JP2022541471A - ヘキソースの生成のための固定化酵素組成物 - Google Patents

ヘキソースの生成のための固定化酵素組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヘキソースの調製のための固定化酵素組成物に関する。ヘキソースとしては、例えば、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、およびイノシトールが挙げられる。また、本発明は、デンプン誘導体を本発明の固定化酵素組成物と接触させることによって、糖からヘキソースを調製するための酵素プロセスに関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国出願第６２／８７５，３２１号、および２０１９年１０月２２日に出願された米国出願第６２／９２４，３２３号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、固定化酵素組成物を使用するヘキソース単糖類の調製に関する。より具体的には、本発明は、糖類（例えば、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、スクロース、Ｄ－グルコース、およびＤ－フルクトース）からＤ－ヘキソース（またはヘキソース）を調製する方法に関し、フルクトース６－リン酸が、固定化酵素により触媒される１つ以上の酵素ステップによって、ヘキソースに変換されるステップを含む。
ヘキソースは、６個の炭素原子を有する単糖類である。ヘキソースとしては、例えば、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、およびイノシトールが挙げられる。ヘキソースは、多くの業界で使用されており、明らかに、製薬業界、バイオテクノロジー、ならびに食品および飲料業界で、様々な用途を有する。ヘキソースは、糖類（例えば、単糖類、オリゴ糖類、デンプン、デンプン誘導体、セルロースなど）から、酵素プロセスを使用して調製され得る。溶液ベースの酵素プロセスは、公開ＰＣＴ出願第２０１８／１６９９５７号、同第２０１７／０５９２７８号、および同第２０１８／１１２１３９号に記載されている（それらは、参照により本明細書に援用される）。
酵素プロセスの商業的な開発は、グリーンケミストリーを利用し、したがって、環境に対する合成の影響を低減する工業プロセスの数を増やすために不可欠である。多くの酵素プロセスが、商業的な生産のために開発されているが（例えば、ＰＣＴ出願第２０１８／１６９９５７号、同第２０１７／０５９２７８号、および同第２０１８／１１２１３９号）、これらのプロセスが低コスト製品（代替甘味料など）用である場合、酵素の使用コストに関連して、商業化へのハードルがある。この問題に対する一般的な解決策は、酵素を担体に固定化することである（例えば、ＷＯ２０１６／１６０５７３）。固定化により、酵素を、バッチ間で再利用し、または連続的なプロセスで使用することが可能になる。酵素の再利用能力は、１ｋｇの生成物当たりの酵素の使用コストを大幅に低減し、商業的な実現性に不可欠であり得る。酵素固定化のための多くの方法が存在し、特定のプロセスによってどの方法が優先されるのかに関して定まったルールはない（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．３ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１３），３：１－９）。したがって、プロセスごとに、独自の解決策を開発する必要がある。
商業的なプロセスでは、酵素は、当該技術分野で既知であるように、機能性を向上させるために一般的に使用される不溶性の有機支持体または無機支持体に吸着させることができる。これらには、アガロース、メタクリレート、ポリスチレン、フェノールホルムアルデヒド、またはデキストランなどの高分子支持体、ならびにガラス、金属、または炭素系材料などの無機支持体が含まれる。これらの材料は、しばしば、固定化酵素の付着および活性を促進する大きい表面積対体積比および特殊化された表面で生成される。酵素は、共有結合性、イオン性、または疎水性の相互作用を介して、これらの固体支持体に付着され得る。酵素はまた、共有結合性融合などの遺伝子操作された相互作用を介して、固体支持体への親和性を有する別のタンパク質またはペプチド配列（最も多くの場合、ポリヒスチジン配列）に付着され得る。酵素は、表面もしくは表面コーティングに直接付着されてもよく、または表面もしくは表面コーティング上に既に存在する他のタンパク質に付着されてもよい。酵素は、すべて１つの担体上で、個々の担体上で、または２つの担体の組み合わせ上で（例えば、担体当たり２つの酵素、次いで、それらの担体を混合する）、固定化することができる。これらのバリエーションは、連続反応器内のターンオーバーを最適化するために、均一にまたは所定の層内で混合することができる。これらの酵素は、ターンオーバーを最適化するために、均一にまたは所定の層もしくはゾーン内で混合されてもよい。例えば、反応器の始まりは、ａＧＰの層を有して、高い初期Ｇ１Ｐ増加を確実にしてもよい。酵素は、すべて１つの担体ビーズ上に固定化されるか、各々、個々の担体ビーズ上に固定化されるか、または酵素群として担体ビーズ上に固定化され得る。同様に、酵素は、１つ以上の固定化の方法論を使用して、１つのプロセス内で、特定の担体または複数の担体上に固定化され得る。
高収率の所望のヘキソースを達成しながら、拡張性のある再利用可能な酵素組成物を可能にする、ヘキソースを生産するための改善されたプロセスを有する必要がある。
本発明は、ヘキソースの調製のための固定化酵素組成物に関する。ヘキソースとしては、例えば、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、およびイノシトールが挙げられる。本発明の固定化酵素組成物は、少なくとも１つの担体または担体の混合物に固定化された以下の酵素のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、または少なくとも８つを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる：
ａ）αグルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、および任意選択的に、１，４－グルカントランスフェラーゼ（４－ＧＴ）、ならびに
ｂ）以下から選択される酵素の組み合わせの中からの酵素：
（ｉ）タガトースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、フルクトース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）、およびタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）、
（ｉｉ）アルロースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、ピスコース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）、およびピコース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）、
（ｉｉｉ）アロースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、Ｐ６ＰＥ、アロース－６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）、およびアロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）、
（ｉｖ）マンノースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）またはホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）、およびマンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）、
（ｖ）ガラクトースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、Ｆ６ＰＥ、ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）、およびガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）、
（ｖｉ）フルクトースを調製するための、ＰＧＩおよびフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）、
（ｖｉｉ）アルトロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）、およびアルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）、
（ｖｉｉｉ）タロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）、およびタロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）、
（ｉｘ）ソルボースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）、およびソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）、
