KR20170130357A - 알룰로오스 함유 감미료 조성물의 제조 방법 - Google Patents

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세이조 타카오카
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Abstract

본 발명의 목적은, 글루코오스에 대하여, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 작용시켜, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 그 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율을 높이는 기술을 제공하는 것이다. 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 고정화 해, 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1이 되도록 칼럼에 충진해, 그 칼럼에 글루코오스 용액을 통액함으로써, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하고, 한편 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 연속적이고 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

알룰로오스 함유 감미료 조성물의 제조 방법
본 발명은, 글루코오스를 원료로서, 효소학적으로 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 글루코오스를 원료로서, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 사용하여, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하고, 또한 알룰로오스의 비율이 높은 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
이성화당은, 호화 전분을 효소로 가수 분해하여 글루코오스 용액으로 하고, 여기에 글루코오스 이소메라아제를 작용(이성화 반응)시켜 제조되는, 글루코오스와 프룩토오스를 주성분으로 하는 감미료이다. 글루코오스 이소메라아제에 의한 이성화 반응은 평형 반응이며, 이성화당에 포함되는 프룩토오스의 배합은 통상 46% ~ 42%이다. 또한, 이성화당의 단맛 부족을 해소하기 위해, 정제 프룩토오스(상술한 이성화당에 포함되는 프룩토오스를 크로마토 분리하여 순도를 95% 정도까지 올린 것)를 첨가하는 경우가 있지만, 첨가 후의 이성화당에 포함되는 프룩토오스는, 통상 55% 정도이다.
이성화당은, 그 생산 비용의 저렴함에서 소프트 드링크나 다른 음료에 감미료로서 폭넓게 대량으로 사용되며, 예를 들면 일본에서는 연간 약 100만톤, 미국에서는 연간 약 800만톤 소비되고 있다. 그러나 한편으로, 이성화당은, 일본, 미국 등을 비롯한 선진국에서, 고혈당이나 과체중(비만), 대사 증후군(metabolic syndrome) 등의 원인으로 의심되고 있다(비 특허문헌 1). 프룩토오스의 간장에서의 대사는 글루코오스와 비교하여 지질 생성을 촉진하기 쉽고, 고지혈증이나 비만을 유발하기 쉽기 때문이다.
한편, 프룩토오스에 D-케토헥소오스·3-에피메라아제(특허문헌 1)를 작용시켜 생성되는 알룰로오스는, 별명을 프시코스라고 칭하는 희소당의 일종이며, 에너지 값이 제로(비 특허문헌 2), 식후 혈당 상승 억제 효과(비 특허문헌 3), 항 비만 효과(비 특허문헌 4) 등의 유용성이 보고되고 있으며, 생활 습관병 예방 소재로서 주목받고 있다. 그래서, 알룰로오스와 이성화당을 병용한 감미료 조성물은, 상술한 이성화당의 위험을 줄일 수 있을 것으로 기대되고 있다.
그러나, 종래의 알룰로오스의 제조 방법에서는, 미리 이성화당에서 크로마토 분리하여 정제한 프룩토오스를 출발 원료로서 사용하기 때문에, 제조 공정이 복잡하며, 원료 비용, 반응 비용, 플랜트 운전 비용이 높아, 알룰로오스의 효율적인 공업 생산은 곤란했다.
그래서, 알룰로오스와 이성화당을 병용한 감미료 조성물을 간이하게 제조하는 방법으로서, 글루코오스에 대하여, 글루코오스 이소메라아제와 D-케토헥소오스·3-에피메라아제를 작용시키는 방법이 제안되고 있다. 예를 들면, 비 특허문헌 5 및 특허문헌 2에는, 글루코오스 용액에 대하여, 비 고정화 글루코오스 이소메라아제, 고정화 글루코오스 이소메라아제 또는 고정화 글루코오스 이소메라아제 균체와, 고정화 D-케토헥소오스·3-에피메라아제 또는 비 고정화 D-케토헥소오스·3-에피메라아제를, 동시에 또는 연속적으로 작용시킴으로써, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 함유하는 감미료를 제조할 수 있는 것이 개시되어 있다. 그러나, 비 특허문헌 5 및 특허문헌 2에 개시되어 있는 회분(batch)식 제조에서는 알룰로오스의 함유 비율을 높일 수 있어도, 지속적인 제조에서는 알룰로오스의 함유 비율이 낮아지게 되는 단점이 있다.
또한, 특허문헌 3에는, 아그로박테리움·투메파시엔스 유래의 프시코스 에피메라아제 활성을 갖는 재조합 미생물을 알긴산에 고정화한 고정화 효소와, 고정화 글루코오스 이소메라아제를 이용하여, 글루코오스에서 프시코스를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 특허문헌 3에서는, 프시코스의 함유 비율을 높이는 제어 인자로서, 글루코오스 농도 및 반응 온도가 검토되는 데에 그쳐, 그 외의 제어 인자에 대해서는 고려되고 있지 않다. 또한, 특허문헌 3에서는, 고정화 글루코오스 이소메라아제와 알긴산염으로 고정화한 프시코스 에피메라아제 활성을 갖는 재조합 미생물을 각각 다른 칼럼에 충진하여 사용하고 있지만, 이것은, 고정화한 양 효소의 물성이 서로 다르기 때문에, 양 효소를 같은 칼럼에 균질로 충진하여 사용하는 것이 곤란하다는 것, 및 같은 칼럼에 충진했을 경우의 효소 반응 제어가 곤란하다는 것을 반영하고 있다.
일본 공개특허 평6-125776호 국제 공개특허 제2008/142860호 일본 등록특허 제2013-501519호
Am. J. Clin. Nutr. , 79,774-779,2004. J. Nutri. Sci. Vitaminol. , 48,77-80,2002. J. Nutri. Sci. Vitaminol. , 54,511-514,2008. Int. J. food Sci. Nutri. , 65,245-250,2014. J. Ferment. Bioeng. , 80,101-103,1995.
본 발명자들은, 알룰로오스가, 글루코오스 이소메라아제에 의한 글루코오스의 프룩토오스로의 이성화 반응을 저해하는 것을 발견하였으며, 글루코오스에 대하여, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 작용시켜 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 얻기 위해서는, 그 저해의 영향을 최소한으로 막는 것이 중요해진다.
