CN110191643B - 甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4、WB1和WB2的生产以及从Reb D4生产莱鲍迪苷M。

Description

甜菊醇糖苷的生物合成生产及其工艺
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年10月14日提交的美国临时申请号62/408,179和2017年9月8日提交的美国临时申请号62/555,809的优先权，其中每个的内容通过引用以其全部结合于此。
技术领域
本发明的领域涉及有用于生产特定甜菊醇糖苷的方法和工艺。更具体地，本公开内容提供了生产先前未知的莱鲍迪苷(rebaudioside)，莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)，莱鲍迪苷D4然后可以通过酶促转化为莱鲍迪苷M(“Reb M”)。本公开还提供了生产先前未知的莱鲍迪苷，莱鲍迪苷WB1(“Reb WB1”)和莱鲍迪苷WB2(“Reb WB2”)。
背景技术
本公开集中于新型莱鲍迪苷Reb D4、Reb WB1和Reb WB2的生产以及Reb D4向RebM的转化。具体地，本公开涉及Reb D4的合成及其随后在生产Reb M中的用途。
甜菊醇糖苷是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中分离的天然产物，并且广泛用作食品、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的碱二萜结构(甜菊醇)，但在甜菊醇骨架的C13和C19位置上碳水化合物残基(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)修饰的数量和结构不同。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M和杜克苷(dulcoside)A。就商业应用而言，莱鲍迪苷M本身通常被认为是安全的(‘GRAS’状态)。
基于干重，甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和杜克苷A分别占野生型甜叶菊叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.1％、3.8％、0.6％和0.30％，而其他甜菊醇糖苷(例如Reb M)以低得多的量存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购的，其中此类提取物通常含有甜菊苷和莱鲍迪苷A作为主要组分。其他已知的甜菊醇糖苷通常作为次要或微量组分存在于甜叶菊提取物中。例如，莱鲍迪苷A在商业制品中的量可以从总的甜菊醇糖苷含量的约20％至多于90％变化，而莱鲍迪苷B的量通常是总的甜菊醇糖苷的约1-2％，莱鲍迪苷C的量可以是总的甜菊醇糖苷的约7-15％，莱鲍迪苷D的量可以是总的甜菊醇糖苷的约2％。在这样的提取物中，莱鲍迪苷M仅以极少量存在。有趣的是，莱鲍迪苷E也是甜叶菊植物品种中存在最少的甜菊醇糖苷之一，占总糖苷的不到0.5％。
作为天然甜味剂，不同甜菊醇糖苷具有不同程度的甜味、“口感”和与所测试的每种莱鲍迪苷种类相关的特定后味。相对于食糖(即“蔗糖”)，甜菊醇糖苷的甜度显著更高。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，但味道测试中有苦的后味，而莱鲍迪苷A和E比蔗糖甜250-450倍，并且后味比甜菊苷好得多，但是，仍有明显的后味。因此，任何甜叶菊提取物的味道特征深受提取物中甜菊醇糖苷的相对含量的影响，这反过来可能受到地下植物所经历的环境条件和所用提取方法的影响。植物产量，天气条件和提取条件的这些变化可导致甜叶菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致，使得不同批次的提取产物之间的味道特征变化很大。
甜叶菊提取物的味道特征也可以受到提取工艺后残留在产物中的植物来源的或环境来源的污染物(比如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物通常其自身具有异味，这对于使用甜叶菊提取物作为消费品中的甜味剂是不合需要的。此外，分离甜叶菊提取物中不丰富的甜菊醇莱鲍迪苷的单独或特定组合的成本是花费和资源过高的。鉴于某些特定甜菊醇糖苷的质量和可用性有限，商业供应可以通过生物转化更好地解决，其中天然酶或特定微生物可以被修饰以携带所需的酶并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加目的糖苷的生产。例如，先前已经报道了使用从经修饰的微生物获得的酶将甜菊苷生物转化为Reb E(参见例如PCT申请公开号WO/2015/065650和WO/2015/171555)。或者，其他非生物合成手段可用于开发目的甜菊醇糖苷。
从生物学角度来看，所有甜菊醇糖苷都是通过甜菊醇的一系列糖基化反应形成的，其通常由UDP-糖基转移酶(UGT)酶催化，使用尿苷5'-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体。在植物中，UGT是将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇的差异性很大的一组酶。在这些反应中，甜菊苷通常是各种莱鲍迪苷化合物生物合成的中间体。例如，甜菊苷在甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化生产莱鲍迪苷A；而在甜菊苷的19-O-葡萄糖位置的C-2'处的糖基化生产莱鲍迪苷E。
如本文所述，莱鲍迪苷E(在C-19-O-葡萄糖处)的特异性和定向糖基化可生产莱鲍迪苷Reb D4，并且UGT酶对Reb D4的进一步糖基化生产莱鲍迪苷M。然而，直到本公开内容为止，酶法生产D4的合成步骤仍没有报道。
根据目前的公开内容，改善甜叶菊提取物的味道品质的实用方法是提高那些通常具有更理想的味道特征的莱鲍迪苷化合物的产率，并且通过更有效的合成途径来实现这一目的。在测试的那些甜菊醇糖苷中，许多人认为Reb M具有用于食品和饮料的最理想的味道和化学特性。然而，如上所述，该植物在其叶子中含有极少量的这种化合物，因此需要开发替代的生物合成用于大规模生产该糖苷以及为食品和饮料行业提供替代的甜味剂。
因此，需要作为商业产品开发的具有更好和更一致的味道特征的甜菊醇糖苷以及对于这种甜菊醇糖苷需要利用相对常见的起始底物，例如更丰富的甜菊醇糖苷作为起始分子，以便生产理想的糖苷可以在商业上尽可能具有成本效益。本公开内容提供了从先前未知的甜菊醇糖苷Reb D4生产莱鲍迪苷M的方法，以及生产Reb D4、Reb WB1和Reb WB2的方法。
更进一步，植物提取过程通常采用固液萃取技术，使用己烷、氯仿和乙醇等溶剂进行甜菊醇糖苷回收(Catchpole等，2003)。然而，溶剂提取本身是能量密集型的，产生有毒废物处理问题，需要大量面积用于植物本身生长并且生产的产物需要进一步纯化来回收少量成分。因此，还需要新的生产方法来降低甜菊醇糖苷生产的成本，并减少大规模培养和加工对环境的影响(Yao等，1994)。一种这样的潜在解决方案是使用发酵生物转化技术，其允许在某些微生物物种中生产，这增加了可用于商业的所需甜菊醇糖苷的选择性、丰度和纯度。
除此之外，虽然消费者赞成并积极寻求天然和生物来源的食品、饲料、香料或药用成分，但他们也关注采购、一致的味道特征和环境可持续生产。在这种情况下，本公开的微生物发酵和生产方法提供了在数量方面有用于各种工业和研究的Reb M，同时以比无机合成或当前植物提取技术更自然的方式做到。
因此，需要开发一种经济且方便地生产Reb M的新方法，以进一步实现人和动物的消费。
发明内容
本公开内容的方面涉及甜菊醇糖苷、生产甜菊醇糖苷的方法、以及包含甜菊醇糖苷的组合物。在一些方面，本公开内容涵盖从先前未报道的甜菊醇糖苷Reb D4生产Reb M的方法。
特别地，本公开内容提供了甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4“Reb D4”的生产，其被鉴定为(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯])及其通过特定UDP-糖基转移酶向Reb M的转化(见图1)。本公开还提供如本文所述的Reb WB1和Reb WB2的生产。
本文描述的当前方法提供使用合成途径合成特定甜菊醇糖苷的方法。
另一个实施例是利用通过RebWB1的途径从莱鲍迪苷W生产莱鲍迪苷D4。
另一个实施例是从莱鲍迪苷D4生产莱鲍迪苷M。
在本公开的一个实施例中，提供了一种方法，其允许使用通过Reb WB2、Reb WB1和Reb D4的途径生产Reb M。
在替代性实施例中，β-葡糖苷酶用于催化Reb W酶促生物转化为Reb WB1，参见图14。
在一些方面，本公开提供了具有以下结构的甜菊醇糖苷Reb D4：
Figure BDA0002095057870000041
在一些实施例中，本公开提供了包含Reb D4的组合物，任选地其中所述组合物中的所述Reb D4含量为至少70％(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)纯。在一些实施例中，本公开提供了包含增甜量的Reb D4的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
在其他方面，本公开内容提供了包含Reb D4和Reb M的混合物的组合物。在一些实施例中，本公开内容提供了包含增甜量的Reb D4和Reb M的混合物的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
在一些其他方面，本公开提供了具有以下结构的甜菊醇糖苷Reb WB1：
Figure BDA0002095057870000051
在一些实施例中，本公开提供了包含Reb WB1的组合物，任选地其中所述组合物中的所述Reb WB1含量为至少70％(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)纯。在一些实施例中，本公开提供了包含增甜量的Reb WB1的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
在一些其他方面，本公开提供了具有以下结构的甜菊醇糖苷Reb WB2：
Figure BDA0002095057870000061
在一些实施例中，本公开提供了包含Reb WB2的组合物，任选地其中所述组合物中的所述Reb WB2含量为至少70％(例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)纯。在一些实施例中，本公开提供了包含增甜量的Reb WB2的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
在一些方面，本公开内容提供了由在培养基中生长的经转化的细胞系统生产的目的甜菊醇糖苷。在一些实施例中，所述经转化的细胞系统选自由以下组成的组：酵母、生产非甜菊醇糖苷的植物、藻类和细菌。在一些实施例中，所述细胞系统是细菌并且选自由以下组成的组：埃希氏菌属(Escherichia)；沙门氏菌属(Salmonella)；芽孢杆菌属(Bacillus)；不动杆菌属(Acinetobacter)；链霉菌属(Streptomyces)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；甲基弯曲菌(Methylosinus)；甲基单胞菌(Methylomonas)；红球菌属(Rhodococcus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；红杆菌属(Rhodobacter)；集胞藻属(Synechocystis)；酵母属(Saccharomyces)；接合酵母属(Zygosaccharomyces)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)；假丝酵母属(Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；德巴利氏酵母属(Debaryomyces)；毛霉菌属(Mucor)；毕赤酵母属(Pichia)；球拟酵母属(Torulopsis)；曲霉属(Aspergillus)；Arthrobotlys；短杆菌属(Brevibacteria)；微杆菌属(Microbacterium)；节细菌属(Arthrobacter)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)；埃希氏菌属(Escherichia)；克雷白氏杆菌属(Klebsiella)；泛菌属(Pantoea)；沙门氏菌棒状杆菌(Salmonella Corynebacterium)；梭菌属(Clostridium)；和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。在一些实施例中，所述细胞系统是大肠杆菌。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb D4。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb WB1。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb WB2。在一些实施例中，源材料是甜菊醇。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷含量为至少70％纯。在一些实施例中，该生产方法进一步包括：i)纯化粗产物；和ii)在真空下除去溶剂以提供浓缩产物。在一些实施例中，通过柱色谱法纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过酸碱提取纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过真空蒸馏纯化所述粗产物。在一些实施例中，生产方法还包括使用半制备HPLC纯化所述甜菊醇糖苷。在其他方面，本公开内容提供了包含增甜量的甜菊醇糖苷的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品选自由饮料、甜品、烘焙产品、饼干和口香糖组成的组。
