WO2016152819A1 - アルロース含有甘味料組成物の製造方法 - Google Patents

アルロース含有甘味料組成物の製造方法 Download PDF

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glucose
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fructose
epimerase
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研作 島田
プシュパ キラン グラッパリ
知也 新谷
晴造 高岡
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松谷化学工業株式会社
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a sweetener composition enzymatically containing glucose, fructose and allulose using glucose as a raw material. More specifically, the present invention efficiently produces a sweetener composition containing glucose, fructose and allulose and having a high ratio of allulose using glucose isomerase and allulose epimerase using glucose as a raw material. Regarding the method.
  • Isomerized sugar is a sweetener mainly composed of glucose and fructose, which is produced by hydrolyzing gelatinized starch with an enzyme to produce a glucose solution and reacting this with glucose isomerase (isomerization reaction).
  • the isomerization reaction by glucose isomerase is an equilibrium reaction, and the ratio of fructose contained in the isomerized sugar is usually 46% to 42%.
  • purified fructose one obtained by chromatographically separating the fructose contained in the isomerized sugar and increasing the purity to about 95%) may be added.
  • the fructose contained in the isomerized sugar after the addition is usually about 55%.
  • Isomerized sugar is widely used as a sweetener in soft drinks and other beverages because of its low production cost. For example, approximately 1 million tons per year is consumed in Japan and approximately 8 million tons is consumed annually in the United States. However, on the other hand, isomerized sugar is suspected as a cause of hyperglycemia, overweight (obesity), metabolic syndrome and the like in developed countries such as Japan and the United States (Non-patent Document 1). This is because the metabolism of fructose in the liver facilitates lipogenesis compared to glucose, and easily induces hyperlipidemia and obesity.
  • Patent Document 1 allulose produced by reacting fructose with D-ketohexose 3-epimerase
  • Patent Document 2 is a kind of rare sugar called psicose, and its energy value is zero
  • Non-Patent Document 3 The usefulness of postprandial blood glucose elevation inhibitory effect (Non-patent document 3), anti-obesity effect (Non-patent document 4), etc. has been reported, and has attracted attention as a lifestyle-related disease prevention material. Therefore, a sweetener composition using a combination of allulose and isomerized sugar is expected to reduce the risk of the isomerized sugar described above.
  • fructose purified by chromatographic separation from isomerized sugar in advance is used as a starting material, the production process is complicated, and raw material costs, reaction costs, and plant operation costs are high. Efficient industrial production was difficult.
  • Non-Patent Document 5 and Patent Document 2 include a non-immobilized glucose isomerase, an immobilized glucose isomerase or an immobilized glucose isomerase cell, an immobilized D-ketohexose-3 epimerase or a non-immobilized glucose solution. It is disclosed that a sweetener containing glucose, fructose and allulose can be produced by allowing immobilized D-ketohexose 3-epimerase to act simultaneously or sequentially.
  • batch production disclosed in Non-Patent Document 5 and Patent Document 2 can increase the content ratio of allulose, there is a disadvantage that the content ratio of allulose is low in continuous production.
  • Patent Document 3 psicose is produced from glucose using an immobilized enzyme in which a recombinant microorganism having psicose epimerase activity derived from Agrobacterium umefaciens is immobilized on alginic acid and immobilized glucose isomerase.
  • a method is disclosed.
  • the glucose concentration and the reaction temperature are only studied as control factors for increasing the content of psicose, and other control factors are not studied.
  • recombinant glucose isomerase and recombinant microorganisms having psicose epimerase activity immobilized on alginate are used by being packed in separate columns. Since the physical properties are different from each other, this reflects that it is difficult to use both enzymes uniformly packed in the same column, and that it is difficult to control the enzyme reaction when packed in the same column.
  • the present inventors have found that allulose inhibits the isomerization reaction of glucose to fructose by glucose isomerase, and glucose isomerase and allulose epimerase are allowed to act on glucose so that the content ratio of allulose is high. In order to obtain a sweetener composition, it is important to minimize the effects of the inhibition.
  • the present invention provides a method for producing a sweetener composition containing glucose, fructose and allulose by allowing glucose isomerase and allulose epimerase to act on glucose. It aims at providing the technique which raises the content rate of allulose.
  • the inventors of the present invention made extensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • glucose isomerase and allulose epimerase were immobilized, and the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase was 1.49: 1-5.
  • a sweetener composition containing glucose, fructose and allulose and having a high content of allulose can be continuously and efficiently added. It was found that it can be manufactured.
  • the space velocity of the glucose solution passing through the column to 0.2 to 1.0, the content ratio of allulose in the sweetener composition can be improved more efficiently. Found to get.
  • the present invention has been completed by further studies based on these findings.
  • this invention provides the invention of the aspect hung up below.
  • Item 1 A process for producing a sweetener composition comprising glucose, fructose and allulose, 1) Step A for preparing a column packed so that the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase is 1.49: 1 to 5.61: 1. 2) Step B in which an enzyme reaction is conducted by passing a glucose solution through the column; and 3) Step C in which the effluent of the column is collected.
  • a process for producing a sweetener composition comprising: Item 2.
  • Item 2. The production method according to Item 1, wherein in step B, the glucose solution is passed at a space velocity of 0.2 to 1.0.
  • Item 3. Item 3.
  • the specific activity of the immobilized allulose epimerase is 20 U / ml or more, 4.
  • Item 5. The production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the immobilized carrier of immobilized allulo-epimerase is a polystyrene-based weakly basic anion exchange resin.
  • a separation step of separating the effluent obtained in step C into a fraction containing a mixture of glucose and fructose and a fraction containing allulose; and a fraction containing allulose obtained in the separation step A mixing step of mixing the effluent obtained in step C and Item 7.
  • a method of simultaneously producing an isomerized sugar product and an allulose product A first step for carrying out the production method according to any one of Items 1 to 6, and a fraction containing a mixture of glucose and fructose, and a fraction containing allulose from the sweetener composition obtained in the first step
  • a second step of performing a separation process, Manufacturing method A second step of performing a separation process, Manufacturing method.
  • a sweetener composition containing glucose, fructose and allulose and having a high content of allulose by a simple method of passing a glucose solution through a predetermined column.
  • a sweetener composition having an allulose content ratio of about 13% or more can be produced efficiently, so that lifestyle-related diseases that promote effects such as zero calories, postprandial blood glucose rise suppression, and anti-obesity It also becomes possible to provide a sweetener composition that can be a preventive material at a low cost.
  • a sweetener composition having a content ratio of glucose, fructose, and allulose of 50:37:13 to 43:42:15 can be obtained. It is also possible to obtain an existing isomerized sugar product and a high-purity allulose product at the same time by a simple technique of subjecting to a fraction containing glucose and fructose and an fraction containing allulose.
  • the production method of the present invention can be performed by a simple technique of passing a glucose solution through a column packed with an immobilized enzyme, and the existing isomerized sugar equipment can be diverted as it is, so the burden of equipment investment is There is also an advantage that it is extremely small.
  • the production method of the present invention is a method for producing a sweetener composition containing glucose, fructose and allulose.
  • the enzyme activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase is 1.49: 1 to 5.
  • Step A for preparing a column packed to be 61: 1 2)
  • Step B for carrying out an enzymatic reaction by passing a glucose solution through the column and
  • Glucose, fructose and allulose from the effluent of the column Including a step C of collecting a fraction containing
  • the manufacturing method of this invention is explained in full detail.
