MX2007002085A - Esquemas de aislamiento y purificacion consecutivos de proteinas mediante cromatografia de afinidad. - Google Patents

Abstract

La invencion expone metodos para el aislamiento y la purificacion secuenciales de proteina a partir de una muestra biologica por cromatografia de afinidad; se efectuo la cromatografia de afinidad usando ligandos o complejos de soporte de ligando que se unen de manera selectiva y especifica a proteinas en la muestra biologica, se pusieron en contacto los ligandos o complejos de soporte de ligando secuencialmente en un orden predeterminado con la muestra biologica para permitir que cada ligando o complejo de soporte de ligando se una secuencialmente a una proteina procedente de la muestra biologica.

Description

ESQUEMAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN CONSECUTIVOS DE PROTEÍNAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional número de serie 60/602,868, presentada el 20 de agosto, 2004, cuyo contenido completo se incorpora en su totalidad a la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para el aislamiento de proteínas a partir de muestras biológicas. En particular, la invención se refiere a métodos para recuperar proteínas altamente purificadas de manera consecutiva a partir de muestras biológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El procesamiento y desarrollo de proteínas requiere un procesamiento de alta eficiencia con el mínimo número de pasos y el máximo rendimiento para obtener la pureza requerida. Los procedimientos de separación y purificación de proteínas presentan retos únicos debido a la variedad de proteínas, la naturaleza diferente de posibles contaminantes y/o impurezas asociados con cada preparación de proteínas, y la gran cantidad de proteínas normalmente necesarias para la producción de productos biofarmacéuticos. Las tecnologías convencionales de purificación generalmente involucran una serie de pasos de purificación con el objetivo de aislar un solo objetivo de proteína. Con cada paso, disminuye el rendimiento e incrementan los costos de fabricación. Los costos de separación y purificación de proteínas por lo general representan más del 50% de los costos totales de fabricación de todas las proteínas terapéuticas. La cromatografía de afinidad es una de las técnicas de separación más importantes en la esencia del desarrollo de procedimientos y descubrimiento de fármacos. Mientras más selectivos sean los pasos de afinidad, mayor será la eficiencia de toda la empresa, lo cual es un requisito crítico en experimentos de fraccionamiento de proteínas. La cromatografía de afinidad encuentra un número de aplicaciones prácticas en la purificación, detección y eliminación de moléculas objetivo a partir de corrientes de componentes múltiples. La cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas, tridimensionales, entre moléculas objetivo y entidades a las cuales se unen (es decir, ligandos). Los ligandos pueden ser aislados o generados para unión de una manera específica y reversible a prácticamente cualquier molécula objetivo. Los ligandos potenciales incluyen moléculas biológicas tales como proteínas, anticuerpos, péptidos y similares, y ligandos sintéticos específicamente diseñados o seleccionados. Se pueden generar genotecas de millones de ligandos potenciales utilizando técnicas de síntesis combinatorial, muchas de las cuales son conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Lam et al., Nature: 354, 82-84 (1991 )). Para ayudar en la separación de moléculas objetivo a partir de una muestra, se pueden unir ligandos a una matriz de soporte sólido, tales como partículas individuales (por ejemplo, perlas de resina de cromatografía) o soportes contiguos (por ejemplo, disposiciones). Los ligandos inmovilizados sobre una matriz de soporte sólido pueden ser posteriormente empleados para purificar objetivos a partir de soluciones complejas. Tal vez el mayor éxito de la cromatografía de afinidad a escala se ha obtenido en el campo de purificación de anticuerpos monoclonales biofarmacéuticos. La demanda de la resina de proteína A es de más de 10,000 litros anualmente e incrementa 50% al año, representando un mercado de adsorbentes de proteína A que excede $50 millones de dólares americanos en 2002. El uso de cromatografía de inmunoafinidad permite la producción de factores Vlll y IX de coagulación recombinantes y derivados de plasma así como otras proteínas plasmáticas y productos biofarmacéuticos a partir de fuentes naturales y recombinantes. Una de las formas más poderosas de la cromatografía de afinidad moderna para uso en el procesamiento corriente abajo, sin embargo, se basa no en ligandos derivados de fuentes naturales tales como anticuerpos, sino en el uso de ligandos de afinidad sintéticos altamente estables. Ver, por ejemplo, Sproule et al., New Stretegy for the Design of Ligands for the Purification of pharmaceutical proteins by affinity chromatography; J. Chromatography B. 740, 17-33 (2000). Este método utiliza ligandos adaptados o diseñados en lugar de utilizar compuestos disponibles en el mercado. Entre proteínas plasmáticas aisladas en la técnica, se han establecido como objetivo particularmente la albúmina y gammaglobulina para propósitos médicos. Los procedimientos comúnmente empleados para aislar estas proteínas a partir de plasma se basaron en el procedimiento de precipitación de etanol frío desarrollado por E. J. Cohn y colaboradores durante la década de los 40. Ver Cohn et al., Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Frations of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids; J. Am. Chem. Soc, 68, 459-475 (1946). Este procedimiento fue originalmente desarrollado para producer albúmina en alto rendimiento pero no fue diseñado para aislar y purificar la disposición diversa de proteínas ahora producida a partir de plasma. En particular, los rendimientos de componentes menores de proteína plasmática a través de estas técnicas son invariablemente tan bajos que las técnicas son inevitablemente ineficientes en términos del rendimiento de fraccionamiento general. Ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,1389,034 para Uemura et al. La aplicación de cromatografía de afinidad para la purificación de albúmina de suero se conoce en la técnica, ver Harvey MJ. En: Curling JM (ed) Methods of Plasma Protein Fractionation. Academic Press London. pp 189-200. La primera separación reportada de proteínas a partir de plasma data de hace aproximadamente 30 años y se enfocó en el agotamiento de albúmina de suero de humano (HAS) mediante cromatografía a partir de plasma para permitir la identificación y purificación de proteínas de baja concentración. Travis, J., y Pannell, R. Behring Inst. Mitt. 54: 30-32 (1974). Este trabajo se llevó a cabo utilizando un conjugado Procion Blue dextran-Sepharose® e identificó un problema inicial con cromatografía de afinidad a colorantes, concretamente la fuga del colorante en el producto de elución. Los autores estuvieron interesados en el aislamiento de alfa 1 -antitripsina a partir de plasma y describieron la difícil separación de esta proteína a partir de albúmina con una fuerza iónica alta en donde cualquier unión de intercambio iónico no específica está a un mínimo. También se ha informado sobre el aislamiento de otras diversas proteínas a partir de plasma. Por ejemplo, los métodos de la técnica anterior describieron el aislamiento y purificación del factor Vlll de proteína de plasma y fracciones de fibronectina, ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,822,872; 4,093,608; y 4,565,651. Los métodos para aislamiento y purificación de antitrombina-lll se describen por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 3,842,061. Los métodos para aislamiento y purificación de plasminógeno se describen por ejemplo en Science: 170, 1095 (1970), patentes de E.U.A. Nos. 4,361 ,652 y 4,361 ,653. Los métodos para aislamiento y purificación de ¡nmunoglobulinas se describen, por ejemplo en las patentes de E.U.A. Nos. 4,371 ,520 y 4,093,606. Los métodos para aislamiento y purificación de hepataglobulina se describen por ejemplo en las patentes de E.U.A. Nos. 4,061 ,735 y 4,137,307. Sin embargo, estos métodos carecen de la especificidad y selectividad requeridas para aislamiento de proteínas utilizadas en la producción de agentes biofarmacéuticos múltiples a partir del mismo material de partida, por ejemplo, plasma humano. Aunque los procedimientos para aislar proteínas a partir de muestras biológicas han proporcionado alguna mejora en calidad del producto, en términos de pureza y actividad específica mejorada, y también en el rendimiento o recuperación, todavía permanece la necesidad de una mejora de procedimiento adicional para obtener un concentrado de proteína con alto rendimiento y alta pureza con minimización de la reducción en la actividad específica de las proteínas aisladas con frecuencia asociadas con procedimientos de la técnica anterior. Esto aplica particularmente en situaciones en donde múltiples objetivos de proteínas son aislados de manera simultánea a partir de una fuente común. Esta invención resuelve estas y otras necesidades persistentes al proveer métodos que utilizan técnicas de cromatografía de afinidad para aislar y purificar diversas proteínas de manera eficiente a partir de materiales biológicos, y particularmente a partir de plasma, al combinar procedimientos de adsorción en secuencias predeterminadas y definidas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención, como se detalla y describe en la presente, provee métodos para aislamiento y purificación consecutiva de proteínas a partir de muestras biológicas. Los métodos comprenden (i) proveer una muestra biológica , (ii) proveer dos o más ligandos cada uno de los cuales se une de manera selectiva y específica a una proteína objetivo a partir de la muestra biológica en donde cada uno de los ligandos se une opcionalmente a un soporte para formar dos o más complejos ligando-soporte, (íii) poner en contacto consecutivamente dos o más ligandos o complejos ligando-soporte en un orden predeterminado con la muestra biológica para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte se una consecutivamente a la proteína objetivo a partir de la muestra biológica, en donde la muestra biológica no es procesada a través de un paso de pre-acondicionamiento antes de la puesta en contacto, (iv) eluir la proteína objetivo unida a cada uno de los dos o más ligando o complejos ligando-soporte, y (v) aislar la proteína objetivo de manera consecutiva a partir de la muestra biológica. El paso de pre-acondicionamiento comprende diversos procedimientos tales como por ejemplo precipitación de alcohol, crioprecipitación, eliminación de lípidos y/o proteínas lipídicas, precipitación de euglobulina, o una combinación de las mismas, entre otras. En una modalidad, la muestra biológica es plasma y la proteína objetivo comprende fibrinógeno (Fg), inhibidor de alfa-1 proteinasa (A1 PI), apolipoproteína A1 (ApoA1 ), inmunoglobulina (IgG), paraoxonasa (PON), factores de coagulación, factor Von Willebrand (vWF), Factor Vlll (FVIII), albúmina de suero de humano (HSA), plasminógeno (Pg), o cualquier combinación de los mismos. En otra modalidad, la muestra biológica comprende un cultivo celular o de fermentación in vitro o un fluido o tejido extraído de una planta o animal transgénico, y las proteínas son proteínas recombinantes. En otra modalidad, la actividad de paraoxonasa se mantiene sustancialmente en la muestra biológica durante el aislamiento de proteína. En una modalidad, vWF/FVIII se aisla del plasma antes de otras proteínas, o después de las otras proteínas. En otra modalidad, la apolipoproteína A1 se aisla del plasma después de otras proteínas. Incluso en otra modalidad, la albúmina se aisla del plasma antes de IgG o después de IgG. En otra modalidad, el plasminógeno se aisla del plasma antes del fibrinógeno. Incluso en otra modalidad, el orden predeterminado para poner en contacto los dos o más ligandos con la muestra biológica da como resultado la unión consecutiva de vWF/FVIII, Pg, Fg, ApoA1/PON, IgG, HSA, y A1 PI en el orden recitado. En otra modalidad, el orden predeterminado para poner en contacto los dos o más ligandos con la muestra biológica da como resultado la unión consecutiva de vWF/FVIII, ApoA1/PON, Pg, Fg, IgG, HSA, y A1 PI en el orden recitado. En una modalidad adicional, el orden predeterminado para poner en contacto los dos o más ligandos con la muestra biológica da como resultado la unión consecutiva de vWF/FVIII, IgG, HSA, y A1 PI en el orden recitado. Los ligandos de la invención comprenden moléculas polipeptídicas o a base de ácido nucleico, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, moléculas no polipeptídicas o a base de nucleótidos, miméticos de carbohidrato, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, materiales inorgánicos, colorantes, carbohidratos, lípidos, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, los ligandos son péptidos que comprenden de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 aminoácidos. En otra modalidad, los ligandos y/o complejos ligando-soporte comprenden ligandos de afinidad sintéticos tales como ligandos Mimetic Blue®, ligandos MAbsorbent ®, ProMetic PBL 112-80, ProMetic PBL 112-81 , ProMetic PBL 112-82, y ProMétic PBL 112-83. El soporte comprende un material sintético, un material natural o ambos. Ejemplos de soportes incluyen agarosa, poliacrilamida, dextrano, celulosa, polisacárido, nitrocelulosa, sílice, alúmina, óxido de aluminio, titania, óxido de titanio, zirconia, estireno, polivinildifluoruro nylon, copolímero de estireno y divinilbenceno, polimetacrilato éster, hidroxietilmetacrilato, acrílico, alcohol polivinílico, polietilenglicol, polímero o copolímero de azlactona derivatizado, vidrio, celulosa, agarosa, derivados de cualquiera de los anteriores, y combinaciones de cualquiera de los anteriores. En una modalidad preferida, el soporte es un polisacárido o perla de resina. En otro aspecto, la invención provee una preparación que comprende una proteína de plasma sustancialmente pura producida a través del aislamiento de proteína consecutivo de la invención. En una modalidad, el plasma es sustancialmente purificado con una pureza de por lo menos 70%. En otra modalidad, la preparación está sustancialmente purificada, libre de cualquier impureza ocasionada por inmunoadsorbentes, y que ha sido sometida a por lo menos un paso de inactivación de patógenos. Incluso en otra modalidad, la muestra biológica es tratada con un agente regulador de pH antes del paso de puesta en contacto con el fin de conservar adicionalmente la concentración y actividad de uno o más agentes objetivo en la muestra biológica. En otro aspecto, la preparación se formula como una composición farmacéutica. Estos y otros aspectos y modalidades de la invención se describen a detalle en la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente métodos para un eficiente aislamiento y purificación de proteínas a partir de muestras biológicas. En particular, la presente invención describe métodos de purificación consecutiva de proteínas a partir de plasma utilizando cromatografía de afinidad. Los métodos de purificación consecutiva de proteínas de la presente invención utilizan dos o más ligandos, cada ligando se une opcionalmente a un soporte para formar un complejo ligando-soporte. Cada ligando o complejo ligándosoporte se une de manera selectiva y específica a una proteína de plasma objetivo en un orden predeterminado para permitir que cada ligando o complejo ligando-soporte se una consecutivamente a una proteína objetivo a partir de plasma. Los métodos de aislamiento y purificación consecutivos de proteínas de la invención son altamente específicos y no requieren pre-acondicionamiento específico del plasma, como se utiliza de manera rutinaria en la técnica anterior, antes de la puesta en contacto con el ligando. Dicho paso de pre-acondicionamiento no incluye regulación de pH o filtración general. El paso de pre-acondicionamiento dentro del alcance de la invención incluye, por ejemplo, métodos y procedimientos tales como precipitación de alcohol, crioprecipitación, eliminación de lípidos y/o proteínas lipídicas, precipitación de euglobulina, o una combinación de los mismos, entre otros. Se pretende en la presente que los pasos de pre-acondicionamiento antes mencionados se excluyan específicamente de la invención reclamada. Los métodos de purificación de proteína de plasma de la presente invención son altamente valiosos en la producción de biofarmacéuticos debido a su capacidad de producir proteínas de plasma sustancialmente puras y altamente activas de manera eficiente y rápida. Los métodos de la presente invención también son útiles en una variedad de otras aplicaciones que incluyen pronóstico, diagnóstico, y/o detección de anormalidades.