在其他方面，本公开内容提供了CP1重组多肽，其包含与SEQ ID NO：3具有至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性的DNA序列。在一些实施例中，CP1重组多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：4具有至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一性。在一些实施例中，CP1重组多肽在表2中列出的一个或多个位置处具有一个或多个突变。
在其他方面，本发明提供了制备目的甜菊醇糖苷的生物合成方法，该方法包括在经转化的细胞系统中表达CP1酶；在含有底物的培养基中培养细胞系统；并生产目的甜菊醇糖苷。在一些实施例中，该方法进一步包括将重组蔗糖合酶与底物一起孵育。在一些实施例中，该方法进一步包括将重组UDP糖基转移酶UGT85C2与蔗糖合酶，底物和CP1重组多肽一起孵育。在一些实施例中，该方法进一步包括将β葡糖苷酶添加到反应混合物中。在一些实施例中，蔗糖合酶选自由拟南芥蔗糖合酶1，拟南芥蔗糖合酶3和绿豆(Vigna radiate)蔗糖合酶组成的组。在一些实施例中，蔗糖合酶是拟南芥蔗糖合酶1。在一些实施例中，生产的甜菊醇糖苷是Reb D4和Reb M的混合物。在一些实施例中，该方法进一步包括：i)纯化粗产物；和ii)在真空下除去溶剂以提供浓缩产物。在一些实施例中，通过柱色谱法纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过酸碱提取纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过真空蒸馏纯化所述粗产物。在一些实施例中，该方法进一步包括使用半制备HPLC纯化所述甜菊醇糖苷。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb WB1。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb WB2。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb D4。在一些实施例中，所述甜菊醇糖苷是Reb M。在一些实施例中，该方法进一步包括使用HV1(SEQ ID NO：9)。在一些实施例中，该方法进一步包括使用UGT76G1(SEQ ID NO：1)。
在其他方面，本公开内容提供了生产莱鲍迪苷M的方法，该方法包括在合适的生长条件下培养重组细胞，其中所述重组细胞表现出生产甜菊醇糖苷的能力，该方法包括使所述重组细胞与含有甜菊苷、蔗糖合酶和蔗糖的反应组合物接触；其中所述重组细胞表达能够使用所述甜菊苷底物生产莱鲍迪苷E的第一UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分；其中所述重组细胞表达能够使用所述莱鲍迪苷E生产莱鲍迪苷D4的第二UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分；并且其中所述重组细胞表达能够使用所述莱鲍迪苷D4生产莱鲍迪苷M的第三UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述重组细胞中表达的蔗糖合酶基因或其催化活性部分。在一些实施例中，该方法进一步包括将蔗糖合酶添加到反应组合物中。
在一些方面，本公开提供了通过以上段落中描述的方法或本文另外公开的方法生产的Reb M。
在其他方面，本公开提供了表达用于生产Reb M的生物合成途径(例如，通过将RebD4转化为Reb M或通过将Reb E转化为Reb D4至Reb M)的重组细胞。在一些实施例中，该细胞表达能够使用所述甜菊苷底物生产莱鲍迪苷E的一种或多种第一UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分、能够使用所述莱鲍迪苷E生产莱鲍迪苷D4的第二UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分、以及能够使用所述莱鲍迪苷D4生产莱鲍迪苷M的第三UDP-糖基转移酶(UGT)或其催化活性部分。在一些实施例中，该细胞是酵母细胞。在一些实施例中，该细胞是细菌细胞。在一些实施例中，该细胞是植物细胞。
在其他方面，本公开内容提供了使用图14中描述的酶和底物或其子集(例如，以Reb W、Reb WB1或Reb D4开始和/或利用UGT76G1、CP1或CR1)生产Reb M的方法，。在一些实施例中，使用含有图14中所述的酶和底物或其子集(例如，以Reb W、Reb WB1或Reb D4开始和/或利用UGT76G1、CP1或CR1)的体外反应混合物生产Reb M。在一些实施例中，Reb M在表达图14中描述的酶或其子集(例如，UGT76G1，CP1或CR1)的细胞中体内生产。其中细胞与图14中描述的底物(例如，Reb W、Reb WB1或Reb D4)一起孵育。在一些实施例中，该细胞是酵母细胞。在一些实施例中，该细胞是细菌细胞。在一些实施例中，该细胞是植物细胞。
在产品/商业实用性方面，在美国市场上有几十种含有甜菊醇糖苷的产品，并且可以用于从镇痛药到驱虫剂以及食品和作为膳食补充剂的所有产品。含有甜菊醇糖苷的产品可以是气溶胶、液体或颗粒配制品。
至于该实施例中的细胞系统，在一些实施例中，其选自由以下组成的组：细菌、酵母及其组合，或任何允许用所选基因进行遗传转化并随后从甜菊醇生物合成生产所需甜菊醇糖苷的细胞系统。在最优选的微生物系统中，大肠杆菌用于生产所需的甜菊醇糖苷化合物。
虽然本发明内容易有各种变型和可选形式，但是其具体的实施例通过附图中的实例的方式显示并将在本文中详细描述。然而，应该理解的是，这里给出的附图和详细描述并非旨在将本公开限制于所公开的特定实施例，相反，其意图是覆盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
参考附图，在下面对本发明优选实施例的详细描述中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示莱鲍迪苷D4(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯])的结构。
图2显示莱鲍迪苷WB1和WB2的结构。
图3显示莱鲍迪苷W水解产物的HPLC谱。莱鲍迪苷W被B-glu1酶水解。A：莱鲍迪苷W的标准(“W”)；B-D:莱鲍迪苷W在1小时(B)、6小时(C)和24小时(D)被重组B-glu1酶水解。
图4显示UGT85C2将莱鲍迪苷WB2(“WB2”)生物转化为莱鲍迪苷WB1(“WB1”)的HPLC谱。将莱鲍迪苷WB2与UGT85C2酶在0小时(A)、2小时(B)、6小时(C)和18小时(D)一起孵育。
图5显示莱鲍迪苷WB1和WB2的LC-MS分析。
图6显示HV1酶将莱鲍迪苷WB1生物转化为莱鲍迪苷D4的HPLC谱。A：莱鲍迪苷WB1的标准(“WB1”)；B-C:在2小时(B)和6小时(C)莱鲍迪苷WB1被HV1酶转化。
图7A和7B显示关于Reb D4分子的结构和LC-MS数据。
图8显示UDP酶UGT71G1的结构。显示了标准定向，其中组氨酸在左侧并且UDP在右侧。
图9显示UGT76G1酶的结构，突出显示UGT76G1结构中的α螺旋和β折叠。
图10显示CP1和UGT76G1酶的比较。UGT76G1晶体结构为灰色，而CP1模型为黑色。
图11显示UGT76G1晶体结构及其与CP1分子的相互作用。这种晶体结构突出了CP1模型中没有β折叠。UGT76G1晶体结构为灰色，而CP1模型为黑色。
图12显示酶CP1的反应中心中的莱鲍迪苷D4。位于图像底部的深灰色分子是莱鲍迪苷D4。
图13显示由重组UGT76G1多肽、重组CP1和突变体(CR1)的组合催化从Reb D4体外生产Reb M。A：显示莱鲍迪苷D(“D”)和莱鲍迪苷M(“M”)的标准。B：显示莱鲍迪苷D4(“D4”)的标准。在30分钟(C)和1小时(F)由UGT76G1酶促生产的Reb M，在30分钟(D)和1小时(G)由CP1酶促生产的Reb M。在30分钟(E)和1小时(H)由CR1酶促生产的Reb M。
图14显示从莱鲍迪苷W的莱鲍迪苷M生物合成途径的合成途径。
图15显示Reb WB2的关键GHMBC相关性。
图16显示Reb WB1的关键GHMBC相关性。
图17显示Reb D4的关键TOCSY和GHMBC相关性。
具体实施方式
本文使用的术语解释：
甜菊醇糖苷是一类化合物，负责南美植物甜叶菊(菊科)叶子的甜味，可用作食品、饲料和饮料中的甜味剂。
定义
“细胞系统”是提供异位蛋白质表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞。它还包括基于细胞组分例如核糖体的蛋白质的体外表达。
“编码序列”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“培养细胞系统”。培养包括提供允许细胞繁殖和分裂的适当培养基。它还包括提供资源以使细胞或细胞组分可以翻译和制备重组蛋白。
“蛋白质表达”。蛋白质生产可以在基因表达后发生。它由DNA转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后mRNA被翻译成多肽链，多肽链最终折叠成蛋白质。DNA通过转染存在于细胞中，转染是一种故意将核酸引入细胞的过程。该术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。该术语也可以指其他方法和细胞类型，但其他术语是优选的：“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化也用于指在这些细胞中发展成癌状态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒感染包括在本申请的转染定义下。
“酵母”。根据本公开内容，本文要求保护的酵母是真核的单细胞微生物，其被分类为真菌界的成员。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但是一些物种对于本公开有用，其是那些能够通过形成称为伪菌丝或假菌丝的连接芽殖细胞串来发展多细胞特征的物种。
“UGT酶”。在本发明内容中所用的UGT酶的名称与UGT命名委员会采用的命名系统一致(Mackenzie等,UDP糖基转移酶基因超家族：基于进化分歧更新的推荐命名法(“TheUDP glycosyltransferase gene super family:recommended nomenclature updatedbased on evolutionary divergence,”)Pharmacogenetics[遗传药理学],1997,第7卷,第255-269页)，其通过家族数字、表示亚家族的字母和代表单独基因的数字的组合分类UGT基因。例如，名称“UGT76Gl”指由属于UGT家族数字76(其是植物的起源)、亚家族G和基因数字1的基因编码的UGT酶。
结构术语：
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非所述内容另有清楚地指示。
就在本说明书或权利要求中所用的术语“包括”、“具有”或等等来说，这种术语以类似于术语“包含”如当被用作权利要求中的过度用语时“包含”被解释的方式意指包括。
用语“示例性的”在本文使用以指“作为一个例子、情况或说明”。本文中被描述为“示例性的”任何实施例并不必须被解释为优选的或优越于其他实施例。
术语“互补的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于描述能够互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA来说，腺苷互补于胸腺嘧啶，胞嘧啶互补于鸟嘌呤。相应地，本主题技术也包括互补于如在所附的序列表中报道的完整序列以及那些实质上相似的核酸序列的分离的核酸片段。