  • enzyme activity (U) of glucose isomerase is defined as a unit of enzyme force that reacts at a reaction temperature of 55 ° C. using glucose as a substrate to produce 1 ⁇ mol of fructose per minute. Specifically, 2500 ⁇ l of 0.2 M glucose solution dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate, 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate. 2167 ⁇ l and glucose isomerase 333 ⁇ l are put into a test tube with a screw cap, immersed in a warm water bath and reacted at 55 ° C. for 15 minutes.
  • a 5% by mass hydrochloric acid aqueous solution is added to adjust the pH to 3.0 to 2.5 to inactivate the enzyme, desalting with an ion exchange resin, filtration through a filter, and HPLC analysis.
  • the enzyme activity is calculated using the peak area ratio of the generated fructose.
  • enzyme activity (U) of allulose epimerase is defined as a unit of enzyme force that reacts at a reaction temperature of 55 ° C. using allulose as a substrate to produce 1 ⁇ mol fructose per minute.
  • the specific measurement procedure is the same as that of the enzyme activity of glucose isomerase described above except that the substrate is allulose.
  • “specific activity of immobilized glucose isomerase (U / ml)” is a value measured according to the method for measuring the maximum activity described in “Japanese Industrial Standard Industrial Glucose Isomerase K7002-1988”. . Specifically, a 45% by mass glucose solution adjusted to pH 7.8-8.0 by adding 2 mM magnesium sulfate and sodium carbonate is prepared. Weigh 30 ml of immobilized glucose isomerase swollen at 4 ° C. all day and night, add 100 ml of the glucose solution to this, soak in a warm water bath, depressurize while keeping at 50 ° C., and degas for 30 minutes or more.
  • the glucose solution is passed in a downward flow at a jacket temperature of 55 ° C. using a feed pump.
  • the effluent is collected, and a portion thereof is desalted with an ion exchange resin, filtered, and analyzed by HPLC, and the isomerization rate is determined from the peak area ratio of the produced fructose.
  • the flow rate is set so that the isomerization rate falls within the range of 0.39 to 0.44.
  • the specific activity of the immobilized glucose isomerase is determined by the following formula.
  • E (FS / W) 0.50ln (0.50 / 0.50-X)
  • E Specific activity (U / ml)
  • F Flow rate (ml / min)
  • S Glucose concentration in glucose solution ( ⁇ mol / ml)
  • W Volume of immobilized glucose isomerase (ml)
  • X Isomerization rate
  • the “specific activity (U / ml) of immobilized allulose epimerase” is measured according to the above-described method for measuring the enzyme activity of immobilized glucose isomerase except that fructose is used instead of glucose. Value. Specifically, a 45 mass% fructose solution adjusted to pH 7.8-8.0 by adding 2 mM magnesium sulfate and sodium carbonate is prepared. 30 ml of immobilized allulose epimerase swollen overnight at 4 ° C. is weighed, 100 ml of the fructose solution is added thereto, and the mixture is immersed in a warm water bath and kept at 50 ° C., and depressurized for 30 minutes or more.
  • the fructose solution is passed in a downward flow using a liquid feed pump at a jacket temperature of 55 ° C.
  • the effluent is collected, a portion thereof is desalted with an ion exchange resin, filtered, and analyzed by HPLC.
  • the isomerization rate is determined from the peak area ratio of the produced allulose. At this time, the flow rate is set so that the isomerization rate falls within the range of 0.21 to 0.24. Then, the specific activity of the immobilized allulose epimerase is determined by the following formula.
  • E (FS / W) 0.27 ln (0.27 / 0.27 ⁇ X)
  • E Specific activity (U / ml)
  • F Flow rate (ml / min)
  • S Fructose concentration in the fructose solution ( ⁇ mol / ml)
  • W Volume of immobilized allulose epimerase (ml)
  • X Isomerization rate
  • the content ratio of each saccharide (glucose, fructose, allulose) in the sweetener composition is the ratio (%) of the mass occupied by each saccharide per total mass (100%) of glucose, fructose, and allulose. ).
  • space velocity (SV) is a unit of a velocity at which a solution is passed through a column
  • space velocity (SV) liquid passage amount (ml) / column volume (ml) / hour (h ) ”.
  • step A a column packed so that the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase is 1.49: 1 to 5.61: 1 is prepared.
  • Glucose isomerase is an enzyme that can catalyze the interconversion of D-glucose and D-fructose.
  • the origin of the glucose isomerase used in the present invention is not particularly limited, and may be any origin of microorganisms, animals, plants, and the like. Examples of the microorganism derived from glucose isomerase include Bacillus coagulans, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces rubinosus, Streptomyces murinus and the like.
  • the glucose isomerase used in the present invention may be isolated from the organism or may be a recombinant produced by genetic engineering techniques. Non-immobilized glucose isomerase is commercially available, for example, from Dow Chemical Co., etc. In the present invention, a commercially available glucose isomerase may be immobilized and used.
  • the immobilized glucose isomerase a purified product or a crude purified product with immobilized glucose isomerase may be used, or a glucose isomerase-producing microorganism may be immobilized. .
  • the carrier for immobilization used for immobilizing glucose isomerase is not particularly limited as long as the enzyme can be immobilized.
  • an ion exchange resin polyvinyl alcohol, polypropylene, acrylic, chitosan
  • examples include organic polymer carriers such as hydrophobic adsorption resins, chelate resins, and synthetic adsorption resins; and inorganic carriers such as celite, diatomaceous earth, kaolinite, silica gel, molecular sieves, porous glass, activated carbon, and ceramics.
  • a quaternized pyridine compound for example, trade name DAC manufactured by Denki Kagaku Kogyo Co., Ltd.
  • an alginate can be used as an immobilization carrier.
  • These immobilization carriers may be used alone or in combination of two or more.
  • these carriers for immobilization from the viewpoint of maintaining the activity of glucose isomerase by immobilization, low cost, low pressure loss and easy handling, preferably ion exchange resins, more preferably weakly basic anion exchange resins, Preferably, a polystyrene-based weakly basic anion exchange resin is used.
  • Immobilized glucose isomerase can be obtained by immobilizing glucose isomerase or a microorganism producing the same on an immobilization carrier by a known technique.
  • immobilization of glucose isomerase using an ion exchange resin as an immobilization carrier can be performed according to the following procedure.
  • the column was filled with ion exchange resin, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate, and then diluted to a predetermined concentration with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate.
  • the glucose isomerase solution is adsorbed while circulating for about 1 to 16 hours.
  • glucose isomerase is washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate to obtain immobilized glucose isomerase.
  • phosphate buffer pH 8.0
  • it may be cross-linked with glutaraldehyde, polyethyleneimine or the like, if necessary, to strengthen immobilization of glucose isomerase.
  • the specific activity of the immobilized glucose isomerase may be appropriately set within a range that satisfies the ratio of the enzyme activity of the immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase described later.
  • it is 100 U / ml or more, preferably 100 to 150 U / ml, more preferably 100 to 200 U / ml.
  • the specific activity of the immobilized glucose isomerase satisfies the above-mentioned range, and further, the space velocity at the time of passing the glucose solution in step B is set to the range described later, whereby the allulose in the sweetener composition to be produced Is 13% or more, and a sweetener composition having a glucose, fructose, and allulose content ratio of 50:37:13 to 43:42:15 can be efficiently produced.
