WO2018052054A1 - 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法 - Google Patents

固定化アルロースエピメラーゼの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018052054A1
WO2018052054A1 PCT/JP2017/033178 JP2017033178W WO2018052054A1 WO 2018052054 A1 WO2018052054 A1 WO 2018052054A1 JP 2017033178 W JP2017033178 W JP 2017033178W WO 2018052054 A1 WO2018052054 A1 WO 2018052054A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
allulose
immobilized
allulose epimerase
epimerase
exchange resin
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/033178
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
プシュパ キラン グラッパリ
知也 新谷
純一郎 西岡
研作 島田
Original Assignee
松谷化学工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 松谷化学工業株式会社 filed Critical 松谷化学工業株式会社
Priority to MX2019002902A priority Critical patent/MX2019002902A/es
Priority to KR1020197003450A priority patent/KR102357124B1/ko
Priority to US16/329,311 priority patent/US20190249167A1/en
Priority to JP2018539767A priority patent/JP6990656B2/ja
Priority to EP17850955.0A priority patent/EP3514231B1/en
Publication of WO2018052054A1 publication Critical patent/WO2018052054A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing immobilized allulose epimerase. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently producing immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability.
  • Patent Document 1 Allulose produced by the action of D-ketohexose 3-epimerase on fructose (Patent Document 1) is a kind of rare sugar called psicose, which has zero energy value (Non-Patent Document 1) and postprandial blood glucose Usefulness such as a rise-inhibiting effect (Non-Patent Document 2) and an anti-obesity effect (Non-Patent Document 3) has been reported, and has attracted attention as a lifestyle-related disease prevention material.
  • allulose epimerase D-ketohexose 3-epimerase derived from microorganisms
  • allulose epimerase As allulose epimerase, allulose epimerase derived from Arthrobacter globiformis or Agrobacterium tumefaciens, and Pseudomonas thioborichos Rhicobium or Pseudomonas chicory Rhicobium. Tose epimerase and the like are known.
  • immobilized allulose epimerase is used to increase production efficiency.
  • methods for producing immobilized allulose epimerase sodium alginate (Patent Document 2), styrene-based porous weak ion exchange resin (Patent Document 3), and phenolic porous weak ion-exchange resin (Patent Document 3)
  • Patent Document 2 sodium alginate
  • Patent Document 3 styrene-based porous weak ion exchange resin
  • Patent Document 3 phenolic porous weak ion-exchange resin
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability.
  • the present inventors have earnestly studied a method capable of efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability.
  • an enzyme solution containing allulose epimerase having a specific activity equal to or higher than a specific level is applied to a styrenic porous weak anion exchange resin or a styrenic gel weak base anion exchange resin with a total loaded protein amount of 1. It was found that an immobilized allulose epimerase having a high specific activity and excellent durability can be efficiently obtained by contacting to 3 to 15 mg / ml-R.
  • the present invention has been completed by further studies based on such findings.
  • this invention provides the invention of the aspect hung up below.
  • Item 1 An enzyme solution containing allulose epimerase having a specific activity of 50 U / mg or more is converted into a styrene-based porous weak anion exchange resin or styrene so that the total amount of protein loaded is 1.3 to 15 mg / ml-R.
  • a method for producing an immobilized allulose epimerase comprising a step of contacting with a gel-type weakly basic anion exchange resin.
  • Item 2. Item 2.
  • Item 1 The production method according to Item 1, wherein the ion exchange group of the styrenic porous type weakly basic anion exchange resin or the styrenic gel type weakly basic anion exchange is a tertiary amine.
  • Item 3. The production method according to Item 1 or 2, wherein an ion exchange group of the styrenic porous weakly anion exchange resin is —N (CH 3 ) 2 .
  • Item 4. Item 4. The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the number of allulose epimerase units in the enzyme solution brought into contact with the ion exchange resin is 270 U or more per ml of the ion exchange resin.
  • the present invention it is possible to obtain an immobilized allulose epimerase having a high allulose epimerase activity and excellent durability compared to a conventional immobilized allulose epimerase. Moreover, it becomes possible to produce allulose by a simple method of passing a fructose solution through a column packed with immobilized allulose epimerase obtained by the method of the present invention. Furthermore, if a column in which the immobilized allulose epimerase of the present invention is combined with an existing immobilized glucose isomerase, allulose containing an isomerized sugar can be efficiently produced from glucose.
  • Example 3 it is the result of having evaluated the half-life of the immobilized allulose epimerase by implementing the continuous enzyme reaction of fructose to allulose using the immobilized allulose epimerase.
  • the present invention relates to a method for producing immobilized allulose epimerase, wherein an enzyme solution containing allulose epimerase having a specific activity of 50 U / mg or more has a total loaded protein amount of 1.3 to 15 mg / ml-R.
  • the method includes a step of contacting with a styrenic porous type weakly basic anion exchange resin or a styrenic gel type weakly basic anion exchange resin.
  • enzyme activity (U) of allulose epimerase is defined as a unit (U) of enzyme power that produces 1 ⁇ mol of fructose per minute by reacting allulose as a substrate at a reaction temperature of 50 ° C. It is. Specifically, 2500 ⁇ l of 0.2 M allulose solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate, 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate.
  • 2167 ⁇ l and allulose epimerase 333 ⁇ l are put into a test tube equipped with a screw cap, immersed in a warm water bath and reacted at 50 ° C. for 15 minutes.
  • a 5% by mass hydrochloric acid aqueous solution is added to adjust the pH to 2.5 to 3.0, the enzyme is deactivated, desalted with an ion exchange resin, filtered, and analyzed by HPLC.
  • the enzyme activity is calculated using the peak area ratio of the produced fructose.
  • “specific activity (U / mg) of allulose epimerase” is the enzyme activity (U) of allulose epimerase possessed by 1 mg of protein. Specifically, (1) preparing an enzyme solution in which allulose epimerase is dissolved, (2) measuring the protein concentration (mg / ml) of the enzyme solution by the Bradford method, (3) the enzyme solution The enzyme activity (U / ml) of allulose epimerase is measured by the above method. (4) The enzyme activity (U / ml) of the obtained allulose epimerase is divided by the protein concentration (mg / ml), It can be determined by calculating the specific activity (U / mg) of loin epimerase.
  • “specific activity of immobilized allulose epimerase (U / ml-R)” is an activity per 1 ml of the immobilized resin, and is a value measured based on the following measurement method. Specifically, 2500 ⁇ l of 0.2 M allulose solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), 2480 ⁇ l of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), and a swollen state excluding excess water 20 mg of immobilized allulose epimerase is put into a 10-ml test tube with a screw cap, immersed in a warm water bath, and shaken at 50 ° C. for 15 minutes.
