KR20140015795A - 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 갈락토스를 이용한 타가토스의 제조 방법 - Google Patents

낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 갈락토스를 이용한 타가토스의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 낙엽송으로부터 타가토스 제조의 핵심 중간 물질인 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본원 발명은 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 타가토스를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 타가토스에 관한 것이다.

Description

낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 갈락토스를 이용한 타가토스의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING D-GALACTOSE FROM LARCH AND METHOD FOR MANUFACTURING D-TAGATOSE USING THE D-GALACTOSE}
본원 발명은 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 낙엽송 유래 갈락토스로부터 타가토스를 제조하는 방법과 그 타가토스에 관한 것이다.
타가토스(Tagatose)는 갈락토스(Galactose)의 이성질체로서, 자연적으로 생성되는 저칼로리의 천연당의 하나로 알려져 있다. 타가토스는 설탕과 유사한 정도의 단맛, 즉 설탕의 약 92% 정도의 감미도를 나타내나, 칼로리면에서는 열량이 설탕의 약 38%에 불과하고 GI(Glycemic index, 당 지수)는 설탕의 약 4%에 불과하여 설탕을 대체할 감미료로 각광받고 있다.
더욱이 타가토스는 미국식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 감미료로 사용될 수 있는 허가를 받은 물질로, 체내 섭취 시 부작용이 거의 없는 것으로 알려져 있어 그 활용이 널리 기대되는 물질이다.
타가토스를 대량 생산하는 방법으로는 갈락토스에 촉매를 이용하여 생산하는 화학적 방법과, 이성화 효소를 이용하여 이성화시키는 생물학적 방법이 있다. 화학적 생산 방법은 고온ㆍ고압의 화학 공정을 요하여 공정 자체가 복잡할 뿐만 아니라, 생산 수율은 낮고 산업 폐기물은 다량 발생시키는 문제점을 가지고 있어 보다 환경 친화적인 생물학적 생산 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.
타가토스를 생산하는 생물학적 방법으로는 갈락토스를 이성화하여 생산하는 효소적 공법이 알려져 있다. 갈락토스는 타가토스 생산의 핵심 중간 물질로서 유당(Lactose)의 분해를 통하여 수득하는 것이 일반적이다(유당으로부터 갈락토스를 수득하는 방법에 관한 선행기술로 대한민국공개특허 제10-1996-0014148호 등). 그러나 세계 시장에서 유당의 가격은 원유의 생산량, 분유의 수요, 유당 소비량의 변화 등으로 인해 정량화되어 있지 못하고 불안정하게 변동하고 있는 실정이어서 타가토스의 대량 생산을 위한 핵심 중간 물질인 갈락토스가 안정적으로 제공되지 못하고 있어 문제가 된다.
따라서, 식품 산업용 갈락토스를 안정적으로 대량 생산하는 방법이 요구되며, 이를 이용하여 타가토스를 대량 생산하는 방법이 개발될 필요가 있다.
대한민국공개특허공보 A 제10-1996-0014148호 (1996.05.22.공개)
본원 발명은 타가토스 제조의 핵심 중간 물질인 갈락토스를 안정적으로 대량 생산하기 위하여 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
또한 본원 발명은 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 타가토스를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 타가토스를 제공하고자 한다.
본원 발명은 낙엽송으로부터 타가토스 제조의 핵심 중간 물질인 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 본원 발명은 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 타가토스를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 타가토스에 관한 것이다.