  • Allulose epimerase is an enzyme that can catalyze the interconversion of D-fructose and allulose.
  • the origin of the allulose epimerase used in the present invention is not particularly limited, and any origin of microorganisms, animals, plants and the like may be used.
  • allulose epimerase is produced by Arthrobacter globebiformis strain M30 (Accession No. NITE BP-1111), and in the present invention, allulose epimerase derived from the microorganism can be used.
  • microorganisms derived from allulose epimerase include Pseudomonus cichorii, Agrobacterium tumefaciens, Clostridium sp, Clostridium scindens, Clostridium bolteae, Ruminococcus sp, Clostridium cellulolyticum and the like.
  • the allulose epimerase used in the present invention may be isolated from the organism or may be a recombinant produced by genetic engineering techniques.
  • immobilized allulose epimerase a purified product or a crudely purified product of immobilized allulose epimerase may be used, or a microorganism that produces allulose epimerase is used. May be.
  • the carrier for immobilization used for immobilizing allulose epimerase is not particularly limited as long as the enzyme can be immobilized.
  • ion exchange resin polyvinyl alcohol, polypropylene, acrylic, chitosan Organic polymer carriers such as hydrophobic adsorption resin, chelate resin, synthetic adsorption resin; inorganic carriers such as celite, diatomaceous earth, kaolinite, silica gel, molecular sieves, porous glass, activated carbon and ceramics.
  • a quaternized pyridine compound for example, trade name DAC manufactured by Denki Kagaku Kogyo Co., Ltd.
  • an alginate can be used as an immobilized carrier.
  • These immobilization carriers may be used alone or in combination of two or more.
  • these carriers for immobilization from the viewpoint of maintaining the activity of allulose epimerase by immobilization, low cost and low pressure loss and easy handling, preferably ion exchange resins, more preferably weakly basic anion exchange resins, More preferably, a weakly basic anion exchange resin based on polystyrene divinylbenzene is used.
  • the ion exchange group of the weakly basic anion exchange resin include a tertiary amine.
  • Immobilized allulose epimerase can be obtained by immobilizing allulose epimerase or a microorganism that produces it on a carrier for immobilization by a known technique.
  • immobilization of allulose epimerase derived from Arthrobacter globiformis using an ion exchange resin as a carrier for immobilization can be performed according to the following procedure. First, Arthrobacter globiformis is inoculated into a minimal salt medium (MSM medium) containing 0.5% D-allulose and cultured. The cells are collected from the obtained culture broth by centrifugation and washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0).
  • MSM medium minimal salt medium
  • the washed cells are suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0), and about 10% by weight of lysozyme per wet cell weight and about 5% by weight of sodium chloride per wet cell weight are added thereto,
  • the enzyme is extracted at a temperature of 37 ° C. for about 120 minutes. Thereafter, heating is further performed at 55 ° C. for about 15 minutes to inactivate the non-heat-resistant enzyme, and the centrifuged supernatant is recovered to obtain a crude enzyme solution.
  • the column was filled with an ion exchange resin, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate, and then diluted with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate.
  • the crude enzyme solution is passed through the ion exchange resin while circulating for about 1 to 16 hours to adsorb the enzyme.
  • it is washed with a 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate to obtain immobilized allulose epimerase.
  • it may be cross-linked with glutaraldehyde, polyethyleneimine or the like to strengthen immobilization of allulose epimerase.
  • the specific activity of the immobilized allulose epimerase may be appropriately set within a range that satisfies the enzyme activity ratio of the immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase described later. From the viewpoint of further improving the content ratio, the amount is 20 U / ml or more, preferably 20 to 150 U / ml, more preferably 25 to 80 U / ml.
  • the specific activity of the immobilized allulose epimerase satisfies the above-described range, and further, by setting the space velocity at the time of passing the glucose solution in Step B to the range described later, in the sweetener composition to be produced It becomes possible to efficiently produce a sweetener composition in which the content ratio of allulose is 13% or more and the content ratio of glucose, fructose and allulose is 50:37:13 to 43:42:15.
  • glucose isomerase and allulose epimerase may be immobilized on different immobilization carriers, and the immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase may be mixed and packed in the same column. Both glucose isomerase and allulose epimerase may be immobilized on the same immobilization carrier, and this may be packed in a column.
  • the activity ratio of immobilized glucose isomerase: immobilized allulose epimerase is 1.49: 1 to 5.61: 1. Then, both immobilized enzymes are packed in the same column.
  • immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase in such a ratio, a sweetener composition having a high allulose content can be efficiently produced.
  • the activity ratio between the immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase is out of the above range, the content ratio of allulose in the sweetener composition to be produced is decreased. It is necessary to extremely reduce the space velocity of the sweetener composition, and a sweetener composition having a high allulose content cannot be efficiently produced.
  • the activity ratio of immobilized glucose isomerase: immobilized allulose epimerase is preferably 2.94: 1 to 3.74: 1. Is mentioned.
  • step B a glucose solution is passed through the column to perform an enzyme reaction.
  • a glucose solution By passing a glucose solution through the column, a part of glucose is reversibly converted to fructose by the action of glucose isomerase, and a part of the generated fructose is further converted to allulose by the action of allose epimerase. Reversibly converted.
  • the enzymatic reaction by glucose isomerase and allulose epimerase proceeds reversibly and continuously in one column, so that a sweetener containing glucose, fructose and allulose can be efficiently produced. it can.
  • the glucose solution is a solution in which glucose as a substrate is dissolved in water.
  • the origin of glucose used in the glucose solution is not particularly limited, and examples thereof include glucose obtained by hydrolyzing and purifying starch with an enzyme.
  • the glucose concentration of the glucose solution may be appropriately set according to the sugar concentration or the like to be provided in the manufactured sweetener composition, but it is said that the sweetener composition having a high allulose content is efficiently produced.
  • the Brix concentration is usually 30 to 50%, preferably 35 to 45%.
  • the glucose solution may contain a water-soluble magnesium salt.
  • a water-soluble magnesium salt By including a water-soluble magnesium salt in this manner, allulose epimerase can be stabilized.
  • the water-soluble magnesium salt added to the glucose solution is not particularly limited as long as it is acceptable for food production, and examples thereof include magnesium sulfate and magnesium chloride. These water-soluble magnesium salts may be used singly or in combination of two or more.
  • the content of the water-soluble magnesium salt in the glucose solution is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 5 mM, preferably 1.5 to 2.5 mM.
  • the pH of the glucose solution may be appropriately set within a range in which the immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase can act, but usually 7.0 to 8.5, preferably 7.8 to 8.0. It is done.
  • the pH of the glucose solution can be adjusted using a known pH adjusting agent.
  • the conditions for passing the glucose solution through the column may be appropriately adjusted according to the specific activity of the immobilized enzyme packed in the column, the content ratio of allulose to be provided in the sweetener composition to be produced, and the like.
  • the space velocity (SV) of the glucose solution to be passed is preferably 0.2 to 1.0, preferably 0.3 to 0.5.
  • the sweetener composition produced by the specific activities of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase satisfying the above-mentioned range, and the space velocity (SV) of the glucose solution to be passed satisfies the above-mentioned range.
  • a sweetener composition in which the content ratio of fructose in the product is 37% or more and the content ratio of allulose is 13% or more, and the content ratio of glucose, fructose and allulose is 50:37:13 to 43:42:15 Can be manufactured.