  • the “total amount of protein loaded (mg / ml-R)” means the mass (mg) of protein contained in the total amount of the enzyme solution to be contacted when the ion exchange resin brought into contact with the enzyme solution is swollen. It is a value obtained by dividing by the volume (1 ml-R).
  • space velocity (SV) is a unit of a velocity at which a solution is passed through a column
  • space velocity (SV) liquid passage amount (ml) / column volume (ml) / hour (h ) ”.
  • Allulose epimerase is an enzyme that can catalyze the interconversion between fructose and allulose.
  • the origin of the allulose epimerase used in the present invention is not particularly limited, and any origin of organisms such as microorganisms, animals and plants may be used.
  • allulose epimerase can be obtained from Arthrobacter globiformis strain M30 (deposit number: NITE BP-1111), Pseudomonas citrichii, Agrobacterium tumefaciens, Clostridium sp. Clostridium scindens, Clostridium bolteae, Clostridium cellulolyticum, Ruminococcus sp. It is known to be produced by microorganisms such as
  • the allulose epimerase immobilized in the present invention may be produced using the above-mentioned organism, or may be a recombinant allulose epimerase produced by a genetic engineering technique.
  • the allulose epimerase used in the present invention may be a mutant obtained by mutating the allulose epimerase derived from the organism.
  • the allulose epimerase immobilized in the present invention may be either a purified product or a crude product.
  • Enzyme solution for immobilization an enzyme solution containing allulose epimerase having a specific activity of 50 U / mg or more is used for immobilization on an immobilization carrier described later.
  • an enzyme solution having a specific specific activity and an immobilization carrier to be described later by immobilizing allulose epimerase with a specific total amount of loaded protein, the specific activity is high and the durability is excellent.
  • the specific activity of allulose epimerase in the enzyme solution used for immobilization on the immobilization carrier is not particularly limited as long as it is 50 U / mg or more, but the immobilized allulose epimerase has high specific activity and excellent durability. From the viewpoint of more efficiently producing the compound, it is preferably 50 U / mg to 200 U / mg, more preferably 50 to 160 U / mg.
  • the solvent of the enzyme solution used for immobilization on the immobilization carrier is not particularly limited and may be any of water, buffer solution and the like.
  • the immobilized carrier of allulose epimerase used in the present invention is a styrene-based weak base anion exchange resin or a styrene gel-type weak base anion exchange resin. By using such a specific anion exchange resin, it becomes possible to efficiently produce immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability.
  • Styrenic porous weakly basic anion exchange resin is a porous weakly basic anion exchange resin consisting of a gel-like resin base of polystyrene divinylbenzene copolymer and physically perforated with macropores. It is.
  • the form of the styrene-based porous basic anion exchange resin is not particularly limited, and may be any of powder, sphere, fiber, film, and the like.
  • the ion exchange group in the styrenic porous type weakly basic anion exchange resin is not particularly limited as long as it is a group capable of anion exchange and exhibiting weak basicity.
  • Examples include amines such as primary amines and polyamines.
  • These ion-exchange groups may be contained alone in the styrene-based porous weak anion exchange resin, or in combination of two or more types in the styrene-based weakly basic anion exchange resin. It may be.
  • these ion exchange groups from the viewpoint of more efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability, preferably a tertiary amine, more preferably a group —N (CH 3 2 ).
  • Examples of the styrenic porous type weakly basic anion exchange resin include Urbanlite EPA95, Amberlite IRA904 (above, manufactured by Organo); Duolite A378D (produced by Sumika Chemtex); Purolite A111S, Purolite A103S (above, Manufactured by Purolite Co., Ltd.); Diaion WA20, Diaion WA30 (manufactured by Mitsubishi Rayon Aqua Solutions Co., Ltd.) and the like are commercially available. In the present invention, these commercially available products can also be used.
  • the styrene-based gel type weakly basic anion exchange resin is a weakly basic anion exchange resin comprising a gel-like resin substrate of a polystyrene divinylbenzene copolymer.
  • the form of the styrenic gel type weakly basic anion exchange resin is not particularly limited, and may be any of powder, sphere, fiber, film, and the like.
  • the ion exchange group in the styrenic gel-type weakly basic anion exchange resin is not particularly limited as long as it is a group capable of anion exchange and showing weak basicity. Examples include amines such as primary amines and polyamines. These ion exchange groups may be contained alone in the styrene gel type weakly basic anion exchange resin, or in combination of two or more kinds in the styrene gel type weakly basic anion exchange resin. It may be. Among these ion exchange groups, a tertiary amine is preferably used from the viewpoint of more efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability.
  • styrenic gel type weakly basic anion exchange resin examples include Diaion HPA25L (manufactured by Mitsubishi Rayon Aqua Solution Co., Ltd.), Amberlite IRA411S (manufactured by Organo Co., Ltd.), etc., and these commercial products are used in the present invention. Can also be used.
  • the total exchange capacity (maximum ion exchange amount of the ion exchange resin) is not particularly limited. From the viewpoint of more efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability, it is usually 1 eq / l-R or more, preferably 1 to 2 eq / l-R, more preferably 1.2. Up to 1.5 eq / l-R.
  • styrenic porous type weakly basic anion exchange resin or the styrenic gel type weakly basic anion exchange resin may be used, or both of these may be used in combination. Good.
  • anion exchange resins from the viewpoint of more efficiently producing an immobilized allulose epimerase having high specific activity and excellent durability, preferably a styrenic porous weak anion exchange resin, Preferably, a styrene-based porous weak anion exchange resin having a tertiary amine as an ion exchange group is used.
  • washing solution such as a buffer solution
  • the amount of the enzyme solution that is brought into contact with the immobilization carrier may be set so that the total amount of loaded protein is 1.3 to 15 mg / ml-R, but the immobilized allulose epimerase having a high specific activity is more efficient.
  • the total amount of protein loaded in the enzyme solution is preferably 2 to 15 mg / ml-R, more preferably 3 to 10 mg / ml-R, and still more preferably 5 to 10 mg / ml-R. Can be mentioned.
  • the ratio of the allulose epimerase contained in the enzyme solution and the ratio of the immobilized carrier may be appropriately set within a range that can satisfy the range of the total amount of protein loaded.
  • the total amount of allulose epimerase contained in the enzyme solution to be contacted per 1 ml of the immobilized carrier when swollen is 200 to 2000 U, preferably 500 to 1000 U, more preferably 600 to 900 U.
  • the method for bringing the enzyme solution into contact with the immobilized carrier is not particularly limited, and a method employed in the production of a normal immobilized enzyme may be used.
  • the immobilized carrier is filled. For example, a method of passing the enzyme solution through the column, a method of adding the immobilization carrier to a container containing the enzyme solution, and the like.
  • the space velocity of the enzyme solution with respect to the column filled with the immobilization carrier is not particularly limited. 0 hr ⁇ 1 , preferably 0.2 to 0.8 hr ⁇ 1 , more preferably 0.4 to 0.6 hr ⁇ 1 .