Definiciones Las definiciones utilizadas en esta solicitud tienen propósitos ilustrativos y no limitan el alcance de la invención. Como se utiliza en la presente, "muestra" incluye cualquier muestra que contiene una proteína objetivo que puede ser aislada y purificada a través del método de la invención. Las muestras se pueden obtener a partir de cualquier fuente que contenga potencialmente una proteína objetivo. Tales fuentes incluyen animales, plantas, tierra, aire, agua, hongos, bacterias y virus, entre otras. Las muestras animales se obtienen, por ejemplo de biopsia de tejidos, sangre, cabello, raspados bucales, plasma, suero, piel, ascitis, efusión pleural, fluido de toracentesis, fluido espinal, fluido linfático, médula espinal, fluido respiratorio, fluido intestinal, fluido genital, materia fecal, orina, flema, lágrimas, saliva, tumores, órganos, tejidos, muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro, células fetales, células de placenta o células y/o fluido amniótico, entre otros.

Como se utiliza en la presente, "cultivo celular" incluye cualquier cultivo procariótico o eucariótico tal como por ejemplo bacteriano, de levadura y otro cultivo celular microbiológico, cultivo celular de mamífero, cultivo celular vegetal, y cultivo de insectos, caldos de fermentación y otro cultivo celular utilizado para la producción y suministro de productos biofarmacéuticos y la preparación de terapéuticos. Como se utiliza en la presente, "plasma" se refiere a componentes sanguíneos líquidos e incluye derivados de plasma y composiciones que contienen plasma. Como se utiliza en la presente, "unión" se define ampliamente dentro del alcance de la invención e incluye cualquier tipo de procedimiento de unión física, química o biológica entre dos entidades e incluye, por ejemplo y no a manera de limitación, absorción, adsorción, enlace covalente, intercambio iónico, hidrófobo, enlace de hidrógeno, bipolar, cuadrupolar o interacción de afinidad, formación de especies cargadas, la unión de ligandos de afinidad (por ejemplo, incluyendo péptidos, oligonucleótidos, proteínas, brazos espaciadores, porciones hidrófobas y materiales fluorados), entre otros. Como se utiliza en la presente, "ligandos" se definen ampliamente dentro del alcance de la invención e incluyen entidades químicas o biológicas que se unen a una proteína objetivo. Los ligandos son compuestos, moléculas, células y constituyentes celulares que se unen a una proteína objetivo y que pueden ser aislados de materiales naturales o producidos de manera sintética. Los ligandos pueden ser endógenos o exógenos a un procarionte o eucarionte. Los ligandos incluyen péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, colorantes, compuestos que contienen triazina, fragmentos de unión a anticuerpos o antígenos, moléculas a base de ácido nucleico, moléculas no polipeptídicas o a base de nucleótidos, carbohidratos, miméticos de carbohidratos, lípidos, materiales inorgánicos, inhibidores, substratos o cualquier combinación de los mismos. Como se utiliza en la presente, "sustancialmente purificadas" o "sustancialmente libres", se refiere a proteínas que son retiradas de su ambiente natural y son aisladas o separadas, y son al menos aproximadamente 70% libres, de preferencia aproximadamente 85% libres, preferiblemente aproximadamente 95%, y de preferencia aproximadamente 99% o más libres de otros componentes con los cuales están naturalmente asociadas. Como se utiliza en la presente, "moléculas a base de polipéptidos" incluyen cualquier proteína, polipéptidos o fragmentos peptídicos, péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de los polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, agonistas, antagonistas, y anticuerpos, entre otros. Como se utiliza en la presente, "moléculas pequeñas" incluyen, pero no se limitan a carbohidratos, miméticos de carbohidratos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 10,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 5,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1 ,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 500 gramos por mol y sales, esteres y otras formas químicamente aceptables de tales compuestos. Como se utiliza en la presente, el término "patógeno" pretende abarcar cualquier agente replicable que se puede encontrar en una muestra biológica tal como una muestra de sangre o que infecte un organismo. Tales patógenos incluyen los diversos virus, bacterias, protozoarios, y parásitos conocidos para los expertos en la técnica que se encuentran generalmente en o que infectan componentes de sangre o de sangre entera y otros contaminantes patogénicos todavía no conocidos. Los ejemplos ilustrativos de tales patógenos incluyen, pero no se limitan a bacterias, tales como especie Streptococcus, especie Escherichia y especie Bacillus; virus, tales como virus de inmunodeficiencia humana y otros retrovirus, herpesvirus, paramixovirus, citomegalovirus, virus de hepatitis (incluyendo hepatitis A, hepatitis B, y hepatitis C), virus de la viruela y togavirus; y parásitos, tales como parásitos de malaria incluyendo especie Plasmodium y parásitos tripanosomales.