본원 발명의 일 양태에 따르면,
a) 낙엽송으로부터 아라비노갈락탄을 열수추출하는 단계;
b) 상기 열수추출된 아라비노갈락탄을 산가수분해하는 단계; 및
c) 상기 산가수분해물로부터 갈락토스를 분리하는 단계;
를 포함하는 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 a) 열수추출 단계에 있어서 상기 낙엽송을 조각 형태 또는 톱밥 형태로 가공하여 수행하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 a) 열수추출 단계는 15℃ 이상 100℃ 미만에서 0.5 시간 내지 24 시간 동안 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 b) 산가수분해 단계는 상기 열수추출된 아라비노갈락탄에 0.1%(wt/v) 내지 15%(wt/v)의 황산을 첨가하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 상기 산가수분해물을 탈색시키는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 산가수분해물의 탈색 공정은 상기 산가수분해물에 0.1%(wt/v) 내지 10%(wt/v)의 활성탄을 첨가하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지를 이용하여 상기 산가수분해물 내 이온 성분을 제거하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 이온 성분 제거 공정은 수소기로 치환된 양이온 교환 수지 또는 수산화기로 치환된 음이온 교환 수지를 이용하여 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 크로마토그래피 분리 방법을 이용하여 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기의 방법에 의하여 제조된 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 타가토스를 제조하는 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 이성화는 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균체를 이용하여 수행되는, 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 균체로 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P)를 이용하는, 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 제조된 타가토스를 제공한다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P)으로 이성화하여 제조된 타가토스를 제공한다.
본원 발명은 자연계에 존재하는 바이오매스인 낙엽송으로부터 타가토스 제조의 핵심 중간 물질인 갈락토스를 안정적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 효과를 갖는다.
또한 본원 발명은 상기 낙엽송 유래 갈락토스로부터 설탕 대체 감미료로 각광받고 있는 타가토스를 대량 생산하는 방법을 제공하는 효과를 갖는다.
또한 본원 발명은 상기 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하는 방법 및 상기 갈락토스로부터 타가토스를 제조하는 방법의 공정 조건을 구체적으로 제시함으로써 갈락토스와 타가토스의 수율을 높이고 공정의 효율성을 향상시키는 효과를 갖는다.
도 1은 낙엽송으로부터 갈락토스를 제조하고 이로부터 타가토스를 제조하는 방법을 간략하게 도시한 것이다.
도 2는 글루코스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 만노스의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 열수추출 전 여러 형태로 가공한 낙엽송 원료를 나타낸 것이다.
도 4는 추출 온도에 따른 갈락토스 추출 수율을 나타낸 것이다.
도 5는 추출 시간에 따른 갈락토스 추출 수율을 나타낸 것이다.
이하, 본원 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본원 명세서에 기재되지 않은 내용은 본원 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본원 발명은 낙엽송으로부터 타가토스 제조의 핵심 중간 물질인 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 본원 발명은 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 타가토스를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 타가토스에 관한 것이다.
구체적으로 본원 발명의 일 양태에 따르면,
a) 낙엽송으로부터 아라비노갈락탄을 열수추출하는 단계;
b) 상기 열수추출된 아라비노갈락탄을 산가수분해하는 단계; 및
c) 상기 산가수분해물로부터 갈락토스를 분리하는 단계;
를 포함하는 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
낙엽송은 겉씨식물 구과식물아강 구과목 소나무과의 낙엽침엽 교목으로, 일반 소나무와 달리 낙엽이 지는 특징이 있다. 본원 발명에서 사용되는 낙엽송은 특별히 제한되지 아니하며 낙엽송이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 상기 낙엽송의 비제한적인 예로는 시베리아 낙엽송(Larixsibirica), 잎갈나무(Larix gmelinii) 등을 들 수 있다.
본원 발명에서 사용되는 낙엽송은 낙엽송의 목질부를 의미하며 나무의 산지나 연령, 생장 기후 등이 특별히 제한되지 아니하나 갈락토스의 수율을 높이기 위하여 당 함량이 높은 낙엽송을 사용하는 것이 바람직하다. 산지별로 낙엽송을 입수하여 고속 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 이용해 낙엽송 내 당 함량을 분석한 결과, 러시아 산 낙엽송이 당 함량면에서 우수한 것으로 나타났다(갈락토스 함량 약 20%).
아라비노갈락탄(arabinogalactan)은 L-아라비노스(L-arabinose)와 D-갈락토스(D-galactose)를 주된 구성으로 하는 수용성 다당류의 일종으로, 고등식물의 세포벽 중엽이나 침엽수의 물관부 등에 많이 함유되어 있다. 아라비노갈락탄은 대부분 소량(10% 이하)의 단백질과 결합하여 존재한다.