  • the enzyme solution discharged through the column is passed through the column again, whereby the enzyme solution is circulated and the enzyme solution is repeatedly passed. It is desirable to do.
  • the time for passing the enzyme solution is not particularly limited, but for example 5 to 20 hours, preferably 10 to 18 hours. More preferred is 12 to 16 hours.
  • the immobilization carrier is added to the container containing the enzyme solution, and the mixture is stirred as necessary to obtain allulose epimerase. What is necessary is just to incubate until it fix
  • the time for adding the immobilization carrier to the container containing the enzyme solution and incubating is not particularly limited. Examples include 10 to 40 hours, preferably 15 to 35 hours, and more preferably 20 to 30 hours.
  • the immobilized allulose epimerase thus obtained may be washed using a washing solution such as a buffer as necessary. Further, the obtained immobilized allulose epimerase may be cross-linked with glutaraldehyde, polyethyleneimine or the like, if necessary, to strengthen the immobilization of allulose epimerase.
  • the immobilized allulose epimerase thus obtained has a high specific activity of allulose epimerase and has excellent durability.
  • the specific activity of the immobilized allulose epimerase obtained by the production method of the present invention is usually 150 U / ml-R or more, preferably 150 to 500 U / ml-R, more preferably 200 to 500 U / ml-R, particularly preferably. 250 to 500 U / ml-R.
  • the durability of the immobilized allulose epimerase obtained by the production method of the present invention is such that the specific activity half-life of the immobilized allulose epimerase under the following test conditions is 150 days or more, preferably 160 to 250 days, More preferred is 200 to 240 days.
  • test conditions A jacketed glass column (inner diameter 20 mm, length 400 mm) is packed with immobilized allulose epimerase in an amount corresponding to an activity of 4500 U.
  • a 35% by mass fructose solution prepared by adding 2 mM magnesium sulfate and further adjusting sodium carbonate to pH 7.8-8.0 is prepared.
  • the fructose solution is continuously brought into contact with a glass column packed with immobilized allulose epimerase so that the fructose content is 0.004 g / hr / U in an upward flow at a jacket temperature of 55 ° C.
  • immobilized allulose epimerase having a specific activity of 450 U / ml-R
  • 10 ml of immobilized allulose epimerase is packed in a jacketed glass column (inner diameter 20 mm, length 400 mm), and the fructose solution is added to the space.
  • the liquid is passed at a speed of 5 hr -1 .
  • the effluent effluent from the column was collected once every 24 hours, and each collected liquid was desalted and filtered through a filter, followed by HPLC analysis to determine the area of allulose in the fructose and allulose peak areas, Conversion rate.
  • the conversion rate is plotted over time to obtain an approximate line, and from the approximate line, the number of days that is half of the conversion efficiency one day after the start of the test is obtained and set as the half-life.
  • the immobilized allulose epimerase obtained by the production method of the present invention has high specific activity of allulose epimerase and excellent durability, allulose is industrially continuously produced from fructose or glucose. Suitable for manufacturing. Further, the immobilized allulose epimerase obtained by the production method of the present invention may be used alone for the production of allulose, or in combination with other immobilized enzymes (for example, immobilized glucose isomerase etc.) to produce allulose. May be used for
  • Example 1 (Screening of immobilized carrier) 1. Preparation of Allulose Epimerase Used for Immobilization Allulose epimerase used for immobilization was prepared through the following steps (1) and (2).
  • Arthrobacter globebiformis strain M30 is inoculated into 4 L of a minimal salt medium (MSM medium) containing 0.5% by mass of allulose and stirred at 30 ° C. for 24 hours using a jar fermenter. The culture was performed at a speed of 400 rpm and an aeration rate of 0.10 L / medium L per minute. From this culture solution, 100 g (wet weight) of bacterial cells were collected by centrifugation and washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0).
  • MSM medium minimal salt medium
  • 50 mM phosphate buffer pH 8.0
  • the method for measuring the enzyme activity of immobilized allulose epimerase in the primary screening is as follows. That is, 500 ⁇ l of 0.2 M allulose solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), 480 ⁇ l of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), and paper waste (Kimwipe) were used to remove excess water. 20 mg of immobilized allulose epimerase was put into a microtube, immersed in a warm water bath, and allowed to react at 50 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the enzyme was deactivated by putting it in a boiling bath at 95 ° C.
  • the specific activity (U / ml-R) of immobilized allulose epimerase was determined from the ratio of the peak area of fructose to the total peak area of allulose.
  • Table 2 shows the results obtained.
  • the specific activity of allulose epimerase immobilized with a styrene-based weakly basic ion exchange resin and a styrene-based gel-based weakly basic ion exchange resin is high.
  • the specific activity of allulose epimerase immobilized with an ion exchange resin having a tertiary amine with a resin, styrenic gel type was high.
  • No. 1 was evaluated as having high specific activity and efficiency in the primary screening.
  • the number of units of allulose epimerase used for immobilization was increased to evaluate the adsorption and immobilization capacity.
  • Allulose epimerase was produced using an E. coli expression system. That is, an allulose epimerase gene derived from Arthrobacter globiformis strain M30 was incorporated into a pQE vector (QIAGEN), introduced into E. coli M15 (QIAGEN), and expressed, and 16 g of the resulting microbial cells were treated with 80 ml of 2 mM magnesium sulfate. It was suspended in a 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) and extracted and purified by sonication and centrifugation. The specific activity of the obtained allulose epimerase was 93.8 U / mg.
  • the method for measuring the enzyme activity of immobilized allulose epimerase in the secondary screening is as follows. Specifically, 2500 ⁇ l of 0.2 M allulose solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), 2480 ⁇ l of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) and excess waste water were removed with paper waste (Kimwipe). 20 mg of the immobilized allulose epimerase was put into a 10 ml test tube with a screw cap, placed on a warm water bath and shaken at 50 ° C. for 15 minutes. 5% by mass hydrochloric acid aqueous solution is added to adjust the pH to 3.0 to 2.5 to deactivate the enzyme.
  • Table 3 shows the obtained results.
  • the ion exchange resin that gives the immobilized allulose epimerase with the highest specific activity is No. 1 in Table 1. It was also clarified that it is an ion exchange resin shown in No. 1 (Amberlite FPA95 manufactured by Organo).
  • No. 1 in Table 1 Using the ion exchange resin shown in No. 1 (Amberlite FPA95 manufactured by Organo Corporation), allulose epimerase was immobilized in place of the loaded enzyme unit of allulose epimerase used for immobilization. Specifically, No. 1 shown in Table 1 washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate.
  • Table 4 shows the obtained results. As a result, it was found that when the total amount of loaded protein is within the range of 1.3 to 15 mg / ml-R, it is possible to efficiently produce immobilized allulose epimerase with high specific activity.
