, em que o polipeptídeo é expresso, e pode variar com o tipo de célula. Polipeptídeos são definidos neste documento em termos de sua estrutura de cadeia principal de aminoácido ou o ácido nucleico que codifica o mesmo. Adições como grupos carboidrato geralmente não são especificadas, mas podem estar presentes apesar de tudo.

[018] O termo "imunoglobulina" refere-se a uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeo(s) substancialmente codificado por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina identificados incluem os diferentes genes de região constante bem como a miríade de genes de região variável de imunoglobulina. Imunoglobulinas podem existir em uma variedade de formatos, que inclui, por exemplo, Fv, Fab, e F(ab)2, bem como cadeias únicas (scFv) ou dicorpos.

[019] O termo "imunoglobulina completa" denota uma imunoglobulina que compreende dois dos chamados polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina leve (cadeia leve) e dois dos chamados polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina pesada (cadeia pesada). Cada um dos polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina leve e pesada de uma imunoglobulina completa contém um domínio variável (região variável) (geralmente a porção de terminal da cadeia de polipeptídeo) que compreende regiões de aglutinação que são capazes de interagir com um antígeno. Cada um dos polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina leve e pesada de uma imunoglobulina completa também compreende uma região constante (geralmente a porção de terminal de carboxila). A região constante da cadeia pesada media a aglutinação do anticorpo i) para células que produzem um receptor gama Fc (FcyR), como células de fagócito, ou ii) para células que produzem o receptor neonatal Fc (FcRn) também conhecido como receptor Brambell. Ela também media a aglutinação para alguns fatores que incluem fatores do sistema de complemento clássico como componente (C1q). O domínio variável de uma cadeia de imunoglobulina leve ou pesada, por sua vez, compreende diferentes segmentos, ou seja, quatro regiões de estrutura (FR) e três hiper-regiões variáveis (CDR).

[020] O termo "fragmento de imunoglobulina" denota um polipeptídeo que compreende pelo menos uma domínio do domínio variável de uma cadeia pesada, o domínio CH1, a região de articulação, o domínio CH2,o domínio CH3, o domínio CH4 de uma cadeia pesada, o domínio variável de uma cadeia leve e/ou o domínio CL de uma cadeia leve. Também compreendidos estão derivados e variantes dos mesmos. Por exemplo, um domínio variável, em que uma ou mais regiões de aminoácidos ou aminoácido são excluídas, pode estar presente.

[021] O termo "conjugado de imunoglobulina" denota um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de uma cadeia de imunoglobulina conjugada pesada ou leve por meio de uma ligação de peptídeo para um peptídeo adicional. O polipeptídeo adicional é um peptídeo de não imunoglobulina, como um hormônio, ou receptor de crescimento, ou peptídeo antifusogênico, ou fator de complemento, ou similares.

[022] O termo "filtro" denota tanto um filtro microporoso quanto macroporoso. O filtro compreende uma membrana de filtro que sozinho é composto de um material polimérico como, por exemplo, polietileno, polipropileno, copolímeros de acetato de vinila etileno, politetrafluoroetileno, policarbonato, cloreto de poli vinila, poliamidas (náilon, por exemplo, ZetaporeTM, N66 PosidyneTM), poliésteres, acetato de celulose, celulose regenerada, compósitos de celulose, polissulfonas, polietersulfonas, poliarilsulfonas, polifenilsulfonas, poliacrilonitrilo, fluoreto de polivinilideno, panos tecidos e não tecidos (por exemplo, Tyvek®), material de fibra, ou de material inorgânico, como zeólito, SiO2, A12O3, TiO2, ou hidroxiapatita. Em uma realização, a membrana de filtro do primeiro e segundo filtro é feita de acetato de celulose.

[023] Para a purificação de imunoglobulinas produzidas de forma recombinante, frequentemente, uma combinação de diferentes etapas de cromatografia por coluna é empregada. Geralmente a cromatografia de afinidade com proteína A é seguida por uma ou duas etapas de separação adicional. A etapa de purificação final é uma etapa chamada de "etapa polidora" para a remoção de impurezas e contaminantes como imunoglobulinas agregadas, HCP residual (proteína de célula hospedeira), DNA (ácido nucleico de célula hospedeira), vírus, ou endotoxinas. Para essa etapa polidora, frequentemente um material de troca de ânion em modo de fluxo direto é usado.