术语“核酸”和“核苷酸”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合性质并且以类似于自然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外表明，特定的核酸序列也暗示包含其保守性修饰变体或简并变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确表明的序列。
术语“分离的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，当被用在分离的核酸或分离的多肽的语境中时，其被非限制性地用于指由人手脱离其原本环境而存在并因此不是天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在或可以存在于非原本环境，比如，在转基因宿主细胞中。
术语“孵育”在本文中用于指混合两种或更多种化学或生物实体(例如化学化合物和酶)并使它们在有利于生产甜菊醇糖苷组合物的条件下相互接触的方法。
术语“简并变体”指具有因一个或多个简并密码子置换而不同于参照核酸序列的残基序列的核酸序列。简并密码子置换可以通过生成其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现。核酸序列和其所有的简并变体会表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思；这三个术语有时互换使用，并且非限制性地用于指氨基酸或氨基酸类似物的多聚物，无论其大小或功能。虽然“蛋白质”常常用于指相对大的多肽，“多肽”常常用于指小的多肽，本领域中这些术语的用法重叠并且变化。术语“多肽”在本文中用于指肽、多肽和蛋白质，除非另外注明。当指代多核苷酸产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸产物、天然存在的蛋白质及其同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其它等同物、变体以及类似物。
当用于指参照多肽时，术语“多肽片段”和“片段”对本领域普通技术人员给出了它们普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指与参照多肽本身相比其中氨基酸残基被删除而剩余氨基酸序列通常与参照多肽上的相应位置相同的多肽。此类缺失可以发生在该参照多肽的氨基末端或羧基末端，或作为另外一种选择同时在这两处发生。
术语多肽或蛋白质的“功能性片段”指代这样的肽片段，其是全长多肽或蛋白质的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白质基本上相同的生物活性，或执行基本上相同的功能(例如，进行相同的酶促反应)。
可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”指代这样的氨基酸序列，其例如通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加而与参照多肽有一个或多个氨基酸不同。在一方面，变体是保持了参照多肽的部分或全部能力的“功能性变体”。
术语“功能性变体”进一步包括经过保守置换的变体。术语“经保守置换的变体”指代这样的肽，其由于一个或多个保守氨基酸置换而具有不同于参照肽的氨基酸序列，并且保持了该参照肽的部分或全部活性。“保守氨基酸置换”是用功能上相似的残基置换氨基酸残基。保守置换的实例包括：非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间的相互置换；带电荷或极性(亲水性)残基间的相互置换如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间；碱性残基如赖氨酸或精氨酸间的相互置换；或酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸间的相互置换；或芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸间的相互置换。预计此类置换对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点具有轻微影响或没有影响。短语“经保守置换的变体”还包括这样的肽，其中残基被化学衍生的残基所替换，前提条件是所得到的肽保持如本文所述的参照肽的部分或全部活性。
术语“变体”，结合主题技术的多肽，还包括功能活性多肽，其具有与参照多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列。
术语“同源的”以其所有语法形式和拼写变型指代具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人，Cell 50:667,1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的，无论是就百分比同一性而言或是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如，两个同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少900％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列。
“合适的调控序列”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且非限制地用于指位于编码序列的上游(5’-非编码序列)、之内或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且非限制地用于指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’。启动子可整个来源于天然基因，或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域的那些技术人员理解的是不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或应答不同的环境条件的表达。引起基因于大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还认识到，由于在大多数情况下，调控序列的准确界限尚未完全明确，所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”指代单个核酸片段上核酸序列间的关联，使得其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，则该启动子与该编码序列可操作地连接(即，所述编码序列处于所述启动子的转录控制之下)。编码序列可以有义或反义取向而被可操作地连接至调控序列。
如在本文中所用的术语“表达”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指衍生于本目标技术的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”指代基因产物在转基因或重组生物体中的产量超过在正常或非转化生物体中的生产水平。
“转化”对本领域普通技术人员给出了它普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指将多核苷酸转移到靶细胞中以供该细胞进一步表达。所述被转移的多核苷酸可以被并入靶细胞的基因组或染色体DNA中，得到基因上稳定的遗传，或其可以独立于该宿主染色体而复制。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
当在本文中与宿主细胞连用时，术语“转化的”、“转基因的”以及“重组的”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指已经向其中引入异源核酸分子的宿主有机体的细胞，例如植物或微生物细胞。所述核酸分子可以被稳定地整合到所述宿主细胞的基因组中，或所述核酸分子可以作为染色体外的分子存在。此类染色体外的分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织或对象应当被理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，还涵盖其转基因子代。
当在本文中与多核苷酸连用时，术语“重组的”、“异源的”以及“外源的”对本领域普通技术人员给出了它们普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指源于相对于特定宿主细胞为外源的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)或如果来自相同来源，其是从其原始形式被修饰的。因此，宿主细胞中的异源基因包括这样的基因，其相对于该具体宿主细胞而言是内源的，但已经通过例如使用定点诱变或其它重组技术进行了修饰。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语指代这样的DNA区段，其相对于细胞而言是外来的或异源的，或相对于细胞而言是同源的但所述元件处在不常见于该宿主细胞内的位置或形式。
类似地，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”，当在本文中结合多肽或氨基酸序列使用时，意指这样的多肽或氨基酸序列，其相对于该具体宿主细胞而言起源于外部来源，或者如果来自相同来源，则在其原始形式上经过修饰。因此，可以在宿主细胞中表达重组DNA区段以生产重组多肽。
术语“质粒”、“载体”以及“盒”对本领域普通技术人员给出了它们各组普通和惯常的意思，并且非限制性地用于指常常携带基因的染色体外元件，所述基因不是细胞的中心新陈代谢的部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可能是任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中大量核苷酸序列已经被接合或重组成独特的构造，其能够将选定的基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入到细胞中。“转化盒”指代特定的载体，其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、有利于具体宿主细胞的转化的元件。“表达盒”指代特定的载体，其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、允许该基因在外来宿主中的增强表达的元件。
详细说明
本公开内容涉及目的甜菊醇糖苷Reb D4的生产，然后使用UGT酶以使Reb D4糖苷转化为Reb M。本公开还涉及其他目的甜菊醇糖苷Reb WB1和Reb WB2的生产。本主题技术提供具有UDP糖基转移酶活性(例如1,2-13-O-葡萄糖糖基化活性和1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性)的重组多肽，用于合成甜菊醇糖苷。本主题技术的重组多肽有用于甜菊醇糖苷化合物的生物合成。在本发明内容中，UDP-糖基转移酶(UGT)指将糖残基从活化的供体分子(通常为UDP-葡萄糖)转移到受体分子的酶。1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性是指将糖部分转移至莱鲍迪苷D4的13-O葡萄糖部分的C-3'以生产Reb M的酶活性(图14)。本主题技术还提供了具有β-葡糖苷酶活性的重组多肽，用于合成甜菊醇糖苷。
合成生物学
这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是公知的并且被描述于例如Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版；冷泉港实验室:冷泉港,纽约,1989(在下文中称为"Maniatis")；和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with GeneFusions[基因融合实验]；冷泉港实验室:冷泉港,纽约,1984；以及Ausubel,F.M.等人，InCurrent Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方案],格林出版社和威利间接科学出版社(Greene Publishing and Wiley-Interscience)出版,1987；(这些文献以与本文保持一致的程度各自通过引用全文并入本文中)。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任意方法和材料可以用于实践或检测本发明内容，优选的材料和方法描述如下。
当考虑到接下来的非限制性实例时，会更充分地理解本发明内容。虽然表示了本目标技术的优选实施例，但应该理解的是这些实例仅通过例证的方式给出。从上面的讨论和这些实例中，本领域技术人员可以确定本主题技术的必要特征，并在不违背其精神和范围下，可以做出本主题技术的各种变化和变型以使其适应各种用途和条件。