  • Clostridium Cellulolyticum H10 strain allulose epimerase Clostridium Cellulolyticum H10 strain allulose epimerase. That is, the allulose epimerase gene synthesized by Lifetechnologies was incorporated into a pQE vector (QIAGEN), introduced into E. coli M15 (QIAGEN), and expressed, and 16 g of the resulting bacterial cells were treated with 80 ml of 2 mM magnesium sulfate. Was suspended in a 50 mM phosphate buffer solution (pH 8.0), extracted and purified by sonication and centrifugation. The specific activity of the obtained allulose epimerase was 156 U / mg.
  • No. 1 in Table 1 washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate. Twist mixer in a chamber set at 20 ° C. by mixing 1 ml of ion exchange resins 1 and 3 and 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 630 U of allulose epimerase (6.7 mg of protein). Was stirred slowly for 24 hours. Next, the supernatant was removed using a pipette and washed 5 times with 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) to obtain immobilized allulose epimerase. The specific activity of the immobilized allulose epimerase was measured by the same method as in the secondary screening.
  • Table 5 shows the obtained results. From this result, the ion exchange resin that gives the immobilized allulose epimerase with the highest specific activity as in the secondary screening is shown in No. 1 of Table 1. 1 (Amberlite FPA95 manufactured by Organo).
  • Example 2 Production of immobilized low activity allulose epimerase (comparative example) Immobilized low activity allulose epimerase was prepared through the following steps (1) to (3).
  • Arthrobacter globebiformis M30 strain is inoculated into 4 L of a minimal salt medium (MSM medium) containing 0.5% by mass of allulose, and a jar fermenter is used at 30 ° C. for 24 hours. The culture was performed at a stirring speed of 400 rpm and an aeration rate of 0.10 L / medium L per minute. From this culture solution, 100 g (wet weight) of bacterial cells were collected by centrifugation and washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0).
  • MSM medium minimal salt medium
  • a jar fermenter is used at 30 ° C. for 24 hours.
  • the culture was performed at a stirring speed of 400 rpm and an aeration rate of 0.10 L / medium L per minute. From this culture solution, 100 g (wet weight) of bacterial cells were collected by centrifugation and washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0).
  • immobilized allulose epimerase for 16 hours, and then washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate to obtain immobilized allulose epimerase.
  • the amount of protein loaded at this time was 18.3 mg / ml-R.
  • the specific activity of the obtained immobilized allulose epimerase was 56 U / ml-R.
  • Allulose epimerase produced using an E. coli expression system was used. That is, an allulose epimerase gene derived from Arthrobacter globebiformis M30 strain was incorporated into a pQE vector (QIAGEN), introduced into E. coli M15 strain (QIAGEN), and expressed. was suspended in a 50 mM phosphate buffer solution (pH 8.0), extracted and purified by sonication and centrifugation to obtain an allulose epimerase solution. The specific activity of allulose epimerase per mg of total protein contained in the obtained allulose epimerase solution was 51.9 U / mg.
  • the column was filled with 50 ml of a wet ion exchange resin (ion exchange resin shown in No. 1 of Table 1, manufactured by Organo, trade name: Amberlite FPA95), and 50 mM phosphate buffer (pH 8. 0), and 500 ml of 2 mM magnesium sulfate-containing 50 mM phosphate buffer containing 13500 U (260 mg in protein amount), 22500 U (433 mg in protein amount) or 31500 U (607 mg in protein amount) of the allulose epimerase prepared above. (PH 8.0) was loaded on an ion exchange resin while circulating at 4 ° C.
  • a wet ion exchange resin ion exchange resin shown in No. 1 of Table 1, manufactured by Organo, trade name: Amberlite FPA95
  • 50 mM phosphate buffer pH 8. 0
  • Example 3 Continuous use of immobilized allulose epimerase
  • immobilized low activity allulose epimerase 56 U / ml-R
  • immobilized high activity allulose epimerase 160 U / ml-R, 203 U / ml-R, 243 U / ml-R
  • a continuous enzyme reaction was carried out to evaluate the half-life of the enzyme reaction.
  • the fructose solution was continuously passed through the column in an upward flow at a jacket temperature of 55 ° C. for a total of 4320 hours.
  • the effluent was sampled once every 24 hours, and a portion of each sampled solution was desalted with an ion exchange resin and filtered, and then analyzed by HPLC (analysis column: MCIGEL CK08EC, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). Then, the area of allulose occupying the peak area of fructose and allulose was determined and used as the conversion rate.
  • the conversion rate was plotted over time to obtain an approximate line, and from the approximate line, the number of days that was half the conversion efficiency one day after the start of the test was obtained and calculated as the half-life.
  • the half-life of the immobilized low activity allulose epimerase of 56 U / ml-R is 144 days
  • the half-life of the immobilized high activity allulose epimerase of 160 U / ml-R is At 154 days
  • the half-life of 203 U / ml-R immobilized high activity allulose epimerase was 207 days
  • the half-life of 243 U / ml-R immobilized high activity allulose epimerase was 237 days. That is, it has been clarified that immobilized allulose epimerase having high specific activity has a long half-life, is excellent in durability, and is more suitable for continuous reaction.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明の目的は、活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法を提供することである。 比活性が特定のレベル以上のアルロースエピメラーゼを含む酵素液をスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に接触させることにより、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼが効率的に得られる。

Description

固定化アルロースエピメラーゼの製造方法
　本発明は、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法に関する。より具体的には、本発明は、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法に関する。
　フラクトースにＤ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼ（特許文献１）を作用させて生成されるアルロースは、別名をプシコースと称する希少糖の一種であり、エネルギー値がゼロ（非特許文献１）、食後血糖上昇抑制効果（非特許文献２）、抗肥満効果（非特許文献３）等の有用性が報告されており、生活習慣病予防素材として注目されている。