본원 발명의 상기 a) 열수추출 단계는 입수한 낙엽송에 용수를 가하고 온도를 높이면서 진행하는 추출 공정을 의미한다.
상기 열수추출에 있어서, 아라비노갈락탄 및 이로부터 갈락토스의 추출 수율을 높이기 위하여 낙엽송을 가공한 후 사용할 수 있다. 구체적으로 바람직하게는 낙엽송을 작은 조각 형태로 자른 후 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 낙엽송을 톱밥 형태로 가공하여 사용할 수 있다.
상기 작은 조각 형태는 그 크기나 모양이 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 가로, 세로 및 높이가 각각 5 cm 이하일 수 있고 보다 바람직하게는 가로, 세로 및 높이가 각각 1 cm 이하일 수 있다.
낙엽송을 상기와 같이 작은 조각 형태 또는 톱밥 형태로 가공하여 열수추출하는 경우 동일한 추출 조건하에서 아라비노갈락탄의 추출 수율 및 이로부터 갈락토스의 추출 수율을 높일 수 있어 공정 효율을 향상시키는 이점이 있다.
본원 발명의 일 양태에 따르면, 상기 열수추출 단계에 있어서 아라비노갈락탄 및 이로부터 갈락토스의 추출 수율을 높이기 위하여 바람직한 추출 온도 범위를 제공한다.
추출 수율을 높이기 위한 추출 온도는 바람직하게는 15℃ 이상 100℃ 미만일 수 있고 보다 바람직하게는 30℃ 이상 100℃ 미만일 수 있으며 더욱 바람직하게는 70℃ 이상 100℃ 미만일 수 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 열수추출 단계에 있어서 추출 수율 및 추출 공정의 경제적 측면을 함께 고려하여 추출 효율을 높이기 위한 바람직한 추출 시간 범위를 제공한다.
추출 효율을 높이기 위한 추출 시간은 바람직하게는 30분 내지 24시간일 수 있고 보다 바람직하게는 30분 내지 5시간일 수 있으며 더욱 바람직하게는 1시간 내지 3시간일 수 있다.
본원 발명의 상기 열수추출 단계에 있어서, 추출 횟수는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 1 회 실시할 수 있다. 이는 제1차 열수추출에서 낙엽송 내 함유된 아라비노갈락탄의 대부분이 추출되어 나오는 것에 비추어 경제성 측면에서 고려된 것이다.
본원 발명의 상기 b) 산가수분해 단계는 아라비노갈락탄을 농축하는 공정, 상기 농축물을 산가수분해 처리하는 공정, 및/또는 상기 산가수분해물을 중화시키는 공정을 포함할 수 있다.
상기 낙엽송으로부터 추출된 아라비노갈락탄을 농축하는 공정은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따를 수 있다. 예를 들어 증발 농축기(evaporator)를 이용하여 농축할 수 있다. 농축 농도는 바람직하게는 10 Brix 내지 50 Brix로 농축할 수 있으며 보다 바람직하게는 20 Brix 내지 40 Brix로 농축할 수 있다.
상기 아라비노갈락탄 농축물을 산가수분해 처리하는 공정은 상기 농축물에 산을 첨가하는 방식으로 수행될 수 있으며 보다 바람직하게는 상기 농축물에 황산을 첨가하고 이를 고압 멸균기에 넣어 반응시키는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 산가수분해 처리 공정은 바람직하게는 아라비노갈락탄 농축물에 황산을 0.1%(wt/v) 내지 15%(wt/v)로 첨가할 수 있고 보다 바람직하게는 0.5%(wt/v) 내지 10%(wt/v)로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5%(wt/v) 내지 3%(wt/v)로 첨가할 수 있다. 상기 범위 내에서 아라비노갈락탄의 산가수분해가 효율적으로 이루어지면서도 추후 수행될 수 있는 중화 공정을 용이하게 하는 이점이 있다.
상기 산가수분해물을 중화시키는 공정은 상기 산가수분해물에 염기성 제제를 첨가하는 방식으로 수행될 수 있으며 보다 바람직하게는 탄산칼슘을 첨가할 수 있다. 상기 중화반응은 바람직하게는 pH가 6 내지 8이 될 때까지 수행될 수 있다.