[024] Diferentes métodos são bem estabelecidos e expandidos usados para purificação e recuperação de proteína, como cromatografia de afinidade com proteínas microbiais (por exemplo, cromatografia de afinidade por proteína A ou proteína G), cromatografia de troca iônica (por exemplo, troca catiônica (resinas de carboximetila), troca aniônica (resinas de amino etila) e troca de modo misturado), absorção tiofílica (por exemplo, com beta- mercaptoetanol e outros ligantes SH), interação hidrofóbica ou cromatografia por absorção aromática (por exemplo, com fenil-sefarose, resinas aza- arenofílicas, ou ácido m-aminofenilborônico), cromatografia de afinidade por quelato de metal (por exemplo, com material de afinidade Ni(II) e Cu(II)), cromatografia por exclusão de tamanho, e métodos eletroforéticos (como eletroforese em gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

[025] Um primeiro aspecto como relatado neste documento é um método para a preparação de uma solução de imunoglobulina que compreende:- proporcionar uma solução de imunoglobulina com umaconcentração de proteína de pelo menos 100 g/l,- filtrar a solução de imunoglobulina através de uma combinação de uma primeira e segunda unidade de filtro, pela qual a primeira unidade de filtro compreende um pré-filtro, um filtro principal com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e a segunda unidade de filtro compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente, por aplicar a solução à combinação de filtro e por aplicar pressão, e com isso, preparar uma solução de imunoglobulina.

[026] Em uma realização, a concentração de proteína é de 100 g/l a 300 g/l. Em outra realização, a concentração de proteína é de 100 g/l até 200 g/l. Em uma realização adicional, a concentração de proteína é de 120 g/l a 165 g/l. Em outra realização, a solução de imunoglobulina tem um volume de 3 litros a 100 litros. Esse volume de solução é equivalente a uma massa total da imunoglobulina de 300 g a 50.000 g. Em uma realização, o volume é de 3,1 litros a 80 litros. Em uma concentração de proteína de 120 g/l a 165 g/l, esse volume de solução é equivalente a uma massa total da imunoglobulina de 370 g a 13.200 g. Em uma realização a imunoglobulina é um anticorpo alfa receptor de anti-IL13. Em outra realização, a imunoglobulina é um anticorpo anti-HER2.

[027] Outro aspecto como relatado neste documento é um método para produzir uma imunoglobulina que compreende as seguintes etapas:- cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina,- recuperar a imunoglobulina da célula ou o meio de cultivo,- purificar a imunoglobulina com uma ou mais etapas de cromatografia, e proporcionar uma solução purificada de imunoglobulina, e- filtrar a solução purificada de imunoglobulina através de uma combinação de filtros como relatado nesse documento, ou seja, uma combinação de uma primeira e segunda unidade de filtro, pela qual a primeira unidade de filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm, respectivamente, e a segunda unidade de filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm, respectivamente, por aplicar a solução à combinação de filtro e por aplicar pressão.

[028] Em uma realização, a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Em uma realização, em que a célula é uma célula procariótica, a célula é selecionada a partir de células E. coli, ou células de bacilo. Em uma realização, em que a célula é uma célula eucariótica, a célula é selecionada a partir de células mamíferas, em uma realização especial de células CHO, células BHK, células HEK, células Per.C6® e células hibridoma. Em uma realização, a célula é uma célula mamífera selecionada a partir de CHO-K1 e CHO DG44. Em uma realização, o cultivo está em uma temperatura de 20 °C z 40 °C, e para um período de 4 a 28 dias. Em uma realização, a purificação ocorre em uma etapa de cromatografia de afinidade com proteína A e pelo menos uma etapa selecionada de cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica, e cromatografia por interação hidrofóbica.