이러한 배경하에서, 본 발명은, 글루코오스에 대하여, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 작용시켜, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물을 제조하는 방법에서, 그 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율을 높이는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제를 고정화해, 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1이 되도록 칼럼에 충진하고, 당해 칼럼에 글루코오스 용액을 통액함으로써, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하고, 또한 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 연속적이며 효율적으로 제조할 수 있는 것을 현출했다. 또한, 이러한 조건에서의 제조에 있어서, 글루코오스 용액의 칼럼 통액 시의 공간 속도를 0.2 ~ 1.0으로 설정함으로써, 보다 한 층 효율적으로 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율을 향상시켜 얻을 수 있는 것을 현출했다. 본 발명은, 이러한 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭함으로써 완성한 것이다.
즉, 본 발명은, 하기에 제시하는 양태의 발명을 제공한다.
항 1. 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물의 제조 방법으로서,
1) 고정화 글루코오스 이소메라아제 및 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1로 되도록 충진한 칼럼을 준비하는 공정 A;
2) 글루코오스 용액을 상기 칼럼에 통액하여 효소 반응을 실시하는 공정 B; 및
3) 상기 칼럼의 유출액을 채취하는 공정 C;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 2. 제 1항에 있어서,
상기 공정 B에 있어서, 공간 속도를 0.2 ~ 1.0으로 설정하여 글루코오스 용액의 통액을 실시하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성이 100U/ml 이상인, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성이 20U/ml 이상인, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 고정화 담체가, 폴리스티렌계의 약 염기성 음이온 교환 수지인, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 글루코오스 용액이, 수용성 마그네슘염을 더 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공정 C에서 얻은 유출액을, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 획분과, 알룰로오스를 포함하는 획분으로 나누는 분리 처리를 실시하는 분리 공정; 및
상기 분리 공정에서 얻은 알룰로오스를 포함하는 획분과 상기 공정 C에서 얻은 유출액을 혼합하는 혼합 공정;
을 더 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
항 8. 이성화당 제품과 알룰로오스 제품을 동시에 제조하는 방법으로서,
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법을 실시하는 제 1공정;및
상기 제 1 공정에서 얻은 감미료 조성물을, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 획분과, 알룰로오스를 포함하는 획분으로 나누는 분리 처리를 더 실시하는 제 2공정;
을 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 글루코오스 용액을 소정의 칼럼에 통액하는 간이한 방법에 의해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하고, 또한 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 연속적으로 제조하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 일 양태에서는, 알룰로오스의 함유 비율이 13% 정도 이상의 감미료 조성물을 효율적으로 제조할 수 있기 때문에 칼로리 제로, 식후 혈당 상승 억제, 항 비만 등의 효과를 소구하는 생활 습관병 예방 소재가 될 수 있는 감미료 조성물을 저렴하게 제공할 수 있는 것도 가능해진다. 게다가, 본 발명의 일 양태에서는, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 함유 비율이 50 : 37 : 13 ~ 43 : 42 : 15의 감미료 조성물을 얻을 수 있기 때문에, 그 감미료 조성물을 분리 처리에 제공하여 글루코오스 및 프룩토오스 함유 획분과 알룰로오스 함유 획분으로 분획하는 간이한 방법으로, 기존의 이성화당 제품과 고순도 알룰로오스 제품을 동시에 얻을 수 있는 것도 가능해진다.
또한, 본 발명의 제조 방법은, 고정화 효소를 충진한 칼럼에 글루코오스 용액을 통액하는 간이한 방법으로 할 수 있으며, 기존의 이성화당 설비를 그대로 전용할 수 있기 때문에, 설비 투자의 부담은 극히 적다는 장점도 있다.
도 1은 실시예 1의 시험 No. 6에서 얻은 유출액을 크로마토 분리하여, 각 분획에 포함된 글루코오스, 프축토오스 및 알룰로오스의 양을 측정한 결과이다.
본 발명의 제조 방법은, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물의 제조 방법으로서, 1) 고정화 글루코오스 이소메라아제 및 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 효소 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5. 61 : 1이 되도록 충진한 칼럼을 준비하는 공정 A, 2) 글루코오스 용액을 상기 칼럼에 통액하여 효소 반응을 실시하는 공정 B, 및 3) 상기 칼럼 유출액으로부터, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 획분을 채취하는 공정 C를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 발명의 제조 방법에 대해 상술한다.
정의
본 발명에서, 「글루코오스 이소메라아제의 효소 활성(U)」은, 글루코오스를 기질로서, 반응 온도 55℃에서 반응시켜, 1분간에 1μmol의 프룩토오스을 생성하는 효소력을 1단위로 한 것이다. 구체적으로는, 2mM의 황산 마그네슘을 포함하는 50mM의 인산 완충액(pH8.0)으로 용해한 0.2M의 글루코오스 용액 2500μl, 2mM의 황산 마그네슘을 포함하는 50mM의 인산 완충액(pH8.0) 2167μl 및 글루코오스 이소메라아제 333μl를 스크류 캡이 달린 시험관에 투입하고, 온수욕에 담가 55℃에서 15분간 반응시킨다. 5 질량%의 염산 수용액을 첨가하여 pH3.0 ~ 2.5로 조정하여 효소를 실활(失活)시켜, 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과한 후, HPLC 분석한다. 생성한 프룩토오스의 피크 면적비를 이용하여 효소 활성을 산출한다.
본 발명에서, 「알룰로오스 에피메라아제의 효소 활성(U)」은, 알룰로오스를 기질로서, 반응 온도 55℃에서 반응시켜, 1분간에 1μmol의 프룩토오스을 생성하는 효소력을 1단위로 한 것이다. 구체적인 측정 순서는, 기질이 알룰로오스인 것 이외, 상기의 글루코오스 이소메라아제의 효소 활성의 경우와 마찬가지이다.