본원 발명의 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 상기 아라비노갈락탄 가수분해물을 탈색하는 공정, 상기 탈색된 가수분해물 내 이온 성분을 제거하는 공정, 상기 탈색 및 탈염된 가수분해물을 농축하는 공정 및/또는 상기 농축물을 크로마토그래피 분리하는 공정을 포함할 수 있다.
상기 탈색 공정은 바람직하게는 상기 아라비노갈락탄 가수분해물에 활성탄(activated carbon)을 첨가한 후 교반하고 여과하는 방식으로 수행될 수 있다. 상기 활성탄은 보다 바람직하게는 분말 활성탄일 수 있다.
상기 탈색 공정에 있어서 첨가되는 활성탄의 농도는 바람직하게는 0.1%(wt/v) 내지 10%(wt/v)일 수 있고 보다 바람직하게는 0.5%(wt/v) 내지 5%(wt/v)일 수 있으며 더욱 바람직하게는 0.5%(wt/v) 내지 2%(wt/v)일 수 있다. 상기 범위 내에서 아라비노갈락탄 가수분해물을 효과적으로 탈색시킬 수 있다.
상기 탈색 공정에 있어서 상기 아라비노갈락탄 가수분해물과 활성탄 혼합물의 교반은 바람직하게는 10 내지 100 rpm의 속도로 0.5 내지 1 시간 동안 교반하는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 이온 성분 제거 공정은 바람직하게는 양이온 교환 수지 및/또는 음이온 교환 수지가 충진된 컬럼을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 양이온 교환 수지는 바람직하게는 수소기로 치환된 교환 수지를 사용할 수 있고, 상기 음이온 교환 수지는 바람직하게는 수산화기로 치환된 교환 수지를 사용할 수 있다.
상기 이온 성분 제거 공정을 수행하는 경우, 아라비노갈락탄 가수분해물로부터 갈락토스와 아라비노스를 분리하기 위해 실시하는 크로마토그래피 분리를 효율적으로 수행할 수 있다. 구체적으로 크로마토그래피 분리를 수행할 물질에 이온 성분이 다량 존재하게 되면 분리 수지의 활성기와 이온 성분이 치환되어 분리능이 저하될 위험이 있고 따라서 분리 수지를 이용한 반복적인 분리가 어려워지는 문제가 있다. 따라서 크로마토그래피 분리를 수행하기 전에 이온 성분을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 탈색 및 탈염된 가수분해물을 농축시키고 그 농축물을 크로마토그래피 분리 처리하는 공정은, 바람직하게는 칼슘기로 치환시킨 이온교환수지에 상기 농축물을 통과시키고 탈이온수로 용출시킨 용액을 크로마토그래피 분리하는 방식으로 수행될 수 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 방법에 의하여 낙엽송으로부터 제조된 갈락토스를 이성화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조 방법을 제공한다.
상기 이성화 단계는 바람직하게는 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균체를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 코리네박테리움속 균체는 재조합 균주일 수 있으며 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P) 재조합 균주를 이용할 수 있다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI은 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221 번지에 소재하는 국제 기탁 기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10786P로 기탁된 균주이다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI에 관한 사항은 대한민국 등록특허 제10-0872694호를 참조한다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI은 고도 호열성 세균인 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 균주 유래의 아라비노스 이성화 효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 재조합된 균주로서, 다른 균주에 비하여 고온 및 고농도의 갈락토스 기질 조건하에서도 아라비노스 이성화 효소를 안정적으로 생산하면서 대량 증식될 수 있는 이점이 있다.
본원 발명의 상기 타가토스의 제조 방법은,
a) 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 균체를 배양하고 사균화시키는 단계;
b) 상기 사균화된 균체에 알지네이트(alginate)를 혼합하여 상기 사균체가 고정화된 비드(bead)를 제조하는 단계; 및
c) 상기 제조된 비드에 낙엽송 유래 갈락토스를 투입하여 갈락토스를 타가토스로 이성화시키는 단계;
를 포함할 수 있다.
상기 a) 단계에서 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 균체를 배양하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따를 수 있다.