Otros términos utilizados en el campo de la purificación de proteínas como se utilizan en la presente serán entendidos de manera general por un experto en la técnica aplicable. En una modalidad, la invención provee métodos para extracción de proteínas de plasma específicas a partir de plasma. Estos métodos utilizan resinas de cromatografía a las cuales están fijos ligandos, selectivos y específicos para dos o más proteínas plasmáticas. Las resinas se ponen en contacto con el plasma, contacto el cual da como resultado la unión selectiva de la proteína objetivo con el ligando. La proteína objetivo puede ser posteriormente eluída con una alta recuperación y pureza. De esta manera, de acuerdo con el método de la presente invención, el plasma se puede fraccionar de manera eficiente en diversas proteínas plasmáticas de componentes. En la presente se describen secuencias preferidas para la extracción y aislamiento posterior de proteínas de plasma específicas. Las proteínas de plasma dentro del alcance de la invención incluyen cualquier y todas de más de 10,000 proteínas diferentes que ocurren en plasma, incluyendo, por ejemplo y no a manera de limitación, butirilcolinesterasa (BChE), factores de coagulación de sangre (por ejemplo, fibrinógeno, factor II, factor V, factor Vil, factor Vlll, factor IX, factor X, factor XI y factor XII), fibronectina, protrombina, proteína C, plasminógeno, antitrombina-lll, haptoglobina, transferrina, albúmina, inhibidor de alfa 1 , proteinasa, apolipoproteína A1 (también conocida como lipoproteína Apo-A1 ), inmunoglobulinas, paraoxonasa, factor Von Willebrand (vEF), las cuales se encuentran de manera natural en el plasma de un organismo en un estado no enfermo. Alternativamente, la proteína de plasma dentro del alcance de la invención está presente en plasma asociado con un estado enfermo, que puede o no encontrarse en el plasma de un sujeto saludable. También abarcadas dentro del alcance de la invención, están las proteínas plasmáticas que están presentes en el plasma como resultado de la administración de un agente, por ejemplo un fármaco. Al respecto, la proteína plasmática puede ser una proteína prión PrPsc infecciosa. 1. Ligandos El método de purificación de proteínas de la invención utiliza dos o más ligandos que están fijos a un sistema de soporte. Los ligandos pueden comprender uno o más grupos funcionales para proveer unión iónica, hidrófoba, de hidrógeno o interacciones de Van der Waal con grupos correspondientes en la biomolécula que será separada. Los ligandos adecuados para el método de la invención incluyen compuestos químicos sintéticos que se producen, por ejemplo por medio de síntesis directa, o genotecas de diversidad, tales como genotecas peptídicas o no peptídicas aleatorias o combinatoriales. Otras genotecas conocidas en la técnica incluyen genotecas químicamente sintetizadas, genotecas recombinantes (por ejemplo, genotecas de despliegue en fagos), y genotecas a base de traducción in vitro. Las genotecas pueden ser analizadas para moléculas que se unen específicamente a una proteína objetivo de la invención. Ejemplos de genotecas químicamente sintetizadas se describen, por ejemplo en Fodor et al., Science 251 :767-773 (1991); Houghten ef al., Nature 354:84-86 (1991 ); Brenner y Lemer, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992), y en la patente de E.U.A. 6,117,996 entre otros. Ejemplos de genotecas de despliegue en fagos se describen, por ejemplo en Scott y Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science 249:404-406 (1990); y Christian et al., J. Mol. Biol. 227:711-718 (1992), entre otros. Las genotecas a base de traducción in vitro se describen, por ejemplo en Mattheakis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :9022-9026 (1994), entre otros. En una modalidad, el ligando de la invención es un péptido que consiste esencialmente en aproximadamente tres a aproximadamente 5, 8, 10, 15, o 30 aminoácidos o más. Los aminoácidos son aminoácidos D y/o L. El péptido se puede seleccionar de manera conveniente de cualquier genoteca peptídica, incluyendo genotecas peptídicas aleatorias, genotecas peptídicas combinatoriales, o genotecas peptídicas tendenciosas. El término "tendenciosa" se utiliza en la presente para referirse a que el método para generar la genoteca es manipulado a manera de restringir uno o más parámetros que regulan la diversidad de la recolección resultante de moléculas. En genotecas peptídicas, el número de péptidos discretos de secuencias diferentes incrementa drásticamente con el número de reacciones de acoplamiento realizadas, el tamaño del péptido, y el número de los distintos aminoácidos utilizados. Por ejemplo, la incorporación aleatoria de 19 aminoácidos en pentapéptidos produce hasta 2,476,099 (195) péptidos individuales de secuencia diferente (Lam et al., supra). Los métodos combinatoriales permiten la generación de genotecas de ligandos directamente sobre un soporte. Por lo regular, los ligandos son sintetizados en partículas de soporte de manera que múltiples copias de un solo ligando se sintetizan en cada partícula (por ejemplo, perla), aunque esto no es requerido en el contexto de la invención. Otro ejemplo de una genoteca que puede ser utilizada, en la cual las funcionalidades amida en péptidos han sido permetiladas para generar una genoteca combinatorial químicamente transformada, se describe en Ostresh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :11138-11142 (1994). Las genotecas no peptídicas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: monómeros y oligómeros decorados. Las genotecas de monómeros decorados emplean una estructura de andamio relativamente simple sobre la cual se añade una variedad de grupos funcionales. Con frecuencia, el andamio será una molécula con una actividad farmacológica útil conocida. Por ejemplo, el andamio puede ser la estructura benzodiazepina. Las genotecas de oligómeros no peptídicos utilizan un gran número de monómeros que se ensamblan en formas que crean nuevas configuraciones que dependen del orden de los monómeros. Entre las unidades de monómero que han sido utilizadas se encuentran carbamatos, pirrolinonas, y morfolinos. Los peptoides, y oligómeros de tipo péptido en los cuales la cadena lateral está unida al grupo alfa amino más que al carbono alfa, forman la base de otra versión de genotecas de oligómeros no peptídicos. Las primeras genotecas de oligómeros no peptídicos utilizaron un solo tipo de monómero y por lo tanto contenían una estructura de base de repetición. Las genotecas recientes han utilizado más de un monómero, dando una flexibilidad añadida a las genotecas. Otras genotecas no peptídicas que son útiles en la presente invención, son por ejemplo genotecas descritas por Ecker y Crooke, Bio/Technology 13:351-360 (1995). Estas genotecas utilizan compuestos tales como por ejemplo, benzodiazepinas (ver, por ejemplo Bunin et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 91 :4708-4712 (1994)) que pueden ser adaptados para uso. Además, también se pueden utilizar genotecas de peptoides (por ejemplo, Simón et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)). Otros compuestos utilizados en genotecas peptídicas incluyen hidantoínas, piperazindionas, bifenilos, análogos de azúcar, beta-mercaptocetonas, ácidos arilacéticos, acilpiperidinas, benzopiranos, cubanos, xantinas, aminimidas, y oxazolonas, entre otros. El análisis de las genotecas se puede realizar a través de cualquiera de una variedad de métodos comúnmente conocidos. Ver por ejemplo, las siguientes referencias, las cuales describen el análisis de genotecas peptídicas: Parmley y Smith, Adv. Exp. Med. Biol. 251 :215-218 (1989), Scott y Smith, id.; Fowlkes ef al., BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5393-5397 (1992); y Yu et al., Cell 76:933-945 (1994), entre otras. El análisis para identificar una molécula que se une a una proteína objetivo también se puede llevar a cabo al poner en contacto los elementos de la genoteca con la proteína objetivo inmovilizada sobre una fase sólida y cosechar esos elementos de genoteca que se unen a la proteína de interés. Ejemplos de tales métodos de análisis, denominados técnicas de "cribado" se describen a manera de ejemplo en Fowlkes ef al., id. Preferiblemente, los ligandos de la invención son diseñados por modelación y química combinatorial e incluyen ligandos sintéticos/biomiméticos que pueden ser moléculas simétricas o asimétricas, solas o ramificadas. Los ligandos de preferencia son resistentes a álcali y soportan procedimientos normales de sanitización y regeneración de álcali. Los ligandos de la invención tienen muy baja filtración, son seguros y poseen alta capacidad de unión y especificidad a la proteína objetivo. Los ligandos preferidos o ligandos y sistemas de soporte utilizados dentro del alcance de la invención incluyen, a manera de ejemplo y no de limitación, ligandos Mímetic Blue® (para columna de HSA), y la resina se designa Mimetic Blue® SAHL P6XL; ligandos MAbsorbent® (para unir IgG), y el adsorbente designado MAbsorbent® A2P; adsorbente ProMetic PBL 112-80 para A1 P1 ; adsorbente ProMetic PBL 112-81 para fibrinógeno; adsorbente ProMetic PBL 112-82 para plasminógeno; adsorbente ProMetic PBL 112-83 para vWF/FactorVIll; ECH-Lys-Sepharose FF. Lote # 243526; SAHL P6XL-Resin; y resinas de ligando peptídíco que incluyen ARQFDF (SEQ ID NO:1 ).