（ｘ）グロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）、およびグロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）、
（ｘｉ）イドースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）、およびイドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）、ならびに
（ｘｉｉ）イノシトールを調製するための、イノシトール３－リン酸シンターゼ（ＩＰＳ）およびイノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰ）。
本発明の固定化酵素組成物では、酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％は、０．１％～４０％の範囲である。
また、本発明は、好適な反応条件下で、デンプン誘導体を本発明の固定化酵素組成物と接触させて、デンプン誘導体をヘキソースに変換することによって、糖からヘキソースを調製するための酵素プロセスに関する。
タガトース生成のために最適化される固定化酵素組成物中の酵素の量を示すグラフである。 固定化酵素組成物中の酵素の量を示すグラフであり、カスケード内で同等の活性単位を有するために、Ｔ６ＰＰ活性に対する各酵素の観察された反応速度に基づいて、それらの量が正規化される。 固定化酵素組成物中の酵素の量を示すグラフであり、その量は、１：１：１：１：１：１のｗ／ｗ比であった。 ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８におけるタガトース生成のために最適化される、固定化酵素組成物の活性に対する酵素負荷（酵素総重量／担体重量のｗ／ｗ％）の関係を示すグラフである。示された結果は、５％負荷の担体に対する相対的な酵素カスケード速度に基づく。
以下の説明は、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソース単糖類（例えば、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、およびイノシトールを含む）に変換するためのプロセスにおいて、担体に固定化された酵素（「固定化酵素組成物」）の製造および使用に関する実施形態に従って、本発明を開示する。これらのプロセスは、概して、遊離リン酸（ＡＴＰなし）を使用して、デンプン、デンプン誘導体、または糖から、リン酸化中間体を生成する酵素反応として説明され得る。遊離リン酸は、非常にエネルギー的に有利な最終ステップで放出されて、目的のヘキソース（例えば、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトール）を生成する。次に、リン酸を再利用して、プロセスを繰り返すことができるように、追加のデンプン、デンプン誘導体、または糖をリン酸化中間体に変換する。これにより、非化学量論的な量のリン酸を利用することが可能になり、プロセスにおけるリン酸の使用のコストが低減され、廃棄物中のリン酸のレベルが制限される。
本発明の実施形態は、担体上で固定化された少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、または少なくとも８つの酵素の組成物を含み、それらは、それぞれ、デンプン、デンプン誘導体、および／もしくは糖をヘキソースに変換するための酵素プロセスにおける反応を触媒する。本発明の固定化酵素組成物は、遊離溶液におけるそれらの使用よりも多くの利点を提供し、これには、より長い活性持続時間（タンパク質の構造的特徴の保護による）、複数サイクルの再利用、および下流の酵素を除去する必要性の排除が含まれる。さらに、固体表面への酵素の固定化は、撹拌槽反応器、充填床反応器、または回転床反応器のいずれかで機能することができ、スケールアップでの柔軟性が可能になる。
本発明の固定化酵素組成物に含まれる酵素は、デンプン、デンプン誘導体、または糖類のヘキソースへの段階的な変換に関与する、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、または少なくとも８つの反応を触媒する。以下の特許公開は、すべてそれらの全体が本明細書で開示され、溶液中でヘキソースを生成するための酵素プロセス（すなわち、酵素反応カスケード）を開示する：公開ＰＣＴ出願第２０１８／１６９９５７号、同第２０１７／０５９２７８号、および同第２０１８／１１２１３９号。本発明の固定化酵素組成物は、これらの参考文献に開示された酵素および酵素の組み合わせのいずれかを含み得るが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの固定化酵素組成物は、反応を触媒する酵素の組み合わせを含み、これらは、異なるヘキソースを生成するプロセス（例えば、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）のフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）への変換につながる反応ステップ）の間で一般的である。これらの一般的な反応ステップを触媒する酵素は、「コア酵素」と呼ばれることもある。したがって、本発明のいくつかの固定化酵素組成物では、固定化酵素組成物は、少なくとも、コア酵素、糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するαグルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）と、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）と、を含む。本発明の固定化酵素組成物中の酵素は、Ｇ６Ｐを様々なヘキソース生成物に変換するための追加の反応ステップを触媒し、コア酵素と共に共固定化されてもよく、または別個の固定化酵素組成物中に含まれてもよい。
典型的には、コア酵素は、固定化組成物中で、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールの生成に使用される酵素のうちの１つ以上と組み合わされる。したがって、本発明によるいくつかの固定化酵素組成物は、αＧＰおよびＰＧＭに加えて、以下も含む：（ｉ）タガトースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、フルクトース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）、およびタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）、（ｉｉ）アルロースを調製するための、ＰＧＩ、ピスコース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）、およびピコース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）、（ｉｉｉ）アロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、アロース－６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）、およびアロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）、（ｉｖ）マンノースを調製するための、ＰＧＩ、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）またはホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）、およびマンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）、（ｖ）ガラクトースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）、およびガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）、（ｖｉ）フルクトースを調製するための、ＰＧＩおよびフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）、（ｖｉｉ）アルトロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）、およびアルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）、（ｖｉｉｉ）タロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）、およびタロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）、（ｉｘ）タロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）、およびソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）、（ｘ）グロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）、およびグロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）、（ｘｉ）イドースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）、およびイドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）、ならびに（ｘｉｉ）イノシトールを調製するための、イノシトール３－リン酸シンターゼ（ＩＰＳ）およびイノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰ）。コア酵素および酵素組成物（ｉ）～（ｘｉｉ）の各組み合わせは、本発明の別個の実施形態である。