  • the content ratio of fructose in the sweetener composition to be produced is less than 37%, unlike the composition ratio of existing isomerized sugar products, it cannot be used as an isomerized sugar product as it is, and further separation processing is required. May be.
  • the content ratio of allulose in the sweetener composition to be produced is less than 13%, the added value of the sweetener composition in which the composition ratio of glucose and fructose is produced is reduced. May be required.
  • the space velocity is set higher than the above range, the production amount per unit time increases, but if the space velocity is too high, the fructose and allulose content ratio tends to decrease.
  • the space velocity is set lower than the above-described range, the production amount per unit time decreases and the production efficiency tends to decrease. That is, in the production method of the present invention, by controlling the space velocity of the glucose solution flowing through the column within the above range, the produced sweetener composition can be used as an isomerized sugar product as it is. Highly valuable allulose can be efficiently contained at a high content, and the production amount per unit time can be further increased.
  • the temperature condition for passing the glucose solution through the column may be set as appropriate as long as the immobilized enzyme packed in the column can act.
  • the temperature in the column may be 45 to A temperature of 65 ° C., preferably 55 to 60 ° C. may be mentioned.
  • the temperature in the column can be adjusted by, for example, a method of heating the column using a heat insulation jacket.
  • step C and subsequent step C the effluent of the column is collected.
  • the effluent thus recovered contains glucose, fructose and allulose and can be used as it is as a sweetener composition.
  • the content ratio of allulose in the effluent is 13 to 15%, the effluent is a low-calorie sweetener composition that has a low risk of inducing hyperglycemia, overweight (obesity), metabolic syndrome, and the like. It can be used as it is.
  • the effluent collected in step C may be concentrated as necessary to increase the concentration of carbohydrates contained.
  • the fraction containing the mixture of glucose and fructose and the fraction containing allulose can also be fractionated by subjecting the effluent collected in step C to separation treatment such as simulated moving bed chromatography.
  • the fraction containing allulose obtained in this way has an allulose purity of 90% or more, and can be used as a material for preventing lifestyle habits such as zero calories, postprandial blood glucose rise suppression, and anti-obesity.
  • a sweetener composition having a further increased allulose content ratio can be obtained.
  • the sweetener composition having an increased allulose content ratio can be used as a sweetener having a low calorie and an enhanced function of allulose.
  • specific activity ratio (I: E) means “specific activity of immobilized glucose isomerase: specific activity of immobilized allulose epimerase”.
  • activity ratio means “specific activity of immobilized glucose isomerase: specific activity of immobilized allulose epimerase”.
  • activity ratio means “activity ratio”, “enzyme activity ratio”, and “enzyme activity ratio” are also synonymous.
  • the procedure was as follows. First, 50 ml of ion exchange resin (manufactured by Purolite, trade name: PUROLITE A103S) is packed in a column, washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate, and then 4500 U of liquid glucose isomerase ( 500 ml of 2 mM magnesium sulfate-containing 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing Dow Chemical Co., Ltd. (product name: Spezyme Gifp) was passed through an ion exchange resin while circulating at 4 ° C. for 16 hours, followed by glucose. Isomerase was adsorbed.
  • ion exchange resin manufactured by Purolite, trade name: PUROLITE A103S
  • Immobilized allulose epimerase was prepared by the following methods (1) to (3).
  • the enzyme was adsorbed and washed with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 2 mM magnesium sulfate to obtain immobilized allulose epimerase.
  • the specific activity of immobilized allulose epimerase was 29.55 U / ml.
  • a commercially available immobilized glucose isomerase prepared in Production Example 1 or an independently prepared immobilized glucose isomerase and an immobilized allulose epimerase were uniformly mixed so as to have the amounts and activity ratios shown in Table 1, and an inner diameter with a jacket A glass column having a length of 32 mm and a length of 300 mm was packed.
  • a 35% by mass glucose solution adjusted to pH 7.8-8.0 by adding 2 mM magnesium sulfate and sodium carbonate was prepared.
  • the glucose solution was continuously passed through the column in an upward flow while controlling the jacket temperature at 50 ° C. and the space velocity (SV) to be 0.2.
  • the effluent was sampled three times at 24-hour intervals, and the space velocity SV was determined from the amount of liquid and the sampling time for each sampling.
  • a portion of each collected effluent was desalted with an ion exchange resin, filtered, and then subjected to HPLC (analysis column: MCIGEL CK08EC, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) analysis to determine the peak area ratio of glucose, fructose and allulose. And the composition ratio of the reaction product was calculated.
  • HPLC analysis column: MCIGEL CK08EC, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
  • Table 2 shows the results obtained. As shown in Table 2, the effluent is almost uniform regardless of the sampling time, and the composition ratio (weight ratio) of glucose, fructose and allulose is 43.6: 41.3: 15.1 to 43.4. : 41.5: 15.1.
  • immobilized glucose isomerase prepared in Production Example 1 or independently prepared immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase were uniformly mixed so as to have the amounts and activity ratios shown in Table 3, and the inner diameter with a jacket A glass column having a length of 32 mm and a length of 300 mm was packed.
  • a 35% by mass glucose solution adjusted to pH 7.8-8.0 by adding 2 mM magnesium sulfate and sodium carbonate was prepared.
  • the glucose solution was continuously passed through the column in an upward flow while controlling the jacket temperature to be 50 ° C. and the space velocity (SV) to be 0.3 to 0.4.
  • the effluent was collected 3 to 4 times at 24 hour intervals, and the space velocity SV was obtained from the amount of liquid and the collection time for each collection.
  • a portion of each collected effluent was desalted with an ion exchange resin, filtered, and then subjected to HPLC (analysis column: MCIGEL CK08EC, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) analysis to determine the peak area ratio of glucose, fructose and allulose. And the composition ratio of the reaction product was calculated.
  • Table 4 shows the obtained results. From this result, when the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase packed in the column is in the range of 1.25: 1 to 5.61: 1, the content ratio of allulose in the effluent is 13%. The content ratio of allulose was high. On the other hand, when the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase packed in the column is less than 1.25: 1, or more than 5.61: 1, the content ratio of allulose in the effluent is 13%. It was not reached.
  • space velocity SV 0.5 condition
  • the following test was performed. That is, in this test, the conditions of an efficient manufacturing method with a high production amount per unit time were verified.
  • the immobilized glucose isomerase and the immobilized allulose epimerase prepared in Production Example 1 were uniformly mixed so as to have the amounts and activity ratios shown in Table 5, and packed in a glass column with a jacket inner diameter of 20 mm and a length of 400 mm. did.
  • a 35% by mass glucose solution adjusted to pH 7.8-8.0 by adding 2 mM magnesium sulfate and sodium carbonate was prepared.
  • the glucose solution was continuously passed through the column in an upward flow while controlling the jacket temperature at 50 ° C. and the space velocity (SV) to be 0.5.
  • the effluent was collected 3 to 4 times at 24 hour intervals, and the space velocity SV was obtained from the amount of liquid and the collection time for each collection.
  • a portion of each collected effluent was desalted with an ion exchange resin, filtered, and then subjected to HPLC (analysis column: MCIGEL CK08EC, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and the peak area ratio of glucose, fructose and allulose And the composition ratio of the reaction product was calculated.
  • Table 6 shows the obtained results. From this result, when the activity ratio of immobilized glucose isomerase and immobilized allulose epimerase packed in the column is in the range of 2.94: 1 to 3.74: 1, the space velocity is as high as 0.5. Even in this case, it became clear that an effluent having an allulose content ratio of 13% or more can be stably obtained.