Los adsorbentes antes mencionados utilizan Purabead 6XL (agarosa entrelazada) como la matriz de soporte. Las matrices de soporte Purabead 6 o 6XL no adsorben estas proteínas por sí solas. 2. Soporte En una modalidad del método de la invención, el ligando se une a un soporte. El término "soporte" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier matriz de soporte, tales como aquellos soportes sólidos conocidos en la técnica, los cuales sirven para inmovilizar el ligando. Un soporte o matriz de soporte es cualquier sustancia sólida o líquida, porosa o no porosa, bidimensional o tridimensional al cual se puede unir un ligando y que provee un medio conveniente para separar el ligando de solutos en una solución de contacto. De preferencia, el soporte es inerte después de la unión del ligando de manera que se reduce al mínimo la reacción covalente con el objetivo. También se incluye dentro del alcance de la invención el uso de brazos espaciadores para acoplar ligandos al soporte. Los brazos espaciadores pueden tener una amplia variedad de formas diferentes, incluyendo sin límite materiales hidroxilados como polietilenglicoles, óxidos de polietileno, alcanos lineales o ramificados, diaminas, glicoles, anillos aromáticos, y carbohidratos o cualquier combinación de los mismos, entre otros. En una modalidad, la matriz de soporte comprende partículas porosas que son capaces de adsorción o absorción del agente objetivo. Las partículas están opcionalmente revestidas con uno o más materiales para modificar las propiedades superficiales de la matriz de soporte, materiales los cuales no se pueden hinchar o se pueden hinchar en fluidos orgánicos o fluidos acuosos y son sustancialmente insolubles en agua o fluidos. Una matriz de soporte preferida utilizada con el esquema de purificación consecutiva de proteínas de la presente invención es una partícula porosa. Las partículas porosas para separaciones por adsorción están disponibles en una gran variedad de materiales diferentes, que incluyen, sílice, vidrio, celulosa, agarosa, y una amplia variedad de diferentes polímeros, que incluyen polimetilmetacrilato de poliestireno, poliacrilamida, agarosa, hidrogel, resinas acrílicas y otros tipos de geles utilizados para electroforesis. Muchas de las partículas porosas de adsorción, tales como sílice, vidrio y polímeros se pueden secar y tienen poros interconectados con áreas superficiales en la escala de aproximadamente 1-2 m2/g de partículas secas a más de 300 m2/g de partículas secas. Otros tipos de partículas son hidrogeles entrelazados. Las matrices de soporte que son particularmente preferidas son agarosa y resina de metacrilato polihidroxilado. Se encuentran disponibles comercialmente varios geles de agarosa en perlas y resinas de polímero. Estos soportes se pueden comprar con ligandos preunidos o alternativamente, los ligandos pueden ser unidos indirectamente o inmovilizados indirectamente en el soporte utilizando los métodos estándar (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies, Cold Spring, Cold Spring Harbor Laboratiry, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Biancala et al., Letters in Peptide Science, 7(291 ), 297 (2000); MacBeath et al., Science, 289, 1760-1763 (2000); Cass el al., ed., Proceedings of the Thirtentf American Peptide Symposium. Leiden, Excmo., 975-979 (194); Patente de E.U.A. No. 5,576,220; Cook et al., Tetrahedron Letters; 35, 6777-6780 (1994); y Fodor et al., supra. En una modalidad, el (los) ligando(s) se sintetiza(n) en la superficie del soporte, lo cual resulta desventajoso en la generación de genotecas de péptidos. El (los) ligando(s) se puede(n) conjugar químicamente al soporte o se puede(n) unir a través de enlazadores, como estreptavidina, beta alanita, glicina, polímeros que contienen glicina-serina, hidrocarburos de cadena corta de la fórmula (CH2), polietilenglicol, ácido epsilon aminocapróico, y enlaces que comprenden O(CH2)n, en donde n es 1-30. 3.- Unión y elución de proteínas objetivo La unión de una proteína objetivo o biomolécula objetivo al ligando o al complejo de ligando-soporte normalmente se realiza poniendo en contacto o el complejo de ligando-soporte con una solución acuosa que contiene los objetivos. Estos se pueden lograr de muchas formas que incluyen, pero no están limitas a, el paso de la solución que contiene el objetivo a través de un lecho empacado o columna del complejo de ligando-soporte, o por la absorción del lote en un tanque agitado o suspensión. De preferencia, la proteína objetivo se captura por el paso de la solución acuosa a través de una columna de cromatografía utilizando una bomba para controlar el caudal. Idealmente la unión de la proteína objetivo se deberá realizar de tal manera que no se requiera ningún ajuste previo de la solución y la solución que contiene el objetivo se aplica directamente al complejo de ligando -soporte. Sin embargo, cuando se requiera para la unión, las propiedades de la solución que contiene le objetivo se pueden ajustar, por ejemplo, por dilución, cambios de pH, resistencia o polaridad iónica, cambios de temperatura y la adición de agentes solubles que incluyen pero no están limitados a sales reguladores de pH, sales inorgánicas, sales orgánicas, compuestos quelantes, tioles, detergentes, agentes tensioactivos, solventes orgánicos, alcoholes, glicoles, agentes caotrópicos, iones de metal o cualquier combinación de los mismos. Para recuperar la proteína objetivo a partir del ligando o del complejo de ligando-soporte, el ligando o el complejo de ligando -soporte se puede poner en contacto con una solución (por ejemplo, una "solución de transferencia" o "regulador de pH de elución") que promueva la disociación de la proteína objetivo del ligando o del complejo de ligando-soporte. La solución de transferencia se puede seleccionar a partir de reguladores de pH de distintas concentraciones de sal, pH, o capacidad de desnaturalización, solventes orgánicos, agentes modificadores de la polaridad tales como alcoholes y agua desionizada. Alternativamente, o además, un gradiente eléctrico o cambio de temperatura puede disociar la proteína objetivo del complejo de proteína-ligando-soporte. Las soluciones de transferencia también pueden comprender ligandos (diferentes a ligando del complejo de proteína-ligando-soporte), cofactores para la proteína objetivo, moléculas específicas enantioméricas, y similares. El uso de diferentes soluciones de transferencia permite la investigación de las condiciones de elución o transferencia de una proteína objetivo específica. Las condiciones de disociación y transferencia que se emplean en el método inventivo se seleccionan de tal manera que se reduzca al mínimo la disrupción del ligando y de la proteína objetivo. En otras palabras, las condiciones de elución y de transferencia no deberán liberar el ligando del soporte o desnaturalizar la proteína objetivo, a menos que se desee. Enana modalidad, la proteína objetivo se detecta y se identifica en el soporte de proteína-ligando antes de la elución. La detección y la identificación de la proteína objetivo en el soporte de proteína-ligando pueden comprender realizar un ensayo de unión. Un ensayo de unión normalmente comprende poner en contacto el soporte de proteína-ligando, con una porción de la cual se sepa que se une a un sustrato. Las pociones de unión para usarlas en los ensayos de unión incluyen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a anfígeno de los mimos, proteínas, u oligonucleótidos. De preferencia, el soporte de proteína-lígando entra en contacto con un anticuerpo o un fragmento de unión antígeno del mismo que se une a la proteína objetivo, o al producto secundario químico o biológico de la proteína objetivo, o un fragmento de la mima). De preferencia la porción de unión se marca con una marca detectable como por ejemplo, un radioisótopo, un cromóforo, o una marca fluorescente. En dicho ensayo de unión, se detecta una señal emitida por la marca detectable, señalando de esta manera la presencia de la proteína objetivo. Una vez que se elucida la presencia de la proteína objetivo en el soporte de proteína-ligando se puede aislar a proteína. Los ensayos de unión para la detección de un objetivo también se describen en, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Sprieng Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Haugland, Handbook of Fluorescent Prodes and Research Chemicales (6a ed.), Molecular Probes, Eugene, Or, (2002). Opcionalmente el método inventivo también puede comprender un paso de lavado para remover el exceso, las porciones o marcadores de unión no unidos antes de a detección. Alternativamente, el método inventivo puede comprender realizar un ensayo de actividad encimática para caracterizar una proteína objetivo con base en la actividad biológica. Se aplica un sustrato de enzima al soporte de proteína -ligando que permite la modificación enzimática del sustrato por la proteína objetivo para formar un producto. Después el producto es detectado, identificando de esta manera la presencia de la proteína objetivo en la muestra. La unión y elución de las proteínas objetivo se puede medir mediante cualquier método adecuado, muchos de los cuales existen y cuyo desempeño y adecuación para un propósito particular serán bien conocidos para los expertos en la técnica. 4.- Métodos de uso La presente invención como se describe en la presente, proporciona métodos para el aislamiento secuencial de proteínas a partir de muestras biológicas, dichos métodos producen proteínas altamente activas y sustancialmente purificadas. Los métodos de la invención son muy sensibles y capases de separar cantidades diminutas de proteínas objetivo a partir de una muestra. Los métodos de purificación secuencial de proteínas de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones que incluyen el pronostico, el diagnostico, la detección, la purificación, la separación, el procesamiento de productos de gen expresados in vitro, y la producción de productos biofarmacéuticos. Las técnicas de purificación y de extracción de la invención ofrecen ventajas sobre las técnicas de purificación convencionales al reducir el número de pasos de purificación, mejorar las producciones, incrementar la pureza y superar las limitaciones asociadas con los métodos tradicionales. En particular, los métodos de la presente invención optimizan el proceso de purificación de proteínas y mejoran el procedimiento de fabricación biofarmacéuticos al aumentar la eficiencia y la pureza. La sustancias biofarmacéuticas son fármacos que contiene proteínas, péptidos u otros polinucleótidos o proteínas complejos basándose en macromoléculas (convencionalmente "producto de gen"). Su procedimiento de fabricación comprende la recuperación del producto de gen deseado a partir de su biomasa hospedera, como el plasma o fuentes biológicas no humanas (por ejemplo, cultivos celulares recombinantes o no recombinantes, leche de animales transgénicos u otras fuentes recombinantes o no recombinantes). En un reto la recuperación de producciones comercialmente viables de una proteína deseada a partir de una biomasa, ya que la última contiene proteínas hospederas no deseables, moléculas de ácido nucleico y otras entidades químicas naturales. Enana modalidad, los métodos de la presente invención se utilizan para el aislamiento de proteínas a partir de sangre entera, concentrados de glóbulos rojos de la sangre, concentrados de plaquetas, plasma, derivados de plasma, leucocitos, sangre sin leucocitos, cultivo de células de mamífero, caldos de fermentación y otros medios que se utilizan en la producción y el suministro de sustancias biofarmacéuticas y la preparación de sustancias terapéuticas. En una modalidad preferida, los métodos de la presente invención aislan proteínas de plasma altamente activas en forma secuencial a partir de una muestra de plasma. Se pueden separar múltiples proteínas a partir de la muestra en forma concomitante y rápida mediante los métodos de la presente invención, a parir de cualquier corriente en la industria del procesamiento de plasma que tiene como objetivo la producción de productos terapéuticos y/o farmacéuticos. Un ejemplo de orden de aislamiento de la proteína del plasma se describe en el cuadro 1 siguiente.