上記の固定化酵素組成物は、任意選択的に、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を含むこともできる。４ＧＴは、分解生成物であるグルコース、マルトース、およびマルトトリオースを、より長いマルトオリゴ糖類に再利用することによって、ヘキソースの収率を増加させるために使用することができ、これは、αＧＰによって加リン酸分解的に切断されて、Ｇ１Ｐを生成することができる。
本発明の固定化酵素組成物中の酵素間の相対重量比は、固定化組成物中の任意の２つの酵素を比較する場合、１：１０００～１０００：１、１：１００～１００：１、または１：５０～５０：１の範囲であり得る。酵素比は、以下で考察される他の任意選択的な酵素を含めて、ヘキソース生成の効率を増加させるために変えることができる。例えば、特定の酵素は、別の酵素の量に対して、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍などの量で存在し得る。
本発明の固定化酵素組成物中の酵素間の相対重量／重量比は、プロセス性能および／またはヘキソース収率を増加させるように最適化することができる。その点に関して、酵素の総重量に対する固定化酵素組成物中の各酵素の重量（ｗ／ｗ）％は、０．１％～７０％の範囲である。例えば、本発明のいくつかの固定化酵素組成物は、１０～３０％（αＧＰ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、ならびに０．１～１０％（ＰＧＩ）（存在する場合）および０．１～１０％（４ＧＴ）（存在する場合）を含む。例えば、本発明の固定化酵素組成物は、タガトースの生成に使用することができ、酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％は、１０～３０％（αＧＰ）、０～１０％（４ＧＴ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、０．１～１０％（ＰＧＩ）、１５～３５％（Ｆ６ＰＥ）、およびＴ６ＰＰ（２５～４５％）であり、組成物中の酵素の総重量は、酵素の総重量に対して１００ｗ／ｗ％である。タガトースの生成に使用する場合、本発明のいくつかの固定化酵素組成物は、１９％のαＧＰ、３％の４ＧＴ、１７％ＰＧＭ、３％のＰＧＩ、２３％のＦ６ＰＥ、および３５％のＴ６ＰＰを含み、各酵素の重量％は、本発明の固定化酵素組成物中の酵素の総重量に対して相対的であり、組成物中の酵素の総重量は、酵素の総重量に対して１００ｗ／ｗ％である。他の実施例では、本発明の固定化酵素組成物は、アルロースの生成に使用され、酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％は、１０～３０％（αＧＰ）、０～１０％（４ＧＴ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、０．１～１０％（ＰＧＩ）、０．１～１０％（Ｐ６ＰＥ）、および４５～６５％（Ｐ６ＰＰ）であり、組成物中の酵素の総重量は、酵素の総重量に対して１００ｗ／ｗ％である。アルロースの生成に使用する場合、本発明のいくつかの固定化酵素組成物は、２０％のαＧＰ、３％の４ＧＴ、１６．５％のＰＧＭ、３％のＰＧＩ、３％Ｐ６ＰＥ、および５４％のＰ６ＰＰを含み、各酵素の重量％は、本発明の固定化酵素組成物中の酵素の総重量に対して相対的であり、組成物中の酵素の総重量は、酵素の総重量に対して１００ｗ／ｗ％である。
本発明の固定化組成物に含まれる酵素は、概して、それらが触媒する反応に基づいて（すなわち、特異性および機能によって）言及されるが、酵素は、通常、アミノ酸配列（例えば、配列番号、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤなどのデータベース識別番号）、既知の機能の酵素に対するアミノ酸配列の同一性／類似性、ヌクレオチド配列、または既知の機能の酵素に対するヌクレオチド配列の同一性／類似性によっても特定される。当該技術分野で既知であり、ヘキソースを調製するために使用される酵素は、本発明の固定化酵素組成物に使用することができ、これには、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、およびイノシトールを生成するために使用され得る固定化酵素組成物が含まれる。当該技術分野で既知の例示的な酵素は、本発明の固定化酵素組成物に使用することができ、以下の関連する特許文献で特定される。列挙された特許における酵素の開示は、参照により本明細書に具体的に援用される。
Figure 2022541471000002
したがって、特定の固定化酵素組成物では、表１に、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤおよび配列番号が提供され、本発明の固定化酵素組成物中に含まれ得る以下の非限定的な例の酵素のアミノ酸配列が特定される：αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｔ６ＰＰ、４－ＧＴ、Ｐ６ＰＥ、およびＰ６ＰＰ。
Figure 2022541471000003
本発明の固定化酵素組成物に含まれる酵素のアミノ酸配列には、例えば、活性、安定性（すなわち、半減期）、または収率を向上させるためなどの何らかの理由で修飾され得る酵素も含まれる。そのような修飾された酵素としては、例えば、酵素の断片、アミノ酸置換、およびキメラタンパク質が挙げられる。修飾された酵素には、本明細書に開示される任意の酵素のバリアントが含まれる。バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基で、アミノ酸置換を含むことができる。バリアントは、天然に存在する酵素と比較して、１５個以下、１２個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個以下の保存的アミノ酸置換、および／または天然に存在する酵素と比較して、５個以下、４個以下、３個以下、もしくは２個以下の非保存的アミノ酸置換、もしくは１個以下の非保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸を含む。本発明のバリアント酵素は、本明細書に記載されるように、アミノ酸類似体、ならびにアミノ酸によるアミノ酸置換を含み得る。
本発明の酵素組成物に含まれる酵素は、ｉ）本明細書に開示される酵素のアミノ酸配列と少なくとも３５％の配列同一性を共有する酵素、およびｉｉ）プロセスに必要な特異性を有する特定の開示される酵素の同じ反応を触媒することができる酵素であってもよい。したがって、本発明の組成物中の酵素は、本明細書に開示される酵素のアミノ酸配列と、少なくとも３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する酵素を含む。本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列間の類似性を指す。配列同一性は、典型的には、アミノ酸配列間の同一性のパーセンテージ（または類似性もしくは相同性）に関して測定され、そのパーセンテージが高いほど、互いに比較される配列の類似性がより高い。
上記のように、本発明の酵素組成物は、少なくとも１つの担体に固定化される。担体はまた、概して、本明細書において、「担体材料」、「担体樹脂」、または「担体ビーズ」と称され得る。本発明の固定化酵素組成物では、複数の異なる担体を使用して、１つ以上の酵素を固定化することができる。本発明の固定化酵素組成物における担体は、必ずしも特定の材料に限定されないが、本発明のいくつかの固定化酵素組成物では、担体は、任意選択的に、フェノールホルムアルデヒド（すなわち、フェノールホルムアルデヒド重縮合体）から構成され得る弱塩基性イオン交換樹脂である。本発明のさらに他の固定化酵素組成物では、担体材料は、制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ、ＣＰＧ）粒子またはハイブリッドＣＰＧ粒子（ＷＯ２０１５／１１５９９３Ａ１）に基づく。本発明のいくつかの固定化酵素組成物中の担体は、三級アミン基を含むことによって官能化され、一方、他のものでは、二級アミン基が官能性を提供する。本発明のいくつかの固定化酵素組成物では、担体樹脂は、例えば、鉄または亜鉛などの金属をキレート化するために使用される基で官能化される。キレート金属基は、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどの適切な結合基を介した分子の高親和性結合を可能にする。かかる官能基の例は、ＷＯ２０１５／１１５９９３Ａ１およびＣａｓｓｉｍｊｅｅ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｏｓｉｔｙ ｇｌａｓｓ： ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１４，５０，９１３４に見出され、２，４－ジヒドロキシベンジル残基を含むが、これに限定されない。