상기 균체 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는, 글루코스, 옥수수 침지액(Corn Steeping Liquid (CSL)), (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4-7H2O, 카나마이신(Kanamycine), 및 기타 성분을 함유하는 배지일 수 있다.
상기 a) 단계에서 상기 아라비노스 이성화 효소를 갖는 균체를 사균화시키는 방법은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 다음의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 균체를 사균화시키는 방법에 있어서, 계면 활성제를 첨가하는 방법을 적용할 수 있으며, 상기 계면 활성제로는 보다 바람직하게는 양이온 계면 활성제를 이용할 수 있다.
상기 균체를 사균화시키는 방법에 있어서, 균체에 계면 활성제를 첨가한 후 60 내지 90℃, 보다 바람직하게는 70 내지 75℃에서 0.5 내지 2 시간 동안 가열함으로써 균의 활성도를 제거할 수 있다.
상기 조건하에서 균체를 사균화 처리하는 경우, 균체는 효율적으로 사멸시키면서도 아라비노스 이성화 효소는 변질되지 않고 유지되어 아라비노스 이성화 효소를 충분히 효율적으로 활용할 수 있는 이점이 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 b) 단계에서, 상기 알지네이트는 바람직하게는 이산화규소 용해액에 알지네이트를 용해시킨 알지네이트 용액일 수 있다.
상기 알지네이트 용액은 바람직하게는 0.1 내지 3 중량%의 이산화규소 용해액에 알지네이트를 0.1 내지 5 중량% 농도로 용해시킨 용액일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.4 내지 1.0 중량%의 이산화규소 용해액에 알지네이트를 1.5 내지 2.5 중량% 농도로 용해시킨 용액일 수 있다.
상기 b) 단계에 있어서 상기 사균체 및 알지네이트 혼합액을 주입하는 비드 제조용 주사기는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 고정화 설비(비드 제조기)에서 사용 가능한 임의의 주사기일 수 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 c) 이성화 단계는 상기 b) 단계에서 제조한 비드를 이성화 반응 설비에 충진하고 이에 갈락토스를 투입하는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 갈락토스는 용액에 갈락토스가 용해된 갈락토스액 일 수 있다.
상기 비드가 충진된 이성화 반응 설비에 갈락토스액을 투입하는 공정에 있어서, 바람직하게는 갈락토스액의 pH를 7 내지 8로 맞추어 사용할 수 있으며, 효소 활성화를 위해 염화망간을 0.01 내지 0.1 % 투입하여 반응을 수행할 수 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 c) 단계 이후,
d) 상기 갈락토스 및 타가토스가 혼합된 이성화액에 의사이동상 크로마토그래피 분리(Simulated moving bed chromatographic separation)를 수행하는 단계;
를 추가로 포함하는, 방법을 제공한다.
상기 의사이동상 크로마토그래피 분리는 분리탑에 채워져 있는 흡착제에 대해 흡착능이 다른 두 물질을 분리하는 연속 공정 기술의 하나로서, 의사이동상 흡착제를 실제로 이동시키지 않고 원액 공급 위치와 분리액 수집 위치를 단계적으로 이동시켜 흡착제가 실제로 이동하는 이동층 크로마토그래피의 효과를 나타내는 분리 방법을 말한다.
본원 발명의 상기 d) 단계에서 갈락토스와 타가토스의 분리를 위하여 바람직하게는 200 내지 400 ㎛, 보다 바람직하게는 220 내지 320 ㎛의 입도를 가지는 칼슘(Ca)형 양이온 수지를 사용할 수 있다.
본원 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 제조된 타가토스를 제공한다.
이하, 실시예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1
용액 내 당 함량 분석 방법
낙엽송으로부터 갈락토스를 수득하는 공정의 각 단계에 있어서, 각 단계별 용액 내 당 함량은 RI(Refractive Index, 굴절률) 검출기가 장착된 HPLC를 이용하여 측정하였다.
HPLC분석은 80℃로 설정된 컬럼(SUPELCOGELTM Pb column)에 시료를 주입한 후 이동상 용매로 증류수를 0.3 ml/min의 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다. 표준시료는 글루코스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 만노스 (Sigma-Aldrich사)를 사용하였으며 이들의 크로마토그램은 도 2와 같다.