CUADRO 1 Esquema de purificación de proteína de plasma La proteína de plasma aislada es "purificada sustancialmente", teniendo una pureza de aproximadamente 70% de preferencia a aproximadamente 85%, más preferiblemente aproximadamente 95%, y más preferiblemente aproximadamente 99% o más. EN la presente se pretende el reciclado de dichos valores de purificación específicos, los valores citados también incluyen todas las cantidades enteras específicas entre los valores citados. Por ejemplo, aproximadamente 85% también pretende abarcar 80%, 81 %, 82%, 83% y 84%, sin citar realmente cada grado especifico de purificación sustancial en la presente. Los expertos en la técnica entenderán que otras modificaciones y adaptaciones adecuados a los métodos y a las aplicaciones que se describen en la presente serán evidentes fácilmente a partir de la descripción de la invenció que está contenida e la presente en vista de la información conocida para el experto en la técnica, y que se pueden hacer sin apartarse del alcance del la invención o de cualquier modalidad de la misma. Habiendo descrito la presente invención al detalle la misma podrá entenderse más claramente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales están incluidos con el propósito de ilustración únicamente, y no pretenden ser limitantes de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Definición de los escenarios 1-7 de secuencia de cascada lineal La cascada lineal se compone de cinco columnas de cromatografía de afinidad: Albúmina (HSA), Fibrinógeno (FG), IgG, Plasminógeno (Pg), y Pon1/ApoA1. Inicialmente, estas columnas se activaron sucesivamente en 4 secuencias diferentes para determinar la secuencia óptima para la cascada lineal. Para simplificar el análisis de la muestra en el proceso solamente se recogió el flujo continuo no diluido como la carga para la siguiente columna en la secuencia. Específicamente, esto ayudó a mantener la concentración constante de las proteínas antecedentes en todo el experimento, También simplifico la comparación de la salida contra la entrada en cada columna. Se analizaron muestra de la carga de cada flujo continuo para monitorear la recuperación de las proteínas objetivo y no objetivo del flujo continuo. Estos valores se utilizaron para monitorear cada columna para determinar su capacidad para capturar esta proteína objetivo con la retención mínima de las pretinas corriente abajo. La secuencia que mejor se ajusto a este criterio se utilizo como la secuencia de cascada lineal (LCS). Una vez que estuvieron disponibles los datos analíticos de las primeras corridas, se probaron tres secuencias adicionales, y se añadió la columna A1 P1 para los escenarios 6 y 7.

Materiales y equipo Se utilizaron las siguientes resinas en cascadas empacadas en columnas Pharmacia XK 50 (longitud 20 o 30 m): Columna de plasminógeno: Pharmacia EH-Lys-Sepharose FF. Lot# 243526. Columna de fibrinógeno: ProMetic Purabead, (2 columnas en serie) Lot#CG 1251 y Lot#CG1252. Columna IgG: ProMetic MA bsorbent A2P, Lot#FA0582-Z. Columna HSA: ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL Batch # FA 0500Z. Columna PON1/ApoA1 : Peptide International, Toyopearl WWLHAN Lot#2177772. Columna A1 P1 : ProMetic 12/330 P6XL Resin Batch #CG 1255. Toda la cromatografía se realizo utilizando el sistema de cromatografía AKTA Explorer 100 con 950 colectores de fracción (Amersham Biosciences). Ultrafiltration (UF) / diafiltration (DF) se realizó con el sistema Sartorius Sartocon Slice 200 Ultrafiltration System utilizando dos membranas de acetato de celulosa 200 cm2 Hydrosart (peso molecular cortado 10 kD).

Métodos Para cada corrida, la carga para la primera columna fue plasma humano reunido + 50 mM Tris, pH 7.5 filtrado a 0.2 µm. se recogió el flujo continuo para cada columna en fracciones y se reunió basándose en el perfil de absorbancia de UV (A28o) del cromatograma. Este grupo se utilizó como material de carga para la siguiente columna en la secuencia. Si la siguiente columna iba a ser realizada el día siguiente, el flujo continuo se filtraba en forma estéril (filtro de vacío de 0.2 µm) y se almacenaba a temperatura ambiente. En los escenarios 6 y 7, se utilizó UF/DF para reducir el volumen y realizar un intercambio de regulador de pH en el flujo continuo reunido como se indica en el siguiente cuadro 2. Esto requirió traer el material de carga de A1 PI en el regulador de pH de corrida de columna A1 PI (15 mM fosfato de sodio, pH 6.1 ) CUADRO 2 Secuencias de columna Resultados A continuación se muestran cuadros y gráficas de la producción por paso para cada escenario. N/D significa que los datos no estaban disponibles <LOD significa que el nivel de proteína esta por debajo del límite de detección para ese ensayo en particular.

CUADRO 3 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #1 El cuadro 3 resume los resultados de escenario #1 CUADRO 4 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #2 El cuadro 4 resume los resultados de escenario #2 CUADRO 5 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #3 El cuadro 5 resume los resultados de escenario #3 CUADRO 6 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #4 El cuadro 6 resume los resultados de escenario #4 CUADRO 7 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #5 * Basado en el ensayo de actividad, datos de nefelometría no disponibles El cuadro 7 resume los resultados de escenario #5 CUADRO 8 Porcentaje de producciones por paso para el escenario #6 El cuadro 8 resume los resultados de escenario #6 CUADRO 9 Porcentaje de producciones por paso del escenario #7 El Cuadro 9 resume los resultados del escenario #7.

Conclusiones En la corrida precedente al escenario #1 (misma secuencia que el escenario #1 ), el material de partida fue plasma filtrado sin agregar ningún sistema regulador de pH. A medida que el plasma se cargaba en la columna hubo una subida sustancial en el pH del flujo continuo. Como resultado de esta observación, se añadió regulador de pH 1 M Tris, pH 7.5 al plasma a una concentración final de 50mM Tris antes de cargarlo en la primea columna. En el siguiente ejemplo 3 se proporciona un resumen del proceso de selección del regulador de pH. Los siete escenarios demostraron una viabilidad de corrida en una cascada lineal de columnas de afinidad como un proceso efectivo para purificar proteínas de plasma. Los datos se analizaron y se seleccionó la secuencia basándose en las siguientes observaciones. En el escenario 1 , la recuperación de proteínas objetivo corriente abajo siguió siendo bastante alta a través de la corrida. En el escenario 2, la columna de IgG casi vació por completo la corriente de alimentación de plasminógeno, fibrinógeno, y ApoA1. De nuevo en el escenario 3, la columna IgG capturó ApoA1. Con base en esta observación, se determinó que las columnas PON1 , Pg. y Fg tenían que ser colocadas antes de la columna IgG en la secuencia. Se tomaron en cuenta los siguientes puntos al decidir el orden de los pasos de cromatografía en la cascada lineal de acuerdo con este experimento: • Los pasos de captura para PON1 , Pg, y Fg deberían de ser colocados antes IgG. • Como la albúmina y el citrato interferirían en la cromatografía de A1 PI, la columna A1 PI debería ser colocada después de la columna de Albúmina. El flujo continuo requiere de un paso de procedimiento de UF/DF para un intercambio de regulador de pH, antes de la columna IgG.