본 발명에서, 「고정화 글루코오스 이소메라아제의 비(比)활성(U/ml)」은, 「일본 공업 규격 공업용 글루코오스 이소메라아제 K7002-1988」 에 기재된 최대 활성의 측정 방법에 준하여 측정되는 값이다. 구체적으로는, 2mM의 황산 마그네슘과 탄산 나트륨을 첨가하여, pH7.8 ~ 8.0으로 조정한 45 질량% 글루코오스 용액을 준비한다. 4℃에서 하루 밤낮 팽윤시킨 고정화 글루코오스 이소메라아제를 30ml 양으로 취하여, 여기에 상기 글루코오스 용액 100ml를 가하고, 온수욕에 담가 50℃로 유지하면서 감압하여 30분 이상 탈기한다. 이것을 재킷이 붙은 내경 20mm, 길이 400mm의 유리제 칼럼에 충진한 후에, 재킷 온도 55℃에서 상기 글루코오스 용액을 송액 펌프를 이용하여 하향류로 통액한다. 유출액을 채취해, 그 일부를 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과 후, HPLC 분석하여, 생성한 프룩토오스의 피크 면적비로부터 이성화율을 구한다. 이때, 이성화율이 0.39 ~ 0.44의 범위에 들어가도록 유속을 설정한다. 그리고, 다음의 식에 의해 고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성을 구한다.
E = (FS/W) 0.50ln {0.50/(0.50-X)}
E : 비활성 (U/ml)
F : 유속 (ml/min)
S : 글루코오스 용액에서의 글루코오스 농도 (μmol/ml)
W : 고정화 글루코오스 이소메라아제의 용량 (ml)
X : 이성화율
본 발명에서, 「고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성(U/ml)」은, 글루코오스의 대신에 프룩토오스를 사용하는 것 이외는, 상기의 고정화 글루코오스 이소메라아제의 효소 활성의 측정 방법에 준하여 측정되는 값이다. 구체적으로는, 2mM의 황산 마그네슘과 탄산 나트륨을 첨가하여, pH7.8 ~ 8.0으로 조정한 45 질량%의 프룩토오스 용액을 준비한다. 4℃에서 하루 밤낮 팽윤시킨 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 30ml 양으로 취하여, 여기에 상기 프룩토오스 용액 100ml를 가하고, 온수욕에 담가 50℃로 유지하면서 감압하여 30분 이상 탈기한다. 이것을 재킷이 붙은 내경 20mm, 길이 400mm의 유리제 칼럼에 충진한 후에, 재킷 온도 55℃에서 상기 프룩토오스 용액을 송액 펌프를 이용하여 하향류로 통액한다. 유출액을 채취해, 그 일부를 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과 후, HPLC 분석하여, 생성한 알룰로오스의 피크 면적비로부터 이성화율을 구한다. 이때, 이성화율이 0.21 ~ 0.24의 범위에 들어가도록 유속을 설정한다. 그리고, 다음의 식에 의해 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성을 구한다.
E = (FS/W) 0.27ln {0.27/(0.27-X)}
E : 비활성 (U/ml)
F : 유속 (ml/min)
S : 프룩토오스 용액에서의 프룩토오스 농도 (μmol/ml)
W : 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 용량 (ml)
X : 이성화율
본 발명에서, 감미료 조성물에서의 각 당질(글루코오스, 프룩토오스, 알룰로오스)의 함유 비율은, 글루코오스, 프룩토오스, 및 알룰로오스의 총 질량(100%) 당, 각 당질이 차지하는 질량의 비율(%)이다.
본 발명에서, 「공간 속도(SV)」는, 용액을 칼럼에 통액하는 속도의 단위이며, 「공간 속도(SV)= 통액량(ml)/칼럼 체적(ml)/시간(h)」에서 산출된다.
공정 A
공정 A에서는, 고정화 글루코오스 이소메라아제 및 고정화 알룰로오스 에피 메라아제의 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1이 되도록 충진한 칼럼을 준비한다.
(고정화 글루코오스 이소메라아제)
글루코오스 이소메라아제는, D-글루코오스와 D-프룩토오스와의 상호 변환을 촉매할 수 있는 효소이다. 본 발명에서 사용되는 글루코오스 이소메라아제의 유래에 대해서는, 특별히 제한되지 않고, 미생물, 동물 및 식물 등 중 어느 유래여도 좋다. 글루코오스 이소메라아제의 유래 미생물로는, 예를 들면, Bacillus coagulans, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces rubinosus, Streptomyces murinus 등이 예시된다. 또한, 본 발명에서 사용되는 글루코오스 이소메라아제는, 상기 생물로부터 단리한 것이어도 좋고, 또한 유전자 공학적 방법에 의해 제조된 재조합체여도 좋다. 고정화되지 않은 글루코오스 이소메라아제는, 예를 들면, 다우·케미칼사 등으로부터 시판되고 있으며, 본 발명에서는 시판품의 글루코오스 이소메라아제를 고정화하여 사용하여도 좋다.
또한, 본 발명에서 고정화 글루코오스 이소메라아제로서, 정제품 또는 조정제품(粗精製品)의 글루코오스 이소메라아제를 고정화한 것을 사용하여도 좋고, 또한 글루코오스 이소메라아제를 생산하는 미생물을 고정화한 것을 사용하여도 좋다.
글루코오스 이소메라아제의 고정화에 사용되는 고정화용 담체에 대해서는, 당해 효소의 고정화가 가능한 것을 한도로써, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 이온 교환 수지, 폴리비닐 알코올, 폴리프로필렌, 아크릴, 키토산, 소수성 흡착 수지, 킬레이트 수지, 합성 흡착 수지 등의 유기 고분자 담체; 셀라이트, 규조토, 카올리나이트, 실리카겔, 분자체(molecular sieve), 다공질 유리, 활성탄, 세라믹 등의 무기 담체 등을 들 수 있다. 또한, 미생물을 고정화 효소로서 사용할 경우는, 4급화 피리딘 화합물(예를 들면 전기 화학 공업 주식회사제의 상품명 DAC)이나 알긴산염을 고정화용 담체로서 사용할 수 있다. 이러한 고정화용 담체는, 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 또한 2종 이상을 조합하여 사용하여도 좋다. 이러한 고정화용 담체 중에서도, 고정화에 의한 글루코오스 이소메라아제의 활성 유지, 저렴하고 압력 손실이 적고 취급이 용이함 등의 관점에서, 바람직하게는 이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 약 염기성 음이온 교환 수지, 더욱 바람직하게는 폴리스티렌계 약 염기성 음이온 교환 수지를 들 수 있다.