[029] Verificou-se que uma combinação de uma primeira unidade de filtro compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e uma segunda unidade de filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente, é vantajosa para processar (filtrar) solução de imunoglobulina altamente concentrada porque permite a filtração de um lote completo de uma solução de imunoglobulina concentrada sem a necessidade de substituir o filtro.

[030] Foi revelado, ainda, que na combinação de filtro é vantajoso que cada um dos dois filtros empregados nas unidades, bem como a combinação de filtro, tem aproximadamente a mesma área de filtro, ou seja, duas vezes a área do filtro menor.

[031] Foi revelado, ainda, que dependendo dos componentes da solução ao lado de concentração e pressão de diferente imunoglobulina, intervalos proporcionam processos vantajosos.

[032] Se a solução é uma solução de imunoglobulina concentrada com uma concentração de 160 g/l ou mais, ou seja, 165 g/l ou 170 g/l, à qual o açúcar ou tensoativo foi adicionado, então um método é operado em uma realização com uma pressão aplicada de 145 kPa (1,45 bar) ou mais, em outra de 150 kPa (1,5 bar) ou mais. Se a solução é uma solução de imunoglobulina concentrada com uma concentração de 125 g/l ou mais, ou seja, 130 g/l ou 135 g/l, à qual pelo menos um açúcar e um tensoativo foi adicionado, então o método é operado em uma realização com uma pressão aplicada de 75 kPa (0,75 bar) ou menos, em outra realização de 70 kPa (0,7 bar) ou menos.

[033] Outro aspecto relatado neste documento é um kit que compreende uma primeira unidade de filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e uma segunda unidade de filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente. Outro aspecto relatado neste documento é o uso de um filtro que compreende uma primeira unidade de filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e umasegunda unidade de filtro que compreende um pré-filtro e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente para afiltração de um solução de imunoglobulina concentrada com uma concentração de proteína de pelo menos 100 g/l.

[034] Os exemplos a seguir e as figuras são proporcionados para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações em anexo. É considerado que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.

FIGURAS

[035] Figura 1: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpo de 222 mg/ml e um pressão aplicada de 200 kPa (2 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro de 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro de 3,0 μm que contém combinação).

[036] Figura 2: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpo de 125 mg/ml suplementada com cerca de 200 mM de trealose e cerca de 0,05 % (w/v) de Tween 20 e uma pressão aplicada de 200 kPa (2 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro de 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro de 3,0 μm que contém combinação).

[037] Figura 3: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpo de 162 mg/ml e uma pressão aplicada de 180 kPa (1,8 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro de 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro 3,0 μm que contém combinação).

[038] Figura 4: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo de anti-IL13Rα com uma concentração de anticorpo de 141 mg/ml suplementada com cerca de 200 mM de trealose e cerca de 0,2 % (w/v) Poloxamer e uma pressão aplicada de 160 kPa (1,6 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro de 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro 3,0 μm que contém combinação).

[039] Figura 5: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpo de 162 mg/ml e um pressão aplicada de 110 kPa (1,1 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro de 3,0 μm que contém combinação).

[040] Figura 6: Curso de tempo de fluxo de permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-IL13Rα com uma concentração de anticorpo de 141 mg/ml suplementada com trealose e Poloxamer e uma pressão aplicada de 80 kPa (0,8 bar) (diamantes = filtro de tamanho de poro de 1,2 μm que contém combinação; quadrados = filtro de tamanho de poro de 3,0 μm que contém combinação).

[041] Figura 7: Curso de tempo de fluxo permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpos de 125 mg/ml suplementado com trealose e Tween 20 e uma pressão aplicada de 80 kPa (0,8 bar) (diamantes = filtro com tamanho de poro de 1,2 μm que contém uma combinação; quadrados = filtro com tamanho de poro de 3.0 μm que contém uma combinação).

[042] Figura 8: Curso de tempo de fluxo permeado obtido com uma solução de anticorpo anti-HER2 com uma concentração de anticorpo de 125 mg/ml suplementado com trealose e Tween 20 e uma pressão aplicada de 30 kPa (0,3 bar) (diamantes = 1.2 μm filtro com tamanho de poro de que contém combinação; quadrados = 3.0 μm filtro com tamanho de poro de que contém uma combinação).