本発明のいくつかの固定化酵素組成物中の担体は、上で列挙された様々な担体の特徴のうちの２つ以上を有する。例えば、本発明のいくつかの固定化酵素組成物では、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソース単糖類に変換するプロセス（タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールを生成するプロセスを含む）で使用するための、本明細書に記載の固定化酵素組成物のいずれかの酵素組成物は、弱塩基性陰イオン交換樹脂に固定化され、これは、フェノールホルムアルデヒド重縮合体から構成されていても、構成されていなくてもよく、三級アミン基によって官能化されていても、官能化されていなくてもよい。上記の特徴を有する担体樹脂は、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８として市販されている。本発明の他の固定化酵素組成物では、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソース単糖類に変換するプロセス（タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールを生成するプロセスを含む）で使用するための、本明細書に記載の固定化酵素組成物のいずれかの酵素組成物は、弱塩基性陰イオン交換樹脂に固定化され、これは、フェノールホルムアルデヒド重縮合体から構成されていても、構成されていなくてもよく、二級アミン基によって官能化されていても、官能化されていなくてもよい。上記の特徴を有する担体樹脂は、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７として市販されている。本発明のさらに他の固定化酵素組成物では、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソース単糖類に変換するプロセス（タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールを生成するプロセスを含む）で使用するための、本明細書に記載の固定化酵素組成物のいずれかの酵素組成物は、Ｈｉｓタグ親和性樹脂に固定化され、これは、ＣＰＧまたはハイブリッドＣＰＧ粒子材料担体から構成されていても、構成されていなくてもよく、鉄または亜鉛をキレート化してもよく、キレート化しなくてもよい。上記の特徴を有する担体樹脂は、ＥｚｉＧ（商標）Ｏｐａｌとして市販されている。
一般に、本発明の固定化酵素組成物中の酵素の総重量は、担体の重量（ｗ／ｗ）％に対して、２．５％～１２．５％の範囲である。したがって、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソース単糖類に変換するプロセス（タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールを生成するプロセスを含む）で使用するための、本明細書に記載の固定化酵素組成物のいずれかの酵素組成物の総重量は、担体の重量（ｗ／ｗ）％に対して、約２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、またはそれらの間の任意のｗ／ｗ％であり得る。例えば、タガトースを生成するために使用されるいくつかの固定化酵素組成物中の酵素（αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、およびＴ６ＰＰ）または（αＧＰ、４ＧＴ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、およびＴ６ＰＰ）の総重量は５％であり、一方、酵素（αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、およびＰ６ＰＰ）または（αＧＰ、４ＧＴ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、およびＰ６ＰＰ）の総重量は６．５％である。
また、本発明は、糖からヘキソースを調製するための酵素プロセスに関し、好適な反応条件下で、デンプン誘導体を本発明の固定化酵素組成物と接触させて、デンプン誘導体をヘキソースに変換するステップを含む。ヘキソースを調製するための本発明の酵素プロセスでは、プロセスの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、または少なくとも８つの酵素を、同じ担体上に固定化してもよく、または複数の担体上に固定化してもよい。例えば、本発明の酵素プロセスでは、酵素は、同じ担体上に固定化されてもよく、または固定化された酵素は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つの担体間で分配されてもよく（同じタイプの担体、または異なる担体の任意の組み合わせであってもよい）、固定化の方法は、弱塩基性陰イオン交換樹脂担体、フェノールホルムアルデヒド重縮合体担体、三級アミン官能基を含む担体（例えば、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８）、二級アミン官能基を含む担体（例えば、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７）、Ｈｉｓタグ親和性樹脂を含む担体、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）粒子を含む担体、およびキレート金属によって官能化された担体（キレート金属が、鉄または亜鉛である担体（例えば、ＥｚｉＧ（商標）Ｏｐａｌ）を含む）を含む。
本明細書に記載の担体のいずれかに酵素を固定化するための方法は、当該技術分野において既知であり、酵素を担体樹脂に結合させるための適切な緩衝液および反応条件が含まれる。例えば、ＷＯ２０１６／１６０５７３を参照されたい（その全体が本明細書に援用される）。
本発明の固定化酵素組成物を使用してデンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類をヘキソースに変換するためのプロセスは、溶液中の非固定化酵素を使用してヘキソースを生成するために使用されるものと同じ温度、緩衝液、および反応時間のパラメータの下で実施することができる。例えば、本発明の固定化酵素組成物は、公開ＰＣＴ出願第２０１８／１６９９５７号、同第２０１７／０５９２７８号、および同第２０１８／１１２１３９号に記載されている反応条件下で、デンプンおよびデンプン誘導体ならびに糖類から、タガトース、プシコース、フルクトース、アロース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、またはイノシトールを生成するために使用され得る。本発明の固定化酵素組成物を使用してヘキソースを生成するプロセスにおける複数の触媒反応ステップは、単一のバイオ反応器、もしくは直列に配置される複数のバイオ反応器、または反応容器内で実施することができる。あるいは、これらのステップは、直列または並列に配置される複数のバイオ反応器、または反応容器で実施することもできる。前述のすべてのプロセスは、バッチモードまたは連続モードで実行することができる。単一バイオ反応器での「ワンポット（ｏｎｅ－ｐｏｔ）」プロセスが好ましい。
本発明の酵素プロセスにおけるステップは、約３５℃～約９０℃、約４０℃～約７０℃、約５０℃～約６０℃、または約５５℃の範囲の温度、および約５．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約７．０～約７．５の範囲のｐＨで実施することができる。これらは、約０．５時間～約４８時間、約４時間～２４時間、または約８時間～１２時間実施され得る。本発明の酵素プロセスのステップは、ＡＴＰ不含で、かつ／またはＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）不含で行われてもよい。ステップは、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭの範囲のリン酸濃度で実行され得る。本発明によるプロセスのリン酸化ステップおよび脱リン酸化ステップで使用されるリン酸は、酵素カスケード反応内で再利用することができる。本発明のプロセスは、充填されたカラムで、またはスラリー中で実行することができる。
例えば、各プロセスにおける反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、各プロセスにおける反応のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであり得る。
リン酸濃度が低いと、総リン酸濃度が低いことから、生産コストが低減され、したがって、リン酸を除去するコストが低減される。また、高濃度の遊離リン酸によるプロセス酵素の阻害が防止され、リン酸汚染の可能性が低減される。