고정화 글루코오스 이소메라아제는, 글루코오스 이소메라아제 또는 그것을 생산하는 미생물을 공지의 방법으로 고정화용 담체에 고정화함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 고정화용 담체로서 이온 교환 수지를 사용하여 글루코오스 이소메라아제를 고정하려면, 이하의 순서에 따라 실시할 수 있다. 이온 교환 수지를 칼럼에 충진하고, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 소정 농도로 희석 한 글루코오스 이소메라아제 용액을, 1 ~ 16시간 정도, 순환하면서 흡착시킨다. 이어서, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정해, 고정화 글루코오스 이소메라아제를 얻는다. 또한, 이러한 글루코오스 이소메라아제를 고정화한 후에, 필요에 따라, 글루타르알데히드나 폴리에틸렌이민 등으로 가교시켜, 글루코오스 이소메라아제의 고정화를 공고히 하여도 좋다.
고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성에 대해서는, 후술하는 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제와의 효소 활성의 비율을 충족하는 범위에서 적절히 설정하면 좋지만, 제조되는 감미료 조성물에서 알룰로오스의 함유 비율을 보다 한 층 향상시킨다는 관점에서, 100U/ml 이상, 바람직하게는 100 ~ 150U/ml, 더욱 바람직하게는 100 ~ 200U/ml을 들 수 있다. 특히, 고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성이 상술하는 범위를 충족하고, 더욱이 공정 B에서의 글루코오스 용액을 통액할 때의 공간 속도를 후술하는 범위로 설정함으로써, 제조되는 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율이 13% 이상으로 되어, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 함유 비율이 50 : 37 : 13 ~ 43 : 42 : 15의 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다.
(고정화 알룰로오스 에피메라아제)
알룰로오스 에피메라아제는, D-프룩토오스와 알룰로오스와의 상호 변환을 촉매할 수 있는 효소이다. 본 발명에서 사용되는 알룰로오스 에피메라아제의 유래에 대해서는, 특별히 제한되지 않고, 미생물, 동물 및 식물 등 중 어느 유래여도 좋다. 예를 들면, 알룰로오스 에피메라아제는, Arthrobacter globiformis M30주(기탁 번호 NITE BP-1111)에 의해 생산되는 것으로 알려져 있으며, 본 발명에서는, 그 미생물 유래의 알룰로오스 에피메라아제를 사용할 수 있다. 알룰로오스 에피메라아제의 유래 미생물로는, 예를 들면, Pseudomonus cichorii, Agrobacterium tumefaciens, Clostridium sp, Clostridium scindens, Clostridium bolteae, Ruminococcus sp, Clostridium cellulolyticum 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 알룰로오스 에피메라아제는, 상기 생물로부터 단리한 것이어도 좋고, 또한 유전자 공학적 방법에 의해 제조된 재조합체여도 좋다.
또한, 본 발명에서 고정화 알룰로오스 에피메라아제로서, 정제품 또는 조정제품(粗精製品)의 알룰로오스 에피메라아제를 고정화한 것을 사용하여도 좋고, 또한 알룰로오스 에피메라아제를 생산하는 미생물을 고정화한 것을 사용하여도 좋다.
알룰로오스 에피메라아제의 고정화에 사용되는 고정화용 담체에 대해서는, 당해 효소의 고정화가 가능한 것을 한도로써, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 이온 교환 수지, 폴리비닐 알코올, 폴리프로필렌, 아크릴, 키토산, 소수성 흡착 수지, 킬레이트 수지, 합성 흡착 수지 등의 유기 고분자 담체; 셀라이트, 규조토, 카올리나이트, 실리카겔, 분자체(molecular sieve), 다공질 유리, 활성탄, 세라믹 등의 무기 담체 등을 들 수 있다. 또한, 미생물을 고정화 효소로서 사용할 경우는, 4급화 피리딘 화합물(예를 들면 전기 화학 공업 주식회사제의 상품명 DAC)이나 알긴산염을 고정화용 담체로서 사용할 수 있다. 이러한 고정화용 담체는, 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 또한 2종 이상을 조합하여 사용하여도 좋다. 이러한 고정화용 담체 중에서도, 고정화에 의한 알룰로오스 에피메라아제의 활성 유지, 저렴하고 압력 손실이 적고 취급이 용이함 등의 관점에서, 바람직하게는 이온 교환 수지, 보다 바람직하게는 폴리스티렌 디비닐벤젠계의 약 염기성 음이온 교환 수지를 들 수 있다. 약 염기성 음이온 교환 수지의 이온 교환기로는, 예를 들면 3급 아민을 들 수 있다.
고정화 알룰로오스 에피메라아제는, 알룰로오스 에피메라아제 또는 그것을 생산하는 미생물을 공지의 방법으로 고정화용 담체에 고정화함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 고정화용 담체로서 이온 교환 수지를 사용하여, Arthrobacter globiformis 유래의 알룰로오스 에피메라아제를 고정하려면, 이하의 순서에 따라 실시할 수 있다. 먼저, 0.5% D-알룰로오스를 포함하는 최소 염 배지(MSM: Minimal Salts Medium)에 Arthrobacter globiformis을 식균하여, 배양을 실시한다. 얻어진 배양액으로부터 원심 분리에 의해 균체를 회수해, 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한다. 이어서, 세정한 균체를 50mM 인산 완충액(pH8.0)에 현탁해, 거기에 습윤 균체 중량당 10 중량% 정도의 라이소자임 및 습윤 균체 중량당 5 중량% 정도의 염화나트륨을 더하여, 37℃에서 120분간 정도 가열하여 효소의 추출 반응을 실시한다. 그 후, 더욱 55℃에서 15분간 정도 가열을 실시해, 비 내열성의 효소를 실활시켜, 원심 분리 상청을 회수해, 조(粗)효소액으로 한다. 별도, 이온 교환 수지를 칼럼에 충진해, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 희석한 상기 조효소 용액을, 1시간 ~ 16시간 정도, 순환하면서 이온 교환 수지에 통액하여 효소를 흡착시킨다. 이어서, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정해, 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 얻는다. 또한, 이와 같이 알룰로오스 에피메라아제를 고정화한 후에, 필요에 따라, 글루타르알데히드나 폴리에틸렌이민 등으로 가교시켜, 알룰로오스 에피메라아제의 고정화를 공고히 하여도 좋다.