EXEMPLO 1 MATERIAL E MÉTODOS ANTICORPO

[043] Um anticorpo exemplificador é uma imunoglobulina contra a proteína α1 receptora de IL13 (anticorpo anti-IL13Rα1), por exemplo, conforme relatado em SEQ ID NO: 01 a 12 do documento WO 2006/072564 (incorporado neste como referência).

[044] Outra imunoglobulina exemplificadora é um anticorpo anti-HER2 relatado nos documentos WO 92/022653, WO 99/057134, WO 97/04801, US 5,677,171 e US 5,821,337 (incorporados neste como referência).

FILTRO

[045] No presente documento, entre outros, um cartucho de filtro Sartobran P 0,45 μm + 0,2 μm e um cartucho de filtro Sartoclean CA 3.0 μm + 0,8 μm foram empregados de maneira exemplar. Ambos os cartuchos de filtros são disponíveis da Sartorius AG, Gottingen, Alemanha.

MÉTODOS ANALÍTICOS

[046] Cromatografia de Exclusão de Tamanho:resina: TSK 3000 (Tosohaas)coluna: 300 x 7,8 mmtaxa de fluxo: 0,5 ml/mintampão: 200 mM de fosfato de potássio que contém 250 mM de cloreto de potássio, ajustado para o pH 7,0comprimento de onda: 280 nm

[047] Sistema de limiar de DNA: vide, por exemplo, Merrick, H., e Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) páginas de 398 a 403

[048] Proteína A ELISA: Os poços de uma placa de micro título são revestidos com uma antiproteína A-IgG policlonal derivada do frango. Após a aglutinação o anticorpo não reagido é removida mediante a lavagem com amostra tampão. For proteína A aglutinação um volume de amostra definido é adicionado aos poços. A proteína A presente na amostra é aglutinada pelo anticorpo de frango e retida nos poços da placa. Após a incubação da solução de amostra é removida e os poços são lavados. Para a detecção são adicionados subsequentemente um conjugado de biotina antiproteína A-IgG policlonal derivada do frango e um conjugado de estreptavidina peroxidase. Após uma etapa de lavagem adicional uma solução substrato é adicionada o que resulta na formação de um produto colorido de reação. A intensidade da cor é proporcional ao conteúdo da proteína A da amostra. Após um tempo definido a reação é interrompida e a absorbância é medida.

[049] Proteína de célula hospedeira (HCP) ELISA: As paredes dos poços de uma placa de micro título são revestidas com uma mistura de albumina de soro e estreptavidina. Um anticorpo policlonal derivado de cabra contra HCP é aglutinado às paredes dos poços da placa de micro título. Após uma etapa de lavagem, poços diferentes da placa de micro título são incubados com uma sequência de calibragem de HCP de diferentes concentrações e soluções de amostra. Após a incubação um material de amostra não aglutinado é removido mediante a lavagem com uma solução de tampão. Para a detecção, os poços são incubados com um conjugado de anticorpo peroxidase para detectar proteína de célula hospedeira aglutinada. A atividade fixa de peroxidase é detectada por meio de incubação com ABTS e detecção em 405 nm.

EXEMPLO 2

[050] Filtração de um anticorpo anti-HER2 com um filtro único com tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm

[051] Neste exemplo é mostrado que uma solução de imunoglobulina altamente concentrada não pode ser filtrada com um filtro estéril único com um tamanho de poro de 0,45 μm (pré-filtro) e 0,22 μm (filtro principal) sem bloquear os poros do filtro com um carregamento de mais do que 2,460 g de proteína por metro quadrado de uma área de filtro.

[052] Neste exemplo, um filtro único com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm e uma área total de filtro de 0,2 metros quadrados foi empregado.TABELA1: SOLUÇÕES EMPREGADAS NA FILTRAÇÃO COM FILTRO ÚNICO.

[053] As soluções de imunoglobulina concentrada foram filtradas através do filtro único com os parâmetros conforme mostrados na Tabela 2.TABELA 2: PARÂMETROS DO PROCESSO.