실시예 2
각 산지별 낙엽송의 당 함량 분석
갈락토스 함량이 상대적으로 높은 낙엽송을 확보하기 위하여 산지별로 당 함량을 평가하였다. 산지는 국내(강원도, 전라도), 러시아 및 중국으로 선정하였다. 상기 각 산지에서 입수한 낙엽송 내의 당 함량 분석을 위하여 HPLC를 사용하였으며 상기 실시예 1의 조건하에 분석을 실시하였다. 분석결과는 하기 표 1에 나타낸다.
낙엽송 산지 갈락토스 함량(%)(Ds 기준)
국내(강원도) 9.22±0.89
국내(전라도) 10.96±3.44
러시아 20.48±2.80
중국 8.31±1.47
실시예 3
낙엽송으로부터 아라비노갈락탄을 열수추출하는 공정
갈락토스 원료로 상기 실시예 2에서 갈락토스 함량이 가장 높은 것으로 평가된 러시아산 낙엽송을 선정하였으며, 아라비노갈락탄 및 이로부터의 갈락토스 추출 수율을 높이고 공정을 최적화하기 위하여, 주요 추출 조건인 낙엽송 원료의 형태, 추출 온도, 추출 시간 및 추출 횟수를 변경하여 실험을 수행하였다.
실시예 3-1: 낙엽송 원료의 형태를 달리한 추출
러시아산 낙엽송을 톱밥 형태(도 3의 A), 가로, 세로, 높이가 약 1 X 1 X 1 cm 이하인 조각 형태(도 3의 B) 및 가로, 세로, 높이가 약 1 X 5 X 1 cm 이하인 조각 형태(도 3의 C), 3 가지로 가공하여 각각 열수추출을 수행하였다.
상기 열수추출은 상기 3 가지 형태로 가공된 각 낙엽송 20 g(건조 중량 기준)에 증류수를 가하여 추출을 진행하였다. 톱밥 형태의 경우, 증류수를 120 ml 첨가하고, 2 종류의 조각 형태의 경우에는 각각 증류수를 100 ml 씩 첨가하였으며 각각 70℃, 정치로 24 시간 동안 추출하였다.
상기 열수추출 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
원료 형태 갈락토스 추출 수율 (%)
톱밥 93.0
1 X 1 X 1 cm 이하인 조각 85.9
1 X 5 X 1 cm 이하인 조각 73.4
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 낙엽송 원료의 크기가 작을수록 추출 수율이 높아짐을 확인할 수 있었다.
실시예 3-2: 추출 온도를 달리한 추출
러시아산 낙엽송을 상기 실시예 3-1에서 최종 선정된 톱밥 형태로 가공하여 추출 온도에 따른 추출 수율을 확인하였다. 실험 온도 범위는 15℃에서부터 90℃로 설정하였으며, 톱밥 형태의 낙엽송 20 g(건조 중량 기준)에 증류수 120 ml를 가하여 정치로 24 시간 동안 추출하였다.
추출 온도에 따른 갈락토스 추출 수율은 도 4에 나타낸다. 도 4를 참조하여 살펴보면, 추출 온도가 70℃ 이상이 되면 갈락토스 수율이 거의 증가하지 않는 경향을 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서 경제성과 수율 변이를 종합적으로 고려할 때 추출 온도는 약 70℃ 내외로 선정하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
실시예 3-3: 추출 시간 및 추출 횟수를 달리한 추출
상기 실시예 3-1 및 3-2에서 최종 선정된 추출 조건에 따라, 러시아산 낙엽송을 톱밥 형태로 가공한 후 70℃에서 추출 시간 및 추출 횟수를 달리하여 열수추출을 수행하였다.