• El IgG debería ser colocado antes de la Albúmina para evitar las pérdidas de IgG. Por lo tanto, se eligió que la secuencia de cascada lineal en este experimento fuera: PON1/ApoA1?Plasminógeno?Fibrinógeno?lgG?HSA?UF/DF?A1pl. Deberá notarse que en otro experimento la columna PON1/ApoA1 se removió de la secuencia de cascada de corriente y que se insertó vWF/FVIII antes del plasminógeno cuando la resina estuvo disponible.

EJEMPLO 2 Captura de afinidad de proteínas de plasma En este experimento se utilizó la siguiente secuencia de columna: vWF/FVIII?Plasminógeno?Fibrinógeno?lgG?UF/DF?HSA?UF/DF. Preparación de plasma: se reunieron cuatro litros de plasma reunido congelado a partir del almacenamiento a -20°C. La reunión de pasma se fundió en 37.0°C ± 2°C en un baño de agua. Una vez que el plasma estaba fundido, se removió rápidamente del baño de agua. El plasma se ajustó a 20mM Tris, 50mM NaCñ utilizando 50x dilución de 1 M Tris, pH 7.5 y una 40 x dilución de 2M NaCl. El plasma se mezcló bien y se filtró utilizando un filtro estéril SartoPure 300 PP2 (8µm). a. Captura de afinidad von Willebrand Factor/Factor Vlll (vWF/FVIII) Se preparó una columna de lecho empacado de 7 cm x 10.6 cm que contenía 410 ml del absorbente de afinidad desarrollado para la captura de vWF/FVIII Affinity capture. Normalmente se mantuvo la columna en una solución de almacenamiento de contenía 0.1 N NaOH cuando no estaba en uso durante la periodos extendidos. La columna previamente almacenada se lavó a una velocidad de flujo de 80 cm/hr con 3 CV de Milli Q de agua hasta que la conductividad cayó a menos de 1 mS/cm. La columna se equilibró con 4 CVs de regulador de pH Equilibration (EQ) compuesto de 20 mM Tris, 20mM Citrate, 140mM NaCI, pH 7.5. El plasma filtrado se aplicó en la columna. El efluente de flujo continuo fue recogido cuando la absorbancia a 280nm alcanzó el 5% de la unidad de absorbancia de escala completa (AUFS=2). La columna se lavó con 4CV de de regulador de pH EQ mientras se seguía la recolección del efluente de columna hasta que la absorbancia cayó al 5% de AUFS. La solución se mezcló bien pero suavemente después se filtró a través de 3/0.8um SartoClean CA (H8) seguido por un filtro 0.45/.022um Sartobran p (H8). El filtro se volvió a enjuagar con 500mL de regulador de pH EQ. El filtrado combinado se filtró suavemente. La solución filtrada constituía la fracción de flujo continuo del paso de captura vW/FVIII (vWF/FVIII-FT (flujo continuo). El vWF/FVIII se eluyó con 4 CV del regulador de pH de elución compuesto de 20 mM Tris, 500mM NaCI, 3mM CaCI2, 0.01 % Polisorbato 80, 30% etilenglicol, pH 6.5. La velocidad de flujo de la columna se estableció a 30cm/hr. La recolección del eluyente se inició una vez que el % UV aumenta a 2% AUFS. El eluyente fue recogido continuamente hasta que la absorbancia cayó de nuevo al 2% del AUFS. El producto de elución de la columna se mezcló suavemente y se almaceno a -80°C hasta que estuvo listo para un procesamiento adicional. La resina se regenero con una solución de CIP-1 compuesta de 0.5N NaOH/ 1 % Tritón X100. la solución de CIP-1 se aplico a la columna en la dirección "de flujo ascendente" a una velocidad de flujo reducida de 5mL/min durante aproximadamente 3 CV. Después la resina se lavo con 2CV de una solución de CIP-2 compuesta de 30% iso-propanol en 0.5N NaOH a 5 ml/min. La resina se equilibro con 3 CV de solución de almacenamiento hasta el siguiente uso. b. Captura de afinidad de plasminógeno (Pg) Se preparó una columna de lecho compacto de 5 cm x 13 cm que contenía 255 ml del absorbente de afinidad desarrollado para la captura de plasminógeno. Normalmente la columna se mantuvo en una solución de almacenamiento que contenía 0.1 N NaOH cuando no estaba en uso durante periodos cortos. La columna previamente almacenada se lavó a una velocidad de flujo de 160 cm/hr con 1-2 CVs de agua Millin Q hasta que la conductividad cayó a menos de 1 mS/cm. La columna fue equilibrada con 3-4 CVs de regulador de pH Equilibración (EQ) compuesto de 20mM Tris, 20mM Citrate, 140 mM NaCI, pH 7.5. El vWF/FVIII-FT se aplico desde el paso de captura previo a la columna. Se recogió el efluente de flujo continuo cuando la absorbancia a 280nm alcanza el 5% de la AUFS (escala completa de unidades de absorbancia). La columna se lavó en 2-3 CB de regulador de pH EQ mientras seguía la recolección del efluente de la columna hasta que la absorbancia cayó a menos del 5% de las AUFS. La solución se mezcló suavemente y después se filtro a través de un filtro 0.22um Sartobran. El filtro se volvió a enjuagar con 500mL de regulador de pH EQ. El filtrado combinado se mezcló suavemente. Esta solución filtrada constituía una fracción del flujo continuo del paso de captura de plasminógeno (Pg-FT). La columna se lavó con 2 CV de regulador de pH de lavado compuesto de 30 mM caprilato, en EQ, pH 7.5 seguido por 2 CV de regulador de pH EQ. El plasminógeno se eluyó con 2-3 CV de regulador de pH Elution compuesto de 50mM de fosfato de Na, y 0.5M EACA, pH 7.0. la recolección del producto de elución se inicio una ves que % UV aumento a 2% AUFS. El producto de elución de recogió continuamente hasta que la absorbancia cayó de regreso a 2% de los AUFS. El producto de elución de columna se mezcló suavemente y se almaceno a -80°C hasta que estuvo listo para un procesamiento adicional. La resina se regenero con una solución de CIP-1 compuesta de 0.5N NaOH. La solución CIP-1 fue aplicada a la columna en la dirección "flujo ascendente" a una velocidad de flujo reducida de 40mL/min durante aproximadamente 4 CV. La resina se equilibrio con 3 CV de la solución de almacenamiento hasta su siguiente uso. c. Captura de afinidad de fibrinógeno (Fg). Se preparó una columna de lecho empacado de 10 cm x 101 que contenía 790mL del absorbente de afinidad desarrollado en la captura de fibrinóigeno. Normalmente la columna se mantuvo en una solución de almacenamiento que contenía 01 N NaOH cuando no estaba en uso durante periodos cortos. La columna previamente almacenada se lavó a una velocidad de flujo de 60cm/hr con 1-2 CVs de agua Millin Q hasta que la conductividad cayó a menos de 1 mS/cm. La columna se equilibro con 3-4 CVs de regulador de pH Equilibration (EQ) compuesto de 20mM Tris, 20mM Citrato, 140mM NaCI, pH 7.5. El Pg-FT se aplico desde el paso de captura previo en la columna. EL efluente de flujo se recogió cuando la absorbancia a 280nm alcanzó el 5% de la AUFS (escala completa de unidades de absorbancia). La columna se lavo con 4-5 CV de regulador de pH EQ y el efluente de la columna se recogió continuamente hasta que la absorbancia cayó a menos de 5% de la AUFS. La solución se mezcló suavemente y después se filtro a través de un filtro 0.22um Sartobran. EL filtro se lavó después con 500 ml de regulador de pH EQ y el filtrado combinado se mezcló suavemente. Esta solución filtrada constituía la fracción de flujo del paso de captura de fibrinógeno (Fg-FT). El fibrinógeno se eluyó con 4-5 CV de regulador de pH de elución 20mM Tris, 20mM Critato, 140mM NaCI, 1 %Cholate,. 10% propilenglicol, pH 7.5. La recolección del producto de elución se inició una ves que % UV se incremento a 2% AUFS. El producto de elución se recogió continuamente hasta que la absorbancia cayó de regreso a 2% de las AUFS. El producto de elución se la columna se mezcló suavemente y se almaceno a -80°C hasta que estuvo listo para un procesamiento adicional. La resina se regeneró con una solución CIP-1 compuesta de 1.ON NaOH. La solución CIP-1 fue aplicada a la columna en la dirección de "flujo ascendente" a una velocidad reducida de flujo de 80mL/min durante aproximadamente 4 CV. La resina se equilibró con 3 CV de solución de almacenamiento hasta su uso siguiente. d. Captura de afinidad de inmunoqlobulina G (IgG) Se preparó la carga añadiendo un volumen de 1/10 del regulador de pH de ajuste de carga (300mM caprilato en EQ) a Fg-FT y se mezcló bien.