[054] Para as soluções n° 3 a 5 os poros do filtro único forambloqueados antes da filtração completa do volume em batelada. Para completar a filtração o filtro bloqueado teve que ser mudado resultando em tempo adicional requerido e perda do produto. TABELA 3: RESULTADOS DA FILTRAÇÃO.

EXEMPLO 3

[055] A filtração de um anticorpo anti-HER2 com umacombinação de um primeiro filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μme um segundo filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm.

[056] Neste exemplo é mostrado que uma solução deimunoglobulina altamente concentrada pode ser filtrada com uma combinação de dois filtros com um tamanho de poro de 3,0 μm (pré-filtro) e 0,8 μm (filtro principal) e de 0,45 μm (pré-filtro) e 0,22 μm (filtro principal) sem bloquear os poros do filtro independente do carregamento da proteína por metro quadrado da área total de filtro.

[057] Neste exemplo um filtro combinado com uma primeira unidade de filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm, respectivamente, e uma segunda unidade de filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente, e uma área de filtro cada uma com 0,6 metros quadrados foi empregada. TABELA 4: SOLUÇÕES EMPREGADAS NA FILTRAÇÃO DE FILTRO COMBINADO.

[058] As soluções de imunoglobulina concentrada foram filtradasatravés da combinação de dois filtros com os parâmetros conforme mostrados na Tabela 5.TABELA 5: PARÂMETROS DO PROCESSO.

[059] Para nenhuma das soluções de N° 6 a 10 os poros dosfiltros combinados foram bloqueados antes da filtração completa do volume em batelada.TABELA 6: RESULTADOS DA FILTRAÇÃO.

EXEMPLO 4

[060] Filtração de um anticorpo anti-IL13Rα com uma combinação de filtro de um filtro com tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm e um filtro com tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm e ambos os filtros com diferentes áreas de filtro

[061] Neste exemplo é mostrado que um eluato de condicionado de proteína A pode ser filtrado com uma combinação de dois filtros mas o fluxo tem que ser reduzido se a área de filtro não estiver compatível entre os dois filtros.

[062] Neste exemplo uma unidade de filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm (pré-filtro) e 0,8 μm (filtro principal) com uma área de filtro de 1,8 metros quadrados e uma unidade de filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm (pré-filtro) e 0,22 μm (filtro principal) com uma área de filtro de 0,6 metros quadrados foi empregado.TABELA7: SOLUÇÕES EMPREGADAS NA FILTRAÇÃO DE FILTRO COMBINADO.

[063] As soluções de imunoglobulina concentrada foram filtradasatravés do filtro combinado com os parâmetros conforme mostrados na Tabela 8.TABELA 8: PARÂMETROS DO PROCESSO.

[064] Para a solução n° 11 os poros do filtro combinado forambloqueados antes da filtração completa do volume em batelada. Para completar a filtração o filtro bloqueado teve que ser mudado resultando em tempo adicional requerido e perda do produto. TABELA 9: RESULTADOS DA FILTRAÇÃO.

[065] Com a finalidade de prevenir o bloqueio de filtro como noexperimento com a solução N° 11 o fluxo através da membrana teve que ser reduzido nos experimentos com as soluções de N° 12 a 14. No experimento com a solução N° 15 o eluato de proteína A foi decantado resultando em uma perda de proteína.

EXEMPLO 5

[066] Filtração de um anticorpo anti-IL13Rα com uma combinação de filtro com tamanho de poro de filtro de 3.0 μm e 0,8 μm e um filtro com tamanho de poro 0,45 μm e 0,22 μm e ambos os filtros cada um com a mesma área de filtro.

[067] Neste exemplo é mostrado que o eluato de condicionado de proteína A pode ser filtrado com uma combinação de dois filtros sem uma redução do fluxo se a área de filtro não estiver compatível entre os dois filtros.

[068] Neste exemplo a unidade de filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e 0,8 μm tem uma área de filtro de 0,2 metros quadrados e a unidade de filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e 0,22 μm tem uma área de filtro de 0,2 metros quadrados. TABELA 10: SOLUÇÕES EMPREGADAS NA FILTRAÇÃO DE FILTRO COMBINADO.