  • cation exchange resin trade name: CR1310, manufactured by Organo

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Abstract

本発明の目的は、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させて、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を高める技術を提供することである。 グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを固定化し、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１～５．６１：１になるようにカラムに充填し、該カラムにグルコース溶液を通液することによって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的で効率的に製造できる。

Description

アルロース含有甘味料組成物の製造方法
　本発明は、グルコースを原料として、酵素学的にグルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、グルコースを原料とし、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを使用して、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの比率が高い甘味料組成物を効率的に製造する方法に関する。
　異性化糖は、糊化澱粉を酵素で加水分解してグルコース溶液とし、これにグルコースイソメラーゼを作用（異性化反応）させて製造される、グルコースとフラクトースを主成分とする甘味料である。グルコースイソメラーゼによる異性化反応は平衡反応であり、異性化糖に含まれるフラクトースの割合は通常４６％～４２％である。更に、異性化糖の甘味不足を解消するために、精製フラクトース（前述した異性化糖に含まれるフラクトースをクロマト分離して純度を９５％程度にまで上げたもの）を添加する場合があるが、添加後の異性化糖に含まれるフラクトースは、通常５５％程度である。
　異性化糖は、その生産コストの安さからソフトドリンクや他の飲料に甘味料として幅広く大量に使用され、例えば日本では年間およそ１００万トン、アメリカでは年間およそ８００万トン消費されている。しかし一方で、異性化糖は、日本、アメリカ等をはじめとする先進国において、高血糖や過体重（肥満）、メタボリックシンドロームなどの原因として疑われている（非特許文献１）。フラクトースの肝臓での代謝はグルコースと比較して脂質生成を促進しやすく、高脂血症や肥満を誘発し易いからである。
　一方、フラクトースにＤ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼ（特許文献１）を作用させて生成されるアルロースは、別名をプシコースと称する希少糖の一種であり、エネルギー値がゼロ（非特許文献２）、食後血糖上昇抑制効果（非特許文献３）、抗肥満効果（非特許文献４）等の有用性が報告されており、生活習慣病予防素材として注目されている。そこで、アルロースと異性化糖を併用した甘味料組成物は、前述した異性化糖のリスクを低減できると期待されている。
　しかしながら、従来のアルロースの製造方法では、予め異性化糖からクロマト分離して精製したフラクトースを出発原料として使用するため、製造工程が複雑であり、原料コスト、反応コスト、プラント運転コストが高く、アルロースの効率的な工業生産は困難であった。
　そこで、アルロースと異性化糖を併用した甘味料組成物を簡易に製造する方法として、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼとＤ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼを作用させる方法が提案されている。例えば、非特許文献５及び特許文献２には、グルコース溶液に対して、非固定化グルコースイソメラーゼ、固定化グルコースイソメラーゼ又は固定化グルコースイソメラーゼ菌体と、固定化Ｄ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼ又は非固定化Ｄ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼとを、同時に又は連続的に作用させることにより、グルコース、フラクトース及びアルロースを含有する甘味料を製造できることが開示されている。しかしながら、非特許文献５及び特許文献２に開示されているバッチ式の製造ではアルロースの含有比率を高めることができても、連続的な製造ではアルロースの含有比率が低くなるという欠点がある。
　また、特許文献３には、アグロバクテリウム・トウメファシエンス由来のプシコースエピメラーゼ活性を有する組換え微生物をアルギン酸に固定化した固定化酵素と、固定化グルコースイソメラーゼとを用いて、グルコースからプシコースを製造する方法が開示されている。しかしながら、特許文献３では、プシコースの含有比率を高める制御ファクターとして、グルコース濃度及び反応温度が検討されているに止まり、その他の制御ファクターについては検討されていない。また、特許文献３では、固定化グルコースイソメラーゼとアルギン酸塩に固定化したプシコースエピメラーゼ活性を有する組換え微生物をそれぞれ別のカラムに充填して使用しているが、これは、固定化した両酵素の物性が相互に異なるために、両酵素を同じカラムに均質に充填して使用することが困難であること、及び同じカラムに充填した場合の酵素反応制御が困難であることを反映している。
Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，７９，７７４－７７９，２００４． Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，４８，７７－８０，２００２． Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，５４，５１１－５１４，２００８． Ｉｎｔ．Ｊ．ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒｉ．，６５，２４５－２５０，２０１４． Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８０，１０１－１０３，１９９５．
特開平６－１２５７７６号公報 国際公開第２００８／１４２８６０号 特表２０１３－５０１５１９号公報
　本発明者らは、アルロースが、グルコースイソメラーゼによるグルコースのフラクトースへの異性化反応を阻害することを見出しており、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させてアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を得るには、該阻害の影響を最小限に止めることが肝要になる。
　このような背景の下、本発明は、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させて、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を高める技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを固定化し、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１～５．６１：１になるようにカラムに充填し、当該カラムにグルコース溶液を通液することによって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的で効率的に製造できることを見出した。更に、かかる条件での製造において、グルコース溶液のカラム通液時の空間速度を０．２～１．０に設定することにより、より一層効率的に甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を向上させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、
１）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１～５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、
２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに
３）前記カラムの流出液を採取する工程Ｃ、
を含むことを特徴とする、甘味料組成物の製造方法。
項２．　前記工程Ｂにおいて、空間速度を０．２～１．０に設定してグルコース溶液の通液を行う、項１に記載の製造方法。
項３．　前記固定化グルコースイソメラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｌ以上である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．　前記固定化アルロースエピメラーゼの比活性が２０Ｕ/ｍｌ以上である、項１～
３のいずれかに記載の製造方法。
項５．　前記固定化アルロ－スエピメラーゼの固定化担体が、ポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂である、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
項６．　前記グルコース溶液が、更に水溶性マグネシウム塩を含む、項１～５のいずれかに記載の製造方法。
項７．　前記工程Ｃで得られた流出液を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分とに別ける分離処理を行う分離工程、及び
　前記分離工程で得られたアルロースを含む画分と前記工程Ｃで得られた流出液を混合する混合工程、
を含む、項１～６のいずれかに記載の製造方法。
項８．　異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造する方法であって、
　項１～６のいずれかに記載の製造方法を実施する第１工程、並びに
　前記第１工程で得られた甘味料組成物を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分に別ける分離処理を行う第２工程、
を含む、製造方法。
　本発明によれば、グルコース溶液を所定のカラムに通液するという簡易な手法によって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的に製造することが可能になる。また、本発明の一態様では、アルロースの含有比率が１３％程度以上の甘味料組成物を効率的に製造できるため、カロリーゼロ、食後血糖上昇抑制、抗肥満等の効果を訴求する生活習慣病予防素材となり得る甘味料組成物を安価に提供することも可能になる。更に、本発明の一態様では、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３～４３：４２：１５の甘味料組成物を得ることができるので、該甘味料組成物を分離処理に供してグルコース及びフラクトース含有画分とアルロース含有画分に分画するという簡易な手法で、既存の異性化糖製品と高純度アルロース製品を同時に得ることも可能になる。
　また、本発明の製造方法は、固定化酵素を充填したカラムにグルコース溶液を通液するという簡易な手法で行うことができ、既存の異性化糖設備をそのまま転用できるので、設備投資の負担は極めて少ないという利点もある。
実施例１の試験Ｎｏ.６で得られた流出液をクロマト分画し、各フラクションに含まれるグルコース、フラクトース及びアルロースの量を測定した結果である。