톱밥 형태의 낙엽송 200 g(건조 중량 기준)에 증류수 1.2L를 가하고 70℃, 정치로 30분 간격으로 5시간 동안 추출하였다. 추출 시간에 따른 추출 수율은 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하여 추출 시간에 따른 추출 수율을 살펴보면, 추출 시간이 증가할수록 추출물의 수율과 함량은 일정 수준까지 증가하며 어느 시점 이후(본 실시예의 경우는 2 시간 이후)에는 추출 수율이 거의 일정하게 유지되는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 추출 수행 후 2 시간 이후에는 수율의 증가량이 많지 않기 때문에 경제성과 수율 변이를 종합적으로 고려할 때 추출 시간을 30분 내지 2 시간 내외로 선정하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
한편, 도 5는 제1차 추출에 따른 결과를 나타낸 것으로, 1차 추출에서 낙엽송에 함유된 갈락토스의 대부분이 추출되는 것을 확인할 수 있다(총 함량의 약 90% 수준). 추출되지 못한 10%의 함량을 추가 확보하기 위하여 상기 제1차 추출과 동일한 조건으로 제2차 추출을 수행하였으며 그 결과 약 5% 정도의 소량의 갈락토스를 추가로 수득할 수 있었다.
결과적으로, 경제성과 수율을 종합적으로 고려할 때 추출 단계는 1 회 실시하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
실시예 4
추출된 아라비노갈락탄을 산가수분해하는 공정
상기 실시예 3에 따라 낙엽송에서 추출된 아라비노갈락탄으로부터 갈락토스를 얻기 위하여 산가수분해 공정을 수행하였다.
산가수분해에 앞서, 추출된 아라비노갈락탄을 증발 농축기(evaporator)를 이용하여 30 Brix 까지 농축시켰다. 상기 농축된 아라비노갈락탄 농축액을 6 개의 시료로 나누고 각각의 시료에 황산을 농도를 달리하여 첨가하였다(각 시료의 황산 농도는 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 3% 및 10% (wt/v)). 그 다음 상기 혼합물을 125℃ 고압 멸균기에 넣어 1 시간 동안 반응시켜 가수분해를 실시하였다.
상기 가수분해 종료 후 중화 반응을 수행하기 위하여 상기 각 산가수분해물에 탄산칼슘을 첨가하여 pH를 약 7 내외로 맞춰 주었다. 상기 중화된 가수분해액을 8000 rpm으로 원심분리하고 그 상등액만을 회수하여 다음 공정에 이용하였다. 또한 상기 상등액을 HPLC 분석하여 가수분해율을 평가하였다.
황산 농도에 따른 아라비노갈락탄의 가수분해율과 갈락토스의 생존율(survival ratio)을 하기 표 3에 나타내었다. 여기서 생존율이라 함은 가수분해 후 황산에 의해 분해되지 않은 갈락토스의 농도를 가수분해 전 갈락토스의 농도로 나눈 비율을 의미한다
황산 농도 (% wt/v) 가수분해율 (%) 생존율 (%)
0.5 96.6 89
1 96.7 88
1.5 96.7 86
2 97.14 82
3 98.2 76
10 100 46
반응 조건범위인 0.5 내지 10% (wt/v) 농도에서는 가수분해율이 거의 비슷하였으며, 황산 농도가 증가할수록 생존율이 감소하는 경향을 보였다. 위의 결과를 통하여, 생존율이 어느 정도 보장되면서 높은 가수분해율을 보이는 바람직한 황산 농도는 약 0.5% (wt/v) 내지 3 % (wt/v)인 것으로 판단되었다.
실시예 5
아라비노갈락탄 가수분해물의 탈색, 이온정제, 및 크로마토분리
상기 실시예 4에서 제조된 아라비노갈락탄 가수분해물에 분말 활성탄(powder activated carbon) 0.5 내지 2.0% (wt/v)를 첨가하고 0.5 내지 1 시간 동안 10 내지 100 rpm으로 교반한 다음, 이를 여과지(Whatman Filter paper 5)로 여과하여 유색 물질을 제거하였다.
상기 유색 물질이 제거된 아라비노갈락탄 가수분해물로부터 갈락토스와 아라비노스를 크로마토그래피 분리를 이용해 효율적으로 분리해내기 위하여, 상기 탈색된 아라비노갈락탄 가수분해물을 수소기로 치환된 양이온교환수지와 수산화기로 치환된 음이온교환수지가 충진된 컬럼에 통과시켜 상기 용액 중의 이온 성분을 제거하는 공정을 수행하였다. 이온 성분 제거의 확인은 전기 전도계로 측정하여 단위 cm 당 10 마이크로 지맨스 이하가 되도록 하였다.