さらに、本明細書に開示されるプロセスの各々は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加することなく（すなわち、ＡＴＰ不含）、実施することができる。各プロセスは、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を添加する必要がなく（すなわち、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）不含）、実施することもできる。他の利点としては、ヘキソースを生成するための開示されたプロセスの少なくとも１つのステップが、非常にエネルギー的に有利な化学反応を伴うという事実が挙げられ、これは、高収率に不可欠である。本発明のプロセスのための非常にエネルギー的に有利な化学反応は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの平衡定数（Ｋｅｑ）を有する。
本発明のプロセスの最初のステップとして、デンプン誘導体は、デンプンの酵素加水分解によって、またはデンプンの酸加水分解によって調製することができる。例えば、ＷＯ２０１７／０５９２７８を参照されたい。例えば、デンプンの酵素加水分解は、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ．３．２．１．６８）、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するプルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ．３．２．１．４１）、短いマルトオリゴ糖類のトランスグリコシル化を触媒し、より長いマルトオリゴ糖類を生成する４－α－グルカノトランスフェラーゼ（４ＧＴ、ＥＣ．２．４．１．２５）、またはα－１，４－グルコシド結合を切断するαアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）によって触媒または増強され得る。さらに、セルロースの誘導体は、セルロースの酵素加水分解によって調製され得、セルラーゼ混合物によって、酸によって、またはバイオマスの前処理によって触媒される。
実施例１．酵素担体の評価。酵素担体を、タガトースを生成するための酵素組成物の相対反応速度、ならびに酵素の安定性に対するそれらの効果について評価した。これらの目的を念頭に置いて、以下の酵素担体材料を評価した：４つのブランドのフェノール－ホルムアルデヒドマトリックス樹脂（ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６１、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７、ＡｍｂｅｒＬｉｔｅ（商標）ＦＰＡ５４）、２つのブランドのポリスチレン樹脂（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１６４０およびＬｉｆｅＴｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１５０４）、２つのブランドのポリメチルアクリレート樹脂（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９ＭおよびＣｈｒｏｍｏｌｉｔｅ（商標）Ｄ６１５４）、ならびに１つのブランドの制御多孔性ガラス樹脂（ＥｚｉＧ Ｏｐａｌ（商標））。
ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８（ＤｕＰｏｎｔ）イオン交換樹脂は、架橋フェノール－ホルムアルデヒド重縮合体系の、高い多孔性の粒状の弱塩基性陰イオン交換樹脂である。その親水性および制御された孔径分布から、多くのバイオプロセス用途で、酵素担体として使用するのに最も好適な樹脂となる。ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８のイオン強度、孔体積、孔径、および粒径は、デンプンおよび脂肪（および他の）産業で使用される酵素の最適な固定化のために設計されている。
ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６１イオン交換樹脂は、三級アミン官能基を有するフェノールホルムアルデヒドから作製される弱塩基性陰イオン交換体であり、その広範な仕様は、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８樹脂に類似しているが、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６１は異なるビーズ形態を有する。
ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７は、アミン官能性、および塩形態を有する弱塩基性陰イオン交換体である。
ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（商標）ＦＰＡ５４イオン交換樹脂は、架橋フェノール－ホルムアルデヒドマトリックス系の、高い多孔性の弱塩基性陰イオン交換樹脂である。ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（商標）ＦＰＡ５４の低膨潤特性は、優れた浸透圧安定性および物理的安定性を提供し、食品加工およびバイオプロセス用途において、従来のスチレン系樹脂よりも、少ない製品ロスおよび長い製品寿命をもたらす。ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（商標）ＦＰＡ５４の親水性のフェノール系多孔性マトリックスは、天然産物および発酵産物の溶液中に頻繁に見られる高分子量の有機性色体の可逆的吸着を可能にする。ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（商標）ＦＰＡ５４は、硫酸およびリン酸に対して高い選択性を示し、したがって、長期間使用する場合、特に、その優れた浸透圧安定性により、発酵に由来するクエン酸および乳酸の両方の処理に理想的である。
Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１６４０は、四級アミンで官能化されたジビニルベンゼン（ＤＶＢ）とスチレンのコポリマーである。これは、イオン化可能な表面アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）とポリマー上の三級アミンとのイオン相互作用による酵素固定化に使用されている。多くのグリコシダーゼのように、３～５の範囲のｐＩを有する酵素の固定化に特に好適である。Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１６４０の主な特徴は、樹脂の再生の可能性、固定化前のｐＨ調整、およびカラム用途の大きい粒径である。ＤＶＢ／スチレンで、四級アミン、３００～１２００ミクロン、ｐＨ安定性１～１４、湿式供給（６６～７２％水）、容量０．８５当量／ｌ、Ｃｌ形態を有する。
Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１５０４は、三級アミンで官能化されたジビニルベンゼン（ＤＶＢ）とスチレンのコポリマーである。これは、イオン化可能な表面アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）とポリマー上の三級アミンとのイオン相互作用による酵素固定化に使用されている。多くのグリコシダーゼのように、３～５の範囲のｐＩを有する酵素の固定化に特に好適である。Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１５０４の主な特徴は、樹脂の再生の可能性、固定化前のｐＨ調整、およびカラム用途の大きい粒径である。ＤＶＢ／スチレンで、三級アミン、３００～１２００ミクロン、ｐＨ安定性１～１４、湿式供給（５３～６２％水）、容量１．３当量／ｌ遊離塩基を有する。
Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９Ｍは、短いスペーサー（Ｃ２）上のアミノ基で官能化された親水性で高い多孔性のメタクリレートポリマーである。
Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｅ（商標）Ｄ６１５４は、マクロ多孔性ポリメタクリレートであり、ポリＨｉｓタグに特異的な親和性結合のために官能化された材料である。官能基は、イミノ二酢酸、Ｎａ＋形態である。
ＥｚｉＧ（商標）Ｏｐａｌは、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）粒子から作製され、親水性表面を有する。この素材は、狭い孔径分布を有し、標準的に、約５００Åの孔径で生産されている。１５～６０％の活性酵素の質量負荷が予想される。ＥｚｉＧ（商標）の他のバリエーションが存在し、（ＡｍｂｅｒおよびＣｏｒａｌを）試験したが、それらは、Ｏｐａｌと比較して最適ではなかった。
総組成酵素重量に対して、以下の酵素の各々を、それぞれ、以下の重量／重量（ｗ／ｗ）％で含む酵素組成物：１９％のα－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０、配列番号１）、１７％のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＹＫＹ９、配列番号２）、３％のホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６、配列番号３）、２３％のフルクトース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＸＮ５０、配列番号４）、３５％のタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｄ１Ｃ７Ｇ９、配列番号５）、および３％の１，４－グルカントランスフェラーゼ（４－ＧＴ、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８、配列番号６）を、上に記載の各担体上に固定化した。すべての固定化酵素調製物は、酵素総重量／担体が５％であった。表２を参照。前述の酵素比は、以下に記載される固定化方法を使用して、タガトースの生成のために以前に最適化された。