　本発明の製造方法は、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、１）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼを酵素活性比率が１．４９：１～５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに３）前記カラムの流出液から、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む画分を採取する工程Ｃを含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について詳述する。
定義
　本発明において、「グルコースイソメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、グルコースを基質として、反応温度５５℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフラクトースを生成する酵素力を１単位としたものである。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのグルコース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及びグルコースイソメラーゼ３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５５℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフラクトースのピーク面積比を用いて酵素活性を算出する。
　本発明において、「アルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、アルロースを基質として、反応温度５５℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフラクトースを生成する酵素力を１単位としたものである。具体的な測定手順は、基質がアルロースであること以外、上記のグルコースイソメラーゼの酵素活性の場合と同様である。
　本発明において、「固定化グルコースイソメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ）」は、「日本工業規格　工業用グルコースイソメラーゼ　Ｋ７００２－１９８８」に記載された最大活性の測定方法に準じて測定される値である。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムと炭酸ナトリウムとを添加して、ｐＨ７．８～８．０に調整した４５質量％のグルコース溶液を準備する。４℃で一昼夜膨潤させた固定化グルコースイソメラーゼを３０ｍｌ量り取り、これに前記グルコース溶液１００ｍｌを加えて、温水浴に浸して５０℃に保ちながら減圧し３０分以上脱気する。これをジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した後に、ジャケット温度５５℃で前記グルコース溶液を送液ポンプを用いて下向流で通液する。流出液を採取し、その一部をイオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ分析し、生成したフラクトースのピーク面積比から異性化率を求める。この時、異性化率が０．３９～０．４４の範囲に入るように流速を設定する。そして、次の式によって固定化グルコースイソメラーゼの比活性を求める。
Ｅ＝（ＦＳ／Ｗ）０．５０ｌｎ（０．５０／０．５０－Ｘ）
　Ｅ：比活性（Ｕ／ｍｌ）
　Ｆ：流速（ｍｌ／ｍｉｎ）
　Ｓ：グルコース溶液におけるグルコース濃度（μｍｏｌ／ｍｌ）
　Ｗ：固定化グルコースイソメラーゼの容量（ｍｌ）
　Ｘ：異性化率
　本発明において、「固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ）」は、グルコースの代わりにフラクトースを使用すること以外は、前記の固定化グルコースイソメラーゼの酵素活性の測定方法準じて測定される値である。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムと炭酸ナトリウムとを添加して、ｐＨ７．８～８．０に調整した４５質量％のフラクトース溶液を準備する。４℃で一昼夜膨潤させた固定化アルロースエピメラーゼを３０ｍｌ量り取り、これに前記フラクトース溶液１００ｍｌを加えて、温水浴に浸して５０℃に保ちながら減圧し３０分以上脱気する。これをジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した後に、ジャケット温度５５℃で前記フラクトース溶液を送液ポンプを用いて下向流で通液する。流出液を採取し、その一部をイオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ分析し、生成したアルロースのピーク面積比から異性化率を求める。この時、異性化率が０．２１～０．２４の範囲に入るように流速を設定する。そして、次の式によって固定化アルロースエピメラーゼの比活性を求める。
Ｅ＝（ＦＳ／Ｗ）０．２７ｌｎ（０．２７／０．２７－Ｘ）
　Ｅ：比活性（Ｕ／ｍｌ）
　Ｆ：流速（ｍｌ／ｍｉｎ）
　Ｓ：フラクトース溶液におけるフラクトース濃度（μｍｏｌ／ｍｌ）
　Ｗ：固定化アルロースエピメラーゼの容量（ｍｌ）
　Ｘ：異性化率
　本発明において、甘味料組成物における各糖質（グルコース、フラクトース、アルロース）の含有比率とは、グルコース、フラクトース、及びアルロースの総質量（１００％）当たり、各糖質が占める質量の比率（％）である。
　本発明において、「空間速度（ＳＶ）」とは、溶液をカラムに通液する速度の単位であり、「空間速度（ＳＶ）＝通液量（ｍｌ）／カラム体積（ｍｌ）／時間（ｈ）」にて算出される。
工程Ａ
　工程Ａでは、固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１～５．６１：１となるように充填したカラムを用意する。
（固定化グルコースイソメラーゼ）
　グルコースイソメラーゼとは、Ｄ－グルコースとＤ－フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるグルコースイソメラーゼの由来については、特に制限されず、微生物、動物及び植物等のいずれの由来であってもよい。グルコースイソメラーゼの由来微生物としては、例えば、Bacillus coagulans、Streptomyces griseofuscus、Streptomyces rubinosus、Streptomyces murinus等が例示される。また、本発明で使用されるグルコースイソメラーゼは、前記生物から単離したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組み換え体であってもよい。固定化されていないグルコースイソメラーゼは、例えば、ダウ・ケミカル社等から市販されており、本発明では市販品のグルコースイソメラーゼを固定化して使用してもよい。
　また、本発明において固定化グルコースイソメラーゼとして、精製品又は粗精製品のグルコースイソメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またグルコースイソメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。
　グルコースイソメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体；セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体等が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、４級化ピリジン化合物（例えば電気化学工業株式会社製の商品名ＤＡＣ）やアルギン酸塩を固定化用担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるグルコースイソメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、より好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。
　固定化グルコースイソメラーゼは、グルコースイソメラーゼ又はそれを産生する微生物を公知の手法で固定化用担体に固定化することにより得ることができる。例えば、固定化用担体としてイオン交換樹脂を使用してグルコースイソメラーゼを固定化するには、以下の手順に従って行うことができる。イオン交換樹脂をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で所定濃度に希釈したグルコースイソメラーゼ溶液を、１～１６時間程度、循環しながら吸着させる。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化グルコースイソメラーゼを得る。また、このようにグルコースイソメラーゼを固定化した後に、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、グルコースイソメラーゼの固定化を強固にしてもよい。
　固定化グルコースイソメラーゼの比活性については、後述する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとの酵素活性の比率を充足する範囲で適宜設定すればよいが、製造される甘味料組成物においてアルロースの含有比率をより一層向上させるという観点から、１００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１００～１５０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは１００～２００Ｕ／ｍｌが挙げられる。特に、固定化グルコースイソメラーゼの比活性が前述する範囲を充足し、更に工程Ｂにおけるグルコース溶液を通液する際の空間速度を後述する範囲に設定することにより、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３～４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。
（固定化アルロースエピメラーゼ）
　アルロースエピメラーゼとは、Ｄ－フルクトースとアルロースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの由来については、特に制限されず、微生物、動物及び植物等のいずれの由来であってもよい。例えば、アルロースエピメラーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）によって産生されることが知られており、本発明では、該微生物由来のアルロースエピメラーゼを使用することができる。アルロースエピメラーゼの由来微生物としては、例えば、Pseudomonus cichorii、Agrobacterium tumefaciens、Clostridium sp、Clostridium scindens、Clostridium bolteae、Ruminococcus sp、Clostridium cellulolyticum等が挙げられる。また、本発明で使用されるアルロースエピメラーゼは、前記生物から単離したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組み換え体であってもよい。
　また、本発明において固定化アルロースエピメラーゼとして、精製品又は粗精製品のアルロースエピメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またアルロースエピメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。
　アルロースエピメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体；セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体等が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、４級化ピリジン化合物（例えば電気化学工業株式会社製の商品名ＤＡＣ）やアルギン酸塩を固定化担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるアルロースエピメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、より好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはポリスチレンジビニルベンゼン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基としては、例えば３級アミンが挙げられる。