糖基化通常被认为是控制植物天然产物的生物活性和储存的普遍存在的反应。在迄今为止已研究的大多数植物物种中，小分子的糖基化由转移酶超家族催化。这些糖基转移酶(GTs)已被分类为超过60个家族。其中，家族1GT酶(也称为UDP糖基转移酶(UGT))将UDP活化的糖部分转移至特定的受体分子。这些是转移在甜菊醇糖苷中这些糖部分以产生各种莱鲍迪苷的分子。这些UGT中的每一个都具有它们自己的活性谱和优选的结构位置，在那里它们转移它们的活化的糖部分。
生产系统
原核生物中蛋白质的表达大部分常常在具有含指导融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体的细菌宿主细胞中完成。融合载体将一些氨基酸添加至在其中编码的蛋白质，常常添加至重组蛋白的氨基端。这种融合载体通常有三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；以及3)通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助重组蛋白的纯化。常常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白裂解位点以在纯化融合蛋白后使重组蛋白从融合部分分离。这些载体在本发明内容的范围内。
在一个实施例中，所述表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于在细菌细胞中转录和翻译的元件可以包括启动子、针对蛋白复合体的编码区和转录终止子。
本领域普通技术人员会知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于包含进本主题技术的所述表达载体的多核苷酸可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)的常规技术制备。
已经开发了许多分子生物学技术以通过互补的粘性末端可操作地将DNA连接至载体。在一种实施例中，可以将互补的均聚物片段添加至待被插入载体DNA的核酸分子中。所述载体和核酸分子然后通过互补的均聚物尾之间的氢键连接以形成重组DNA分子。
在一个可替代的实施例中，提供的含有一个和或多个限制性位点的合成的接头用于可操作地将本主题技术的多核苷酸连接到所述表达载体。在实施例中，多核苷酸通过限制性内切酶消化产生。在实施例中，核酸分子用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这些酶用它们的3’-5’核酸外切酶活性去除突出的3’-单链末端，并用它们的聚合活性填补凹进的3’-末端，从而产生平末端DNA片段。在酶的存在下所述平末端片段然后用大摩尔过量的接头分子进行孵育，所述酶能够催化平末端DNA分子的连接，比如噬菌体T4DNA连接酶。因此，反应产物是在它的末端携带有聚合的接头序列的多核苷酸。这些多核苷酸然后用合适的限制性酶裂解并连接至已经用酶裂解而产生与多核苷酸的那些末端相容的末端的表达载体。
或者，可以使用具有不依赖于连接的克隆(ligation-independent cloning(LIC))位点的载体。所要求的PCR扩增的多核苷酸然后可以不经限制性消化或连接地被克隆到LIC载体(Aslanidis和de Jong,Nucl.Acid.Res.18,6069-74,(1990),Haun,等,Biotechniques 13,515-18(1992),其以与其一致的程度通过引用的方式并入本文)。
在实施例中，为了分离和/或修饰用于插入所选质粒的目标多核苷酸，适合用PCR。可以设计用于序列的PCR制备的合适的引物以分离核酸分子的所要求的编码区、加入限制性核酸内切酶或LIC位点、将编码区放入期望的读码框。
在实施例中，用于包含进本主题技术的表达载体的多核苷酸通过使用合适的寡核苷酸引物使用PCR制备。编码区被扩增，同时引物本身变为包含进扩增的序列产物中。在实施例中，扩增引物包含限制性核酸内切酶识别位点，所述位点使得扩增的序列产物被克隆到合适的载体。
可以通过传统的转化或转染技术将所述表达载体引入到植物或微生物宿主细胞。用本主题技术的表达载体进行合适细胞的转化通过本领域已知的方法完成并通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。
通过本领域公知的技术可以鉴别成功转化的细胞(即，含有表达载体的那些细胞)。例如，可以培养用本主题技术的表达载体转染的细胞以生产本文所述的多肽。可以通过本领域公知的技术检查细胞中是否存在表达载体DNA。
所述宿主细胞可以含有的前面所述的表达载体的单拷贝，或者，所述表达载体的多个拷贝，
在一些实施例中，所述转化的细胞为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施例中，所述细胞是选自由以下组成的组的植物细胞：加拿大油菜(canola)植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和牵牛植物细胞。
含有指导外源蛋白高水平表达的调控序列的微生物宿主细胞表达体系和表达载体是本领域技术人员公知的。这些中的任何可以被用于构建用于在微生物宿主细胞中表达本主题技术的重组多肽的载体。然后可以通过转化将这些载体引入至合适的微生物中以允许本主题技术的重组多肽的高水平表达。
用于合适的微生物宿主细胞的转化的载体或盒在本领域是公知的。典型地所述载体或盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列、选择性标记以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括具有转录起始控制的多核苷酸的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。对于两个控制区均优选的是源自于与被转化的宿主细胞同源的基因，虽然应该被理解的是这些控制区不需要源自被选作宿主的特定物种的天然的基因。
用于驱动在期望的微生物宿主细胞中表达重组多肽的起始控制区或启动子对于本领域技术人员来说是非常多的并且是熟悉的。事实上，任何能驱动这些基因的启动子都适合于本目标技术，其包括但不限于CYCI、HIS3、GALI、GALIO、ADHI、PGK、PH05、GAPDH、ADCI、TRPI、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母菌属中的表达)；AOXI(用于在毕赤酵母属中的表达)；以及lac、trp、JPL、IPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。
终止控制区也可以来自微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主来说，任选地可以包括终止位点。
在植物细胞中，本主题技术的所述表达载体可以包括可操作地连接到能指导本主题技术的重组多肽在期望的组织在期望的发育阶段中表达的启动子的编码区。出于方便，待表达的多核苷酸可以包含来自相同多核苷酸的启动子序列和翻译先导序列。编码转录终止信号的3’-非编码序列也应该存在。所述表达载体也可以包含一个或多个内含子以促进多核苷酸表达。
对于植物宿主细胞，能够诱导编码区表达的任何启动子和任何终止子的任何组合可以用在本主题技术的载体序列中。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可以使用的有效的植物启动子的一种类型是高水平植物启动子。与主题技术的表达载体可操作连接的这种启动子应该能促进所述载体的表达。在本目标技术中可以使用的高水平植物启动子包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的启动子(例如来自大豆(Berry-Lowe等,J.Molecular andApp.Gen.[分子与应用基因],1:483498(1982),其以与其一致的程度将其全部内容特此并入本文))以及叶绿素结合蛋白的启动子。这两种启动子已知在植物细胞中是光诱导的(参见，比如，Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective[植物基因工程农业视角],A.Cashmore,Plenum,N.Y.(1983),第2938页；Coruzzi,G.等,The Journal ofBiological Chemistry[生物化学杂志],258:1399(1983),和Dunsmuir,P.等,Journal ofMolecular and Applied Genetics[分子与应用基因学杂志],2:285(1983)，以与它们一致的程度通过引用的方式将其每一篇的全部内容特此并入本文)。
Reb D4前体合成
如前所述，甜菊醇糖苷是负责南美植物甜叶菊(菊科)的叶子和植物覆盆子(蔷薇科)的甜味的化学化合物。这些化合物是糖基化的二萜。具体地，它们的分子可被视为甜菊醇分子，其羟基氢原子被葡萄糖分子取代形成酯，羟基氢被葡萄糖和鼠李糖的组合取代形成缩醛。
在本公开内容中制备目的化合物的一种方法是采用常见或廉价的前体(例如在工程化的微生物如细菌和/或酵母中通过生物合成化学上衍生的或产生的甜菊醇或甜茶素(rubosuside)，并且通过已知的或廉价的方法如Reb D4方法合成靶标甜菊醇糖苷。
本公开内容的方面涉及方法，所述方法涉及在能够生产甜菊醇的微生物系统中重组表达酶。通常，这些酶可包括：柯巴基焦磷酸合酶(CPS)，贝壳杉烯合酶(KS)和香叶酰香叶酰二磷酸合酶(GGPPS)。这应该在表达内源类异戊二烯合成途径(例如非甲羟戊酸(MEP)途径或甲羟戊酸途径(MVA))的微生物菌株中发生。在一些实施例中，细胞是细菌细胞，包括大肠杆菌，或酵母细胞如酵母属细胞，毕赤酵母属细胞或耶氏酵母属细胞。在一些实施例中，该细胞是藻细胞或植物细胞。
此后，从发酵培养物中回收前体用于化学合成。通常，这是甜菊醇，尽管它可以是贝壳杉烯，或来自细胞培养物的甜菊醇糖苷。在一些实施例中，从气相中回收甜菊醇、贝壳杉烯和/或甜菊醇糖苷，而在其他实施例中，向细胞培养物中加入有机层或聚合物树脂，并从有机层或聚合树脂中回收贝壳杉烯、甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。在一些实施例中，甜菊醇糖苷选自莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜克苷A。在一些实施例中，生产的萜类化合物是甜菊双糖苷或甜菊苷。还应理解，在一些实施例中，离体进行至少一个酶促步骤，例如一个或多个糖基化步骤。
本发明的一部分是Reb D4甜菊醇糖苷的生产，然后将其进一步酶促转化为Reb M。根据目前的公开内容，当使用糖部分多步化学组装成甜菊醇主链将二萜类甜菊醇转化为甜菊苷和莱鲍迪苷A时，发生用于将微生物生产的甜菊醇转化为所需甜菊醇糖苷(此处为RebD4)的生物合成。更具体地说，化学合成包括以下步骤：1)由起始前体甜菊醇合成在C19COOH基团处三甲基甲硅烷基(TMS)保护的甜菊醇。使用受保护的β-Glc-β-Glc(2→1)-β-Glc(3→1)基团在甜菊醇的C13-OH位置进行三糖基化。然后进行TMS的脱保护和受保护的单β-Glc-Br部分的偶联。最后的去保护除去所有保护基团以产生莱鲍迪苷D4。
甜菊醇糖苷的生物合成
如本文所述，本技术的重组多肽具有UDP-糖基转移酶活性，并且有用于开发用于制备天然来源中不存在或通常具有低丰度的甜菊醇糖苷(分别例如莱鲍迪苷D4和莱鲍迪苷M)的生物合成方法。本技术的重组多肽具有β-葡糖苷酶或UDP-糖基转移酶活性，有用于开发用于制备新型甜菊醇糖苷(例如莱鲍迪苷D4)的生物合成方法并且可用于生产莱鲍迪苷M。
所述底物可以是能在被一种或多种UDP糖基转移酶催化的反应中被转变为甜菊醇糖苷化合物的任何天然的或合成的化合物。例如，所述底物可以是天然的甜叶菊提取物、甜菊醇、甜菊醇-13-O-糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷、甜菊醇-l,2-二糖苷、甜茶苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷G或莱鲍迪苷E。所述底物可以是纯的化合物或不同化合物的混合物。优选地，所述底物包括选自由甜茶苷、甜菊苷、甜菊醇、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷E和其组合组成的组的化合物。
本文所述的方法也提供偶联反应体系，其中允许本文所述的重组肽与一种或多种另外的酶组合起作用以提高效率或调整甜菊醇糖苷化合物的整体生物合成的结果。例如，另外的酶可以通过(例如，使用蔗糖作为葡萄糖残基的供体)将糖基化反应制备的UDP转变回UDP-葡萄糖而再生糖基化反应所需的UDP-葡萄糖，因此提高糖基化反应的效率。
在另一个实施例中，本主题技术的方法进一步包括用本文所述的重组蔗糖合酶、底物和重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶。所述重组UDP-糖基转移酶可以催化不同于本主题技术的重组多肽所催化的反应的糖基化反应。
合适的UDP-糖基转移酶包括本领域已知的任何UGT，所述UGT能催化甜菊醇糖苷化合物的生物合成中一种或多种反应，如UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1或它们的功能同系物。