Figure 2022541471000004
組成物中の酵素を各担体に付着させる前に、担体を、２当量の水、次いで、３当量の固定化緩衝液（ｐＨ７．２）（５ｍＭのＮａ２ＰＯ４、５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭのＭｎＣｌ２）で平衡化した。酵素を固定化緩衝液中に懸濁して、酵素組成物を形成させ（好ましくは、酵素５～１０ｇ／Ｌ）、次いで、担体に添加して、スラリーを作製した。８００ｒｐｍのオービタルシェーカー上で、室温でインキュベーションする間、酵素組成物および担体スラリーの吸光度を２８０ｎｍで測定して、９５％超の可溶性酵素が溶液中に懸濁されなくなるまで、酵素の担体への吸着を追跡した。これは、５％（ｗ／ｗ、酵素／担体）負荷試料の場合、約６時間であった。上清を除去し、固定化された担体を、反応緩衝液（ｐＨ７．２）（２５ｍＭのＮａ２ＰＯ４、４ｍＭのＮａ２ＳＯ３、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭのＭｎＣｌ２）で洗浄して、残存する可溶性酵素をすべて除去した。各スラリー試料を、等量の２倍濃縮供給溶液（３２０ｇ／Ｌのマルトデキストリンデキストロース当量５（ＤＥ５）ｐＨ７．２、２５ｍＭのＮａ２ＰＯ４、４ｍＭのＮａ２ＳＯ３、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭのＭｎＣｌ２）と混合し、反応条件で、最終マルトデキストリン基質濃度を１６０ｇ／Ｌにした。マルトデキストリン－担体混合物を、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーＦ２．０の２．０ｍＬマイクロフュージチューブ内で、８００～１５００ｒｐｍで、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１６４０、ＬｉｆｅＴｅｃｈ（商標）ＥＣＲ１５０４、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９Ｍ、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｅ（商標）Ｄ６１５４、およびＥｚｉＧ（商標）Ｏｐａｌ組成物－担体組み合わせの場合は５０℃、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６１、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７、ＡｍｂｅｒＬｉｔｅ（商標）ＦＰＡ５４の組成物－担体組み合わせの場合は５５℃のいずれかで、一晩振盪した。この反応を１５～１８時間続けた。得られた生成物は、インライン屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して（５ｍＭのＨ２ＳＯ４移動相を用いて６５℃で０．６ｍＬ／分）、ＨｉＰｌｅｘ Ｈリガンド交換カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で展開した。タガトースの濃度は、試料のピーク面積を、既知のタガトース標準溶液のものと比較することによって決定された。固定化酵素組成物のカスケード活性率（タガトース生成μｍｏｌ／分／ｍｇ総酵素）を、各担体について計算した。各担体－組成物調製物のカスケード活性率は、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８担体－組成物調製物のカスケード活性率と比較して、表１に報告されている。残りのマルトデキストリンおよびタガトースを、各々、少なくとも３体積当量の反応緩衝液からなる５回の洗浄によって、各固定化酵素調製物から洗い流し、再利用のための調製物を平衡化した。固定化酵素調製物を、前のように２倍濃縮マルトデキストリン供給溶液を添加することによって、再利用した。反応速度を、その後の使用ごとに計算し、プロットして、固定化触媒の作動半減期を確認した。半減期は、（０日目と比較して）活性の半分未満が一貫して失われるまで、０日目および後日に、カスケード速度（μｍｏｌ／分／ｍｇ）を測定することによって決定した。表３におけるｎ／ｄの指定は、１０％未満の半減期が見出されたか、またはカスケード活性がＤｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８の５０％未満であったことを示す。
Figure 2022541471000005
実施例２．カスケード速度に対する酵素比の影響。タガトースの生成に対する様々な固定化酵素の比率の変化の影響を評価するために、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８上に固定化されたαＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｔ６ＰＰ、および４－ＧＴの量を、実施例１および表１に記載される酵素比（「実施例１の固定化組成物」）を使用して調製されたＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化組成物と比較して、２つの固定化組成物調製物において、変化させた。それらの活性率を、実施例１の固定化組成物の性能に対して評価した。様々な濃度の固定化組成物のうちの１つでは、酵素の量は、表４（図１Ｂ）に示されるように、溶液中のＴ６ＰＰに対する各酵素の観察された速度に基づいており、酵素ごとに、等量の酵素活性（μｍｏｌ／分）が添加された。この固定化組成物の活性率は、最適比の７４％であった。他の様々な濃度の固定化組成物には、重量で等量の各酵素が含まれた（図１Ｃ）。この固定化組成物の活性率は、最適比の８５％であった。反応を実施し、変換速度を、実施例１に記載されるように、μｍｏｌ／分／ｍｇ総酵素で測定した。
Figure 2022541471000006
実施例３．１つ以上の担体に対する酵素の分布の影響。実施例１に記載されるように、単一の固定化反応で調製されたＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化組成物（１９％のαＧＰ、１７％のＰＧＭ、３％のＰＧＩ、２３％のＦ６ＰＥ、３５％のＴ６ＰＰ、および３％の４－ＧＴ）を使用して、マルトデキストリンからタガトースを生成するプロセスを、以下を使用して実施されるプロセスの活性率と比較した：（１）コア生成酵素（αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、および４ＧＴ）のＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化組成物と、タガトース生成特異的酵素（Ｆ６ＰＥおよびＴ６ＰＰ）のＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化組成物の混合物、ならびに（２）６種の別個の固定化酵素調製物：ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化αＧＰ、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化ＰＧＭ、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化ＰＧＩ、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化４ＧＴ、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化Ｆ６ＰＥおよびＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化Ｔ６ＰＰ。（１）および（２）のすべての酵素は、参照されるＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８固定化組成物と同じ比率で存在し、すべての固定化は、実施例１に記載されるように、５％ｗ／ｗ比（酵素／担体）および緩衝液／反応条件を使用して行われた。結果を表５に示す。
Figure 2022541471000007
実施例４．酵素負荷の影響。異なる負荷における酵素（ｇ酵素／ｇ担体、２．５％間隔で２．５％～１２．５％の範囲）を、実施例１に記載のように、また表２に列挙される比率で、Ｄｕｏｌｉｔｅ Ａ５６８上に固定化した。しかし、実施例１とは異なり、固定化を、６時間ではなく、各試料について１６時間継続させ、より高い負荷で、酵素の結合が完了に達するように時間をかけた。可溶性酵素を、少なくとも３つの試料体積の反応緩衝液ｐＨ７．２（２５ｍＭのＮａ２ＰＯ４、４ｍＭのＮａ２ＳＯ３、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭのＭｎＣｌ２）を含有する５回の洗浄で洗い流した。試料をマルトデキストリン供給溶液と１６時間反応させ、変換速度を実施例１のようにμｍｏｌ／分／ｍｇの合計酵素で測定した。５％負荷の試料に対する相対的な酵素カスケード速度を、図２の負荷の関数としてプロットする。負荷応答は、酵素および支持体の価格と併せて、最もコスト効率の高い触媒の設計を可能にする。