고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성에 대해서는, 후술하는 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제와의 효소 활성의 비율을 충족하는 범위에서 적절히 설정하면 좋지만, 제조되는 감미료 조성물에서 알룰로오스의 함유 비율을 보다 한 층 향상시킨다는 관점에서, 20U/ml 이상, 바람직하게는 20 ~ 150U/ml, 더욱 바람직하게는 25 ~ 80U/ml을 들 수 있다. 특히, 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성이 상술하는 범위를 충족하고, 더욱이 공정 B에서의 글루코오스 용액을 통액할 때의 공간 속도를 후술하는 범위로 설정함으로써, 제조되는 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율이 13% 이상으로 되어, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 함유 비율이 50 : 37 : 13 ~ 43 : 42 : 15의 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다.
(고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제 칼럼에의 충진)
본 발명에서, 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제는, 각각 다른 고정화용 담체에 고정화되어, 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제가 혼합되어 동일한 칼럼에 충진되어 있어도 좋고, 또한, 동일한 고정화용 담체에 글루코오스 이소메라아제 및 알룰로오스 에피메라아제의 쌍방을 고정화 해, 이 칼럼에 충진되어 있어도 좋다.
본 발명에서는, 고정화 글루코오스 이소메라아제 : 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율(고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성 : 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성)이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1이 되도록, 양 고정화 효소를 동일한 칼럼에 충진한다. 이와 같은 비율로 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 병용함으로써, 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다. 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 상기 범위에서 벗어나는 경우에는, 제조되는 감미료 조성물에서의 알룰로오스의 함유 비율이 저하하고, 그 알룰로오스의 함유 비율을 높이기 위해서는 통액 시의 공간 속도를 극단적으로 낮출 필요가 있으며, 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 효율적으로 제조할 수 없게 된다.
보다 한 층 효율적으로 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 제조한다는 관점에서, 고정화 글루코오스 이소메라아제 : 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율로서, 바람직하게는 2.94 : 1 ~ 3.74 : 1을 들 수 있다.
공정 B
공정 B에서는, 글루코오스 용액을 상기 칼럼에 통액하여 효소 반응을 실시한다. 글루코오스 용액을 상기 칼럼에 통액함으로써, 글루코오스의 일부가 글루코오스 이소메라아제의 작용을 받아 프룩토오스로 가역적으로 변환되며, 나아가 생성된 프룩토오스의 일부가 알룰로오스 에피메라아제의 작용을 받아 알룰로오스로 가역적으로 변환된다. 본 발명의 제조 방법으로는, 글루코오스 이소메라아제와 알룰로오스 에피메라아제에 의한 효소 반응이 하나의 칼럼 내에서 가역적 · 연속적으로 진행하기 위해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료를 효율적으로 제조할 수 있다.
(글루코오스 용액)
글루코오스 용액은, 기질이 되는 글루코오스를 물에 용해시킨 용액이다. 글루코오스 용액에 사용되는 글루코오스의 유래에 대해서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 전분을 효소로 가수 분해 · 정제하여 얻은 글루코오스를 들 수 있다.
글루코오스 용액의 글루코오스 농도에 대해서는, 제조되는 감미료 조성물에 구비시켜야 할 당질 농도 등에 따라 적절히 설정하면 좋지만, 알룰로오스의 함유 비율이 높은 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 관점에서, Brix 농도로서, 통상 30 ~ 50%, 바람직하게는 35 ~ 45%를 들 수 있다.
또한, 글루코오스 용액에는, 수용성 마그네슘염을 포함하고 있어도 좋다. 이러한 수용성 마그네슘염이 포함되어 있음으로써, 알룰로오스 에피메라아제의 안정화가 가능하게 된다. 글루코오스 용액에 첨가되는 수용성의 마그네슘염으로는, 식품 제조상 허용되는 것인 것을 한도로서 특히 제한되지 않지만, 황산 마그네슘, 염화 마그네슘 등을 들 수 있다. 이러한 수용성의 마그네슘염은, 1종 단독으로 사용하여도 좋고, 또한 2종 이상을 조합하여 사용하여도 좋다.
글루코오스 용액에서의 수용성 마그네슘염의 함유량은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 1 ~ 5mM, 바람직하게는 1.5 ~ 2.5mM를 들 수 있다.
글루코오스 용액의 pH에 대해서는, 고정화 글루코오스 이소메라아제 및 고정화 알룰로오스 에피메라아제가 작용 가능한 범위로 적절히 설정하면 되지만, 통상 7.0 ~ 8.5, 바람직하게는 7.8 ~ 8.0을 들 수 있다. 글루코오스 용액의 pH의 조정은, 공지의 pH 조정제를 사용하여 실시할 수 있다.
(글루코오스 용액의 통액 조건)
상기 칼럼에 글루코오스 용액의 통액 조건에 대해서는, 칼럼에 충진되어 있는 고정화 효소의 비활성, 제조되는 감미료 조성물에 구비시켜야 할 알룰로오스의 함유 비율 등에 따라 적절히 조정하면 좋지만, 제조되는 감미료 조성물에서의 프룩토오스와 알룰로오스의 함유 비율을 보다 한 층 효과적으로 높인다는 관점에서, 통액하는 글루코오스 용액의 공간 속도(SV)로서, 0.2 ~ 1.0, 바람직하게는 0.3 ~ 0.5를 들 수 있다.