Se preparó una columna del hecho empacado de 14 cm x 12.2 cm que contenía 1880 ml del absorbente de afinidad desarrollado para la captura de IgG. Normalmente se mantuvo en una solución de almacenamiento que contenía 01 N NaOH cuando no estaba en uso durante periodos cortos. La columna previamente almacenada se lavó a una velocidad de flujo de 73 cm/hr con 2 CVs de agua Milli Q hasta que la conductividad cayó a menos de 1 mS/cm. La columna se equilibró con 2 CV de regulador de pH de lavado compuesto de 20mM Tris, 20mM Critato, 1 M NaCI, pH 7.5 seguido por 3-5 CV de regulador de pH IgG Equilíbration compuesto de 30mM caprilato, 20mM Tris, 20mM Critato, 140mM NaCI, pH 7.5. El Fg-FT se aplicó del paso previo de captura sobre la columna. Se recolectaron el efluente de flujo continuo, cuando la absorbencia a 280 nm alcanzó 5% de la AUFS (escala completa de unidades de absorbencia). Se lavó la columna con 4-5 CV de regulador de pH Wash y se continuó recolectando el efluente de columna, hasta que la absorbencia descendió a 5% de la AUFS. Se mezcló la solución suavemente y se filtró luego a través de un filtro Sartobran de 0.22 µm. Se enjuagó posteriormente el filtro con 500 ml de regulador de pH EQ y se combinó suavemente el producto de filtración combinado. Esta solución filtrada constituyó la fracción de flujo continuo del paso de captura de IgG (IgG-FT). Antes de la elución de la IgG, se acondicionó la columna con 1 CV de regulador de pH de preelución compuesto de 50 mM de citrato, pH 6.0. Se eluye la IgG con 4 CV de regulador de pH de elución compuesto de 50 mM de citrato, pH 3.0. Se inició la recolección del producto de elución una vez que el % UV aumentó a 2% AUFS. Se continuó la recolección del producto de elución, hasta que la absorbencia descendió de nuevo a 2% de la AUFS. Se mezcló suavemente el producto de elución de la columna y se ajustó el pH arriba de pH 7.0 con un volumen suficiente de 1 M de Base Tris y se almacenó luego a -80°C, hasta que estuvo listo para el procesamiento ulterior. Se regeneró la resina con solución de CIP-1 compuesta de NaOH 1.0 N. Se aplicó la solución CIP-1 a la columna en la dirección de "flujo ascendente" a un régimen de flujo reducido de 170 ml/min durante aproximadamente 4 CV, seguido por 3 CV de agua Milli-Q en la dirección de flujo descendente. Se equilibró la resina con 3 CV de solución de almacenamiento hasta el siguiente uso. e. Ultrafiltración /diafiltración Se efectuó la filtración para concentrar el producto IgG-FT, hasta que se alcanzó el volumen de objetivo de aproximadamente 1.5-2 I. Se efectuó la diafiltración con respecto a 6 volúmenes de regulador de pH EQ con una presión de entrada de filtro (P1 ) de 1.2654 ± 0.0703 kg/cm2 y un TMP de 0.1850 ± 0.0703 kg/cm2. Se muestreó el producto de permeación en cuanto a mediciones de pH y conductividad al comienzo de la diafiltración y aproximadamente con cada volumen de diafiltración del producto de retención para monitorear cuándo se completó la diafiltración. f. Captura de afinidad de albúmina (HSA) Se preparó una columna de lecho compacto de 20 cm x 17.8 cm, que contenía 5,600 ml del adsorbente de afinidad desarrollado para la captura de albúmina. Se mantuvo la columna típicamente en una solución de almacenamiento que contenía NaOH 0.1 N, cuando no estaba en uso durante períodos breves. Se lavó la columna previamente lavada a un régimen de flujo de 86 cm/h con 2 CV de agua Milli-Q, hasta que la conductividad descendió a menos de 1 MS/cm. Se equilibró la columna con 3-4 CV de regulador de pH EQ. Se aplicó el producto de retención UF/DF del paso previo en la columna. Se recolectaron el efluente de flujo continuo, cuando la absorbencia a 280 nm alcanzó 5% de la AUFS (escala completa de unidades de absorbencia). Se lavó la columna con 2.3 CV de regulador de pH EQ y se continuó recolectando el efluente de columna, hasta que la absorbencia descendió a 5% de la AUFS. Se mezcló la solución suavemente. Esta solución filtrada constituyó la fracción de flujo continuo del paso de captura de albúmina (HSA-FT). Antes de la elución de la albúmina, se acondicionó la columna con 2 CV de regulador de pH de preelución compuesto de 50 mM de citrato, 300 mM de NaCI, pH 7.5. Se eluyó la albúmina con 2-3 CV de regulador de pH de elución compuesto de 50 mM de citrato de Na, 50 mM de caprilato de Na, pH 6.2. Se inició la recolección del producto de elución una vez que el % UV aumentó a 2% AUFS. Se recolectaron el producto de elución continuamente, hasta que la absorbencia descendió de nuevo a 2% de la AUFS. Se mezcló el producto de elución de la columna suavemente y se almacenó luego a -80°C, hasta que estuvo listo para su procesamiento ulterior. Se regeneró la resina con una solución CIP-1 compuesta de NaOH 1.0 N. Se aplicó la solución CIP-1 a la columna en la dirección de "flujo ascendente" a un régimen de flujo reducido de 400 ml/min durante aproximadamente 4CV, seguido por 3 CV de agua Milli-Q en la dirección de flujo descendente. Se equilibró la resina con 3 CV de solución de almacenamiento hasta el siguiente uso. g. Concentración del flujo continuo de HSA Se conecta la bolsa HSA-FT que contiene el resto de la muestra a la entrada de tubería en el depósito de producto. Se arranca la bomba a un "régimen de flujo constante" de 1 ,300 ml/min en el sistema Slice 200. Se ajusta la presión de la salida de filtro (P2) a 0.9139 ± 0.0703 kg/cm2. Esto debe dar por resultado una presión de entrada de filtro (P1 ) de 1.2654 ± 0.0703 kg/cm2 y una TMP de 0.1850 ± 0.0703 kg/cm2. Mientras se concentra el producto, se abasteció continuamente HSA-FT adicional al depósito del sistema. Se continuó la concentración del HSA-FT, hasta que se alcanzó el volumen de objetivo de aproximadamente 1.5-2 I. Se continuó la recirculación durante aproximadamente 1 minuto sin presión o filtración a través de la membrana, antes de cosechar el producto UF del sistema de filtro. Se añadieron aproximadamente 500-1000 ml de regulador de pH de equilibrio al depósito para enjuagar el sistema de filtro. La recirculación comenzó lentamente para evitar "espumar" el enjuague del sistema durante aproximadamente 3 a 5 minutos, sin filtración ni presión. Se combinó el producto UF, se enjuagó y almacenó a -80°C. Se consideró que el concentrado HAS-FT era un material de partida apropiado para la purificación de AI PI.

Resultados CUADRO 10 Atributos clave para la captura de vWF/FVIII CUADRO 11 Atributos clave para la captura de plasminógeno CUADRO 12 Atributos clave para la captura de fibrinóqeno CUADRO 13 Atributos clave para la captura de IgG CUADRO 14 Atributos clave para la captura de HSA CUADRO 15 Rendimientos del procedimiento para las proteínas de objetivo EJEMPLO 3 Evaluación y selección del sistema regulador de pH del plasma para su uso en el procedimiento de cascada lineal Se realizó este experimento a fin de determinar el sistema óptimo regulador de pH para el esquema de purificación de proteína del plasma de secuencia de cascada lineal. Se observó que durante la carga de la columna de IgG el pH ascendió a 2 unidades arriba de la del plasma (pH -7.5). Se observó un cambio de pH durante la carga de IgG varias veces y pareció ser dependiente de la disminución de proteína de la carga. Esto sugirió que ciertas proteínas de plasma tienen capacidad de regulación de pH, y la remoción de estas proteínas de la solución de carga puede aumentar la probabilidad de un cambio del pH. Se necesitó un sistema regulador de pH para el plasma, para conservar la concentración de proteína y la actividad en el plasma. El sistema regulador de pH tenía que ser tal que el pH permaneciera en una escala aceptable de aproximadamente 7.5 ± 0.4 a través de todo el procedimiento. Para asegurarse de que el cambio de pH no ocurriría en el ciclo subsiguiente se reguló en su pH la carga de plasma para la operación subsiguiente, usando una solución madre de 1 M Tris a pH 7.5. Se creó este regulador de pH madre usando dos concentraciones separadas, 1 M de Tris base y 1 M de Tris HCl. Se titularon estos reguladores de pH uno con otro a pH 7.5. El regulador de pH madre se diluyó luego a 1 :20 en plasma antes de su filtración. La carga preparada final contenía plasma ajustada con 50 mM de Tris, se filtró con un filtro de 0.45/0.2 µm. Se usó este sistema regulador de pH para la determinación de experimentos 1-7 con secuencias en cascada lineal (LCS). Se usó regulador de pH de 50 mM de Tris en el plasma y se operó el regulador de pH a través de todo el procedimiento. No se observaron problemas de pH durante la carga de columna, mientras estaba en uso 50 mM de Tris, pH 7.5. El cuadro 16 resume los rendimientos por paso de purificaciones LCS realizadas usando 50 mM de Tris, pH 7.5, como el regulador de pH de plasma.

CUADRO 16 Rendimientos en porcentaje por paso de las proteínas de objetivo a través de la LCS regulada en su pH con 50 mM de Tris, pH 7.5 Se buscó un sistema regulador de pH alternativo, debido a los costos proyectados relativamente altos de regulador de pH de 50 mM de Tris a escala de fabricación. Se realizaron varios experimentos en alícuotas pequeñas de plasma regulado en su pH con bicarbonato, fosfato y Tris a pH 7.5. Se llevaron a cabo estos experimentos en el transcurso de varios días para estimular la LCS de múltiples días. Se regularon en su pH alícuotas del mismo acervo de plasma y se dejó incubando a temperatura ambiente (RT) durante varios días. Se analizaron muestras de cada una en cuanto a la actividad y concentración de proteína. Se presentan en el cuadro 17 los rendimientos por paso de incubación, cuando se regula en su pH el plasma con cada sistema. Se realizó varias veces el plasma regulado en su pH con 50 mM de Tris, como la referencia para la comparación.