[069] Para nenhuma das soluções n° 16 a 20, os poros do filtrocombinados foram bloqueados antes da filtração completa do volume em batelada.TABELA 11: RESULTADOS DA FILTRAÇÃO.

EXEMPLO 6

[070] Filtração de soluções de anticorpos diferentes comdiferentes combinações de filtro com concentrações de proteína diferentes, compostos diferentes na solução e diferentes pressões aplicadas

[071] Soluções que compreendem ou um anticorpo anti-IL13Rα ou um anticorpo anti-HER2 foram filtradas com uma combinação de filtro que emprega diferentes áreas de filtro e um tamanho de poro do filtro assim como diferentes excipientes e pressões aplicadas.

[072] As combinações de filtro usadas são listadas na Tabela 12. Na denotação seguinte “A1”, “A2”, “B1”, e “B2” serão,portanto, usadas. TABELA 12: COMBINAÇÕES DE FILTRO

[073] Nas tabelas a seguir de 13 a 20 e nas Figurascorrespondentes de 1 a 8, os resultados obtidos com diferentes combinações de filtro, soluções de anticorpos diferentes e diferentes condições de filtração são apresentadas.TABELA 13: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 222 MG/ML E UMA PRESSÃO APLICADADE 200 KPA(2,0 BAR).

TABELA 14: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 125 MG/ML SUPLEMENTADO COM CERCA DE 200 MM TREALOSE E CERCA DE 0,05 % (P/V) DE TWEEN20 E UMA PRESSÃOAPLICADA DE 200 KPA (2,0 BAR).

TABELA 15: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 162 MG/ML E UMA PRESSÃO APLICADADE 180 KPA (1,8 BAR).

TABELA 16: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-IL13RACOM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 141 MG/ML SUPLEMENTADO COM CERCADE 200 MM DE TREALOSE E CERCA DE 0,2 % (P/V) DE POLOXAMER E UMA PRESSÃOAPLICADA DE 160 KPA(1,6 BAR).

TABELA 17: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 162 MG/ML E UMA PRESSÃO APLICADADE 110 KPA (1,1 BAR).

TABELA 18: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-IL13RACOM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 141 MG/ML SUPLEMENTADOCOM TREALOSE E POLOXAMER E UMA PRESSÃO APLICADA DE 80 KPA (0,8 BAR).

TABELA 19: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 125 MG/ML SUPLEMENTADO COMTREALOSE E TWEEN 20 E UMA PRESSÃO APLICADA DE 80 KPA (0,8 BAR).

TABELA 20: RESULTADOS OBTIDOS COM UMA SOLUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-HER2COM UMA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO DE 125 MG/ML SUPLEMENTADO COMTREALOSE E TWEEN 20 E UMA PRESSÃO APLICADA DE 30 KPA (0,3 BAR)

Claims

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-HER2, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) cultivar uma célula, que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-HER2,b) recuperar o anticorpo anti-HER2 da célula ou do meio de cultivo,c) purificar o anticorpo anti-HER2 com uma ou mais etapas de cromatografia, e fornecer uma solução de anticorpo anti-HER2,d) adicionar um açúcar e um detergente à solução,e) concentrar a solução de anticorpo anti-HER2 a uma concentração de 125 g/l ou mais com um método selecionado a partir de diafiltração ou filtração de fluxo tangencial, ef) aplicar a solução de anticorpo anti-HER2 da etapa anterior a uma combinação de uma primeira e uma segunda unidades de filtro, em que a primeira unidade de filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 3,0 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,8 μm, e a segunda unidade de filtro compreende um pré-filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm e um filtro principal com um tamanho de poro de 0,22 μm com uma pressão de 10 kPa a 75 kPa (0,1 a 0,75 bar), e por meio disso produzir um anticorpo anti-HER2.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a purificação ocorre em uma etapa de cromatografia de afinidade com a proteína A, e pelo menos uma etapa selecionada a partir de cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica, e cromatografia de interação hidrofóbica.