특히, 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 각 비활성이 상술하는 범위를 충족하고, 또한 통액하는 글루코오스 용액의 공간 속도(SV)가 상기 범위를 충족함으로써, 생산되는 감미료 조성물에서의 프룩토오스의 함유 비율이 37% 이상 또한 알룰로오스의 함유 비율이 13% 이상이 되어, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 함유 비율이 50 : 37 : 13 ~ 43 : 42 : 15의 감미료 조성물을 효율적으로 제조하는 것이 가능하게 된다. 제조되는 감미료 조성물의 프룩토오스의 함유 비율이 37%를 밑돌면, 기존의 이성화당 제품의 조성비와 달리, 그대로는 이성화당 제품으로서 이용할 수 없으며, 더하여 분리 처리 등이 필요할 수 있다. 또한, 제조되는 감미료 조성물의 알룰로오스의 함유 비율이 13%를 밑돌면, 글루코오스와 프룩토오스의 조성비가 제조되는 감미료 조성물의 부가가치를 낮아지게 하여, 별도, 알룰로오스의 첨가 등이 필요할 수 있다.
또한, 공간 속도를 상술하는 범위보다도 높게 설정하면, 단위 시간당의 생산량이 증가하지만, 공간 속도가 너무 높으면, 프룩토오스 및 알룰로오스 함유 비율이 낮아지게 되는 경향이 나타난다. 또한, 역으로, 공간 속도를 상기 범위보다도 낮게 설정하면. 단위 시간당의 생산량이 감소하고, 제조 효율이 저하하는 경향이 나타난다. 즉, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 칼럼에 통액하는 글루코오스 용액의 공간 속도를 상기 범위로 제어함으로써, 생산되는 감미료 조성물을 그대로 이성화당 제품으로서 이용 가능하며, 게다가 부가가치가 높은 알룰로오스를 효율적으로 고함량으로 함유시킬 수 있으며, 또한 그 단위 시간당의 생산량을 높일 수 있다.
또한, 상기 칼럼에 글루코오스 용액을 통액할 때의 온도 조건에 대해서는, 칼럼에 충진되어 있는 고정화 효소가 작용 가능한 범위에서 적절히 설정하면 좋지만, 예를 들면, 칼럼의 온도로서, 45 ~ 65℃, 바람직하게는 55 ~ 60℃를 들 수 있다. 칼럼 내의 온도의 조절은, 예를 들면, 보온 재킷을 이용하여 칼럼을 가열하는 방법 등을 들 수 있다.
공정 C, 및 그 후의 공정
공정 C에서는, 상기 칼럼 유출액을 채취한다. 이리하여 회수되는 유출액은, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스가 포함되어 있으며, 그대로 감미료 조성물로서 사용할 수 있다. 또한, 유출액의 알룰로오스의 함유 비율이 13 ~ 15%일 경우에는, 그 유출액은, 고혈당이나 과체중(비만), 대사 증후군 등을 유발할 위험이 낮은 저칼로리 감미료 조성물로서 그대로 사용할 수 있다.
또한, 공정 C에서 회수한 유출액을, 필요에 따라 농축 등을 실시하여, 함유하는 당질 농도를 높여도 좋다.
또한, 공정 C에서 회수된 유출액을, 유사이동층 크로마토그래피 등의 분리 처리에 제공함으로써, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 분획과 알룰로오스를 포함하는 분획을 분취할 수 있다. 이렇게 해서 얻어지는 알룰로오스를 포함하는 분획은, 알룰로오스의 순도가 90% 이상이며, 칼로리 제로, 식후 혈당 상승 억제, 항 비만 등의 생활 습관 예방 소재로서 이용할 수 있다. 또한, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 분획은, 그대로 기존의 이성화당 제품(글루코오스 : 프룩토오스 = 58 : 42 ~ 50 : 50 중량비)으로서 이용할 수 있다.
또한, 상기의 알룰로오스를 포함한 분획을, 공정 C에서 회수된 유출액에 첨가하여 알룰로오스 함유 비율을 더욱 높인 감미료 조성물을 얻을 수 있다. 알룰로오스 함유 비율을 높인 감미료 조성물은, 저칼로리로 알룰로오스 기능이 증강된 감미료로서 사용할 수 있다.
{실시예{
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하, 「비활성의 비율(I : E)」이라는 표기는, 「고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성 : 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성」을 의미한다. 또한, 「활성 비율」, 「효소 활성 비율」 및 「효소 활성의 비율」에 대하여도, 같은 뜻이다.
제조예 1. 고정화 효소의 제조와 고정화 효소 활성의 측정
시판의 고정화 글루코오스 이소메라아제를 나가세 켐텍스사(제품명: 스이타제 GN)로부터 입수했다. 이 제품은, 글루코오스 이소메라아제 활성을 갖는 미생물을 담체에 고정화한 과립상의 제제이며, 팽윤 후의 비활성은 110.43U/ml 였다.
고정화 글루코오스 이소메라아제를 직접 조제하는 경우는, 이하의 순서로 실시했다. 먼저, 50ml의 이온 교환 수지(퓨로라이트사제, 상품명: PUROLITE A103S)를 칼럼에 충진하고, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세척한 후, 4500U의 액상 글루코오스 이소메라아제(다우 케미칼사제, 제품명: Spezyme Gifp)를 포함하는 500ml의 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액 (pH 8.0)을, 4℃에서 16시간, 순환하면서 이온 교환 수지에 통액하여 글루코오스 이소메라아제를 흡착시켰다. 이어서, 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세정하고, 고정화 글루코오스 이소메라아제를 얻었다. 이리하여 얻어진 고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성은 107.65U/ml 였다.