実施例５．固定化酵素組成物を使用したアルロースの調製。表６に記載されるように、酵素間で３つの異なる比率で以下の酵素：αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）、プシコース６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）、および４－ＧＴを含む酵素組成物を、それぞれの固定化反応において、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８に固定化した。マルトデキストリンからアルロースを生成するための３つの固定化組成物調製物の比較分析を行った。
Figure 2022541471000008
固定化カクテルを調製するために、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８を、１％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）水溶液中で、エンドオーバーエンドローテーターで、室温で２時間前処理した。ＧＡを、水で５回洗浄し、固定化緩（１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＳＯ４、および８０μＭのＣｏＣｌ２）で２回洗浄することによって除去した。次いで、酵素溶液（表５）を、最終洗浄ステップ後（上清は廃棄される）、ＧＡで前処理された担体に添加した。酵素溶液は、反応緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＳＯ４、５ｍＭのＮａＳＯ３および８０μＭのＣｏＣｌ２）中の５ｇ／Ｌの酵素で構成された。酵素および担体の溶液を、８００ｒｐｍに設定されたオービタルシェーカー上で、室温で１６時間インキュベートし、酵素混合物を担体に固定化した。総パーセント負荷は、６．５％（担体１ｍｇ当たりのｍｇ酵素）であった。上清を、反応緩衝液からなる６回の洗浄で洗い流して、残存する結合されていない酵素を除去した。最終上清を除去し、事前に反応緩衝液に溶解された１５０ｇ／Ｌのマルトデキストリンを添加した。マルトデキストリン－担体混合物を、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーＦ２．０の２．０ｍＬマイクロフュージチューブ内で、８００～１５００ｒｐｍで、５５℃で一晩（１５～１６時間）振盪した。得られた生成物は、インライン屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して（超純水の移動相を用いて８０℃で０．６ｍＬ／分）、ＳｕｐｅｌＣｏｇｅｌ Ｐｂカラム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上で展開した。アルロース濃度は、試料ピーク面積を、既知のアルロース標準溶液のものと比較することによって決定し、酵素カスケード比活性率を計算した。アルロース生成反応物を、各固定化調製物について、４回の反応緩衝液の洗浄で洗い流し、再利用のために固定化調製物を平衡化した。各試料組成物の相対的な比活性の結果を、以下の表７に示す。
Figure 2022541471000009
実施例６．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのアロースの調製。アロースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、４ＧＴおよびＰ６ＰＥ、Ａ６ＰＩ、ならびにＡ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例７．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのフルクトースの調製。フルクトースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、４ＧＴ、およびＦ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例８．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのマンノースの調製。フルクトースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、４ＧＴ、およびＭ６ＰＩまたはＰＧＰＭＩおよびＭ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例９．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのガラクトースの調製。ガラクトースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、４ＧＴ、Ｇａｌ６ＰＩ、およびＧａｌ６Ｐを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１０．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのアルトロースの調製。アルトロースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、Ａｌｔ６ＰＩ、およびＡｌｔ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１１．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのタロースの調製。タロースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｔａｌ６ＰＩ、およびＴａｌ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１２．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのソルボースの調製。ソルボースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、およびＳ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１３．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのグロースの調製。グロースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、Ｇｕｌ６ＰＩ、およびＧｕｌ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１５．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのイドースの調製。イドースは、αＧＰ、ＰＧＭ、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、Ｉ６ＰＩ、およびＩ６ＰＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。
実施例１６．固定化酵素組成物を使用したマルトデキストリンからのイノシトールの調製。イノシトールは、αＧＰ、ＰＧＭ、４ＧＴ、ＩＰＳ、およびＩＭＰを含む固定化酵素組成物を使用して、マルトデキストリンから生成される。

Claims (22)

  1. ヘキソースの調製のための固定化酵素組成物であって、少なくとも１つの担体または担体の混合物に固定化された以下の酵素のうちの、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの担体、少なくとも７つ、または少なくとも８つを含む、固定化酵素組成物：
    ａ）αグルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、および任意選択的に、１，４－グルカントランスフェラーゼ（４－ＧＴ）、ならびに
    ｂ）以下から選択される酵素の組み合わせの中からの酵素：
    （ｉ）タガトースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、フルクトース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）、およびタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）、
    （ｉｉ）アルロースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、ピスコース－６－リン酸エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）、およびピコース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）、
    （ｉｉｉ）アロースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、Ｐ６ＰＥ、アロース－６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）、およびアロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）、