通常，在本主题技术的体外方法中，UDP-葡萄糖以从约0.2mM至约5mM，优选从约0.5mM至约2mM，更优选从约0.7mM至约1.5mM的浓度包含于所述缓冲液中。在实施例中，当重组蔗糖合酶被包含在反应中时，蔗糖也以从约100mM至约500mM，优选从约200mM至约400mM，更优选从约250mM至约350mM的浓度包含在所述缓冲液中。
通常，在本主题技术的体外方法中，基于干重，所述重组多肽与所述底物的重量比为从约1:100至约1:5，优选从约1:50至约1:10，更优选从约1:25至约1:15。
通常，体外方法的反应温度为从约20℃至约40℃，适合地从25℃至约37℃，更适合地从28℃至约32℃。
本领域技术人员会认识到，由本文所述的方法制备的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得期望的风味或甜味剂组合物。例如，如本文所述制备的富集有莱鲍迪苷D4的组合物可以与含有莱鲍迪苷A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合，或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所期望的甜味剂组合物。或者，从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本纯净的甜菊醇糖苷(如，莱鲍迪苷D4)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糊精、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的，可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得期望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D4、莱鲍迪苷M或它们的组合)可以包含在食品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充品、医药营养品以及药品中。
本领域技术人员会认识到，由本文所述的方法制备的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得期望的风味或甜味剂组合物。例如，如本文所述制备的富集有莱鲍迪苷D4的组合物可以与含有莱鲍迪苷A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合，或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所期望的甜味剂组合物。或者，从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本纯净的甜菊醇糖苷(如，莱鲍迪苷D4)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糊精、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的，可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得期望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D4、莱鲍迪苷WB1、莱鲍迪苷WB2、莱鲍迪苷M或它们的组合)可以包含在食品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充品、医药营养品以及药品中。
用同一性评分分析序列相似性
如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口中不变的程度。用于测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“百分比同一性”是指参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比的相同核苷酸的百分比，这是当这两个序列最佳比对时(在比较窗口上合适的核苷酸插入、缺失或缺口总共小于参考序列的20％)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法，Needleman和Wunsch的同源性比对算法，Pearson和Lipman的搜索相似性方法的工具来进行，并且优选地通过这些算法的计算机化实施，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，可作为
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(Accelrys公司(Accelrys Inc.)，柏林顿市，麻萨诸塞州)的一部分获得。用于测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其部分，或与更长的多核苷酸序列。出于本公开的目的，还可以使用针对翻译的核苷酸序列的BLASTX 2.0版本和针对多核苷酸序列的BLASTN 2.0版本来确定“百分比同一性”。
序列同一性的百分比优选使用序列分析软件包TM(Sequence Analysis SoftwarePackageTM)(版本10；记忆计算机基团公司(Genetics Computer Group,Inc.)，麦迪逊市，威斯康辛州)的“Best Fit(最佳拟合)”或“Gap(缺口)”程序确定。“Gap”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]48:443-453,1970)来找到两个序列的比对，其使匹配数最大化并使缺口数最小化。“BestFit”对两个序列之间的最佳相似性区段进行最佳比对，并使用Smith和Waterman的局部同源性算法插入缺口以使匹配数最大化(Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics[应用数学进展]，2:482-489，1981，Smith等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]11:2205-2220,1983)。最优选使用“Best Fit”程序确定同一性百分比。
用于确定序列同一性的有用方法也公开在基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中，该程序可从美国国立卫生研究院(National Institute of Health，Bethesda,Md.20894)的国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家中心生物技术信息(National Center Biotechnology Information，NCBI)公开获得；参见BLAST手册，Altschul等人，NCBI，NLM，NIH；Altschul等,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)；BLAST程序的2.0版或更高版本允许在比对中引入缺口(删除和插入)；对于肽序列，BLASTX可用于确定序列同一性；并且，对于肽序列，BLASTN可用于确定序列同一性；
如本文所用，术语“实质性百分比序列同一性”是指至少约70％序列同一性，至少约80％序列同一性，至少约85％同一性，至少约90％序列同一性，或甚至更大的序列同一性(例如约98％或约99％序列同一性)的百分比序列同一性。因此，本公开的一个实施例是多核苷酸分子，其与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性，至少约80％序列同一性，至少约85％同一性，至少约90％序列同一性，或甚至更大序列同一性，例如约98％或约99％序列同一性。具有本公开内容的Blu1和CP1基因活性的多核苷酸分子能够指导多种甜菊醇糖苷的生产，并且具有与本文提供的多核苷酸序列具有实质性百分比序列同一性，并且包括在本公开的范围内。
同一性和相似性
同一性是在序列比对后一对序列之间相同的氨基酸的分数(可以仅使用序列信息或结构信息或一些其他信息来完成，但通常仅基于序列信息)，并且相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对而分配的得分。相似性指数可以是以下BLOSUM62、PAM250或GONNET中的任何一种，或本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有缺口)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18-25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是两个序列比较时它们之间的相似程度。这取决于他们的同一性。
可消费产品
在另一方面，本公开内容涉及包含如本文所述的莱鲍迪苷(例如Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)的可消费产品。在一些实施例中，可消费产品包含如本文所述的增甜量的莱鲍迪苷，例如Reb W1、Reb W2、Reb D4和/或Reb M。在一些实施例中，可消费产品选自由以下组成的组：饮料产品、食品、营养品、药物、膳食补充剂、牙齿卫生组合物、可食用凝胶组合物、化妆品和餐饮调味品。
在一些实施例中，所述可消费产品可以与约1％(w/v-％)至约4％(w/v-％)的蔗糖溶液具有等同的甜味强度。
在一些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷，例如Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M，是口服可消费产品中唯一的甜味剂。
在一些实施例中，可消费产品还可具有至少一种另外的甜味剂。所述至少一种另外的甜味剂可以是例如，天然的高强度甜味剂。所述另外的甜味剂可以选自：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D、2莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查尔酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜、奇异果甜蛋白、应乐果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果(Lo Han Guo)、hernandulcin、叶甜素、trilobtain及其组合。
在一些实施例中，可消费产品还可具有至少一种添加剂。所述添加剂可以是，例如：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、风味料、风味成分、收敛化合物、蛋白质、蛋白水解产物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、酒精、聚合物及其组合。
在一方面，本公开内容涉及包含增甜量的如本文所述的莱鲍迪苷(例如Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)的饮料产品。
所述饮料产品可以是，例如，碳酸饮料产品或非碳酸饮料产品。饮料产品还可以是例如软饮料、清凉饮料(fountain beverage)、冷冻饮料、即饮饮料、冷冻和即饮饮料、咖啡、茶、乳饮料、粉末软饮料、浓缩液、调味水、强化水、果汁、果汁风味饮料、运动饮料或能量饮料。
在一些实施例中，本公开的饮料产品可以包含一种或多种饮料成分，如例如：酸化剂、果汁和/或蔬菜汁、果肉等、风味剂、着色剂、防腐剂、维生素、矿物质、电解质、赤藓糖醇、塔格糖、甘油和二氧化碳。此类饮料产品可以任何合适形式提供，如饮料浓缩液或碳酸即饮型饮料。
在某些实施例中，本公开的饮料产品可以具有众多不同特定配方或组成中的任一种。本公开的饮料产品的配方可以在某种程度上变化，这取决于如下因素：该产品的预期细分市场、其需要的营养特性、风味属性等。例如，在某些实施例中，向具体的饮料产品的配方中添加另外的成分通常可以是一个选项。例如，可以添加另外的甜味剂，通常可将风味剂、电解质、维生素、果汁或其它水果产品、增味剂、掩蔽剂等、风味增强剂和/或碳酸化添加至任何此类配方中以改变味道、口感、营养特性等。在实施例中，该饮料产品可以是含有水的可乐饮料，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M、或其组合，例如Reb D4和Reb M)、酸化剂和风味剂。示例性风味剂可以是，例如，可乐风味剂、柑橘风味剂和香料风味剂。在一些实施例中，可以二氧化碳的形式添加碳酸化用于泡腾。在其它实施例中，可以根据其它成分、生产技术、所需保质期等添加防腐剂。在某些实施例中，可以添加咖啡因。在一些实施例中，所述饮料产品可以是可乐味碳酸饮料，特征在于含有碳酸水、甜味剂、可乐果提取物和/或其它风味剂、焦糖色、一种或多种酸和任选的其它成分。
在另一方面，本公开内容涉及包含如本文所述的莱鲍迪苷(例如Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)的可消费产品，其中所述可消费产品是：食物产品、保健品、药物、膳食补充剂、牙科卫生组合物、可食用凝胶组合物、化妆产品或餐饮调味料。在一些实施例中，莱鲍迪苷以增甜量存在。