　このようにアルロースはダイエット甘味料として脚光を浴びており、食品産業分野でアルロースを効率的に生産できる方法の開発の必要性が高まっている。
　従来、アルロースの生産方法としては、例えばフルクトースを基質として用いて、微生物由来のＤ-ケトヘキソース３-エピメラーゼ（以下、「アルロースエピメラーゼ」とも言う）を作用させてアルロースを酵素的に生成する方法が知られている。
　アルロースエピメラーゼとしては、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のアルロースエピメラーゼ、及びシュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ）又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のタガトースエピメラーゼ等が知られている。
　また、アルロースエピメラーゼを利用してアルロースを工業的に製造する場合には、製造効率を高めるために、固定化アルロースエピメラーゼが使用されている。従来、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法としては、アルギン酸ナトリウム（特許文献２）、スチレン系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂（特許文献３）、及びフェノール系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂（特許文献４）を固定化担体として使用する方法が知られている。
　しかしながら、従来の固定化アルロースエピメラーゼの製造方法では、商業的生産に求められる経済性（製造コスト）や安定性（活性維持）等の性能が不十分であったり、連続生産に耐えられなかったりするという欠点がある。そこで、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法の開発が切望されている。
特開平６－１２５７７６号公報 特表２０１３－５０１５１９号公報 特開２０１４－１４０３６１号公報 特表２０１５－５３０１０５号公報
Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，４８，７７－８０，２００２． Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，５４，５１１－５１４，２００８． Ｉｎｔ．Ｊ．ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒｉ．，６５，２４５－２５０，２０１４．
　本発明は、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決することを目的として、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造し得る方法について鋭意研究した。その結果、比活性が特定のレベル以上のアルロースエピメラーゼを含む酵素液をスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように接触させることにより、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼが効率的に得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　比活性が５０Ｕ/ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含む、記固定化アルロースエピメラーゼの製造方法。
項２．　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換のイオン交換基が３級アミンである、項１に記載の製造方法。
項３．　前記スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基が－Ｎ（ＣＨ3）2である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．　イオン交換樹脂と接触させる前記酵素液のアルロースエピメラーゼ単位数がイオン交換樹脂１ｍｌ当り２７０Ｕ以上である、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、従来の固定化アルロースエピメラーゼと比べ、アルロースエピメラーゼ活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを得ることができる。また、本発明の方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼを充填したカラムにフルクトース溶液を通液するという簡易な手法でアルロースを生産することが可能になる。更に、本発明の固定化アルロースエピメラーゼと既存の固定化グルコースイソメラーゼを組み合わせたカラムを用いれば、グルコースから異性化糖を含むアルロースを効率的に製造することもできる。
実施例３において、固定化アルロースエピメラーゼを用いてフラクトースからアルロースの連続酵素反応を実施し、固定化アルロースエピメラーゼの半減期を評価した結果である。
　本発明は、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法であって、比活性が５０Ｕ/ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について詳述する。
［定義］
　本発明において、「アルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、アルロースを基質として、反応温度５０℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素力を１単位（Ｕ）としたものである。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及びアルロースエピメラーゼ３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５０℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ２．５～３．０に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフルクトースのピーク面積比を用いて酵素活性を算出する。
　本発明において、「アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｇ）」は、タンパク質１ｍｇがもつアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）である。具体的には、(1)アルロースエピメラーゼを溶解させた酵素液を準備する、(2)当該酵素液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）をブラッドフォード法で測定する、(3)当該酵素液のアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を前述の方法で測定する、(4)得られたアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で除して、アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出する、ことによって求めることができる。
　本発明において、「固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）」は固定化樹脂１ｍｌ当たりの活性であり、以下の測定方法に基づいて測定される値である。具体的には、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ、及び余計な水分を除いた膨潤状態の固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して浸漬させ、５０℃で１５分間振とう反応させる。その後５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させて反応液を回収し、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過に供した後に、ＨＰＬＣ分析し、生成したフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求める。
　本発明において「負荷総タンパク質量（ｍｇ／ｍｌ-Ｒ）」とは、接触させる酵素液の総量に含まれるタンパク質の質量（ｍｇ）を、当該酵素液に接触させたイオン交換樹脂の膨潤時の容量（１ｍｌ-Ｒ）で除することにより求められる値である。
　本発明において、「空間速度（ＳＶ）」とは、溶液をカラムに通液する速度の単位であり、「空間速度（ＳＶ）＝通液量（ｍｌ）／カラム体積（ｍｌ）／時間（ｈ）」にて算出される。
［アルロースエピメラーゼ］
　アルロースエピメラーゼとは、フルクトースとアルロースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの由来については特に制限されず、微生物、動物及び植物等の生物のいずれの由来であってもよい。例えば、アルロースエピメラーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株（寄託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｅｕｍ　ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｅｕｍ　ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．等の微生物によって生産されることが知られている。
　また、本発明において固定化されるアルロースエピメラーゼは、前記生物を用いて製造したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組換えアルロースエピメラーゼであってもよい。更に、本発明で使用されるアルロースエピメラーゼは、前記生物由来のアルロースエピメラーゼに変異を施した変異体であってもよい。
　また、本発明において固定化されるアルロースエピメラーゼは、精製品又は粗精製品のいずれであってもよい。
［固定化に供する酵素液］
　本発明では、比活性が５０Ｕ／ｍｇ以上のアルロースエピメラーゼを含む酵素液を後述する固定化担体への固定化に供する。このように特定の比活性を有する酵素液と後述する固定化担体とを使用して、特定の負荷総タンパク質量でアルロースエピメラーゼの固定化を行うことによって、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造することが可能になる。
　固定化担体への固定化に供する酵素液のアルロースエピメラーゼの比活性については、５０Ｕ／ｍｇ以上であることを限度として特に制限されないが、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは５０Ｕ／ｍｇ～２００Ｕ/ｍｇ、更に好ましくは５０～１６０Ｕ／ｍｇが挙げられる。
　固定化担体への固定化に供する酵素液の溶媒については、特に制限されず、水、緩衝液等のいずれであってもよい。
［固定化担体］
　本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの固定化担体は、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂である。このような特定の陰イオン交換樹脂を使用することによって、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造することが可能になる。
　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂とは、ポリスチレンジビニルベンゼンの共重合体のゲル状の樹脂基体からなり、物理的に穴（マクロポアー）を開けた多孔質の弱塩基性陰イオン交換樹脂である。
　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂の形態については、特に制限されず、例えば、粉状、球状、繊維状、膜状等のいずれであってもよい。
　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂におけるイオン交換基については、陰イオン交換が可能で弱塩基性を示す基であることを限度として特に制限されないが、例えば、第３級アミン、第４級アミン、ポリアミン等のアミンが挙げられる。これらのイオン交換基は、１種単独でスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよく、２種以上を組み合わせてスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよい。これらのイオン交換基の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは第３級アミン、更に好ましくは基－Ｎ（ＣＨ3）2が挙げられる。
　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、アーバンライトＥＰＡ９５、アンバーライトＩＲＡ９０４（以上、オルガノ社製）；デュオライトＡ３７８Ｄ（住化ケムテックス社製）；ピュロライトＡ１１１Ｓ、ピュロライトＡ１０３Ｓ（以上、ピュロライト社製）；ダイアイオンＷＡ２０、ダイアイオンＷＡ３０（以上、三菱レーヨンアクアソリューション社製）等が市販されており、本発明ではこれらの市販品を使用することもできる。
　スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂とは、ポリスチレンジビニルベンゼンの共重合体のゲル状の樹脂基体からなる弱塩基性陰イオン交換樹脂である。
　スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂の形態については、特に制限されず、例えば、粉状、球状、繊維状、膜状等のいずれであってもよい。
　スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂におけるイオン交換基については、陰イオン交換が可能で弱塩基性を示す基であることを限度として特に制限されないが、例えば、第３級アミン、第４級アミン、ポリアミン等のアミンが挙げられる。これらのイオン交換基は、１種単独でスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよく、２種以上を組み合わせてスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよい。これらのイオン交換基の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは第３級アミンが挙げられる。
　スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、ダイアイオンＨＰＡ２５Ｌ（三菱レーヨンアクアソリューション社製）、アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（オルガノ社製）等が市販されており、本発明ではこれらの市販品を使用することもできる。
　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂及びスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂において、総交換容量（イオン交換樹脂が持っている最大のイオン交換量）については、特に制限されないが、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、通常１ｅｑ／ｌ－Ｒ以上、好ましくは１～２ｅｑ／ｌ－Ｒ、更に好ましくは１.２～１．５ｅｑ／ｌ－Ｒが挙げられる。
　本発明では、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂のいずれか一方のみを使用してもよく、またこれらの双方を組み合わせて使用してもよい。
　これらの陰イオン交換樹脂の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくはスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはイオン交換基として第３級アミンを有するスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。
［アルロースエピメラーゼの固定化］
　前記酵素液を前記固定化担体に対して負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように接触させることによって、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を備える固定化アルロースエピメラーゼが得られる。
　前記酵素液を前記固定化担体に接触させるに先立って、緩衝液等の洗浄液を使用して、前記固定化担体を洗浄しておくことが望ましい。
　前記固定化担体に接触させる前記酵素液量は、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように設定すればよいが、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、前記酵素液の負荷総タンパク質量として、好ましくは２～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒ、より好ましくは３～１０ｍｇ／ｍｌ-Ｒ、更に好ましくは５～１０ｍｇ／ｍｌ-Ｒが挙げられる。
　前記固定化担体と前記酵素液を接触させる工程において、前記酵素液に含まれるアルロースエピメラーゼ量と前記固定化担体の比率については、前記負荷総タンパク質量の範囲を充足できる範囲で適宜設定すればよいが、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、前記固定化担体の膨潤時の体積１ｍｌ当たり、接触させる前記酵素液に含まれるアルロースエピメラーゼの総量が２００～２０００Ｕ、好ましくは５００～１０００Ｕ、更に好ましくは６００～９００Ｕとなる比率が挙げられる。
　前記酵素液を前記固定化担体に接触させる方法については、特に制限されず、通常の固定化酵素の製造で採用されている方法を用いればよいが、具体的には、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加する方法等が挙げられる。
　前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、前記固定化担体を充填したカラムに対する前記酵素液の空間速度については、特に制限されないが、例えば０．１～１．０ｈｒ-1、好ましくは０．２～０．８ｈｒ-1、更に好ましくは０．４～０．６ｈｒ-1、が挙げられる。また、当該方法によって固定化アルロースエピメラーゼを製造する場合、カラムを通液して排出された酵素液は、再度カラムに通液することにより、酵素液を循環させて前記酵素液を繰り返し通液することが望ましい。
　また、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、前記酵素液を通液する時間については、特に制限されないが、例えば５～２０時間、好ましくは１０～１８時間、更に好ましくは１２～１６時間が挙げられる。
　また、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加する方法の場合、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加して、必要に応じて撹拌を行い、アルロースエピメラーゼが前記固定化担体に固定化されるまでインキュベートすればよい。
　また、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加してインキュベートする時間については、特に制限されないが、例えば１０～４０時間、好ましくは１５～３５時間、更に好ましくは２０～３０時間が挙げられる。
　斯くして得られた固定化アルロースエピメラーゼは、必要に応じて、緩衝液等の洗浄液を使用して洗浄を行ってもよい。また、得られた固定化アルロースエピメラーゼは、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、アルロースエピメラーゼの固定化を強固にしてもよい。
［固定化アルロースエピメラーゼの特性・用途］
　斯くして得られた固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を備えることができている。
　本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼが有する比活性として、通常１５０Ｕ／ｍｌ-Ｒ以上、好ましくは１５０～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒ、更に好ましくは２００～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒ、特に好ましくは２５０～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒが挙げられる。
　また、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼが備える耐久性としては、以下の試験条件における固定化アルロースエピメラーゼの比活性の半減期が１５０日以上、好ましくは１６０～２５０日、更に好ましくは２００～２４０日が挙げられる。
（耐久性の試験条件）
　ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に、活性が４５００Ｕに相当する量の固定化アルロースエピメラーゼを充填する。別途、２ｍＭの硫酸マグネシウムを添加し、更に炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のフラクトース溶液を準備する。当該フラクトース溶液を、固定化アルロースエピメラーゼが充填されたガラス製カラムに、ジャケット温度５５℃、上向流でフラクトース分が０．００４ｇ／ｈｒ／Ｕとなるように連続的に接触させる。例えば、比活性が４５０Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化アルロースエピメラーゼの場合、ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に固定化アルロースエピメラーゼを１０ｍｌ充填し、上記フラクトース溶液を、空間速度５ｈｒ-1で通液する。カラムから流出した流出液を２４時間毎に１回採取し、採取したそれぞれの液を、脱塩してフィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析し、フラクトース及びアルロースのピーク面積に占めるアルロースの面積を求め、変換率とした。変換率を経時的にプロットして近似直線を求め、その近似直線から試験開始１日後の変換効率の半分となる日数を求めて半減期とする。
　このように、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を有しているので、フラクトース又はグルコースからアルロースを工業的に連続的に製造するのに適している。また、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼは、単独でアルロースの製造に使用してもよく、また他の固定化酵素（例えば、固定化グルコースイソメラーゼ等）と組み合わせてアルロースの製造に使用してもよい。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１（固定化担体のスクリーニング）
１．固定化に使用するアルロースエピメラーゼの調製
　固定化に使用するアルロースエピメラーゼは、次の（１）及び（２）に示す工程を経て調製した。
（１）菌体培養と菌体回収
　０．５質量％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。
（２）粗酵素の抽出工程
　得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。当該租酵素液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は４．９Ｕ/ｍｇであった。
２．固定化担体の一次スクリーニング
　アルロースエピメラーゼの固定化担体として、表１に示すイオン交換樹脂（市販品）を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１のイオン交換樹脂３５５ｍｇと前記で調製された３０Ｕのアルロースエピメラーゼを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。次いで、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼとした。
　一次スクリーニングにおける固定化アルロースエピメラーゼの酵素活性測定方法は次の通りである。即ち、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇをマイクロチューブに投入し、温水浴に浸して５０℃で１０分間反応させた。その後、９５℃の沸騰浴中に５分間投入して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。
　得られた結果を表２に示す。その結果、スチレン系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂及びスチレン系ゲル型弱塩基性イオン交換樹脂で固定化したアルロースエピメラーゼの比活性が高く、とりわけスチレン系ポーラス型で３級アミンを有するイオン交換樹脂、スチレン系ゲル型で３級アミンを有するイオン交換樹脂で固定化したアルロースエピメラーゼの比活性が高いという傾向が認められた。しかしながら、データには示していないが、フラクトースに固定化アルロースエピメラーゼを作用させてアルロースを連続的に生成させた別の実験においてスチレン系ポーラス型３級アミンであっても、強塩基性陰イオン交換樹脂は、生成したアルロースを分解し、純度を低くすることが認められ、固定化担体として不適当であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．固定化担体の二次スクリーニング
　次に、一次スクリーニングで比活性が高く、効率的と評価されたＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂について、固定化に使用するアルロースエピメラーゼの単位数を多くして、吸着固定化容量を評価した。
　アルロースエピメラーゼは大腸菌発現系を用いて生産されたものを用いた。即ち、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株由来のアルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを８０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製した。得られたアルロースエピメラーゼの比活性は９３．８Ｕ／ｍｇであった。
　２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１に示すＮｏ．１又は３のイオン交換樹脂１ｍｌと４５０Ｕ又は１０００Ｕのアルロースエピメラーゼを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。その後、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼとした。二次スクリーニングにおける固定化アルロースエピメラーゼの酵素活性測定方法は次の通りである。即ち、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して置き、５０℃で１５分間振とう反応させた。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。