고정화 알룰로오스 에피메라아제는, 다음의 (1) ~ (3)으로 나타내는 방법으로 제조했다. (1) 균체 배양 및 균체 회수: 0.5%의 알룰로오스를 포함한 최소 염 배지(MSM: Minimal Salts Medium) 4L에 Arthrobacter globiformis M30을 식균하고, 발효조(jar fermentor)를 이용하여 30℃에서 24시간, 교반 속도 400rpm, 통기량 분당 0.10L/배지 L로 배양했다. 이 배양액으로부터 원심 분리에 의해 균체 100g(습중량)을 회수하고, 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세정했다. (2) 조효소의 추출 공정: 얻어진 균체 100g(습중량)을 50mM 인산 완충액(pH 8.0) 1000ml에 현탁하고, 거기에 10g 난백 라이소자임(식품 첨가물, 큐피사제) 및 5g 염화나트륨을 더해, 37℃에서 120분간 가열함으로써, 효소의 추출 반응을 수행했다. 그 후, 더욱 55℃에서 15분간 가열하고, 원심 분리(12000rpm, 30분)에 의해 얻어지는 상청을 조효소액으로 했다. (3) 조효소의 고정화: 습윤 상태의 이온 교환 수지(퓨로라이트사제, 상품명: PUROLITE A103S) 50ml를 칼럼에 충진하고, 2mM 황산 마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 4500 단위의 D-알룰로오스-3-에피메라아제를 포함하는 500ml의 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH 8.0)을 4℃에서 16시간, 순환하면서 이온 교환 수지에 통액하여 효소를 흡착시켜, 2mM 황산 마그네슘 함유 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 세정하여 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 얻었다. 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성은 29.55U/ml 였다.
실시예 1. 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제를 충진 한 칼럼에 글루코오스 용액을 통액하여 얻어지는 감미료 조성물의 확인(공간 속도 SV = 0.2 조건 하)
제조예 1에서 준비한 시판의 고정화 글루코오스 이소메라아제 또는 독자적으로 조제한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제를, 표 1에 나타내는 양 및 활성 비율이 되도록 균일 혼합하여, 재킷이 붙은 내경 32mm, 길이 300mm의 유리제 칼럼에 충진했다.
Figure pct00001
2mM의 황산 마그네슘 및 탄산 나트륨을 첨가하여 pH 7.8 ~ 8.0으로 조정한 35 질량%의 글루코오스 용액을 준비했다. 상기 칼럼에 글루코오스 용액을 재킷 온도 50℃, 공간 속도(SV)가 0.2로 되도록 제어하면서, 상향류에서 연속적으로 통액했다. 유출액을 24시간 간격으로 3회 채취하고, 채취마다 액량과 채취 시간으로부터 공간 속도 SV를 구했다. 다음으로, 채취한 각 유출액의 일부를, 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과 후, HPLC(분석 칼럼: MCIGEL CK08EC 미쓰비시화학사제) 분석에 제공해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 피크 면적비를 구해, 반응 생성물의 조성비를 산출했다.
얻어진 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 유출액은, 채취 시간이 달라도, 거의 균일하며, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 조성비(중량비)는 43.6 : 41.3 : 15.1 ~ 43.4 : 41.5 : 15.1로 되어 있었다.
Figure pct00002
실시예 2. 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 혼합 비율이, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 조성비에 미치는 영향(공간 속도 SV = 0.3 ~ 0.4 조건 하)
제조예 1에서 준비한 시판의 고정화 글루코오스 이소메라아제 또는 독자적으로 조제한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제를, 표 3에 나타내는 양 및 활성 비율이 되도록 균일 혼합하여, 재킷이 붙은 내경 32mm, 길이 300mm의 유리제 칼럼에 충진했다.
Figure pct00003
2mM의 황산 마그네슘 및 탄산나트륨을 첨가하여 pH 7.8 ~ 8.0으로 조정한 35질량%의 글루코오스 용액을 준비했다. 상기 칼럼에 글루코오스 용액을 재킷 온도 50℃, 공간 속도(SV)가 0.3 ~ 0.4가 되도록 제어하면서, 상향류에서 연속적으로 통액했다. 유출액을 24시간 간격으로 3 ~ 4회 채취하고, 채취마다 액량과 채취 시간으로부터 공간 속도 SV를 구했다. 이어서, 채취한 각 유출액의 일부를, 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과 후, HPLC(분석 칼럼: MCIGEL CK08EC 미쓰비시화학사제) 분석에 제공해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스 면적비를 구해, 반응 생성물의 조성비를 산출했다.
얻어진 결과를 표 4에 나타낸다. 이 결과에서, 칼럼에 충진한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.25 : 1 ~ 5.61 : 1의 범위인 경우에는, 유출액에서의 알룰로오스의 함유 비율이 13%를 넘어 있어, 알룰로오스의 함유 비율이 높아지고 있었다. 한편, 칼럼에 충진한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.25 미만 : 1 또는 5.61 이상 : 1인 경우에는, 유출액에서의 알룰로오스의 함유 비율은 13%에 도달하지 않았다. 이 결과로부터, 유출액 중의 알룰로오스의 함유 비율을 높이기 위해서는, 칼럼에 충진하는 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율을 1.25 : 1 ~ 5.61 : 1로 설정할 필요가 있는 것이 확인되었다.
Figure pct00004
실시예 3. 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 혼합 비율이, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 조성비에 미치는 영향(공간 속도 SV = 0.5 조건 하)
공간 속도 SV가 높은 조건에서도 알룰로오스의 비율이 13% 이상으로 되는 고정화 효소의 활성 비율을 나타내기 위해, 이하의 시험을 실시했다. 즉, 본 시험에서는, 단위 시간 당 생산량이 높은 효율적인 제조 방법의 조건을 검증했다.
제조예 1에서 준비한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제를, 표 5에 나타내는 양 및 활성 비율이 되도록 균일 혼합하여, 재킷이 붙은 내경 20mm, 길이 400mm의 유리제 칼럼에 충진했다.
Figure pct00005
2mM의 황산 마그네슘 및 탄산나트륨을 첨가하여 pH 7.8 ~ 8.0으로 조정한 35질량%의 글루코오스 용액을 준비했다. 상기 칼럼에 글루코오스 용액을 재킷 온도 50℃, 공간 속도(SV)가 0.5가 되도록 제어하면서, 상향류에서 연속적으로 통액했다. 유출액을 24시간 간격으로 3 ~ 4회 채취하고, 채취마다 액량과 채취 시간으로부터 공간 속도 SV를 구했다. 이어서, 채취한 각 유출액의 일부를, 이온 교환 수지에 의한 탈염, 필터 여과 후, HPLC(분석 칼럼: MCIGEL CK08EC 미쓰비시화학사제) 분석에 제공해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스 면적비를 구해, 반응 생성물의 조성비를 산출했다.