如本文所用，“膳食补充剂”指代旨在补充膳食并提供营养物质(如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、氨基酸等)的化合物，其可能缺失或可能未在饮食中摄入足够的量。可使用本领域已知的任何合适的膳食补充剂。合适的膳食补充剂的实例可以是，例如，营养物质、维生素、矿物质、纤维、脂肪酸、药草、植物制剂、氨基酸和代谢物。
如本文所用，“保健品”指代这样的化合物，其包括可提供医药或健康益处的任何食物或食物的一部分，所述益处包括预防和/或治疗疾病或障碍(例如，疲劳、失眠、衰老、记忆丧失、心境障碍、心血管疾病和血液中高水平的胆固醇、糖尿病、骨质疏松、炎症、自身免疫性疾病等)。可使用本领域已知的任何合适的保健品。在一些实施方案中，保健品可以被用作对食物和饮料的补充以及作为用于肠内或肠外应用的药物制剂，其可以是固体制剂(如胶囊或片剂)或液体制剂(如溶液或悬浮液)。
在一些实施例中，膳食补充剂和保健品可以进一步含有：保护性水解胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、胶囊包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流化剂、掩味剂、增重剂、果冻化剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌剂。
如本文所用，“凝胶”指代胶态体系，其中颗粒的网络散布于液体介质的整个体积中。尽管凝胶主要由液体构成，并因而具有类似于液体的密度，但是由于散布于液体介质中的颗粒网络，使得凝胶具有固体的结构连贯性。因此，凝胶通常看起来是固态、果冻状的材料。凝胶可以被用于许多应用中。例如，凝胶可以被用于食品、油漆和粘接剂。可以食用的凝胶被称为“可食用凝胶组合物”。可食用凝胶组合物通常作为零食、甜品、主食的一部分食用，或伴着主食一起食用。合适的可食用凝胶组合物的实例可以是，例如：凝胶甜品、布丁、果酱、果冻、糊酱、乳脂松糕、肉冻、棉花软糖、橡皮糖等。在一些实施例中，可食用凝胶混合物通常是粉末状或颗粒状固体，可向其中加入液体以形成可食用凝胶组合物。合适的液体的实例可以是，例如：水、乳液、类乳液体、果汁、酒精、酒精性饮料及其组合。合适的乳液的实例可以是，例如：奶、发酵奶、奶油、液体乳清及其混合物。合适的类乳液体的实例可以是，例如：豆奶和非乳制咖啡伴侣。
如本文所用，术语“胶凝成分”指代可以在液体介质内形成胶态体系的任何材料。合适的胶凝成分的实例可以是，例如：明胶、藻酸盐、角叉菜胶、树胶、果胶、魔芋、琼脂、食品酸、凝乳酶、淀粉、淀粉衍生物及其组合。对于本领域技术人员众所周知的是，可食用凝胶混合物或可食用凝胶组合物中所用胶凝成分的量可以根据许多因素而有很大差异，所述因素如例如，所用的具体胶凝成分、所用的具体液体基质以及该凝胶的所需特性。
本公开的凝胶混合物和凝胶组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法制备。在一些实施例中，本公开的可食用凝胶混合物和可食用凝胶组合物可以使用除所述胶凝剂以外的其它成分制备。其它合适的成分的实例可以是，例如：食品酸、食品酸的盐、缓冲系统、增量剂、多价螯合剂、交联剂、一种或多种香精、一种或多种色素及其组合。
可使用本领域已知的任何合适的药物组合物。在一些实施例中，本公开的药物组合物可以被用于配制含有一种或多种发挥生物效应的活性试剂的药品。因此，在一些实施例中，本公开的药物组合物可以含有一种或多种发挥生物效应的活性试剂。合适的活性试剂是本领域众所周知的(例如，The Physician's Desk Reference[医生案头参考])。此类组合物可以根据本领域熟知的程序制备，例如，如在Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药物科学],马克出版有限公司(MackPublishing Co.),伊斯顿,宾夕法尼亚州.,美国中所述的。
本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)可与本领域已知的任何合适的牙科和口腔卫生组合物一起使用。合适的牙科和口腔卫生组合物的实例可以是，例如：牙膏、牙齿抛光剂、牙线、洗口药、漱口水、牙粉、口喷剂、口腔清新剂、牙斑冲洗液、牙科止痛药等。
如本文所用，“食物产品”指代任何固态或液态的可服用材料，其可以(但不必)具有营养价值并旨在用于人和动物的食用。
合适的食物产品的实例可以是，例如：糖果组合物，如糖果、薄荷糖、果味滴露、可可制品、巧克力等；调味品，如番茄酱、芥末酱、奶黄酱等；口香糖；谷物组合物；烘焙制品，如面包、蛋糕、馅饼、饼干等；乳制品，如奶、奶酪、奶油、冰淇淋、酸奶油、酸奶、冰冻果子露等；餐饮甜味剂组合物；汤；炖菜；方便食品；肉类，如火腿、熏肉、香肠、肉干等；明胶及明胶类产品，如果酱、果冻、蜜饯等；水果；蔬菜；蛋制品；糖衣；糖浆，包括糖蜜；零食；坚果仁及坚果制品；以及动物饲料。
食物产品组合物还可以是草本香料、香料和佐料、天然及合成的香精、以及增味剂，如谷氨酸一钠。在一些实施例中，食物产品可以是，例如：预包装产品，如限糖甜味剂、液态甜味剂、粒状风味混合物、宠物食品、牲畜饲料、烟草，以及用于烘焙应用的材料，如用于制备面包、饼干、蛋糕、煎饼、面包圈等的粉状烘焙混合物。在其它实施例中，食物产品还可以是减肥及低热量食物以及含有少量蔗糖或不含蔗糖的饮料。
在可与任何前述实施例组合的某些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，RebW1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)是唯一的甜味剂，任选地，其中所述产品具有相当于约1％至约4％(w/v-％)蔗糖溶液的甜味强度。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，所述可消费产品和饮料产品可以进一步包含另外的甜味剂，任选地其中所述产品具有与约1％至约10％(w/v-％)的蔗糖溶液等同的甜味强度。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，所述产品中的每种增甜成分均是高强度甜味剂。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，所述产品中的每种增甜成分均可以是天然的高强度甜味剂。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，所述另外的甜味剂包括选自以下的一种或多种甜味剂：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊双糖苷、蔗糖、高果糖玉米糖浆、果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、AceK、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、糖精、柚皮苷二氢查尔酮(NarDHC)、新橙皮苷二氢查耳酮(NDHC)、甜茶苷、罗汉果苷IV、赛门苷I、罗汉果苷V、莫纳甜、奇异果甜蛋白、应乐果甜蛋白、布那珍、L-丙氨酸、甘氨酸、罗汉果(Lo Han Guo)、hernandulcin、叶甜素、trilobtain及其组合。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，所述可消费产品和饮料产品可以进一步包含选自以下的一种或多种添加剂：碳水化合物、多元醇、氨基酸或其盐、聚氨基酸或其盐、糖酸或其盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐、有机酸盐、有机碱盐、无机盐、苦味化合物、风味料、风味成分、收敛化合物、蛋白质、蛋白水解产物、表面活性剂、乳化剂、类黄酮、酒精、聚合物及其组合。在可以与任一前述实施例结合的某些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)在加入产品之前具有约50％至约100％纯度(按重量计)。
在一些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)在组合物中提供，所述组合物进一步包含一种或多种填充剂，增量剂和防结块剂。合适的填充剂、增量剂和防结块剂是本领域已知的。
在某些实施例中，可以以足够使可消费产品和饮料产品的甜味变甜和/或增强的最终浓度包含和/或添加如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)。本文所述的莱鲍迪苷的“最终浓度”(例如，Reb W1、Reb W2、RebD4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)存在于最终可消费产品和饮料产品中(即，在添加所有成分和/或化合物以生产所述可消费产品和饮料产品之后)。因此，在某些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)包含在和/或添加至用来制备可消费产品和饮料产品的化合物或成分中。如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)可以存在于单一化合物或成分中，或多种化合物和成分中。在一些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)包含在和/或添加至可消费产品和饮料产品中。
在某些实施例中，如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)是包含在和/或添加至可消费产品和饮料产品中的唯一甜味剂。在一些实施例中，包含莱鲍迪苷的可消费产品和饮料产品与约1％至约4％(w/v-％)的蔗糖溶液、约1％至约3％(w/v-％)的蔗糖溶液、或约1％至约2％(w/v-％)的蔗糖溶液具有等同的甜味强度。作为另外一种选择，可消费产品和饮料产品与约1％至约4％(w/v-％)的蔗糖溶液、约2％至约4％(w/v-％)的蔗糖溶液、约3％至约4％(w/v-％)的蔗糖溶液、或约4％的蔗糖溶液具有等同的甜味强度。例如，可消费产品和饮料产品可与约1％、约2％、约3％或约4％(w/v-％)(包括这些值之间的任何范围)的蔗糖溶液具有等同的甜味强度。
本公开的可消费产品和饮料产品可包括如本文所述的莱鲍迪苷(例如，Reb W1、Reb W2、Reb D4、Reb M或其组合，例如Reb D4和Reb M)和一种或多种本公开内容的甜味剂的混合物，其比例足以获得所需的甜味强度、营养特征、味道特征、口感或其他感官因子。
从前面的描述显而易见的是，本公开的某些方面不受本文所示的实例的特定细节的限制，因此预期本领域技术人员将想到其他修改和应用、或其等同物。因此预期权利要求旨在覆盖不脱离本公开的精神和范围的所有这些修改和应用。
而且，除非另行定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然任何类似或等同于在此描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但优选的方法和材料是以上所描述的。
尽管出于理解的目的通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以实施某些改变和修改。因此，描述和实例不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求描述。
实例1：酶促合成Reb D4
有若干种制备Reb D4的酶促方法。这里介绍了从Reb W开始的一种方法。
以前，我们证明了从Reb V(WO 2016054540)生产Reb W。在这里，我们发现Reb W可以被来自毕赤酵母的β-葡糖苷酶(B-glu1，SEQ：5)水解，生产一种新的甜菊醇糖苷，我们称之为莱鲍迪苷WB1。所生产的莱鲍迪苷WB1可以转而被B-glu1水解生产莱鲍迪苷WB2。(参见图14)。
更具体地，合成了B-glu1(SEQ ID NO：6)基因的全长DNA片段。具体地讲，cDNA经过密码子优化而用于大肠杆菌表达(金斯瑞公司(Genscript),皮斯卡塔韦市,新泽西州)。将合成的DNA克隆到细菌表达载体，pETite N-His SUMO Kan载体(Lucigen公司)中。将编码B-glu1(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(参见SEQ ID NO：5)插入框内。
将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中于37℃生长直至OD600达到0.8-1.0。通过加入1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，并使培养物在16℃再生长22小时。通过离心(3,000x g；10min；4℃)收获细胞。收集细胞团块并立即使用或保存在-80℃。