　得られた結果を表３に示す。その結果、意外なことに、負荷酵素単位数を多くした場合は、固定化アルロースエピメラーゼの比活性上昇することが認められた。そして、最も比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼを与えるイオン交換樹脂は表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）であることも明らかとなった。
　更に、表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）を用いて、固定化に供するアルロースエピメラーゼの負荷酵素単位を代えて、アルロースエピメラーゼの固定化を行った。具体的には、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１に示すＮｏ．１又は３のイオン交換樹脂１ｍｌと、前記比活性９３．８Ｕ／ｍｇのアルロースエピメラーゼ５４０Ｕ、６３０Ｕ、９００Ｕ、１３５０Ｕ又は１８００Ｕを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。その後、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄して、固定化アルロースエピメラーゼを調製し、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）と固定化後に残存する酵素液の活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。具体的には、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して置き、５０℃で１５分間振とう反応させた。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。また、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及び残存酵素液３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５０℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ２．５～３．０に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフルクトースのピーク面積比を用いて残存する酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を求めた。
　得られた結果を表４に示す。この結果、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒの範囲内であれば、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造できることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
４．他の微生物由来アルロースエピメラーゼの固定化
　表１のＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂について、他の微生物由来アルロースエピメラーゼの吸着固定化容量を同様に評価した。
　他の微生物由来アルロースエピメラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ　Ｈ１０株由来アルロースエピメラーゼを用いた。即ち、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社にて合成した当該アルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを８０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製した。得られたアルロースエピメラーゼの比活性は１５６Ｕ／ｍｇであった。
　２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１のＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂１ｍｌと６３０Ｕのアルロースエピメラーゼ（タンパク質量で６．７ｍｇ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。次いで、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼを得た。２次スクリーニングと同様の方法で当該固定化アルロースエピメラーゼの比活性を測定した。
　得られた結果を表５に示す。この結果から、２次スクリーニングと同様に最も比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼを与えるイオン交換樹脂は、表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例２（固定化アルロースエピメラーゼの製造）
１．固定化低活性アルロースエピメラーゼの製造（比較例）
　固定化低活性アルロースエピメラーゼは、次の（１）～（３）に示す工程を経て調製した。
（１）菌体培養と菌体回収工程
　０．５質量％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。
（２）粗酵素の抽出工程
　得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。粗酵素液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は４．９Ｕ／ｍｇであった。
（３）アルロースエピメラーゼの固定化
　湿潤状態のイオン交換樹脂（表１のＮｏ．４に示すイオン交換樹脂、ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ　Ａ１０３Ｓ）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、前記で調製したアルロースエピメラーゼを４５００Ｕ（タンパク質量で９１８ｍｇ）含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させた後に、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。この時負荷したタンパク質量は１８．３ｍｇ/ｍｌ-Ｒであった。得られた固定化アルロースエピメラーゼの比活性は５６Ｕ／ｍｌ-Ｒであった。
２．固定化高活性アルロースエピメラーゼの製造
　アルロースエピメラーゼは大腸菌発現系を用いて生産されたものを用いた。すなわち、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株由来のアルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５株（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを１６０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製し、アルロースエピメラーゼ液を得た。得られたアルロースエピメラーゼ液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は５１．９Ｕ／ｍｇであった。
　湿潤状態のイオン交換樹脂（表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂、オルガノ社製、商品名：アンバーライトＦＰＡ９５）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、前記で調製したアルロースエピメラーゼを１３５００Ｕ（タンパク質量で２６０ｍｇ）、２２５００Ｕ（タンパク質量で４３３ｍｇ）又は３１５００Ｕ（タンパク質量で６０７ｍｇ）含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に負荷して酵素を吸着させ後に、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。得られた固定化アルロースエピメラーゼの比活性はそれぞれ、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒであった。
実施例３（固定化アルロースエピメラーゼの連続使用）
　実施例２で得られた固定化低活性アルロースエピメラーゼ（５６Ｕ／ｍｌ-Ｒ）及び固定化高活性アルロースエピメラーゼ（１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を用いてそれぞれ連続酵素反応を実施し、酵素反応の半減期を評価した。
　ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に５６Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化低活性アルロースエピメラーゼを８０ｍｌ、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを２８ｍｌ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを２２ｍｌ、及び２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを１８．５ｍｌそれぞれ充填した。また、別途、２ｍＭになるように硫酸マグネシウムを添加し、更に炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のフラクトース溶液を準備した。前記カラムにフラクトース溶液を、ジャケット温度５５℃で、上向流で連続的に合計４３２０時間通液した。固定化したアルロースエピメラーゼ量（１Ｕ）あたり０．００７ｇ／ｈのフラクトースが接触するように、固定化低活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝１に、１６０Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝３に、２０３Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝３．６に、２４３Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝４．３にそれぞれ設定して通液した。流出液を２４時間毎に１回採取し、採取したそれぞれの液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩及びフィルターろ過を行った後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析に供し、フラクトース及びアルロースのピーク面積に占めるアルロースの面積を求め、変換率とした。変換率を経時的にプロットして近似直線を求め、その近似直線から試験開始１日後の変換効率の半分となる日数を求めて半減期として算出した。
　得られた結果を図１に示す。その結果、意外なことに、５６Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化低活性アルロースエピメラーゼの半減期が１４４日であるのに対し、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は１５４日、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は２０７日、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は２３７日であった。即ち、比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼは半減期が長くなり、耐久性に優れ、より連続反応に適していることが明らかとなった。

Claims (4)

  1. 　比活性が５０Ｕ/ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含む、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法。
  2. 　スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換のイオン交換基が３級アミンである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基が－Ｎ（ＣＨ3）2である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　イオン交換樹脂と接触させる前記酵素液のアルロースエピメラーゼ単位数がイオン交換樹脂１ｍｌ当り２７０Ｕ以上である、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
PCT/JP2017/033178 2016-09-14 2017-09-14 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法 WO2018052054A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2019002902A MX2019002902A (es) 2016-09-14 2017-09-14 Metodo para producir alulosa epimerasa inmovilizada.
