JP2012050386A - 2種類以上の多孔質充填剤を充填するカラム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酵素と該酵素による分解物と親和性を持つ分子を個別に固定化した2種類の担体に分け、酵素反応と該酵素による分解物の濃縮の順序となるようなカラムとすることで、過剰分解物の生成を抑制できるアフィニティートラップリアクター。
【選択図】なし
Description
本発明によるカラムは、リガンドを固定化した2種類以上の多孔質充填剤を充填した1つのカラムとすることで、異なる機能を同一カラムで発揮させることが可能である。また、充填される多孔質充填剤を任意の比率で変更することで、最適なカラムの使用条件を提供できるため、2段階以上に分けた場合よりも優れた精製効果を取得することが期待できる。
バイオリアクターカラムは、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させたものであるので、生化学の分野で使用されるアフィニティークロマトグラフィーを製造する方法を応用することにより、当業者であれば容易に作製をすることができる。
本発明によるバイオリアクターカラムの1つであるアフィニティートラップリアクターを用いて、所望の酵素と基質の反応を進行させるには、上記のように調製したアフィニティートラップリアクターをあらかじめ緩衝液で平衡化しておく。緩衝液の種類は、固定化した酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができる。酵素としてバシロライシンMAを、基質と特異的に結合する分子として6−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合、50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)(緩衝液C)を用いることができる。
(実施例1)
特開2007−131668に記載の実施例と同様に、PVA担体を作製した。
PVA担体151gに、ジメチルスルホキシド(DMSO)183mL、30%NaOH15.2mL、エピクロロヒドリン122mLを加えて、40℃で5時間反応させた。このスラリーをDMSO0.6L、水3.0Lで洗浄することで、エポキシ活性化PVA担体を得た。
エポキシ活性化PVA担体160mLに水100mL、2M炭酸ナトリウム水溶液40.1mL、2Mアミノカプロン酸水溶液20.5mLを加え、50℃で5時間反応させた。このスラリーを水3.2Lで洗浄することで6−アミノカプロン酸を固定化したPVA担体を得た。
6−アミノカプロン酸を固定化したPVA担体98mLをDMSO245mLで洗浄し、洗浄した担体にDMSO94mL、NHS12.6g、EDC21.0gを加え、40℃で10時間反応させた。このスラリーをDMSO2.0Lで、IPA0.3Lで洗浄することでNHS活性化PVA担体を得た。このNHS活性化PVA担体5mLを冷1mM HCl溶液25mLで洗浄し、洗浄した担体に1mM HCl溶液2.6mL、次に4mgのバシロライシンMAを含む緩衝液A(1mM HCl溶液と合わせて、0.2M 炭酸水素ナトリウム、0.5M NaCl、5%イソプロピルアルコールとなる溶液)7.4mLを添加し、5℃で4時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液B(5%イソプロピルアルコールを含む、25mM リン酸ナトリウム)50mLでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液B中、−10℃以下で保存した。
6−アミノカプロン酸を固定化したPVA担体と、6−アミノカプロン酸とバシロライシンMAを固定化したPVA担体を各々0.5mL計量し、1mL容積のカラムに6−アミノカプロン酸とバシロライシンMAを固定化したPVA担体がカラムの上流側となるように充填し、バシロライシンMA/6−アミノカプロン酸リアクターカラムを作製した。前記リアクターカラム内部の液体を前述の緩衝液Bで置換し、−10℃以下で保存した。
上記で作製した、バシロライシンMA/6−アミノカプロン酸リアクターカラム(1mL)を、緩衝液C(50mM リン酸ナトリウム、pH7.4)で平衡化した。平衡化したリアクターカラムに、クエン酸処理したヒト血漿5mLを流速0.125mL/分で添加した。その後、0.5M NaClを含む上記組成の緩衝液C10mLでリアクターを洗浄した(3mL/分)。生成したBL−アンジオスタチンの溶出は、200mMの6−アミノヘキサン酸溶液3mLで行なった。その結果、BL−アンジオスタチンの収量及び純度は、315μg及び43%であった。
(比較例1)
(参考例1)
市販のNHS活性化セファロース担体約3.9mLを冷1mM HCl溶液117mLで洗浄し、洗浄した担体に78μgのバシロライシンMAを含む緩衝液A(0.2M 炭酸水素ナトリウム、0.5M NaCl、5%イソプロピルアルコールとなる溶液)7.8mLを添加し、25℃で2時間撹拌することによって、酵素固定化反応を行った。反応終了後に反応溶液を除去し、0.2M リジン溶液(5%イソプロピルアルコールを含む)7.8mLを添加し、25℃で2時間攪拌することによって、リジン固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液B(5%イソプロピルアルコールを含む、25mM リン酸ナトリウム)117mLでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液B中、−10℃以下で保存した。左記のリアクターを使用する以外は、実施例1と同じ方法で評価を行った。その結果、BL−アンジオスタチンの収量及び純度は、224μg及び42%であった。
Claims (9)
- リガンドを固定化した2種類以上の多孔質担体が充填されることを特徴とするカラム。
- 少なくとも1種類の多孔質担体がカラムの下流側に充填され、且つ体積で10%以上を占める、請求項1記載のカラム。
- 2種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ50%ずつ充填され、且つ2種類の多孔質担体が混合状態にある体積が50%以下である、請求項1または2に記載のカラム。
- 2種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ50%ずつ充填され、それらの多孔質担体が互いに混ざらないようにすることができるフィルターまたはメッシュのようなもので仕切られている、請求項1から3のいずれかに記載のカラム。
- 1種類の多孔質担体がリガンドとして酵素を固定化した多孔質担体であり、もう1種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素による分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項1から4のいずれかに記載のカラム。
- 1種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素を固定化した多孔質担体であり、もう1種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素によるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項1から5のいずれかに記載のカラム。
- 1種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素であるバシロライシンMAを固定化した多孔質担体であり、もう1種類の多孔質担体がリガンドとしてバシロライシンMAによるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子であるリジンまたは/および6−アミノカプロン酸を固定化した多孔質担体である、請求項1から6のいずれかに記載のカラム。
- 多孔質担体が水酸基を有する化合物からなる水不溶性多孔質担体である、請求項1から7のいずれかに記載のカラム。
- 水不溶性多孔質担体がセルロース、アガロースなどの多糖類、ポリビニルアルコールなどの合成高分子などの群から選ばれるものである、請求項1から8のいずれかに記載のカラム。
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