CUADR0 17 Resumen de estudios preliminares sobre regulación de pH de plasma Los resultados indicaron que no había mayor pérdida de proteína o actividad con varios reguladores de pH sometidos a prueba, cuando se comparaban con el control, agua. Ninguna de las proteínas de objetivo fue afectada adversamente por la adición de un agente regulador de pH al plasma. Se sometió luego a prueba cada esquema de regulación de pH en un estudio de cascada para determinar las condiciones óptimas de regulación de pH. Se evaluó un sistema regulador de pH de 10 mM de fosfato de sodio, durante los experimentos con LCS. Durante la preparación de la carga de plasma, se diluyó una solución madre de 0.2 M de fosfato de Na en 10 mM de fosfato de Na con una dilución a 20 veces del regulador de pH madre con plasma. Se filtró el plasma regulado en su pH con 10 mM de fosfato a 0.2 µm antes de su uso en el estudio de cascada lineal. Durante la experimentación de este esquema de regulación de pH, la actividad de proteína fue notablemente menor para las proteínas objetivo y otros factores que eran indicativos de la actividad de proteína. El cuadro 18 siguiente resume los rendimientos por paso de varios ciclos de LCS usando regulador de pH de 10 mM de fosfato.

CUADRO 18 Rendimiento en porcentaje por paso de las proteínas de objetivo a través de la LCS regulada en su pH con 10 mM de fosfato de sodio, pH 7.5 Aunque el plasma regulado en su pH con Tris a 50 mM había tenido éxito en evitar las oscilaciones de pH, se necesitaba un medio más costeable de regular el pH del plasma. Como resultado, se usó 20 mM de Tris, pH 7.5 para la LCS. Se ajustó el plasma a 20 mM de Tris a pH 7.5, con una dilución a 50 veces de 1 M de Tris, pH 7.5. Se hizo este regulador de pH madre, titulando base de Tris con Tris HCl. El cuadro 19 muestra que la realización de los ciclos de LCS usando plasma titulada a 20 mM de Tris es comparable con la del regulador de pH de 50 mM de Tris, como se describe anteriormente en términos de recuperación de la proteína de objetivo, la capacidad de regulación de pH y la estabilidad de la carga.

CUADRO 19 Rendimiento en porcentaje por paso de las proteínas de objetivo a través de la LCS regulada en su pH con 20 mM de Tris, pH 7.5 CUADRO 20 Rendimientos por paso de HSA a través de la LCS usando diferentes sistemas reguladores de pH El cuadro 20 representa los resultados de una comparación entre los sistemas de regulación de pH evaluados en términos de los rendimientos por paso de HSA a través de la LCS. En general, las recuperaciones del paso para la captura de HSA entre tres reguladores de pH sometidos a prueba fueron comparables una con otra, excepto con 10 mM de fosfato, se evidenció un menor rendimiento para HSA con el paso de captura de IgG. También, la IgG, una proteína de objetivo de mayor valor, tuvo una menor recuperación durante el paso de captura de fibrinógeno, cuando se aplicó regulador de pH de 10 mM de fosfato. Todos los valores fueron rendimientos en porcentaje indicados para cada paso de captura. Se reunieron los datos de ciclos de 0.5 I, se calcularon las recuperaciones del paso, basándose únicamente en la cantidad de albúmina presentada en la carga y el flujo continuo. Se concluyó que un regulador de pH que contenía 50 mM de Tris era un regulador de pH de plasma eficaz que puede ser demasiado costoso, conforme se amplía en proporción el procedimiento a la fabricación. Se evaluaron varias alternativas al Tris y se sometieron a cíelos completos de LCS. Se juzgaron estas alternativas, basándose en la capacidad de regulación de pH, facilidad de uso, costo y conservación de la concentración y actividad de proteína. Se halló que un Tris de molaridad reducida (20 mM) a pH 7.5 era eficaz como regulador de pH de plasma. Se puede modalizar la presente invención en otras formas específicas sin desviarse del espíritu y los atributos esenciales de la misma y, por consiguiente se debe hacer referencia a las reivindicaciones anexadas, más bien que la memoria descriptiva precedente, como indicadoras del alcance de la invención.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método de aislamiento y purificación de secuenciales de proteína, caracterizado porque comprende (i) proveer una muestra biológica, (ii) proveer dos o más ligandos, cada uno de los cuales se une específicamente a una proteína de objetivo en la muestra biológica, en donde cada uno de los dos o más lígandos se une a un soporte para formar dos o más complejos de soporte de ligando, (iii) poner en contacto los dos o más ligandos o complejos de soporte de ligando secuencialmente y en un orden predeterminado con la muestra biológica, para permitir que cada ligando o complejo de soporte de ligando se una secuencialmente a la proteína de objetivo de la muestra biológica, en donde no se procesa la muestra biológica a través de un vaso de preacondicioamiento, antes de la puesta en contacto, (iv) eluir la proteína de objetivo unida a cada uno de los dos o más ligandos o complejos de soporte de ligando, y (v) aislar la proteína de objetivo secuencialmente de la muestra biológica.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica es plasma y las proteínas de objetivo comprenden fibrinógeno, inhibidor de alfa-1 proteinasa, apolipoproteína A1 , inmunoglobulinas, paraoxonasa, factores de coagulación, vWF/FVIII, albúmina, plasminógeno o una combinación de los mismos.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica comprende un cultivo celular in vitro y la proteína es una proteína recombinante.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se retiene la actividad de paraoxonasa en la muestra biológica durante el aislamiento de proteína.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se aisla vWF/FVIII del plasma antes de las proteínas.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se aisla la apolipoproteína A1 del plasma después de las otras proteínas.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se aisla la albúmina del plasma antes de la IgG.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se aisla la albúmina de plasma después de la IgG.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se aisla el plasminógeno del plasma antes del fibrinógeno.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el orden predeterminado de poner en contacto los dos o más ligandos o complejos de soporte de ligando con la muestra biológica da por resultado la unión secuencial de vWF/FVIII, plasminógeno, fibrinógeno, apolipoproteína A1 , paraoxonasa, IgG, albúmina e inhibidor de alfa-1 o proteinasa en el orden citado.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el orden predeterminado de poner el contacto los dos o más ligandos o complejos de soporte de ligando con la muestra biológica da por resultado la unión secuencial de vWF/FVIII, apolipoproteína A1 , paraoxonasa, plasminógeno, fibrinógeno, IgG, albúmina, inhibidor de alfa-1 proteinasa en el orden citado.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el orden predeterminado de poner el contacto los dos o más ligandos o complejos de soporte de ligando con la muestra biológica da por resultado la unión secuencial de vWF/FVIII, albúmina e inhibidor de alfa-1 proteinasa en el orden citado.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ligando comprende un péptido, polipéptído, peptidomimético, molécula pequeña, colorante, compuesto a que contiene triazina, anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, molécula a base de ácido nucleico, molécula no polipeptídica o a base de nucleótidos, carbohidrato, miméticos de carbohidrato, lípidos, material inorgánico, inhibidor, sustrato, o cualquier combinación de los mismos.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque los lígandos comprenden péptidos que consisten esencialmente en aproximadamente 1 a aproximadamente 15 aminoácidos.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se obtiene la muestra biológica de biopsia de tejido, sangre, cabello, raspaduras bucales, plasma, suero, piel, ascitis, efusión plural, fluido de toracentesis, fluido espinal, fluido linfático, médula ósea, fluido respiratorio, fluido intestinal, fluido genital, materia fecal, orina, flema, lágrimas, saliva, tumores, órganos, tejidos, muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro, células fetales, células de placenta o células amnióticas y/o fluido, un medio acondicionado, un caldo de fermentación, fluido cerebroespinal, leche, fluido de conducto, sudor y semen.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el soporte comprende un material sintético, un material natural o ambos.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el soporte comprende agarosa, poliacrilamida, dextrano, celulosa, polisacárido, nitrocelulosa, sílice, alúmina, óxido de aluminio, titania, óxido de titanio, zirconia, estireno, polivinildifluoruro nylon, copolímero de estireno y divinilbenceno, polimetacrilato-éster, polímero o copolímero de aziactona derivatizado, vidrio, celulosa, agarosa, derivados de cualesquiera de los precedentes y combinaciones de cualesquiera de los precedentes.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el soporte es una perla de resina.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el preacondicionamiento comprende precipitación de alcohol, crioprecipitación, remoción de lípidos y/o proteínas lipídicas, precipitación de euglobulina o una combinación de los mismos.

20.- Una preparación caracterizada porque comprende una proteína de plasma sustancialmente pura, producido mediante el procedimiento de la reivindicación 1.

21.- La preparación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la proteína de plasma comprende fibrinógeno, inhibidor de alfa-1 proteinasa, apolipoproteína A1 , inmunoglobulinas, paraoxonasa, factores de coagulación, vWF/FVIII, albúmina, plasminógeno o cualquier combinación de los mismos.

22.- La preparación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la proteína de plasma está purificada sustancialmente con una pureza por lo menos del 70%.

23.- La preparación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la preparación está sustancialmente purificada, libre de cualesquiera impurezas causadas por inmunoadsorbentes y ha sido sometida por lo menos a un paso de activación de patógenos.

24.- La preparación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque está formulada como composición farmacéutica.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se trata la muestra biológica con un agente regulador de pH antes del paso de poner en contacto a fin de conservar adicionalmente la concentración y la actividad de uno o más agentes de objetivo en la muestra biológica.