　固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼ又はそれを産生する微生物を公知の手法で固定化用担体に固定化することにより得ることができる。例えば、固定化用担体としてイオン交換樹脂を使用して、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルロースエピメラーゼを固定化するには、以下の手順に従って行うことができる。先ず、０．５％Ｄ－アルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）にＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓを植菌し、培養を行う。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する。次いで、洗浄した菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、そこへ湿潤菌体重量当たり１０重量％程度のリゾチーム及び湿潤菌体重量当たり５重量％程度の塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間程度加熱して酵素の抽出反応を行う。その後、更に５５℃で１５分間程度の加熱を行い、非耐熱性の酵素を失活させ、遠心分離上清を回収し、粗酵素液とする。別途、イオン交換樹脂をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した前記粗酵素溶液を、１時間～１６時間程度、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させる。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼを得る。また、このようにアルロースエピメラーゼを固定化した後に、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、アルロースエピメラーゼの固定化を強固にしてもよい。
　固定化アルロースエピメラーゼの比活性については、後述する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとの酵素活性の比率を充足する範囲で適宜設定すればよいが、製造される甘味料組成物においてアルロースの含有比率をより一層向上させるという観点から、２０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは２０～１５０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは２５～８０Ｕ／ｍｌが挙げられる。特に、固定化アルロースエピメラーゼの比活性が前述する範囲を充足し、更に工程Ｂにおけるグルコース溶液を通液する際の空間速度を後述する範囲に設定することにより、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３～４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。
（固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼのカラムへの充填）
　本発明において、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼは、それぞれ異なる固定化用担体に固定化され、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼが混合されて同一のカラムに充填されていてもよく、また、同一の固定化用担体にグルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼの双方を固定化し、これがカラムに充填されていてもよい。
　本発明では、固定化グルコースイソメラーゼ：固定化アルロースエピメラーゼの活性比率（固定化グルコースイソメラーゼの比活性：固定化アルロースエピメラーゼの比活性）が１．４９：１～５．６１：１となるように、両固定化酵素を同一のカラムに充填する。このような比率で固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼを併用することによって、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が前記範囲から外れる場合には、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が低下し、該アルロースの含有比率を高めるには通液時の空間速度を極端に下げる必要があり、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造できなくなる。
　より一層効率的にアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を製造するという観点から、固定化グルコースイソメラーゼ：固定化アルロースエピメラーゼの活性比率として、好ましくは２．９４：１～３．７４：１が挙げられる。
工程Ｂ
　工程Ｂでは、グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う。グルコース溶液を前記カラムに通液することにより、グルコースの一部がグルコースイソメラーゼの作用を受けてフラクトースに可逆的に変換され、更に生成したフラクトースの一部がアルロースエピメラーゼの作用を受けてアルロースに可逆的に変換される。本発明の製造方法では、グルコースイソメラーゼとアルロースエピメラーゼによる酵素反応が一本のカラム内で可逆的・連続的に進行するため、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料を効率的に製造することができる。
（グルコース溶液）
　グルコース溶液は、基質となるグルコースを水に溶解させた溶液である。グルコース溶液に使用されるグルコースの由来については、特に制限されないが、例えば、澱粉を酵素で加水分解・精製して得られたグルコースが挙げられる。
　グルコース溶液のグルコース濃度については、製造される甘味料組成物に備えさせるべき糖質濃度等に応じて適宜設定すればよいが、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造するという観点からは、Ｂｒｉｘ濃度として、通常３０～５０％、好ましくは３５～４５％が挙げられる。
　また、グルコース溶液には、水溶性のマグネシウム塩が含まれていてもよい。このように水溶性マグネシウム塩が含まれていることによって、アルロースエピメラーゼの安定化が可能になる。グルコース溶液に添加される水溶性のマグネシウム塩としては、食品製造上許容されるものであることを限度として特制限されないが、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。これらの水溶性のマグネシウム塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　グルコース溶液における水溶性のマグネシウム塩の含有量については、特に制限されないが、例えば１～５ｍＭ、好ましくは１．５～２．５ｍＭが挙げられる。
　グルコース溶液のｐＨについては、固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼが作用可能な範囲に適宜設定すればよいが、通常７．０～８．５、好ましくは７．８～８．０が挙げられる。グルコース溶液のｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を使用して行うことができる。
（グルコース溶液の通液条件）
　前記カラムへのグルコース溶液の通液条件については、カラムに充填されている固定化酵素の比活性、製造される甘味料組成物に備えさせるべきアルロースの含有比率等に応じて適宜調整すればよいが、製造される甘味料組成物におけるフラクトースとアルロースの含有比率をより一層効果的に高めるという観点から、通液するグルコース溶液の空間速度（ＳＶ）として、０．２～１．０、好ましくは０．３～０．５が挙げられる。
　特に、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの各比活性が前述する範囲を充足し、且つ通液するグルコース溶液の空間速度（ＳＶ）が前記範囲を満たすことによって、製造される甘味料組成物におけるフラクトースの含有比率が３７％以上且つアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３～４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。製造される甘味料組成物のフラクトースの含有比率が３７％を下回ると、既存の異性化糖製品の組成比と異なり、そのままでは異性化糖製品として利用できなくなり、更になる分離処理等が必要になることがある。また、製造される甘味料組成物のアルロースの含有比率が１３％を下回ると、グルコースとフラクトースの組成比が製造される甘味料組成物の付加価値が低くなってしまい、別途、アルロースの添加等が必要になることがある。
　また、空間速度を前述する範囲よりも高く設定すると、単位時間当たりの生産量が増加するが、空間速度が高すぎると、フラクトース及びアルロース含量比率が低くなる傾向が現れる。また、逆に、空間速度を前述する範囲よりも低く設定すると、単位時間当たりの生産量が減少し、製造効率が低下する傾向が現れる。即ち、本発明の製造方法において、前記カラムへ通液するグルコース溶液の空間速度を前記範囲に制御することにより、製造される甘味料組成物をそのまま異性化糖製品として利用可能になり、しかも付加価値の高いアルロースを効率的に高含有量で含有させることができ、更にその単位時間当たりの生産量を高めることができる。
　また、前記カラムにグルコース溶液を通液する際の温度条件については、カラムに充填されている固定化酵素が作用可能な範囲で適宜設定すればよいが、例えば、カラム内の温度として、４５～６５℃、好ましくは５５～６０℃が挙げられる。カラム内の温度の調節は、例えば、保温ジャケットを用いてカラムを加温する方法等が挙げられる。
工程Ｃ、及びその後の工程
　工程Ｃでは、前記カラムの流出液を採取する。斯して回収される流出液には、グルコース、フラクトース及びアルロースが含まれており、そのまま甘味料組成物として使用することができる。また、流出液のアルロースの含有比率が１３～１５％である場合には、該流出液は、高血糖や過体重（肥満）、メタボリックシンドロームなどを誘発するリスクが低い低カロリー甘味料組成物としてそのまま使用することができる。
　また、工程Ｃにおいて回収した流出液を、必要に応じて濃縮等を行い、含有する糖質濃度を高めてもよい。
　更に、工程Ｃで回収された流出液を、疑似移動床クロマトグラフィー等の分離処理に供することにより、グルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分を分取することもできる。このようにして得られるアルロースを含む画分は、アルロースの純度が９０％以上であり、カロリーゼロ、食後血糖上昇抑制、抗肥満等の生活習慣予防素材として利用することができる。また、グルコースとフラクトースの混合物を含む画分は、そのまま既存の異性化糖製品（グルコース：フラクトース＝５８：４２～５０：５０、重量比）として利用することができる。
　また、前記のアルロースを含む画分を、工程Ｃで回収された流出液に添加することによって、アルロース含有比率を更に高めた甘味料組成物を得ることもできる。アルロース含有比率を高めた甘味料組成物は、低カロリーでアルロースの機能が増強された甘味料として利用することができる。