상기 탈색 및 탈염으로 유색 물질 및 이온 성분 등의 불순물이 제거된 아라비노갈락탄 가수분해물을 60% (g/g 용액)까지 농축하여 칼슘기로 치환시킨 이온교환수지 (Amberlite CR1310 Ca)에 통과시키고 탈이온수로 용출시킨 용액을 분획, 크로마토분리하여 정제된 갈락토스 용액을 수득하였다.
실시예 6
낙엽송 유래 갈락토스의 이성화를 통한 타가토스의 제조
상기 실시예 5에 따라 제조된 낙엽송 유래 갈락토스를 이용해 타가토스를 제조하기 위한 갈락토스의 이성화 반응을 실시하였다.
갈락토스의 이성화 반응을 위하여 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P) 균주를 사용하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P) 균체를 초기농도 O.D. 600 = 0.6으로 접종하고 30℃에서 20시간 배양하였다. 상기 배양 후, 배양액의 원심분리에 의해 균체를 회수하고 회수된 세포가 20%가 되도록 증류수로 현탁 시켰다. 현탁된 재조합 균주의 균체를 2%(v/v)의 알긴산나트륨 (sodium alginate) 수용액에 첨가하고, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 이용하여 100 mM CaCl2용액에 떨어뜨려 균체가 알긴산나트륨의 비드에 포집된 균체-알기네이트의 결합체를 제조하였다.
상기 알긴산나트륨에 고정화된 재조합 균주를 충진상 컬럼(packed-bed column)(XK 26/40 column, Amersham pharmacia)에 100 ml 충진한 후 기질인 갈락토스액에 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH를 7로 맞추고 효소 활성화를 위해 염화망간 0.06%를 투입한 다음, 온도 55℃ 조건에서 이성화탑에 시간당 50 ml씩 통과시켜 갈락토스로부터 이성화된 타가토스를 수득하였다.

Claims (14)

  1. a) 낙엽송으로부터 아라비노갈락탄을 열수추출하는 단계;
    b) 상기 열수추출된 아라비노갈락탄을 산가수분해하는 단계; 및
    c) 상기 산가수분해물로부터 갈락토스를 분리하는 단계;
    를 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 열수추출 단계는 상기 낙엽송을 조각 형태 또는 톱밥 형태로 가공하여 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 a) 열수추출 단계는 15℃ 이상 100℃ 미만에서 0.5 시간 내지 24 시간 동안 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 b) 산가수분해 단계는 상기 열수추출된 아라비노갈락탄에 황산을 0.1%(wt/v) 내지 15%(wt/v)의 농도로 첨가하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 상기 산가수분해물을 탈색시키는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 산가수분해물의 탈색 공정은 상기 산가수분해물에 활성탄을 0.1%(wt/v) 내지 10%(wt/v)의 농도로 첨가하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지를 이용하여 상기 산가수분해물 내 이온 성분을 제거하는 공정을 포함하는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이온 성분 제거 공정은 수소기로 치환된 양이온 교환 수지 또는 수산화기로 치환된 음이온 교환 수지를 이용하여 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 c) 갈락토스 분리 단계는 크로마토그래피 분리 방법을 이용하여 수행되는, 낙엽송 유래 갈락토스의 제조 방법.
  10. 갈락토스를 이성화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조 방법으로서, 상기 갈락토스는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 제조된 낙엽송 유래 갈락토스인, 타가토스의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이성화 단계는 아라비노스 이성화 효소 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균체를 이용하여 수행되는, 타가토스의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 균체로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CJ1-TNAI(KCCM10786P)를 이용하는, 타가토스의 제조 방법.
  13. 낙엽송 유래 갈락토스를 이성화하여 제조된 타가토스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 낙엽송 유래 갈락토스를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ1-TNAI(KCCM10786P)으로 이성화하여 제조된 타가토스.
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