将细胞团块重悬浮于裂解缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、25μg/ml溶菌酶、5μg/ml DNase I、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油和0.4％TRITONX-100)中。在4℃通过超声处理破坏细胞，并通过离心(18,000x g；30min)澄清细胞碎片。将上清液上样到经过平衡的(平衡缓冲液：50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油)Ni-NTA(凯杰公司(Qiagen))亲和层析柱上。在上样蛋白样品后，将柱用平衡缓冲液洗涤以去除未结合的污染蛋白。用含有250mM咪唑的平衡缓冲液洗脱带His标签的B-glu1重组多肽。
将重组B-glu1(10μg)加入200μL体外反应体系中。反应体系含有50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2和作为底物的1mg/ml莱鲍迪苷W。该反应在37℃进行并通过加入200μL的1-丁醇终止。用200μL的1-丁醇萃取样品三次。将汇集的级分干燥并溶于70μL的80％甲醇中用于高效液相色谱(HPLC)分析。
使用DionexUPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale,CA)进行HPLC分析，该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。使用具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱来表征甜菊醇糖苷。乙腈水溶液在HPLC分析中被用于洗脱。检测波长为210nm。
如图3所示，B-glu1水解的莱鲍迪苷W底物在1小时生产莱鲍迪苷WB1(图3B)。生成的莱鲍迪苷WB1可以在稍后的反应时间点进一步转化为莱鲍迪苷WB2(图3C和3D)。
总之，莱鲍迪苷W被B-glu1水解生产WB1，生产的WB1被B-glu1进一步水解生产WB2。
通过与UGT85C2酶一起孵育，可以将上述中间体莱鲍迪苷WB2转化回莱鲍迪苷WB1(图4)。将重组UGT85C2酶(10μg)在200μL体外反应体系中测试。所述反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、3mM MgCl2、0.5mg/ml莱鲍迪苷WB2底物和3mM UDP-葡萄糖。如图3所示，莱鲍迪苷WB2可以通过UGT85C2转化为莱鲍迪苷WB1(SEQ ID NO：7，图4)。UGT85C2酶具有将葡萄糖添加到C4羧基的C-13中从甜菊醇形成甜菊醇-13-单糖苷的活性。这些结果表明B-glu1水解莱鲍迪苷WB1的C13位葡萄糖以生产莱鲍迪苷WB2。莱鲍迪苷WB1和莱鲍迪苷WB2的预测结构如图2所示。通过LC-MS分析确认结构(图5)。
通过与HV1UGT酶(WO/2015/065650)一起孵育，可以将上述中间体Reb WB1转化为Reb D4。将重组HV1(10μg)在200μL体外反应体系中测试。所述反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、3mM MgCl2、0.5mg/ml莱鲍迪苷WB1底物和3mM UDP-葡萄糖。如图4所示，莱鲍迪苷WB1可以在6小时时被HV1完全转化为莱鲍迪苷D4(图6C)。
根据上述酶促反应，预测D4的结构为(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯](图7A)。通过LC-MS确认Reb D4的结构(图7B)。质谱分析显示与预测结构相同的质量[(M+Na)1151.47m/z]。
实例2：通过野生型酶将Reb D4转化为Reb M
我们发现Reb D4可以通过UGT76G1进一步转化为Reb M。合成UGT76G1(SEQ ID NO：2)的全长DNA片段。cDNA经过密码子优化用于大肠杆菌表达(Genscript)。将合成的DNA克隆到细菌表达载体，pETiteN-His SUMO Kan载体(Lucigen公司)中。将编码76G1的核苷酸序列插入框内。
将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中于37℃生长直至OD600达到0.8-1.0。通过加入0.5mM IPTG诱导蛋白表达，并使培养物在16℃再生长22小时。通过离心(3,000x g；10min；4℃)收获细胞。收集细胞团块并立即使用或保存在-80℃。
如上所述将细胞团块重悬浮于裂解缓冲液中。在4℃通过超声处理破坏细胞，并通过离心(18,000x g；30min)澄清细胞碎片。如上所述将上清液上样至平衡的Ni-NTA(凯杰公司)亲和柱。在上样蛋白样品后，将柱用平衡缓冲液洗涤以去除未结合的污染蛋白。用含有250mM咪唑的平衡缓冲液洗脱带His标签的76G1重组多肽。
将重组UGT76G1(10μg)加入200μL体外反应体系中。反应体系含有50mM磷酸钾缓冲液pH7.2、作为辅因子的1mM UDPG、和作为底物的1mg/ml Reb D4。该反应在37℃进行并通过加入200μL的1-丁醇终止。用200μL的1-丁醇萃取样品三次。将汇集的级分干燥并溶于70μL的80％甲醇中用于高效液相色谱(HPLC)分析。
使用Dionex UPLC ultimate 3000系统进行HPLC分析，该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。使用具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱来表征甜菊醇糖苷。乙腈水溶液在HPLC分析中被用于洗脱。检测波长为210nm。
如图13所示，UGT76G1可以将Reb D4转换为Reb M(图13C；和图13F)。
实例3：对催化Reb D4至Reb M的UGT酶的反应中心进行解析
为了更有效地确定UDP-葡糖基转移酶的化学过程，我们获得了野生型甜菊醇UDP-葡萄糖基转移酶UGT76G1的晶体结构。该酶是首次报道的进行甜菊醇糖苷生物转化的酶。我们想要获得反应中心和底物结合位点的结构信息，以设计Reb D4到Reb M转化的酶，以更全面地理解它，然后利用这些知识找到更有效地发现或设计可用于Reb D4到Reb M生物转化的酶。
为了生产硒代甲硫氨酸(SeMet)取代的蛋白质，用pET-28a-UGT76G1载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并在37℃(250rpm)在补充有含50ug mL-1卡那霉素的SeMet(Doublie，2007)的M9基本培养基中生长直至A600nm～0.8。添加异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(最终0.8mM)诱导蛋白质表达，细胞生长过夜(16℃)。通过离心(10,000x g；10分钟)收获细胞团块并悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，1mMβ-巯基乙醇(β-ME)，10％(v/v)甘油和1％(v/v)吐温(Tween)-20)。通过超声裂解后，通过离心(30,000x g；45分钟)除去细胞碎片，并将上清液通过用洗涤缓冲液(裂解缓冲液减去吐温-20)平衡的Ni2+-硝基乙酸(NTA；凯杰公司)柱。上样后，用10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子。用洗脱缓冲液(含有250mM咪唑的洗涤缓冲液)洗脱结合的融合蛋白并收集。为了进一步纯化，在用50mM Tris，pH 8.0，25mM NaCl，1mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)平衡的Superdex-20026/60HiLoadFPLC柱上进行尺寸排阻色谱。收集峰级分并使用离心浓缩器(Amicon)浓缩，使用Bradford测定法以牛血清白蛋白作为标准物测定蛋白质浓度。将纯化的蛋白质在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
将纯化的UGT761浓缩至10mg/mL，并使用悬滴蒸汽扩散法以2μl滴(1:1浓缩蛋白和结晶条件)结晶。在4℃下用20％(w/v)PEG-4000、20％2-丙醇(v/v)和100mM三碱价柠檬酸钠二水合物缓冲液(pH 5.6)获得衍射质量晶体。将各个晶体在液氮中快速冷冻，母液含有25％甘油作为冷冻保护剂。在阿贡国家实验室先进光子源(Argonne National LaboratoryAdvancedPhoton Source)19-ID光束线
Figure BDA0002095057870000362
收集衍射数据(100K)。HKL3000(Otwinowski&Minor，1997)用于索引，积分和缩放衍射数据。通过单波长异常衍射(SAD)定相确定SeMet取代的UGT76G1的结构。SHELX(Sheldrick，2008)用于确定SeMet位置并估计峰值波长数据集的初始相位。用MLPHARE(Terwilliger，2000)进行SeMet位置和参数的细化。溶剂扁平化(利用ARP/wARP(Morris等人，2003)实施的密度修饰)来构建初始模型。随后的迭代轮次的手动模型构建和细化(包括翻译-解离-筛选参数细化)分别使用COOT(Emsley等人，2010)和PHENIX(Adams等人，2007)。数据收集和细化数据总结在表1中。
表1.晶体学统计总结
Figure BDA0002095057870000361
Figure BDA0002095057870000371
UGT71G1的结构由具有相似Rossmann型折叠的N-末端结构域和C-末端结构域组成，并且如所预测的，属于GT-B折叠(图8)。UGT76G1晶体结构的标准取向如图8所示。N-末端结构域包含侧翼为八个α螺旋的中心七链平行β折叠。该结构域还含有催化组氨酸。C-末端结构域含有侧翼为七个α螺旋的六链β折叠(图9)。这两个结构域非常紧密地堆积并形成深裂隙，其中UDP分子被束缚。
实例4：突变体的合理设计
基于UGT76G1结构，我们能够设计循环置换(PLoS computational Biology[PLoS计算生物学],2012,8(3)e1002445；BIOINFORMATICS[生物信息学],2015,(3))和一组突变。循环置换分析是开发有用或有价值的酶的有力工具。在测试若干种版本的循环置换后，我们发现一个具有非常高活性的循环置换版本“循环置换1”(“CP1”)具有最高的活性。根据目前的公开内容，我们研究了CP1(SEQ ID NO：3)酶的活性及其辅助Reb D4向Reb M的转化的能力。
在图10中比较UGT76G1和CP1的结构。尽管UGT76G1晶体结构的大部分结构特征与UGT和CP1之间的相似，但CP1在其结构的“β折叠”位置具有显著不同的序列和结构(图11)。
为了预测酶的催化活性，我们将Reb D4停靠在CP1的反应中心。我们在专注于酶与Reb D4的相互作用的情况下强调了反应中心。停靠的莱鲍迪苷D4配体相对于催化组氨酸和结合的UDP处于有利位置(图12)。基于这种停靠实验，我们能够找到值得通过诱变研究测试活性的特定残基。
基于CP1建模分析，我们选择并测试了CP1的多个突变位点以增加酶活性。最后，我们发现了与莱鲍迪苷D4生物转化为莱鲍迪苷M相关的若干个突变位点(表2)。CR1是一种CP1突变体，其包括表2中的至少一个突变位点。
表2.CP1突变位点总结。
位置 氨基酸
3 W-L
6 L-A,L-G
90 T-A；T-G
91 S-G；S-L
93 V-A；V-G
181 S-G
183 F-V；F-A；F-G
184 G-A
185 L-A
350 G-A
389 L-V
410 S-G
418 H-V
450 T-A；T-G
451 K-A
452 D-A
454 K-L；K-V
实例5：通过使用突变体UGT将Reb D4转化为Reb M。
在该实例中，为了证实Reb D4向莱鲍迪苷M的体外转化，使用Reb D4作为甜菊醇糖苷底物测定UGT76G1、CP1和酶突变体。将重组多肽(10μg)在200μL体外反应体系中测试。所述反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液，pH7.2、3mM MgCl2、1mg/ml甜菊醇糖苷底物和1mM UDP-葡萄糖。反应在30℃进行并通过加入200μL的1-丁醇终止。用200μL的1-丁醇萃取样品三次。将汇集的级分干燥并溶于70μL的80％甲醇中用于高效液相色谱(HPLC)分析。莱鲍迪苷D4用作底物。使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(Sunnyvale,CA)进行HPLC分析，该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。使用具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱来表征甜菊醇糖苷。乙腈水溶液在HPLC分析中被用于洗脱。检测波长为210nm。
如图13所示，UGT76G1、CP1和CR1突变体可以将一个葡萄糖分子转移至Reb D4以形成Reb M。然而，CP1和CR1具有比UGT76G1酶显著更高的酶活性。
实例6：通过NMR分析的Reb WB2的结构。