　以下に実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下、「比活性の比率（Ｉ：Ｅ）」との表記は、「固定化グルコースイソメラーゼの比活性：固定化アルロースエピメラーゼの比活性」を意味する。また、「活性比率」、「酵素活性比率」及び「酵素活性の比率」についても、同義である。
製造例１
固定化酵素の調製と固定化酵素活性の測定
　市販の固定化グルコースイソメラーゼをナガセケムテックス社（製品名：スイターゼ　ＧＮ）より入手した。この製品は、グルコースイソメラーゼ活性を有する微生物を担体に固定化した顆粒状の製剤であり、膨潤後の比活性は１１０．４３Ｕ／ｍｌであった。
　固定化グルコースイソメラーゼを独自に調製する場合は、以下の手順で行った。先ず、５０ｍｌのイオン交換樹脂（ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ　Ａ１０３Ｓ）をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、４５００Ｕの液状グルコースイソメラーゼ（ダウ・ケミカル社製、製品名：Ｓｐｅｚｙｍｅ　Ｇｉｆｐ）を含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液してグルコースイソメラーゼを吸着させた。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化グルコースイソメラーゼを得た。斯して得られた固定化グルコースイソメラーゼの比活性は１０７．６５Ｕ／ｍｌであった。
　固定化アルロースエピメラーゼは、次の（１）～（３）に示す方法で調製した。（１）菌体培養と菌体回収：０．５％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　Ｍ３０を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。（２）粗酵素の抽出工程：得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。（３）粗酵素の固定化：湿潤状態のイオン交換樹脂（ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ　Ａ１０３Ｓ）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、４５００単位のＤ－アルロース－３－エピメラーゼを含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させ、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。固定化アルロースエピメラーゼの比活性は２９．５５Ｕ／ｍｌであった。
実施例１
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼを充填したカラムにグルコース溶液を通液して得られる甘味料組成物の確認（空間速度ＳＶ＝０．２条件下）
　製造例１で準備した市販の固定化グルコースイソメラーゼ又は独自に調製した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表１に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径３２ｍｍ、長さ３００ｍｍのガラス製カラムに充填した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．２となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析に供し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。
　得られた結果を表２に示す。表２に示す通り、流出液は、採取時間が違っても、ほぼ均一であり、グルコース、フラクトース及びアルロースの組成比（重量比）は４３．６：４１．３：１５．１～４３．４：４１．５：１５．１になっていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの混合比率が、グルコース、フラクトース及びアルロースの組成比に及ぼす影響（空間速度ＳＶ＝０．３～０．４条件下）
　製造例１で準備した市販の固定化グルコースイソメラーゼ又は独自に調製した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表３に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径３２ｍｍ、長さ３００ｍｍのガラス製カラムに充填した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．３～０．４となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３～４回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析に供し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。
　得られた結果を表４に示す。この結果から、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．２５：１～５．６１：１の範囲の場合には、流出液におけるアルロースの含有比率が１３％を超えており、アルロースの含有比率が高くなっていた。一方、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．２５未満：１、又は５．６１超：１の場合には、流出液におけるアルロースの含有比率は１３％に達していなかった。この結果から、流出液中のアルロースの含有比率を高めるには、カラムに充填する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率を１．２５：１～５．６１：１に設定する必要があることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例３
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの混合比率が、グルコース、フラクトース及びアルロースの比率に及ぼす影響（空間速度ＳＶ＝０．５条件下）
　空間速度ＳＶが高い条件下であってもアルロースの比率が１３％以上となる固定化酵素の活性比率を明らかにするために、以下の試験を行った。即ち、本試験では、単位時間当たりの生産量が高い効率的な製造方法の条件を検証した。
　製造例１で準備した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表５に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．５となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３～４回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析に供しし、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。
　得られた結果を表６に示す。この結果から、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が２．９４：１～３．７４：１の範囲内にある場合には、空間速度が０．５と高い場合であっても、アルロースの含有比率が１３％以上の流出液が安定に得られることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例４
異性化糖製品とアルロース製品の同時製造
　クロマトグラフ分離向け陽イオン交換樹脂（商品名：ＣＲ１３１０、オルガノ社製）４００ｍｌをジャケット付きの内径４２ｍｍ、長さ５００ｍｍのガラス製カラムに圧密充填して６０℃に保持したカラムに、実施例２の試験Ｎｏ.７で得られた流出液（グルコース
：フラクトース：アルロースの組成比＝４５．２：４０．３：１４．５）２１．８６ｇを注入し、溶離液としての純水をＳＶ＝１．５で通液した。溶離液通液開始から１５分後以降の溶出液を、フラクションコレクターを用いて、３０秒毎に８８フラクションに分離・採取した。各フラクションの溶液重量（ｇ）、Ｂｒｉｘ（％）を測定した後、その一部を、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ　ＣＫ０８ＥＣ　三菱化学社製）分析し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、各フラクションの組成比とした。
　これらの測定結果から、各フラクションに溶出したグルコース、フラクトース及びアルロースの固形分量（ｇ）をそれぞれ算出した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、フラクション１～４５とフラクション４６～８８の前後半で分離・採取すると、前半のフラクション１～４５側に、異性化糖（グルコース：フラクトース：アルロース＝５３．２：４５．６：１．２）を得ることができ、後半のフラクション４６～８８側に、純度９１．５％のアルロース（グルコース：フラクトース：アルロース＝１．５：７．０：９１．５）を得ることができることが分かった。即ち、本結果から、前記実施例１～３で得られた流出液を、イオン交換樹脂を用いて分画することにより、異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造できることが明らかとなった。

Claims (8)

  1. 　グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、
    １）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１～５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、
    ２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに
    ３）前記カラムの流出液を採取する工程Ｃ、
    を含むことを特徴とする、甘味料組成物の製造方法。
  2. 　前記工程Ｂにおいて、空間速度を０．２～１．０に設定してグルコース溶液の通液を行う、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記固定化グルコースイソメラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｌ以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記固定化アルロースエピメラーゼの比活性が２０Ｕ/ｍｌ以上である、請求項１～３
    のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　前記固定化アルロ－スエピメラーゼの固定化担体が、ポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　前記グルコース溶液が、更に水溶性マグネシウム塩を含む、請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 　前記工程Ｃで得られた流出液を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分とに別ける分離処理を行う分離工程、及び
    　前記分離工程で得られたアルロースを含む画分と前記工程Ｃで得られた流出液を混合する混合工程、
    を含む、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造する方法であって、
    　請求項１～６のいずれかに記載の製造方法を実施する第１工程、並びに
    　前記第１工程で得られた甘味料組成物を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分に別ける分離処理を行う第２工程、
    を含む、製造方法。
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