KR1020197003450A KR102357124B1 (ko) 2016-09-14 2017-09-14 고정화 알룰로스 에피메라제의 제조방법
US16/329,311 US20190249167A1 (en) 2016-09-14 2017-09-14 Method for producing immobilized allulose epimerase
JP2018539767A JP6990656B2 (ja) 2016-09-14 2017-09-14 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法
EP17850955.0A EP3514231B1 (en) 2016-09-14 2017-09-14 Method for producing immobilized allulose epimerase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-179954 2016-09-14
JP2016179954 2016-09-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018052054A1 true WO2018052054A1 (ja) 2018-03-22

Family

ID=61619511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/033178 WO2018052054A1 (ja) 2016-09-14 2017-09-14 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20190249167A1 (ja)
EP (1) EP3514231B1 (ja)
JP (1) JP6990656B2 (ja)
KR (1) KR102357124B1 (ja)
MX (1) MX2019002902A (ja)
WO (1) WO2018052054A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444716A (zh) * 2021-05-21 2021-09-28 诚志生命科技有限公司 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶及其制备方法
CN114231578A (zh) * 2021-12-30 2022-03-25 保龄宝生物股份有限公司 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001011090A (ja) * 1999-06-24 2001-01-16 Hayashibara Biochem Lab Inc 複合体結晶性糖質とその製造方法並びに用途
WO2008142860A1 (ja) * 2007-05-18 2008-11-27 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 砂糖様味質をもつ新規甘味料、その製造法および用途
WO2016152819A1 (ja) * 2015-03-26 2016-09-29 松谷化学工業株式会社 アルロース含有甘味料組成物の製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3333969B2 (ja) 1992-10-08 2002-10-15 株式会社林原生物化学研究所 Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
KR20110035805A (ko) 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
GB2508586B (en) 2012-09-27 2020-09-02 Tate & Lyle Ingredients Americas Llc A protein
JP2014140361A (ja) 2012-12-26 2014-08-07 Matsutani Chem Ind Ltd ケトース３−エピメラーゼ酵素
JP6774875B2 (ja) * 2013-09-03 2020-10-28 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001011090A (ja) * 1999-06-24 2001-01-16 Hayashibara Biochem Lab Inc 複合体結晶性糖質とその製造方法並びに用途
WO2008142860A1 (ja) * 2007-05-18 2008-11-27 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. 砂糖様味質をもつ新規甘味料、その製造法および用途
WO2016152819A1 (ja) * 2015-03-26 2016-09-29 松谷化学工業株式会社 アルロース含有甘味料組成物の製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIM, B-C. ET AL.: "A stable immobilized D-psicose 3-epimerase for the production of D-psicose in the presence of borate", PROCESS BIOCHEMISTRY, vol. 44, 2009, pages 822 - 828, XP026160655, DOI: doi:10.1016/j.procbio.2009.03.017 *
See also references of EP3514231A4 *
TAKESHITA, K. ET AL.: "Mass Production of D-Psicose from D-Fructose by a Continuous Bioreactor System Using Immobilized D-Tagatose 3-Epimerase", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 90, no. 4, 2000, pages 453 - 455, XP003003993, DOI: doi:10.1016/S1389-1723(01)80018-9 *
YOSHIHARA,A. ET AL.: "Purification and characterization of D-allulose 3-epimerase derived from Arthrobacter globifomis M30, a GRAS microorganism", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 123, no. 2, 4 October 2016 (2016-10-04), pages 170 - 176, XP029896821, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2016.09.004 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444716A (zh) * 2021-05-21 2021-09-28 诚志生命科技有限公司 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶及其制备方法
CN114231578A (zh) * 2021-12-30 2022-03-25 保龄宝生物股份有限公司 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20190249167A1 (en) 2019-08-15
EP3514231A4 (en) 2020-03-04
EP3514231A1 (en) 2019-07-24
MX2019002902A (es) 2019-07-04
JPWO2018052054A1 (ja) 2019-06-24
KR20190046779A (ko) 2019-05-07
EP3514231B1 (en) 2024-06-12
KR102357124B1 (ko) 2022-01-28
JP6990656B2 (ja) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8030035B2 (en) D-psicose production method by D-psicose epimerase
JP5997693B2 (ja) アルスロバクターグロビホルミスの生産する酵素
JP2010504082A (ja) ２−Ｏ−グリセリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの生産方法
Neifar et al. Immobilization of the glucose isomerase from Caldicoprobacter algeriensis on Sepabeads EC-HA and its efficient application in continuous High Fructose Syrup production using packed bed reactor
Lim et al. A stable immobilized D-psicose 3-epimerase for the production of D-psicose in the presence of borate
EP3885442A1 (en) Novel ketose 3-epimerase
WO2016152819A1 (ja) アルロース含有甘味料組成物の製造方法
WO2018052054A1 (ja) 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法
KR20220035460A (ko) 육탄당의 생산을 위한 고정화된 효소 조성물
KR20120049421A (ko) 아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료
CN110049991A (zh) 用于纯化阿洛酮糖转化产物的方法
CN112708616B (zh) 一种固定化多酶体系生产塔格糖的方法
Engel et al. Immobilization of β-Galactosidase in Adsorptive Membranes for the Continuous Production of Galacto-Oligosaccharides from Lactose §
Yun et al. Enzymatic production of fructooligosaccharides from sucrose
EP2186904B1 (en) Method for producing glucose derivatives
Kovaleva et al. Development of a Heterogenous Biocatalyst on the basis of Immobilized Inulinase Preparation from Kluyveromyces marxianus
WO2022114207A1 (ja) 新規ｌ－ラムノースイソメラーゼ
JPS643480B2 (ja)
Perminova et al. Catalytical properties of Arthrobacter nicotianae cells, a producer of glucose isomerase, immobilized inside xerogel of silicium dioxide
Kovalenko et al. Investigation on macrokinetics of heterogeneous process of monosaccharide isomerization using non-growing cells of a glucoisomerase producer Arthrobacter nicotianae immobilized inside SiO 2-xerogel
JPH10248560A (ja) 固定化酵素及びトレハロースの製造方法
JPH0616706B2 (ja) 固定化酵素の製造法
JPH10117793A (ja) アデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17850955

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197003450

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018539767

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017850955

Country of ref document: EP

Effective date: 20190415