用于表征Reb WB2的材料通过使用Reb W的酶促转化来生产并通过HPLC纯化。使用标准脉冲序列在Agilent VNMRS 500MHz仪器上获得NMR光谱。1D(1H和13C)和2D(TOCSY、ASAPHMQC、GCOSY和GHMBC)NMR光谱在CD3OD中进行。
Reb WB2的分子式基于其正高分辨率(HR)质谱推断为C38H60O18，其显示对应于在m/z 827.3671的[M+Na]+的加合离子；该组合物被NMR谱数据支持。
Reb WB2的NMR光谱数据揭示了对映-贝壳杉烷二萜类化合物的基本骨架，并通过GHMBC、COSY和TOCSY实验进一步证实。使用APT测试确认碳多重性。13C NMR显示3个异头碳(δ102.8、101.7和92.46)以及δ62.2、61.14和60.88处的3个–CH2OH信号，证实了3个糖单元。还存在δ177.1处的一个羰基共振和δ152.2和104.4处的两个烯烃碳。H21与C19的GHMBC相关性证实了糖与二萜核心结构的连接点。在δ79.4处的C13的化学位移表明与该碳连接的氧。RebWB2的1H和13C NMR值是根据TOCSY、HMQC和HMBC数据分配的并于表3中给出。
表3.Reb WB2a-c的1H和13C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)。a基于TOCSY、ASAPHMQC和GHMBC相关性所做的分配；b化学位移值以δ(ppm)为单位；c偶合常数以Hz为单位。
Figure BDA0002095057870000391
/>
Figure BDA0002095057870000401
H33与C25、H27与C24之间的关键GHMBC相关性证实了3种糖分子的连接性。基于所有观察到的2D相关性和化学位移信号，Reb WB2的结构如图15中所示。Reb WB2的结构被推断为13-羟基-对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。
实例7：通过NMR分析的Reb WB1的结构。
用于表征Reb WB1的材料通过使用Reb W的酶促转化来生产并通过HPLC纯化。使用标准脉冲序列在Agilent VNMRS 500MHz仪器上获得NMR光谱。1D(1H和13C)和2D(TOCSY、ASAPHMQC、GCOSY和GHMBC)NMR光谱在80％CD3OD–20％D2O中进行。
Reb WB1的分子式基于其正高分辨率(HR)质谱推断为C44H70O23，其显示对应于在m/z 989.4206的[M+Na]+的加合离子；该组合物被NMR谱数据支持。
Reb WB1的NMR光谱数据揭示了对映-贝壳杉烷二萜类化合物的基本骨架，并通过GHMBC、COSY和TOCSY实验进一步证实。使用APT测试确认碳多重性。13C NMR显示4个异头碳(δ102.6、101.697.6和92.61)以及δ62.0、61.1、61.0和60.8处的4个–CH2OH信号，证实了4个糖单元。还存在δ177.0处的一个羰基共振和δ152.5和104.4处的两个烯烃碳。H21与C19和H39与C13的GHMBC相关性证实了糖与二萜核心结构的连接点。Reb WB1的1H和13C NMR值是根据TOCSY、HMQC和HMBC数据分配的并于表4中给出。
表4.Reb WB1a-c的1H和13C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)。a基于TOCSY、ASAPHMQC和GHMBC相关性所做的分配；b化学位移值以δ(ppm)为单位；c偶合常数以Hz为单位。
Figure BDA0002095057870000411
/>
Figure BDA0002095057870000421
H33与C25，H27与C24(反之亦然)之间的其他关键GHMBC相关性证实了3种糖分子的键。基于所有观察到的2D相关性和化学位移信号，Reb WB1的结构如图16中所示。Reb WB1的结构被推断为13-β-D-吡喃葡萄糖基氧基对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。
实例8：通过NMR分析的Reb D4的结构。
用于表征Reb D4的材料通过使用Reb WB1的酶促转化来生产并通过HPLC纯化。使用标准脉冲序列在Agilent VNMRS 500MHz仪器上获得NMR光谱。1D(1H和13C)和2D(TOCSY、ASAPHMQC、GCOSY和GHMBC)NMR光谱在80％CD3OD和20％D2O中进行。
Reb D4的分子式基于其正高分辨率(HR)质谱推断为C50H80O28，其显示对应于在m/z1151.4728的[M+Na]+的加合离子；该组合物被NMR谱数据支持。
Reb D4的1HNMR光谱数据显示在δ1.24和0.92存在两个甲基单峰，在环外双键的δ5.20和4.86处作为单峰的两个烯烃质子。对映-贝壳杉烷二萜类化合物的基本骨架得到了GHMBC、COSY和TOCSY实验的支持。使用APT测试确认碳多重性。13C NMR显示5个异头碳(δ103.5、102.5、101.8、95.6和92.8)证实5个糖单元，δ177.1处的一个羰基和δ152.2和104.4处的两个烯烃碳。H40与C12和H22与C19的GHMBC相关性证实了糖与二萜核心结构的连接。Reb D4的1H和13C NMR值是根据TOCSY、HMQC和HMBC数据分配的并于表5中给出。
表5.Reb D4a-c的1H和13C NMR光谱数据(化学位移和偶合常数)。a基于TOCSY、ASAPHMQC和GHMBC相关性所做的分配；b化学位移值以δ(ppm)为单位；c偶合常数以Hz为单位。
Figure BDA0002095057870000431
/>
Figure BDA0002095057870000441
H45与C46、H28与C27和H26与C34之间的关键GHMBC相关性(反之亦然)证实了5个糖分子的连接性。基于所有观察到的2D相关性和化学位移信号，Reb D4的结构如图17中所示。Reb D4的结构被推断为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯。
实例9：莱鲍迪苷的味道测试
使用蔗糖作为对照进行莱鲍迪苷的感官评价。蔗糖样品购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，并用于在室温下在瓶装水中被制备成三种不同浓度的对照样品：1.0％、3.0％和6.0％的蔗糖。通过向1000mL瓶装水中添加相应的质量，以300ppm制备莱鲍迪苷用于感官评价。将混合物在室温下搅拌并随后由13名志愿人受试者组成的评审团针对若干个对照蔗糖样品(1.0％、3.0％和6.0％)评价了所述甜菊醇糖苷样品。感官评价的结果显示在表6中。
表6.与蔗糖相比，Reb W1、Reb W2和Reb D4的感官评价
Figure BDA0002095057870000451
工业实用性声明/技术领域
本公开适用于食品、饲料、饮料和药理学工业。本公开总体上涉及通过经修饰的微生物菌株生物合成生产甜菊醇糖苷的方法。
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目的序列：
UGT76G1序列：
氨基酸序列：(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0002095057870000471
DNA序列(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0002095057870000472
/>
Figure BDA0002095057870000481
CP1序列：
氨基酸：(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0002095057870000482
DNA序列(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0002095057870000483
/>
Figure BDA0002095057870000491
B-glu1序列：
氨基酸：(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0002095057870000492
DNA:(SEQ ID NO:6)
Figure BDA0002095057870000501
/>
Figure BDA0002095057870000511
UGT85C2序列：
氨基酸：(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0002095057870000513
DNA(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0002095057870000512
/>
Figure BDA0002095057870000521
HV1序列：
氨基酸序列：(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0002095057870000522
DNA序列：(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0002095057870000531
/>
Figure IDA0002095057930000011
Figure IDA0002095057930000021
Figure IDA0002095057930000031
Figure IDA0002095057930000041
Figure IDA0002095057930000051
Figure IDA0002095057930000061
Figure IDA0002095057930000071
Figure IDA0002095057930000081
Figure IDA0002095057930000091
Figure IDA0002095057930000101
Figure IDA0002095057930000111
Figure IDA0002095057930000121
Figure IDA0002095057930000131
Figure IDA0002095057930000141
Figure IDA0002095057930000151
Figure IDA0002095057930000161
Figure IDA0002095057930000171
Figure IDA0002095057930000181
Figure IDA0002095057930000191

Claims (9)

1.一种制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：
准备包含以下的反应混合物：
(a)具有以下结构的莱鲍迪苷W：
Figure FDA0004069653510000011
和
(b)β-葡糖苷酶；且
将所述反应混合物孵育足够的时间以产生包含莱鲍迪苷WB1、莱鲍迪苷WB2或其组合的甜菊醇糖苷组合物，其中莱鲍迪苷WB1具有以下结构：
Figure FDA0004069653510000012
和
莱鲍迪苷WB2具有以下结构：
Figure FDA0004069653510000021
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)β-葡糖苷酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括获得包含莱鲍迪苷WB1的粗产物。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷WB1与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4，其中所述UDP-糖基转移酶是HV1UGT酶，并且莱鲍迪苷D4具有以下结构：
Figure FDA0004069653510000022
5.根据权利要求4所述的方法，其中在蔗糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的存在下将所述UDP-糖基转移酶与蔗糖合酶一起孵育。
6.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的UGT76G1。
7.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括将莱鲍迪苷D4与UDP-糖基转移酶一起孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷M，其中所述UDP-糖基转移酶是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的酶的突变体，其中所述突变体包含在对应于选自SEQ ID NO:3的3、6、90、91、93、181、183、184、185、350、389、410、418、450、451、452和454的位置的氨基酸残基位置处的至少一个突变。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，所述方法还包括获得从所述反应混合物产生的用作甜味剂的莱鲍迪苷M。
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