얻어진 결과를 표 6에 나타낸다. 이 결과에서, 칼럼에 충진한 고정화 글루코오스 이소메라아제와 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 2.94 : 1 ~ 3.74 : 1의 범위인 경우에는, 공간 속도가 0.5로 높을 경우에 있어서도, 알룰로오스의 함유 비율이 13% 이상의 유출액이 안정적으로 얻어지는 것이 밝혀졌다.
Figure pct00006
실시예 4. 이성화당 제품과 알룰로오스 제품의 동시 제조
크로마토그래피 분리를 위한 양이온 교환 수지(상품명: CR1310, 올가노사제) 400ml를 재킷이 붙은 내경 42mm, 길이 500mm의 유리제 칼럼에 압밀 충진하여 60℃로 유지한 칼럼에, 실시예 2의 시험 No.7에서 얻은 유출액 (글루코오스 : 프룩토오스 : 알룰로오스의 조성비 = 45.2 : 40.3 : 14.5) 21.86g을 주입하고, 용리액으로서 순수(純水)를 SV = 1.5로 통액했다. 용리액 통액 개시부터 15분 이후의 용출액을, 분획 수집기(fraction collector)를 이용하여, 30초마다 88 분획으로 분리·채취했다. 각 분획의 용액 중량(g), Brix(%)를 측정한 후, 그 일부를, 필터 여과 후, HPLC(분석 칼럼: MCIGEL CK08EC 미쓰비시화학사제) 분석해, 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 피크 면적비를 구하여, 각 분획의 조성비로 했다.
이러한 측정 결과로부터, 각 분획에 용출한 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스의 고형 분량(g)을 각각 산출했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에서 알 수 있듯이, 분획 1 ~ 45와 분획 46 ~ 88의 전후반(前後半)에서 분리·채취하면, 전반(前半)의 분획 1 ~ 45 측으로, 이성화당(글루코오스 : 프룩토오스 : 알룰로오스 = 53.2 : 45.6 : 1.2)을 얻을 수 있으며, 후반(後半)의 분획 46 ~ 88 측으로, 순도 91.5%의 알룰로오스(글루코오스 : 프룩토오스 : 알룰로오스 = 1.5 : 7.0 : 91.5)를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 즉, 본 결과로부터, 상기 실시예 1 ~ 3에서 얻은 유출액을, 이온 교환 수지를 이용하여 분획함으로써, 이성화당 제품과 알룰로오스 제품을 동시에 제조할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

Claims (8)

  1. 글루코오스, 프룩토오스 및 알룰로오스를 포함하는 감미료 조성물의 제조 방법으로서,
    1) 고정화 글루코오스 이소메라아제 및 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 활성 비율이 1.49 : 1 ~ 5.61 : 1로 되도록 충진한 칼럼을 준비하는 공정 A;
    2) 글루코오스 용액을 상기 칼럼에 통액하여 효소 반응을 실시하는 공정 B; 및
    3) 상기 칼럼의 유출액을 채취하는 공정 C;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 공정 B에 있어서, 공간 속도를 0.2 ~ 1.0으로 설정하여 글루코오스 용액의 통액을 실시하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 고정화 글루코오스 이소메라아제의 비활성이 100U/ml 이상인, 감미료 조성물의 제조 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 비활성이 20U/ml 이상인, 감미료 조성물의 제조 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고정화 알룰로오스 에피메라아제의 고정화 담체가, 폴리스티렌계의 약 염기성 음이온 교환 수지인, 감미료 조성물의 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글루코오스 용액이, 수용성 마그네슘염을 더 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 C에서 얻은 유출액을, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 획분과, 알룰로오스를 포함하는 획분으로 나누는 분리 처리를 실시하는 분리 공정; 및
    상기 분리 공정에서 얻은 알룰로오스를 포함하는 획분과 상기 공정 C에서 얻은 유출액을 혼합하는 혼합 공정;
    을 더 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.
  8. 이성화당 제품과 알룰로오스 제품을 동시에 제조하는 방법으로서,
    제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법을 실시하는 제 1공정; 및
    상기 제 1 공정에서 얻은 감미료 조성물을, 글루코오스와 프룩토오스의 혼합물을 포함하는 획분과, 알룰로오스를 포함하는 획분으로 나누는 분리 처리를 더 실시하는 제 2공정;
    을 포함하는, 감미료 조성물의 제조 방법.




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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6990656B2 (ja) * 2016-09-14 2022-02-03 松谷化学工業株式会社 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法
EP3565892A4 (en) * 2017-01-06 2020-10-07 Greenlight Biosciences, Inc. ACELLULAR SUGAR PRODUCTION
CN113015810A (zh) * 2018-11-08 2021-06-22 国立大学法人香川大学 含有稀少糖的组合物的制造方法和含有稀少糖的组合物
KR20220096209A (ko) * 2020-12-30 2022-07-07 주식회사 삼양사 안정성이 증가된 알룰로스
CN113080357B (zh) * 2021-05-17 2023-09-15 江苏赛威分离科技有限公司 一种低热量复配甜味剂及其生产工艺
CN113912655B (zh) * 2021-09-30 2024-01-23 中粮营养健康研究院有限公司 利用模拟移动床从混合糖浆中分离阿洛酮糖的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0889273A (ja) * 1994-09-28 1996-04-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd α，α−トレハロースの製造方法
JP3764855B2 (ja) * 2001-06-22 2006-04-12 花王株式会社 油脂類の加水分解方法
WO2007058086A1 (ja) * 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
US20100204346A1 (en) * 2007-05-18 2010-08-12 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. Novel sweetener having sucrose-like taste, method for producing the same, and use of the same
CN102365290B (zh) * 2009-03-30 2014-12-31 松谷化学工业株式会社 与含有规定量目标己糖的原料糖不同的糖组成的糖组合物制造方法以及所制造的糖组合物的用途
KR20110035805A (ko) * 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
US9057062B2 (en) * 2011-07-06 2015-06-16 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. Enzyme produced by Arthrobacter globiformis
CN105163603A (zh) * 2013-04-08 2015-12-16 松谷化学工业株式会社 甜味料组合物及其制造方法以及其用途

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