    （ｉｖ）マンノースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）またはホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）、およびマンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）、
    （ｖ）ガラクトースを調製するための、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）、Ｆ６ＰＥ、ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）、およびガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）、
    （ｖｉ）フルクトースを調製するための、ＰＧＩおよびフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）、
    （ｖｉｉ）アルトロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）、およびアルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）、
    （ｖｉｉｉ）タロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）、およびタロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）、
    （ｉｘ）ソルボースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）、およびソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）、
    （ｘ）グロースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）、およびグロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）、
    （ｘｉ）イドースを調製するための、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、Ｓ６ＰＥ、イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）、およびイドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）、ならびに
    （ｘｉｉ）イノシトールを調製するための、イノシトール３－リン酸シンターゼ（ＩＰＳ）およびイノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰ）。
  2. 前記酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％が、０．１％～４０％の範囲である、請求項１に記載の固定化酵素組成物。
  3. １０～３０％（αＧＰ）、０～１０％（４ＧＴ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、および存在する場合、０．１～１０％（ＰＧＩ）を含む、請求項１または２に記載の固定化酵素組成物。
  4. タガトースを調製するために、ＰＧＩ、Ｆ６ＰＥ、およびＴ６ＰＰをさらに含む、請求項３のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  5. 前記酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％が、１０～３０％（αＧＰ）、０～１０％（４ＧＴ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、０．１～１０％（ＰＧＩ）、１５～３５％（Ｆ６ＰＥ）、およびＴ６ＰＰ（２５～４５％）であり、前記組成物中の酵素の総重量が、前記酵素の総重量に対して、合計１００ｗ／ｗ％である、請求項４に記載の固定化酵素組成物。
  6. 前記αＧＰが、配列番号１のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記４－ＧＴが、配列番号６のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記ＰＧＭが、配列番号２のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記ＰＧＩが、配列番号３のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記Ｆ６ＰＥが、配列番号４のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記Ｔ６ＰＰが、配列番号５のアミノ酸配列、またはその断片を含む、請求項５に記載の固定化酵素組成物。
  7. アルロースを調製するために、ＰＧＩ、Ｐ６ＰＥ、およびＰ６ＰＰをさらに含む、請求項３のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  8. 前記酵素の総重量に対する各酵素の重量（ｗ／ｗ）％が、１０～３０％（αＧＰ）、０～１０％（４ＧＴ）、１０～３０％（ＰＧＭ）、０．１～１０％（ＰＧＩ）、０．１～１０％（Ｐ６ＰＥ）、および（４５～６５％）Ｐ６ＰＰであり、前記組成物中の酵素の総重量が、前記酵素の総重量に対して、合計１００ｗ／ｗ％である、請求項７に記載の固定化酵素組成物。
  9. 前記αＧＰが、配列番号１のアミノ酸配列、またはその断片を含み、
    前記４－ＧＴが、配列番号６のアミノ酸配列を含み、
    前記ＰＧＭが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
    前記ＰＧＩが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
    前記Ｐ６ＰＥが、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
    前記Ｐ６ＰＰが、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の固定化酵素組成物。
  10. 前記担体の重量に対する前記酵素の総重量（重量／重量）が、２．５％～１２．５％である、請求項１～９のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  11. 前記担体が、弱塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  12. 前記担体が、フェノールホルムアルデヒド重縮合体を含む、請求項１１に記載の固定化酵素組成物。
  13. 前記担体が、三級アミン官能基を含み、前記組成物が、任意選択的に、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）Ａ５６８である、請求項１１または１２に記載の固定化酵素組成物。
  14. 前記担体が、二級アミン官能基を含み、前記組成物が、任意選択的に、ＤＵＯＬＩＴＥ（商標）ＰＷＡ７である、請求項１１または１２に記載の固定化酵素組成物。
  15. 前記担体が、Ｈｉｓタグ親和性樹脂を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  16. 前記担体が、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）粒子を含む、請求項１５のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物。
  17. 前記担体が、キレート金属によって官能化されている、請求項１５または１６に記載の固定化酵素組成物。
  18. 前記キレート金属が、鉄もしくは亜鉛であるか、または前記担体が、任意選択的に、ＥｚｉＧ（商標）Ｏｐａｌである、請求項１８に記載の固定化酵素組成物。
  19. 好適な反応条件下で、デンプン誘導体を請求項１～１８のいずれか一項に記載の固定化酵素組成物と接触させて、前記デンプン誘導体をヘキソースに変換するステップを含む、糖からヘキソースを調製するための酵素プロセス。
  20. 前記プロセスのステップが、約４０℃～約８５℃の範囲の温度で、約５．０～約８．０の範囲のｐＨで、および／または約０．５時間～約４８時間行われる、請求項１９に記載のプロセス。
  21. 前記プロセスのステップが、単一のバイオ反応器、直列に配置された複数のバイオ反応器、または並列に配置された複数のバイオ反応器で行われる、請求項１９または２０に記載のプロセス。
  22. 前記プロセスのステップが、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）不含で行われ、前記リン酸が、酵素カスケード反応内で再利用され、かつ／または前記プロセスの少なくとも１つのステップが、非常にエネルギー的に有利な化学反応を伴う、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のプロセス。
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